Untersuchungen zum Einfluss der MDR-1-Genexpression beim Pferd auf pharmakokinetische Prozesse am Beispiel von Ivermectin

Untersuchungen zum Einfluss der MDR-1-Genexpression beim Pferd auf pharmakokinetische Prozesse am Beispiel von Ivermectin

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Thomas Borg Pietà, Malta

Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Y. Naim

Tag der mündlichen Prüfung: 28.11.2011

Diese Arbeit wurde durch das Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit gefördert.

Meinen Eltern in Liebe und Dankbarkeit

gewidmet

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 11

2 Literaturübersicht 13

2.1 Barriere der intestinalen Absorption 13

2.2 Transporterproteine 14

2.3 P-Glykoprotein 15

2.3.1 Lokalisation des P-Glykoproteins ... 15

2.3.2 Funktion von P-Glykoprotein... 16

2.3.3 Struktur und der Wirkmechanismus von P-Glykoprotein ... 18

2.3.3.1 Struktur ... 18

2.3.3.2 Wirkmechanismus ... 19

2.3.4 Substrate des P-Glykoproteins ... 20

2.3.5 Modulatoren des P-Glykoproteins ... 21

2.3.6 Rolle von P-Glykoprotein in der Pharmakokinetik ... 22

2.3.6.1 Absorption ... 23

2.3.6.2 Verteilung (Distribution) ... 24

2.3.6.3 Metabolismus ... 24

2.3.6.4 Exkretion ... 25

2.3.7 Bedeutung des P-Glykoproteins für die Pharmakokinetik ... 26

2.3.8 Weitere ABC-Transporter ... 28

2.3.8.1 Weitere ABC-Transporter beim Pferd ... 29

2.4 Ivermectin als Substrat für das P-Glykoprotein 30 3 Material und Methoden 34 3.1 Versuchsziel 34 3.2 Überprüfung des Zusammenhangs zwischen der MDR-1-Genexpression in der Leber und in Haarfollikelzellen 34 3.2.1 Probenentnahme und –Lagerung ... 35

3.2.2 Probenaufbereitung ... 35

3.2.2.1 RNA-Extraktion ... 35

3.2.2.2 cDNA-Synthese ... 36

3.2.3 Real-Time qPCR ... 37

3.2.3.1 Primer- und Sondendesign ... 37

3.2.3.2 Herstellung von Standards für die qPCR ... 38

3.2.3.3 Durchführung der Real-Time qPCR ... 39

3.2.3.4 Auswertung der Real-Time qPCR ... 40

3.3 Hauptversuch 41 3.3.1 Versuchstiere ... 41

3.3.2 Molekularbiologische Untersuchung ... 42

3.3.2.1 Probenentnahme und -lagerung ... 42

3.3.2.2 Probenaufbereitung... 43

3.3.2.3 Real-Time qPCR ... 43

3.3.2.4 Auswertung der Real-Time qPCR ... 43

3.3.3 Pharmakokinetische Untersuchung ... 44

3.3.3.2 Versuchsablauf ... 45

3.3.3.3 Aufarbeitung der Plasmaproben zu Analyse ... 46

3.3.3.4 HPLC ... 48

3.3.3.5 Validierung der HPLC für die untersuchten Testsubstanzen ... 50

3.3.3.6 Pharmakokinetische Analyse ... 53

3.3.3.7 Statistische Analyse ... 53

3.4 Geräte, Reagenzien und Verbrauchsmaterialen 54 3.4.1 Molekularbiologische Untersuchungen ... 54

3.4.2 Analytik ... 56

4 Ergebnisse 58 4.1 Effizienz der Real-Time qPCR vom MDR-1-Gen 58 4.2 MDR-1 Genexpression in Haarfollikelzellen und in der Leber 59 4.3 MDR-1-Genexpression in Haarfollikelzellen 61 4.4 Pharmakokinetische Untersuchung 66 4.4.1 Plasmakonzentrationen von Ivermectin ... 66

4.4.2 Pharmakokinetische Parameter ... 69

4.4.2.1 Maximale Plasmakonzentration ... 70

4.4.2.2 Zeitpunkt der maximalen Plasmakonzentration ... 71

4.4.2.3 Apparentes Verteilungsvolumen der terminalen Phase ... 73

4.4.2.4 Gesamtclearance nach oraler Applikation ... 74

4.4.2.5 Fläche unter der Kurve ... 76

4.4.2.6 Terminale Dispositionsgeschwindigkeitskonstante... 77

4.4.2.7 Halbwertszeit der terminalen Dispositionsgeschwindigkeitskonstante ... 78

5 Diskussion 80 5.1 Zusammenhang zwischen der MDR-1-Genexpression in der Leber und in Haarfollikelzellen 82 5.2 Pharmakokinetische Studie 83 5.2.1 Pharmakokinetische Simulation ... 87

5.3 Ausblick 103

6 Zusammenfassung 105

7 Summary 108

8 Literaturverzeichnis 111

9 Anhang 124

9.1 Herstellung der Standards für die qPCR 124

9.2 Abbildungsverzeichnis 130

9.3 Tabellenverzeichnis 133

10 Danksagung 135

Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius

λz Terminale Dispositionsgeschwindigkeitskonstante

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µM Mikromol

Abb. Abbildung

ABC ATP Binding Cassette ACN Acetonitril

ATP Adenosintriphosphat AUC Area Under the Curve

AUC last Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve bis zur Zeit der letzten messbaren Konzentration

bp Basenpaare

bzw. Beziehungsweise

BCRP Breast Cancer Resistance Protein

ca. circa

cDNA Komplementäre Desoxyribonucleinsäure Cmax Maximale Plasmakonzentration

Cl/F Gesamtclearance nach extravasaler Applikation Ct Threshold cycle

CYP 3A Cytochrom P450 3A DIN Deutsche Industrie Norm

dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate FAM 6-Carboxyfluorescin

g Gramm

GABA Gamma-aminobuttersäure

GAPDH Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase

h Stunde

HPLC High Performance Liquid Chromatography HQS High quality control standard

Hz Hertz

kDa Kilo Dalton

kg Kilogramm

KGW Kilogramm Körpergewicht LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantification LQS Low quality control standard

MDR Multidrug resistance MGB Minor groove binding

mg Milligramm

min Minute

ml Milliliter mMol Millimol

MRP Multidrug resistance associated protein MRT Mean residence time

MW Mittelwert

n Anzahl

NBD Nucleotide binding domain

ng Nanogramm

nm Nanometer

OATP Organic anion-transporting polypeptide OCT Organic cation transporter

PCR Polymerase Kettenreaktion P-gp P-Glykoprotein

pmol Picomol

PXR Pregnane X Rezeptor

qPCR Quantitative PCR RNA Ribonukleinsäure

rpm Umdrehungen pro Minute

s Sekunden

SD Standardabweichung

SEM Standardfehler des Mittelwertes SLC Solute carrier

t ½ λz Halbwertszeit der terminalen Dispositionsgeschwindigkeitskonstante Tab. Tabelle

Tmax Zeitpunkt der maximalen Konzentration TMD Transmembrane Domäne

U Unit

Vz/F Verteilungsvolumen der terminalen Phase

WDT Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG z.B. zum Beispiel

ZNS Zentralnervensystem

Die chemischen Elemente werden gemäß dem internationalen Periodensystem abgekürzt.

1 Einleitung

In pharmakokinetischen Studien beim Pferd fallen große Streuungen in der Plasmakonzentration von verschiedenen Medikamenten auf. Auch die orale Absorption von Antibiotika und Antihistaminika ist beim Pferd niedriger als bei anderen Tierarten (TORNEKE et al. 2003; DAVIS et al. 2006; OLSEN et al. 2007).

Das MDR-1-Gen kodiert ein P-Glykoprotein, das einen der wichtigsten Effluxtransporter im Körper darstellt. Das P-Glykoprotein besitzt die Fähigkeit, verschiedene Stoffe durch Membranen zu transportieren. Hierzu zählen z.B. Steroidhormone, Antiparasitika, Antibiotika, Immunosuppressiva und Opioide. Als Folge einer Mutation im caninen MDR-1-Gen kommt es bei betroffenen Hunderassen zu einer Akkumulation von Ivermectin im Gehirn, welche sich in neurotoxischen Symptomen äußert (MEALEY et al. 2001). Beim Mensch besteht eine negative Korrelation zwischen der MDR-1-mRNA Expression im Darm und der oralen Bioverfügbarkeit des P-Glykoprotein-Substrates Cyclosporin (FRICKER et al. 1996). Polymorphismen im humanen MDR-1-Gen sind für die veränderte Expression des P-Glykoproteins und eine veränderte Pharmakokinetik seines Substrates Digoxin beschrieben (HOFFMEYER et al.

2000).

Das P-Glykoprotein kann auch beim Pferd eine Rolle in der Pharmakokinetik seiner Substrate spielen. Eine Hemmung des equinen P-Glykoproteins führt zu höheren Plasmakonzentrationen von dem P-Glykoprotein-Substrat Cetirizin (OLSEN et al. 2007). Eine In-vitro Studie an equinen Jejunum-Zellen demonstriert die Beteiligung von P-Glykoprotein beim Transport von dem Opioid Methadon (LINARDI 2010).

Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss der MDR-1-Genexpression auf die Pharmakokinetik eines P-Glykoprotein-Substrates untersucht werden. Da der Zugang zum Darm und anderen inneren Organe beim lebenden Pferd begrenzt ist, wurde die MDR-1- Genexpression in equinen Haarfollikelzellen untersucht. Bei Pferden mit einer hohen bzw.

niedrigen MDR-1-Genexpression wurde eine pharmakokinetische Studie mit Ivermectin als Modellsubstrat für das P-Glykoprotein durchgeführt. Anhand von Messungen der

Ivermectinkonzentration im Plasma wurden pharmakokinetische Parameter berechnet und zwischen den Pferden mit unterschiedlicher MDR-1-Genexpression verglichen.

Mit Hilfe dieser Untersuchung sollte überprüft werden, ob anhand der MDR-1-Genexpression in Haarfollikelzellen beim Pferd prädikative Aussagen über das pharmakokinetische Verhalten von Ivermectin als Modellsubstrat für das P-Glykoprotein möglich sind.

2 Literaturübersicht

Die Fähigkeit von Medikamenten, durch zelluläre Barrieren zu diffundieren, kann einen bedeutsamen Einfluss auf ihre Wirksamkeit haben. Während lipophile Arzneistoffe diese Barrieren relativ einfach überwinden können, benötigen hydrophile Stoffe für ihre Aufnahme in die Zelle oft spezifische Transportmechanismen. Das P-Glykoprotein (P-gp), was vom MDR-1- Gen kodiert wird, stellt einen wichtigen Efflux-Transporter dar. Dieser wirkt der intrazellulären Akkumulation von Stoffen entgegen und kann somit an der limitierten Absorption seiner Substrate beteiligt sein (CHAN et al. 2004).

2.1 Barriere der intestinalen Absorption

Die orale Applikation von Medikamenten wird aufgrund der nicht invasiven Natur sowie der oft guten Absorption durch den Magen-Darm-Trakt häufig bevorzugt. Die Enterozyten stellen eine selektive Barriere dar, die einen Einfluss auf die Absorption und dadurch auch auf die Bioverfügbarkeit hat (CHAN et al. 2004).

Stoffe können über parazelluläre oder transzelluläre Wege durch das intestinale Epithel diffundieren. Kleine hydrophile, ionisierte Arzneistoffe werden über den parazellulären Weg absorbiert (HAYASHI et al. 1997). Viele der oral verabreichten Medikamente sind jedoch lipophil und werden durch passive transzelluläre Prozesse absorbiert (HUNTER u. HIRST 1997). Arzneistoffe, die die apikalen Zellmembranen durchdringen, können Substrate für apikale Efflux-Transporter sein. Durch diese Transporter werden die Arzneistoffe zurück ins intestinale Lumen transportiert (HUNTER et al. 1993). Zu diesen apikalen Efflux Transporter gehören das P-Glykoprotein (P-gp) und Multidrug Assoziierte Resistenz Proteine (MRPs). Als erste Abwehrmechanismen limitieren diese Transporter die Absorption von potentiell toxischen Fremdstoffen (CHAN et al. 2004). Durch den transzellulären Weg werden Arzneistoffe nicht nur dem Efflux-Transporter ausgesetzt, sondern weiterhin auch intrazellulären metabolischen Systemen. Während die Leber der Hauptort der Metabolisierung ist, stellen die Enterozyten des

Dünndarms den ersten Ort für die Cytochrom P450-vermittelte Metabolisierung von oral aufgenommenen Medikamenten und Xenobiotika dar (WATKINS 1992).

2.2 Transporterproteine

Transporter sind Membranproteine, die bei allen Organismen vorhanden sind. Diese Proteine kontrollieren die Aufnahme von essentiellen Nährstoffen und Ionen sowie den Efflux von zellulärem Debris, Umwelttoxinen und anderen Xenobiotika. Somit spielen sie eine sehr wichtige Rolle in der zellulären Homöostase. Im menschlichen Genom sind über 2000 Gene, die für Transporter oder Transporter-Assoziierte Proteine kodieren, bekannt. Beim Transport von Medikamenten spielen Transporterproteine aus zwei Superfamilien eine große Rolle: die ABC- (ATP-Binding-Cassette) und die SLC- (Solute Carrier) Transporter (GIACOMINI u.

SUGIYAMA 2005).

Zu der SLC-Transporter-Familie gehören die Aufnahme-Transporter, die für den intrazellulär gerichteten Transport zuständig sind. Viele dieser Transporter benutzen elektrochemische Gradienten von Ionen wie Na⁺ oder HCO₃^-,um den Transport gegen Konzentrationsgradienten zu ermöglichen. Zu diesen Transportern gehören die Organic Anion Transporter (OATP, auch SLC21A) und die Organic Cation Transporter (OCT, SLC22A) (CASCORBI 2006).

Die meisten Efflux-Transporter gehören zu der ABC-Transporter-Superfamilie. Diese Transporter spielen eine Rolle im Abwehrmechanismus gegen Xenobiotika und beim transmembranen Transport von verschiedenen endogenen Stoffen. Die hierfür benötigte Energie wird durch ATP-Hydrolyse gewonnen und ermöglicht den Transport von Substraten auch gegen steile Konzentrationsgradienten (HIGGINS u. GOTTESMAN 1992). Bei Menschen sind 49 Gene, die für ABC-Transporterproteine kodieren, bekannt. Diese werden in sieben Subfamilien (ABCA bis ABCG) unterteilt (BORST u. ELFERINK 2002).

2.3 P-Glykoprotein

Das P-Glykoprotein ist ein wichtiger ABC-Transporter, der bei pharmakokinetischen Prozessen (Absorption, Distribution, Metabolismus und Exkretion) eine Rolle spielt (MEALEY 2004).

Die erste Beschreibung dieses Proteins erfolgt 1976 in chinesischen Hamster Ovar (CHO) Zellen, die auf Colchicinresistenz kultiviert werden (JULIANO u. LING 1976). Die colchicinresistenten Zellen exprimieren große Mengen eines 170 kDa Proteins. Dieses Protein wird P-Glykoprotein genannt und verleiht den Zellen eine Resistenz gegenüber Colchicin und anderen Medikamenten. Das kodierende Gen wird aufgrund seiner hohen Expression in Multidrug resistenten Tumorzellen als das Multidrug Resistance-(MDR-1) Gen bezeichnet (UEDA et al. 1987).

2.3.1 Lokalisation des P-Glykoproteins

P-Glykoprotein wird nicht nur in Tumorzellen exprimiert, sondern auch konstitutiv in vielen Organen. In Untersuchungen bei Menschen kann das Protein auf der apikalen Membran von Enterozyten (LI et al. 1999), in Endothelzellen von Gehirnkapillaren (CORDON-CARDO et al.

1989), auf Epithelzellen im proximalen Nierentubulus (HORI et al. 1993), in peripheren Blut T- Lymphozyten (PARK et al. 2003), in intestinalen Lymphozyten (YACYSHYN et al. 1999), in der Plazenta (LANKAS et al. 1998) und in den Hoden (MELAINE et al. 2002) nachgewiesen werden. Analoge Verhältnisse sind beim Pferd vorhanden. Das equine P-gp kann auf der apikalen Membran von Enterozyten im Duodenum, Jejunum, Ileum, Kolon und Caecum, auf der Zellmembran von Lymphozyten der intestinalen Lamina propria, in peripheren Blutlymphozyten, auf der Oberfläche von Gallengangsepithelzellen in der Leber sowie auf Epithelzellen im proximalen Tubulus und in der Henle’schen Schleife der Niere nachgewiesen werden (TYDEN et al. 2009).

2.3.2 Funktion von P-Glykoprotein

Das P-Glykoprotein ist als ATP-abhängige Effluxpumpe für den Auswärtstransport seiner Substrate vom intrazellulären Raum in den extrazellulären Raum verantwortlich (FROMM 2004).

Das P-Glykoprotein hat daher aufgrund seiner Lokalisation drei Hauptfunktionen:

1. Auf der apikalen (luminalen) Membran von Enterozyten limitiert das P-gp die Aufnahme von Xenobiotika in den Körper (Abb. 2.1).

Abb. 2.1: Funktion vom P-gp im Darm (modifiziert nach FROMM 2004)

2. Auf der kanalikulären Membran von Hepatozyten und auf der luminalen Membran der Zellen des proximalen Nierentubulus ist P-gp an der aktiven Elimination seiner Substrate aus dem Blut in die Galle bzw. in den Harn beteiligt (Abb. 2.2).

Abb. 2.2: Funktion vom P-gp in der Niere (modifiziert nach FROMM 2004)

3. Das P-Glykoprotein ist ein wichtiger Bestandteil von Organschranken. Durch den Efflux seiner Substrate schützt das P-gp empfindliche Organe. So schützt es z.B. das Gehirn (Abb. 2.3), indem es an der Blut-Hirn-Schranke die Penetration von verschiedenen Xenobiotika limitiert (FROMM 2004).

Abb. 2.3: Funktion vom P-gp an der Blut-Hirn-Schranke (modifiziert nach FROMM 2004)

2.3.3 Struktur und der Wirkmechanismus von P-Glykoprotein

2.3.3.1 Struktur

Bei Eukaryonten besitzt das P-Glykoprotein eine Dimer-Struktur aus ca. 1280 Aminosäuren.

Jede homologe Hälfte dieses Proteins besteht aus sechs hydrophoben transmembranen Segmenten, die zusammen eine transmembrane Domäne (TMD) und eine ATP-bindende Domäne (auch Nukleotid bindende Domäne, NBD) bilden. Die beiden homologen Hälften des Dimers sind durch eine „Linker-Region“ verbunden. Die transmembrane Domäne stellt die Bindungsstelle für Substrate dar, während die NBD als intrazytoplasmatische Schleifen die ATP-Bindungsstellen enthalten. Die Bindung und Hydrolyse von ATP ist für den Transport des Substrates essentiell (ECKFORD u. SHAROM 2009).

Abb. 2.2: Struktur von P-Glykoprotein: Jede homologe Hälfte der Dimer-Struktur besteht aus einer transmembranen Domäne (TMD), die wiederum aus sechs transmembranen Segmenten und einer nukleotidbindenden Domäne (NBD) besteht (modifiziert nach ECKFORD u.

SHAROM 2009).

Extrazellulär

Intrazellulär

P-gp

2.3.3.2 Wirkmechanismus

Klassische Membranpumpen, wie die Laktose-Permease oder die Na⁺/K⁺-ATPase, bewegen polare oder geladene Substrate durch Membranen, indem sie das Substrat durch einen von polaren Residuen ausgelegten Weg durch das Protein transportieren. So kommt das Substrat nicht in Kontakt mit dem hydrophoben Innenraum der Lipid-Doppelmembran. Da P- Glykoprotein-Substrate relativ unpolar sind, können sie in die Lipid-Doppelmembran diffundieren und dort akkumulieren (SHAROM 2006).

Für den Wirkmechanismus von P-Glykoprotein bestehen zwei Theorien. HIGGINS u.

GOTTESMAN (1992) stellen das Modell des „hydrophoben Staubsaugers“ („hydrophobic vacuum cleaner“) vor. Das Substrat bewegt sich in die Lipid-Doppelmembran, wird dort von dem P-gp gebunden und in den extrazellulären Raum transportiert (Abb. 2.3).

SHAROM (2006) beschreibt das Modell der „Drug Flippase“. Wie bei dem „hydrophoben Staubsauger Modell“ bewegen sich die P-gp Substrate auch bei diesem Modell in die Doppelmembran und zwar zuerst nur in das zytoplasmatische Blatt. Dort werden sie von P-gp gebunden und in das extrazelluläre Blatt der Doppelmembran transportiert. Aus dem extrazellulären Blatt diffundieren die Substrate in den extrazellulären Raum (Abb. 2.3).

Anzumerken ist, dass beide Modelle sich nicht gegenseitig ausschließen. Der definitive Mechanismus ist noch nicht völlig geklärt.

Abb. 2.3: Wirkmechanismus des P-Glykoproteins: Links dargestellt ist die klassische Pumpe, in der Mitte das hydrophobische Staubsauger Modell und rechts die Flippase (modifiziert nach SHAROM 2006).

2.3.4 Substrate des P-Glykoproteins

Das P-Glykoprotein kann strukturell sehr unterschiedliche Substanzen transportieren. Zu diesen Substanzen gehören z.B. Chemotherapeutika, Steroide, verschiedene Fluoreszenz-Farbstoffe, Peptide sowie verschiedene Ionophore. Die meisten Substrate sind schwach amphiphatisch und relativ hydrophob, viele besitzen aromatische Kohlenstoffverbindungen und ein positiv geladenes tertiäres Stickstoffatom (SHAROM 2006). Viele der P-gp-Substrate sind gleichzeitig auch Substrate des metabolisierenden Enzyms Cytochrom P450 3A4 (CYP 3A4). Diese Überlappung ist nicht vollständig, da bestimmte Arzneistoffe, wie Digoxin, von P-gp transportiert werden aber keine Substrate für das CYP 3A4 sind, während andere Arzneistoffe, wie Midazolam, Substrate für das CYP 3A4 aber nicht für das P-gp sind (WACHER et al.

1995). Anhand der Struktur eines Stoffes alleine ist eine Aussage über die Transportfähigkeit durch P-gp nicht möglich (DIDZIAPETRIS et al. 2003; ZMUIDINAVICIUS et al. 2003).

In der folgenden Tabelle sind verschiedene Arzneimittel, die bekannten P-gp-Substrate sind, zusammengefasst.

Tab. 2.1: Substrate für das P-Glykoprotein (ZENG et al. 1998; FROMM 2002; SAKAEDA et al. 2002, 2003; SCHWAB et al. 2003; MARZOLINI et al. 2004).

Zytostatika Opioide

Doxorubicin Loperamid

Docetaxel* Morphin

Vincristin*

Vinblastin* Herzglykoside

Etoposid* Digoxin

Mitoxantron Diltiazem*

Actinomycin D Verapamil*

Talinolol

Steroidhormone Immunosuppressiva

Aldosteron Cyclosporin*

Cortisol* Tacrolimus*

Dexamethason*

Methylprednisolon

Antibiotika Sonstige

Erythromycin* Ivermectin*

Ketoconazol Amitriptylin

Itraconazol* Terfenadin*

Tetrazykline Ondasteron

Doxycycline Domperidon

Levofloxacin Phenothiazine

Sparfloxacin Vecuronium

*gleichzeitig CYP 3A Substrate

2.3.5 Modulatoren des P-Glykoproteins

Bestimmte Arzneistoffe und natürlich vorkommende Verbindungen besitzen die Fähigkeit, das P-Glykoprotein zu hemmen oder zu induzieren (MEALEY 2004).

Zu den Inhibitoren gehören verschiedene Antibiotika (wie Ceftriaxon, Cefoperazon, Clarithromycin und Erythromycin), Ca²⁺-Antagonisten (Verapamil), Zytostatika (Ritonavir, Indinavir, Saquinavir, Nelfinavir) sowie andere Wirkstoffe, wie z.B. Hydrocortison, Tacrolimus, Itraconazol, Ketoconazol oder Ivermectin (LESPINE et al. 2007; MARCHETTI et al. 2007). Weiterhin können pflanzliche Bestandteile wie Piperine (BHARDWAJ et al. 2002), Giasenoside (CHOI et al. 2003), andere Flavonoide (ZHANG u. MORRIS 2003) und Capsaicin (NABEKURA et al. 2005) das P-Glykoprotein hemmen.

Die P-Glykoprotein-Expression wird vom Pregnane-X-Rezeptor (PXR) gesteuert (XU et al.

2005). Hyperforin, Bestandteil des Johanniskrauts, sowie verschiedene Karotinoide können den PXR aktivieren (MOORE et al. 2000; RUHL et al. 2004). Die Flavonoide Kaempferol und Quercetin besitzen auch die Fähigkeit, die P-gp Expression zu induzieren (DUBUSKE 2005).

Interaktionen zwischen P-Glykoprotein-Substraten und -Inhibitoren können zu einer Zunahme der Bioverfügbarkeit des Substrates führen und somit das Risiko einer Toxizität und unerwünschten Arzneimittelwirkung erhöhen. Auf der anderen Seite kann die gleichzeitige Gabe von Substraten und P-gp-induzierenden Stoffen eine Abnahme der Plasmakonzentration des Substrates verursachen (MARCHETTI et al. 2007). Diese Interaktionen wurden in der tierärztlichen Praxis beispielsweise genutzt, um die orale Bioverfügbarkeit von Cyclosporin, durch die gleichzeitige Gabe von dem P-Glykoprotein Hemmer Ketoconazol, zu erhöhen (DAHLINGER et al. 1998).

2.3.6 Rolle von P-Glykoprotein in der Pharmakokinetik

Speziesunterschiede in der therapeutischen Antwort von Arzneimittel sind in der Tiermedizin bekannt. Neben den physikochemischen Eigenschaften des Arzneimittels spielen biologische Faktoren, wie die Verweildauer im Magen-Darm-Trakt und der luminale pH-Wert, eine Rolle.

Es ist bekannt, dass P-Glykoprotein eine Rolle bei verschiedenen pharmakokinetischen Parameter (Absorption, Distribution, Metabolismus und Exkretion) seiner Substrate spielt (MEALEY 2004).

Studien zur Rolle von P-Glykoprotein in der Pharmakokinetik seiner Substrate werden vor allem mit mdr1-Knockout-Mäusen durchgeführt. Erste Studien mit mdr1-Knockout-Mäusen zeigen, dass das P-gp für normale physiologische Funktionen unter normalen Laborbedingungen keine große Bedeutung hat, da solche Mäuse sich als gesund und fruchtbar, ohne sonstige Auffälligkeiten, zeigen (SCHINKEL et al. 1994; SCHINKEL et al. 1995a).

Die wichtige Rolle von P-Glykoprotein wird nach einer Ivermectin-Behandlung sichtbar. So sterben fast alle mdr1a-Knockout-Mäuse innerhalb von 24 Stunden nach Ivermectin Behandlung (0,6 mg/kg), während die Wildtyp-Mäuse und die heterozygoten-Mäuse keine Symptomatik zeigen. Die Konzentration von Ivermectin im Gehirngewebe ist bei den mdr1a- Knockout-Mäusen etwas hundertfach höher als bei den Wildtyp-Mäusen (SCHINKEL et al.

1994; SCHINKEL et al. 1995a; SCHINKEL et al. 1995b).

2.3.6.1 Absorption

Es wird postuliert, dass das P-Glykoprotein aufgrund seiner Lokalisation auf der apikalen Oberfläche von Enterozyten, in der oralen Absorption seiner Substrate eine Rolle spielen könnte. Tatsächlich ist die orale Bioverfügbarkeit von dem P-gp Substrat Paclitaxel dreifach höher bei mdr1a-Knockout-Mäusen als bei Wildtyp-Mäusen (SPARREBOOM et al. 1997). Die Ivermectin-Blutkonzentration ist nach oraler Applikation bei mdr 1a-Knockout-Mäusen bis zu dreifach höher als bei Wildtyp-Mäusen (KWEI et al. 1999). Ähnliche Ergebnisse können auch für andere P-gp-Substrate gezeigt werden, wie z.B. für Cyclosporin A (LOWN et al. 1997), Digoxin (SCHINKEL et al. 1995b), Dexamethason (SCHINKEL et al. 1995b) und Fluorchinolone (YAMAGUCHI et al. 2002).

Weiterhin kann bei Menschen eine negative Korrelation zwischen der MDR-1-mRNA- Expression im Darm und der AUC von Cyclosporin nach oraler Gabe gezeigt werden (FRICKER et al. 1996). Eine ähnliche negative Korrelation wird auch zwischen der duodenalen P-Glykoprotein-Expression und Plasmakonzentrationen von Digoxin gesehen (HOFFMEYER et al. 2000).

2.3.6.2 Verteilung (Distribution)

Organschranken stellen physiologische Barrieren dar, die empfindliche Gewebe vor Xenobiotika schützen. Diese Barrieren können einen Einfluss auf die Verteilung von Medikamenten haben.

Versuche mit mdr1a- bzw. mdr1a/b-Knockout-Mäusen demonstrieren die Funktion des P- Glykoproteins in Endothelzellen der Gehirnkapillaren als wichtiger Bestandteil der Blut-Hirn- Schranke. Als Efflux-Pumpe verhindert das P-Glykoprotein die Akkumulation seiner Substrate, wie z.B. Ivermectin, im Gehirn (SCHINKEL et al. 1994; SCHINKEL et al. 1995b). Dies führt zu einer Ivermectin-induzierten Neurotoxizität, welche letal endet (SCHINKEL et al. 1994).

Eine ähnliche Ivermectin Sensitivität wie bei mdr1a-Knockout-Mäusen wird auch bei einer Subpopulation von Collie-Hunden beobachtet (PULLIAM 1985; PAUL et al. 1987). Die letale Dosis bei diesen Hunden liegt mit 0,4 mg/kg um ein vielfaches niedriger als die bei anderen Hunden (bis zu 80 mg/kg) (PULLIAM 1985). Bei Hunden, die eine erhöhte Sensitivität gegenüber Ivermectin zeigen, ist eine Deletionsmutation des MDR-1-Gens vorhanden (MEALEY et al. 2001). Diese Deletionsmutation erzeugt mehrere Stopp-Kodons und beendet somit die P-gp-Synthese frühzeitig. Das resultierende P-Glykoprotein ist nicht funktionsfähig.

Bei Hunden, die für diese Deletion homozygot sind, treten unerwünschte neurologische Arzneimittelwirkungen schon nach der einmaligen Verabreichung von 100 µg/kg Ivermectin auf (MEALEY et al. 2001). Eine ähnliche Anfälligkeit wird auch gegenüber anderen Avermectinen wie zum Beispiel Milbemycin, Selamectin und Moxidectin bei solchen Hunden beobachtet (TRANQUILLI et al. 1991).

2.3.6.3 Metabolismus

Das P-Glykoprotein kann eine Rolle im intestinalen Metabolismus seiner Substrate spielen, auch wenn es selbst keine intrinsische metabolische Funktion besitzt. Die Cytochrom P450 3A- Subfamilie (CYP 3A) besitzt wichtige Enzyme des Phase I-Metabolismus (PATEL u. MITRA 2001; ZHANG u. BENET 2001). Das CYP 3A und P-gp werden auch beim Pferd auf den Villi der Enterozyten in hohen Mengen exprimiert (TYDEN et al. 2004; TYDEN et al. 2009). Hier

können beide Proteine an der oralen Absorption ihrer Substrate beteiligt sein (MEALEY 2004).

Nachdem das Substrat in dem Magen-Darm-Trakt mittels passiver Prozesse in den Enterozyt aufgenommen wird, kann es durch CYP 3A metabolisiert werden oder durch das P-gp zurück ins Darmlumen transportiert und in weiter distal gelegenen Enterozyten wiederaufgenommen werden und dem CYP 3A erneut ausgesetzt werden (ZHANG u. BENET 2001).

Substanzen, die nicht P-gp Substrate sind, passieren den Enterozyt nur einmal, während P-gp Substrate kontinuierlich zwischen dem Enterozyt und dem Darmlumen transportiert werden können. Durch diesen Vorgang werden die Substrate dem CYP 3A mehrmals ausgesetzt. Die Beteiligung von P-gp und CYP 3A an der oralen Absorption ist nicht immer eindeutig, da viele Arzneimittel Substrate für P-gp und CYP 3A sind (MEALEY 2004).

Eine Studie an Ratten demonstriert die Effekte von P-Glykoprotein auf den intestinalen Metabolismus in vivo. Der intestinale first-pass Metabolismus von Indinavir beträgt 6 % bei den Kontrolltieren, während er bei Ratten die mit Dexamethason vorbehandelt sind, 34 % beträgt (LIN et al. 1999b). Die Vorbehandlung mit Dexamethason (40 mg/kg oral über drei Tage) führt zu einer zweieinhalbfachen Zunahme des intestinalen Proteingehalts von CYP3A und P- Glykoprotein. Da die sechsfache Zunahme des intestinalen first-pass Metabolismus nicht durch die zweieinhalbfache Zunahme von CYP3A alleine erklärt werden kann, liegt diese Zunahme des intestinalen first-pass-Metabolismus an einer Kombination von erhöhtem intestinalen CYP 3A- und P-Glykoprotein-Gehalt. Hiermit kann die Rolle von P-Glykoprotein an dem intestinalen first-pass Metabolismus in vivo belegt werden (LIN et al. 1999b). Durch eine Sättigung des Transporters nimmt der Einfluss dieses Proteins bei einer hohen Dosierung des Substrates ab (LIN et al. 1999a).

2.3.6.4 Exkretion

Die Lokalisation des P-Glykoproteins auf den Tubuluszellen der Niere und den kanalikulären Zellen der Leber weist auf die Funktion dieses Proteins in der Exkretion von Arzneimitteln hin (TYDEN et al. 2009). Die gleichzeitige Gabe des P-gp-Inhibitors Erythromycin und des P-gp-Substrates Doxorubicin verringert die biliäre und renale Doxorubicin-Clearance bei Ratten (KISO et al. 2000). Ebenso führt die gleichzeitige Verabreichung eines P-gp-Inhibitors und der

P-gp-Substrate Digoxin und Vincristin zu der reduzierten Clearance beider Substrate (SONG et al. 1999).

Zu den Exkretionsorganen zählt auch der Darm. Hier kann das P-Glykoprotein einen Einfluss auf die Exkretion seiner Substrate haben. Die intestinale Exkretion von Ivermectin ist bei mdr1a-Wildtyp-Mäusen höher als bei mdr1a-defizienten Mäusen (KWEI et al. 1999). Durch die Hemmung der jejunalen Ivermectin-Exkretion mittels des P-Glykoprotein-Hemmers Verapamil um 30 % kann die Beteiligung von P-Glykoprotein bei der jejunalen Elimination von Ivermectin nachgewiesen werden (LAFFONT et al. 2002). Das Ausbleiben einer Hemmung der biliären, duodenalen, und ilealen Ivermectin-Elimination durch Verapamil bei den gleichen Tieren deutet auf die Mitwirkung von anderen Efflux-Mechanismen in der Sekretion von Ivermectin hin (LAFFONT et al. 2002).

2.3.7 Bedeutung des P-Glykoproteins für die Pharmakokinetik

Obwohl gezeigt wird, dass P-Glykoprotein an der intestinalen Absorption seiner Substrate beteiligt sein kann, stellen die Ergebnisse aus anderen Studien die Rolle des P-Glykoproteins bei diesem Vorgang in Frage.

Wie schon in 2.3.6.1 erwähnt, liegt die Blutkonzentration von Ivermectin bei mdr1a-Knockout- Mäusen bis zu dreifach höher als bei Wildtyp-Mäusen. Dagegen unterscheiden sich die Gehirnkonzentrationen von Ivermectin um das 70 fache. Weiterhin führt die gleichzeitige Verabreichung des P-gp-Substrats und -Inhibitors Verapamil zu einer dreifachen Zunahme der Gehirnkonzentration von Ivermectin, ohne dass Unterschiede in der Blutkonzentration dieses makrozyklischen Laktones zu sehen sind (KWEI et al. 1999). Ein ähnlicher Unterschied in der Gehirnkonzentration von Ivermectin zwischen mdr1ab-Knockout- und mdr1ab-Wildtyp- Mäusen wird von GEYER et al. (2009) demonstriert. Doch die maximale erreichte Plasmakonzentration von Ivermectin sowie weitere pharmakokinetische Parameter wie die AUC und die orale Bioverfügbarkeit unterscheiden sich nicht signifikant zwischen den untersuchten mdr1ab-Knockout- und Wildtyp-Mäusen. Die Autoren kommen zum Schluss, dass der Funktionsverlust von P-Glykoprotein in vivo für den Medikamententransport an der Blut-Hirn-Schranke die größte Bedeutung hat (GEYER et al. 2009).

Bei Hunden führt eine Mutation in dem MDR-1-Gen zu einem funktionsunfähigen P-Glykoprotein (MEALEY et al. 2001). Eine Studie zu der oralen Bioverfügbarkeit der P-gp Substrate Loperamid, Nelfinavir, Cyclosporin und Quinidin bei Hunden mit der MDR-1- Mutation und normalen Hunden zeigt keine signifikante Unterschiede für verschiedene pharmakokinetische Parameter. Bei den mutationstragenden Hunden sind aufgrund des funktionsunfähigen P-gp höhere Werte für die maximale erreichte Plasmakonzentration (Cmax), Fläche unter der Kurve (AUC) und orale Bioverfügbarkeit zu erwarten. Diese Unterschiede sind aber nicht zu beobachten; bei Loperamid zeigt sich sogar eine umgekehrte Tendenz, die Wildtyp-Hunde tendieren zu höheren Plasmakonzentrationen als die mutationstragenden Hunde (MEALEY et al. 2010). Die Ergebnisse dieser Studie stellen die Rolle des P-gp bei der oralen Absorption seiner Substrate in Frage. Die Autoren warnen vor der voreiligen Schlussfolgerung, dass P-gp nur eine minimale Rolle in der oralen Absorption seiner Substrate spielt. Anhand der überlappenden Gewebeverteilung und Substratspezifität von CYP 3A und P-gp (PATEL u.

MITRA 2001) können die durch P-gp verursachten Effekte durch größere Einflüsse von CYP 3A teilweise oder komplett maskiert werden (MEALEY et al. 2010).

Zweitens kann die im Darm vorhandene Arzneistoffkonzentration zu einer P-gp-Sättigung führen. Die Autoren wiederholen deshalb die Studie mit drei unterschiedlichen Dosen für Quinidin. Die klinische eingesetzte Dosis von 4 mg/kg führt zu keinen Unterschieden in der oralen Bioverfügbarkeit der zwei Hundegruppen. Auch bei einer bis zu zehnfach niedrigeren Dosis (0,5 und 0,1 mg/kg) sind keine signifikante Unterschiede in dem Mittelwert der oralen Bioverfügbarkeit der beiden Gruppen zu beobachten (MEALEY et al. 2010).

Beim Pferd führt die orale Applikation von dem P-Glykoprotein-Substrat- und –Inhibitor Ivermectin (0,2 mg/kg) 1,5 Stunden vor der oralen Cetirizin-Gabe (0,2 mg/kg) zu keinen Änderungen pharmakokinetischer Parameter des Antihistaminikums. Erfolgte die Vorbehandlung mit Ivermectin jedoch 12 Stunden vor der Cetirizin-Applikation, so führt dies zu einer Zunahme der AUC um 60 % sowie zu erhöhten maximal erreichten Plasmakonzentrationen, Cmax, zu einer erhöhten terminalen Halbwertszeit, t½β , und zu einer erhöhten mittleren Verweilzeit, MRT, für Cetirizin (OLSEN et al. 2007). Die Autoren erklären diese Ergebnisse durch die Fähigkeit von Ivermectin, das P-Glykoprotein zu hemmen. Die Hemmung des renalen P-Glykoproteins führt zu einer Abnahme der renalen Exkretion von

Cetirizin und die Hemmung des intestinalen P-Glykoproteins führt zu einer erhöhten Cetirizin Aufnahme aus dem Darm (OLSEN et al. 2007). In einer zweiten Studie führt die Vorbehandlung mit Ivermectin (0,2 mg/kg) zu umgekehrten Veränderungen in der Pharmakokinetik von dem Antihistaminikum und P-gp-Substrat Fexofenadin (OLSEN et al.

2006). Die Bioverfügbarkeit von Fexofenadin und die AUC sind nach der Ivermectin Vorbehandlung herabgesetzt (OLSEN et al. 2006). Da Fexofenadin auch ein Substrat für die OATP intestinale Influx-Pumpe ist, werden die Ergebnisse dieser Studie von OLSEN et al.

(2006) durch eine eventuelle Ivermectin-vermittelte Inhibition von OATP (Organic anion- transporting polypeptide) erklärt.

Das intestinale P-Glykoprotein scheint eine größere Rolle bei der Absorption zu spielen, wenn eine kleine orale Dosis verabreicht wird oder wenn eine sehr langsame Diffusionsrate vorliegt.

Der Grund hierfür ist die Saturation der P-gp-Transportaktivität bei hohen Konzentrationen des Medikamentes im intestinalen Lumen (LIN u. YAMAZAKI 2003). Ergebnisse von Tierversuchen zeigen, dass die P-Glykoprotein-Hemmung immer einen größeren Einfluss auf die Gewebeverteilung, vor allem in Hinsicht auf die Anreicherung im Gehirn, als auf die Plasmakonzentrationen hat (LIN u. YAMAZAKI 2003).

2.3.8 Weitere ABC-Transporter

Die Transporter MRP 1, 2, 3 (Multidrug Resistance Assoziierte Proteine 1, 2 und 3, kodiert durch ABCC1, 2, und 3) sowie das BCRP (Breast Cancer Resistance Protein, kodiert durch das ABCG2) sind weitere Mitglieder der ABC-Transporter-Superfamilie. Die Multidrug- Resistance-Proteine besitzen eine überlappende Funktion als Efflux-Pumpen (LAUTIER et al.

1996; BORST et al. 1999). Die zelluläre Lokalisation dieser Proteine ist in Abbildung 2.4 schematisch dargestellt. Bei Ratten wird das MRP1 ubiquitär exprimiert, während die Expression von MRP 2 und 3 auf das Epithel der Niere, des Darms, und der Leber beschränkt ist (CHANG et al. 2004). MRP2 ist auf apikalen Membranen lokalisiert (BUCHLER et al.

1996), während MRP1 und 3 sich auf der basolateralen Membran befinden (CHANG et al.

2004). Es kann gezeigt werden, dass MRP2 zusammen mit dem P-Glykoprotein an der intestinalen Sekretion von dem Fluorchinolon Antibiotikum Grepafloxacin bei humanen Caco-2

Zellen Monolayer (YAMAGUCHI et al. 2000; LOWES u. SIMMONS 2002) und bei Ratten (NARUHASHI et al. 2001, 2002) beteiligt ist.

Das BCRP zeigt eine hohe Expression in der Plazenta, während eine niedrigere Expression in der Milchdrüse, im Ovar, im Dünndarm, im Kolon und in der Leber beobachtet wird (ALLIKMETS et al. 1998; MALIEPAARD et al. 2001). Dieses Protein wird auf der apikalen Membran des Dünndarm- und Kolonepithels exprimiert sowie auf der kanalikulären Membran von Hepatozyten (MALIEPAARD et al. 2001). Das BCRP vermittelt den sekretorischen Transport von Substraten in Zelllinien mammären und gastrointestinalen Ursprungs (ROSS et al. 1999). Weiterhin kann gezeigt werden, dass dieses Protein einen großen Einfluss auf die orale Bioverfügbarkeit des Zytostatikums Topotectan hat (JONKER et al. 2000).

Abb. 2.4: Die zelluläre Lokalisation von ABC Efflux Transportern im Enterozyt. (modifiziert nach CUSTODIO et al., 2008). P-Glykoprotein (Pgp), Multidrug Resistenz Assoziierte Proteine (MRP) und Breast Cancer Resistance Protein (BCRP).

2.3.8.1 Weitere ABC-Transporter beim Pferd

Beim Pferd kann das BCRP auf der apikalen Oberfläche von Enterozyten im Duodenum, Jejunum und Ileum nachgewiesen werden. Weiterhin wird das BCRP vorwiegend auf der apikalen, weniger auf der basolateralen Membran der interlobulären Gallengänge der Leber exprimiert. In der Niere wird eine starke BCRP-Expression auf den luminalen aber auch auf den basalen und interzellulären Membranen der Zellen der Henle’schen Schleife beobachtet. Im

distalen Tubulus der Niere befindet sich das BCRP vorwiegend auf der luminalen Membran (TYDEN et al. 2010).

Das MRP2 wird auf der apikalen Oberfläche von Enterozyten im Duodenum, Jejunum, und Ileum exprimiert. In der Leber kann das MRP2 auf der apikalen Zellmembran der interlobulären Gallengänge dargestellt werden. In der Niere wird dieses Protein vor allem auf den luminalen und basalen Zellmembranen der Henle’schen Schleife und des distalen Tubulus exprimiert (TYDEN et al. 2010).

Das MRP1 kann im Zytoplasma, apikal der Zellkerne, in Enterozyten des Zäkums und Kolons nachgewiesen werden. Dieses Protein kann in der Leber und in der Niere immunhistochemisch nicht nachgewiesen werden (TYDEN et al. 2010).

2.4 Ivermectin als Substrat für das P-Glykoprotein

Ivermectin ist ein Derivat des Fermentationsprodukts des Strahlenpilzes Streptomyces avermitilis, Avermectin B₁. Das makrozyklische Lakton besteht aus mindestens 80 % 22,23- dihydroavermectin B₁a und aus nicht mehr als 20 % 22,23-dihydroavermectin B₁b (Abb. 2.5) Beide Homologe weisen die gleiche antiparasitische Wirkung auf (CAMPBELL 1985).

Abb. 2.5: Struktur von 22,23-dihydroavermectin B₁a, der Hauptbestandteil von Ivermectin (nach CAMPBELL 1995).

Die Molmasse des B1a-Bestandteiles beträgt 874, während die des B1b-Bestandteiles bei 860 liegt. Ivermectin ist sehr lipophil und löst sich sehr gut in organischen Lösungsmitteln, nicht jedoch in Wasser (CAMPBELL 1993).

Das breite Wirkspektrum von Ivermectin umfasst Adulte und Larven vieler Nematoden sowie viele Ektoparasiten (CAMPBELL u. BENZ 1984). Die antiparasitische Aktivität von Ivermectin beruht auf der Fähigkeit, an Glutamat gesteuerte Chloridkanäle, die bei Insekten und Nematoden aber nicht bei Wirbeltieren vorkommen, zu binden. Dies führt zu einem erhöhten Einstrom von Chloridionen in die Zelle mit der Folge einer Hyperpolarisation und Elimination der Signaltransmission (CULLY et al. 1994). Die neurotoxische Wirkung von makrozyklischen Laktonen wird durch die Bindung an GABA gesteuerte Chloridkanäle hervorgerufen (SIGEL u.

BAUR 1987). Der Zugang von Ivermectin zum Säugetier ZNS und damit zu den GABA gesteuerten Chlorid-Kanäle ist durch die Blut-Hirn-Schranke limitiert (CAMPBELL et al.

1983). Studien an mdr1a-Knockout-Mäusen zeigen, dass das P-Glykoprotein für den aktiven Efflux von diesem makrozyklischen Lakton aus dem Gehirn verantwortlich ist (SCHINKEL et al. 1994). Bei Collies und verwandten Hunderassen wird eine durch Ivermectin ausgelöste Neurotoxizität beobachtet (PULLIAM 1985), die durch eine Mutation in dem MDR-1 Gen und

daraus folgenden Verlust der P-Glykoprotein Funktion erklärt werden kann (MEALEY et al.

2001).

Obwohl Ivermectin die höchste Affinität zum P-Glykoprotein zeigt, kann anhand von Untersuchungen in Zellkulturen gezeigt werden, dass Ivermectin auch zu den Multidrug Resistance Proteinen MRP 1, 2 und 3 eine Affinität aufweist und somit auch von diesen Proteinen transportiert werden kann (LESPINE et al. 2006). Die Affinität von Ivermectin zum MRP1 ist stärker als die zu MRP2 und MRP3 (LESPINE et al. 2006).

Ivermectin ist nicht nur ein Substrat, sondern auch ein potenter Inhibitor von P-Glykoprotein.

Die Inhibition des P-gps vermittelten Rho123-Efflux durch Ivermectin ist der vom Referenzinhibitor Valspodar gleich und weitgehend stärker als die durch den Referenzinhibitor Verapamil verursachte Inhibition (LESPINE et al. 2007).

Die Interaktion von Ivermectin mit dem ABCG2 scheint speziesspezifisch zu sein, da es bovines (MERINO et al. 2009) und humanes ABCG2 (JANI et al. 2010) aber nicht murines BCRP hemmen kann (MUENSTER et al. 2008). Das Breast Cancer Resistance Protein scheint bei der Penetration von Ivermectin durch die Blut-Hirn-Schranke bei bcrp-Knockout-Mäusen keine Rolle zu spielen (GEYER et al. 2009).

Obwohl Ivermectin eine große therapeutische Breite besitzt, wird bei Collies und verwandten Hunderassen eine Ivermectin verursachte Neurotoxizität beobachtet (PULLIAM 1985). Die Ivermectin-Gehirnkonzentrationen bei zwei Collies, die eine Neurotoxizität zeigen, liegt bei 52 und 134 µg/kg (PULLIAM 1985).

Eine Ivermectin-Vergiftung bei Pferden wird nur selten beschrieben. In den meisten Fällen handelt es sich um junge Equiden, die eine Überdosierung des Antiparasitikums bekommen (GODBER et al. 1995; PLUMMER et al. 2006). SWOR et al. (2009) beschreibt einen Fall einer Ivermectin-Vergiftung bei drei adulten Pferden der Rasse Quarter Horse. Die Pferde zeigen nach der oralen Applikation von Ivermectin Hypersalivation, Berührungs- und Geräuschhypersensitivität sowie bilaterale Mydriasis. Ein Pferd zeigt zusätzlich Zittern, Muskelfaszikulationen und Kopfpressen und stirbt trotz Behandlung. Die Gehirnkonzentration von Ivermectin bei diesem Pferd beträgt 131 µg/kg und liegt somit im ähnlichen Bereich wie

bei Collies die eine Ivermectin-induzierte Neurotoxizität zeigen (PULLIAM 1985; SWOR et al.

2009). Die Autoren führen dies auf eine Schädigung der Blut-Hirn-Schranke zurück (SWOR et al. 2009). In einem ähnlichen Fall führt die orale Ivermectin-Behandlung bei 8 von 14 behandelten Pferden zu ähnlichen neurotoxischen Symptomen. Die betroffenen Pferde haben im Gegensatz zu den nicht betroffenen Pferden Heu gefressen, welches mit Solanum eleagnifolium kontaminiert war. Zwei der acht betroffenen Pferde sterben und weisen Ivermectin-Gehirnkonzentrationen von 115 und 672 µg/kg auf (GARLAND 1998).

Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Rolle des MDR-1-Gens in der Pharmakokinetik von dem P-gp-Substrat Ivermectin untersucht werden. Mit Hilfe dieser Untersuchung sollte überprüft werden, ob anhand der Expression dieses Gens in einem einfach zugänglichen Gewebe, prädikative Aussagen über das pharmakokinetische Verhalten von P-gp-Substraten beim Pferd möglich sind.

3 Material und Methoden

3.1 Versuchsziel

Das Ziel der eigenen Untersuchung war es zu überprüfen, ob die Kenntnis der MDR-1-Genexpression prädikative Aussagen über das pharmakokinetische Verhalten eines P-Glykoprotein-Substrates ermöglicht. Zuerst wurde daher bei sieben Pferden eine mögliche Korrelation zwischen der MDR-1-Genexpression in Haarfollikelzellen und der MDR-1- Genexpression in der Leber überprüft. Anschließend wurde die relative MDR -1-Genexpression in Haarfollikelzellen von 49 Pferden molekularbiologisch bestimmt. Sechs Pferde wurden aufgrund ihrer hohen relativen MDR-1-Genexpression und fünf andere Pferde aufgrund ihrer niedrigen relativen MDR-1-Genexpression in entsprechenden Gruppen eingeteilt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde mit diesen 11 Pferden eine pharmakokinetische Studie unter Verwendung des P-Glykoprotein-Substrates Ivermectin durchgeführt.

3.2 Überprüfung des Zusammenhangs zwischen der MDR-1- Genexpression in der Leber und in Haarfollikelzellen

Der Zugang zu inneren Organen ist beim lebenden Pferd begrenzt. Daher sollte überprüft werden, ob einen Zusammenhang zwischen der MDR-1-Genexpression in diesen Organe mit der in einem von außen einfach zugänglichen Gewebe besteht. Untersuchungen beim Pferd zeigen, dass die MDR-1-Genexpression in der Leber relativ stabil ist, während diese im Darm sich regional deutlich unterscheidet (TYDEN et al. 2009). Daher sollte die MDR-1- Genexpression in der Leber untersucht werden. Da die Expression des MDR-1-Gens in muriner und humaner Haut nachgewiesen ist (LI et al. 2006) und aufgrund ihrer einfachen Gewinnung, wurden Haarfollikelzellen als das von außen einfach zugängliche Gewebe gewählt. Um den Zusammenhang zwischen der MDR-1-Genexpression in der Leber und in Haarfollikelzellen zu überprüfen, wurden Leberproben und Haarfollikelzellen von sieben Schlachtpferden (s. Tabelle 3.1) auf die MDR-1-Genexpression untersucht.

Tab. 3.1: Rasse, Geschlecht und Alter der Schlachtpferde a bis g

Pferde Bezeichnung Rasse Geschlecht Alter [Jahre]

a Haflinger Wallach 12

b Deutsches Reitpony Stute 16

c Warmblut Wallach 4

d Warmblut Wallach 26

e Kaltblut Stute 7

f Warmblut Wallach 15

g Warmblut Wallach >10

3.2.1 Probenentnahme und –Lagerung

Von jedem Pferd wurden Lebergewebe-Proben und Haarfollikelzellen unmittelbar nach der Schlachtung gewonnen. Die Haarfollikelzellen konnten durch Herausziehen der Haare von der Mähnenregion gewonnen werden. Die Proben wurde in ein mit 1,5 ml RNAlater RNA Stabilization Reagent (Qiagen®) gefülltes, Reaktionsgefäß überführt und bei 4 °C gelagert.

3.2.2 Probenaufbereitung

Die Probenaufbereitung beinhaltete die RNA-Exktraktion und die anschließende Umschreibung der gewonnenen RNA zu cDNA.

3.2.2.1 RNA-Extraktion

Die RNA-Extraktion erfolgte mit dem Rneasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen®). Der Haarprobe wurden 1 ml QIAzol Lysis Puffer (Qiagen®) und eine Edelstahl Kugel in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß zugesetzt und in dem TissueLyser (Qiagen®) bei 20 Hz für 10 min zerkleinert und homogenisiert. Die Silikat-Gel-Membranen in den Säulen des Rneasy Lipid Tissue Kit bilden eine RNA-bindende Matrix. Das gesamte Homogenat (ca. 1 ml) wurde mit 200 µl Chloroform versetzt und für 15 s kräftig durchmischt. Nach 3 min Ruhen bei Raumtemperatur wurde die Probe bei 12000 x g und 4 °C für 15 min zentrifugiert. Nach diesem Zentrifugationsschritt bildeten sich drei Phasen im Reaktionsgefäß: eine obere farblose,

wässrige Phase, die die RNA enthält (ca. 600 µl), eine weiße Interphase und eine untere rote, organische Phase. Die obere Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Nach Fällung der RNA durch Zugabe von 1 Volumen 70 %igen Ethanols wurde das Reaktionsgemisch auf eine Säule aufgetragen und für 15 s bei 8000 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen.

Als nächstes erfolgte eine On-Column DNase Digestion um das Kontaminationsrisiko durch genomische DNA zu vermeiden. Dies erfolgte mittels des RNase-Free DNase Set (Qiagen®).

Hierzu wurden 10 µl der DNase I Stock Solution und 70 µl des RDD Puffers für 15 min auf die Säule gegeben. Danach wurde die Säule mit 350 µl Puffer RW1 überschichtet und erneut für 15 s bei 8000 x g zentrifugiert. Anschließend erfolgten zwei Waschschritte mit je 500 µl Ethanolwaschpuffer RPE, wobei nach dem ersten Zentrifugationsschritt (15 s) und dem Verwerfen des Eluates ein zweiter Waschschritt und eine weitere Zentrifugation (2 min) erfolgte. Die Säule wurde danach in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Nach Zugabe von 30 µl RNase freiem H₂O auf die Säule erfolgte ein Zentrifugationsschritt bei 8000 x g für 1 min Dieser Schritt wurde wiederholt um auf ein gesamtes Endvolumen von 60 µl zu kommen.

Die im Eluat gewonnene RNA wurde bei -80 °C gelagert oder bei sofortiger Weiterverwendung auf Eis gelagert.

3.2.2.2 cDNA-Synthese

Zur cDNA Synthese wurde das kommerziell erhältliche Maxima® First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR (Fermentas®) verwendet. 1 µg der gewonnenen RNA wurde zusammen mit 4 µl 5x Reaction Mix und 2 µl Maxima® Enzyme Mix in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert.

Nuklease-freies Wasser wurde, um auf ein Gesamtvolumen von 20 µl zu kommen, dazu gegeben (Tab. 3.2). Nach einer initialen Inkubation für 10 min bei 25 °C erfolgte die cDNA Synthese für 30 min bei 50 °C. Danach wurde die Reaktion durch 5 min bei 85 °C beendet (Tab 3.3).

Tab. 3.2: Reaktionsgemisch für die cDNA Synthese Reaktionssubstrate Volumen

5x Reaction Mix 4 µl

Maxima® Enzyme Mix 2 µl

RNA 1 µg

Nuklease freies Wasser ad 20 µl

Tab. 3.3: Reaktionsschritte bei der cDNA Synthese Reaktionsschritt Temperatur Zeit

Inkubation 25 °C 10 min

Synthese 50 °C 30 min

Termination 85 °C 5 min

3.2.3 Real-Time qPCR

Für die Untersuchung der relativen Genexpression wurde die quantitative Real-Time PCR (qPCR) eingesetzt. Somit konnte die Genexpression von equinem MDR1 relativ zu dem equinen GAPDH gemessen werden. Das GAPDH Gen wurde als endogene Kontrolle (housekeeping gene) gewählt, da es eine stabile Expression in verschiedenen Geweben beim Pferd zeigt (LINARDI 2010; TYDEN et al. 2010).

3.2.3.1 Primer- und Sondendesign

Die Primer wurden mit Hilfe der Primer3 Software (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) ausgewählt. Die Sonden wurden mit Hilfe der Software ABI PRISM® Primer Express (Applied Biosystems) ausgewählt.

Tab. 3.4: Primer und Sonden für die Quantifizierung von GAPDH und MDR-1. fwd:

Vorwärtsprimer, rev: Rückwärtsprimer

Name Sequenz Länge Fragmengröße

GAPDH-fwd 5'-GGC TGC TTT TAA CTC TGG CAA A -3' 22 bp 126bp GAPDH-rev 5'-GCC TTG ACT GTG CCA TGG A-3' 19 bp

GAPDH- sonde

5'-ACA TGG TCT ACA TGT TTC AGT-3' 21 bp

MDR1-fwd 5'-TCT TTG ACT CGG GAG CAG AAG-3' 21 bp 116bp MDR1-rev 5'-GCC TGG GTG ATG GAA AAC G-3' 19 bp

MDR1-sonde 5'-TGC AGG TCC CAT ATA GA-3' 17 bp

Die mRNA-Sequenzen wurden der Genbank entnommen (equines MDR-1-Gen: Genbank-Nr;

XM_001492023.2; equines GAPDH-Gen: Genbank-Nr. NM_001163856.1). Die Quantifizierung des MDR1 Gens erfolgte mit einem Vorwärts Primer in Exon 24 (5’-TCT TTG ACT CGG GAG CAG AAG-3’) und einem Rückwärts Primer in Exon 25 (5’-GCC TGG GTG ATG GAA AAC G-3’), die ein 116 bp großes Produkt produzierten. Dieses wurde von einer VIC-markierten TaqMan minor groove binding (MGB) Sonde (Applied Biosystems, Darmstadt), an der Grenze von Exon 24 zu Exon 25 (5’-TGC AGG TCC CAT ATA GA-3’) gebunden. Das equine GAPDH Gen wurde als endogene Kontrolle eingesetzt. Die Quantifizierung dieses Gens erfolgte mit einem Vorwärts Primer in Exon 3 (5’- GGC TGC TTT TAA CTC TGG CAA A-3’) und einem Rückwärts Primer in Exon 4 (5’- GCC TTG ACT GTG CCA TGG A- 3’), die ein 126 bp großes Produkt herstellten. Diese wurde von einer FAM- markierten TaqMan MGB Sonde (Applied Biosystems) an der Grenze von Exon 3 zu Exon 4 (5’- ACA TGG TCT ACA TGT TTC AGT- 3’) gebunden.

3.2.3.2 Herstellung von Standards für die qPCR

Die Effizienz der Real-Time qPCR wurde mithilfe von hergestellten Standards bestimmt. Um genaue und reproduzierbare Ergebnisse bei der qPCR zu erzielen, soll die Effizienz der Reaktion nahezu 100 % sein. Eine Effizienz von 100 % bedeutet, dass die Anzahl an PCR Produkten sich bei jedem Zyklus verdoppelt. Diese Tatsache ist für die Analyse der relativen Genexpression mittels der 2^-ΔΔCT Methode essentiell (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001). Die Standards für die qPCR wurden nach der im Anhang 9.1 beschriebenen Methode hergestellt.

3.2.3.3 Durchführung der Real-Time qPCR

Die Real-Time qPCR wurde in einem 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Darmstadt) durchgeführt. Zusätzlich zur Expression des MDR-1-Gens wurde in jedem Lauf die Expression des Housekeeping-Gens GAPDH in den Proben gemessen.

Um die PCR-Effizienz zu überprüfen, wurde in jedem PCR-Lauf Standardverdünnungsreihen für das MDR-1-Gen und für das GAPDH-Gen mitgeführt (1:10⁴ bis 1:10⁶ Verdünnung). Die Proben und die Negativkontrollen wurden in Dreifach-Ansätzen gemessen.

Für die qPCR kam ein kommerziell erhältliches Kit zum Einsatz (2x SensiMix™ Probe Kit, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen). Die Herstellung des Master-Mix und die Zugabe der cDNA erfolgten in einem speziellen, nur dafür vorgesehenen Raum. Jeder 20 µl Reaktionsansatz bestand aus 10 µl 2x Sensimix, 1,8 µl Vorwärts Primer (10 µM), 1,8 µl Rückwärts Primer (10 µM), 0,4 µl Sonde (10 µM), 3,75 µl Rnase freies Wasser, 0,25 µl ROX Standard und 2 µl der cDNA bzw. weitere 2 µl Rnase freies Wasser bei den Negativkontrollen (Tab. 3.5).

Tab. 3.5: Mastermix Reaktionsansatz je Probe für die qPCR Reaktionssubstrate Volumen

2x SensiMix 10,0 µl

Vorwärts Primer (10µM) 1,8 µl Rückwärts Primer (10µM) 1,8 µl

Sonde (10µM) 0,4 µl

Rnase freies Wasser 3,75 µl

ROX Std. 0,25 µl

cDNA 2,0 µl

Gesamtvolumen 20,0 µl

Der Mastermix wurde in ein Well einer MicroAmp™ Optical 96-Well Reaction Plate (Applied Biosystems) pipettiert, in der die cDNA bzw. Rnase freies Wasser bei den Negativkontrollen schon zugesetzt worden sind. Die Platte wurde anschließend mit einem MicroAmp™ Optical Adhesive Film Kit (Applied Biosystems) verschlossen und in das qPCR Gerät überführt.

Nach einem initialen Polymerase Aktivierungsschritt von 10 min bei 95 °C folgten 40 Zyklen mit 10 s bei 95 °C und 60 s bei 58 °C, in denen die Information zu der Reaktion erfasst wurde (Tab. 3.6).

Tab. 3.6: Temperaturschema der qPCR

Prozess Temperatur

(°C)

Zeit Aktivierung der Polymerase 95 10 min

in nachfolgenden 40 Zyklen:

Denaturierung 95 10 s

Anlagerung und Elongation 58 60 s

3.2.3.4 Auswertung der Real-Time qPCR

Die Auswertung erfolgte mit der für das Gerät zugehörigen Software (Applied Biosystems 7300 SDS Software).

Die Erstellung der Baseline (Grundlinie) erfolgte Software-gesteuert. Der Quotient aus der Emissionsintensität des Reporter-Farbstoffes und der Emissionsintensität der passiven Referenzfarbstoffes ROX wird als Rn bezeichnet. Den ΔRn-Wert erhält man durch die Subtraktion der Hintergrundaktivität von dem Rn-Wert jedes Zyklus. Der Threshold (Schwellenwert) ist das Fluoreszenzsignal, das eine statistisch signifikante Zunahme gegenüber der Baseline zeigt. Dieser erfolgte ebenfalls Software-gesteuert. Dieser Schwellenwert liegt ca.

eine Zehnerpotenz oberhalb der Hintergrundaktivität und im linearen Bereich der Fluoreszenzkurve. Für jeden Ansatz wurde der Threshold-Cycle (C_t-Wert) ermittelt. Dieser Wert gibt die Zykluszahl an, bei der der ΔRn-Wert den Schwellenwert übersteigt. Wenn man von einer PCR Effizienz von 100 % ausgeht, bedeutet die Erhöhung des C_t-Wertes um eins eine Verdopplung der vorhandenen Kopienzahl der DNA (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001).

Zunächst wurde der ΔCt Wert für die Proben nach folgender Formel berechnet:

ΔCt= C_{t MDR-1}-C_{t GAPDH} [Gl. 3.1]

Anschließend konnte die relative MDR-1-Genexpression in den Haarfollikelzellen und in der Leber mithilfe der 2^-ΔCt Methode berechnet werden. Die MDR-1-Genexpression relativ zu der GAPDH-Genexpression in einer Probe entspricht 2^-ΔCt.

3.3 Hauptversuch

Der Hauptversuch bestand aus zwei Teilen. Nach der Messung der relativen MDR-1- Genexpression in Haarfollikelzellen mittels molekularbiologischen Methoden bei 49 Pferden wurde eine pharmakokinetische Studie bei den sechs Pferden mit der höchsten und bei den fünf Pferden mit der niedrigsten relativen MDR-1 Expression durchgeführt.

3.3.1 Versuchstiere

Die Pferde wurden im WDT-Serumwerk in Memsen, Hoyerhagen, gehalten. Als Stall diente ein großer Boxenlaufstall mit einzelnen Futterplätzen sowie Einzelboxen. Über Tag bewegten sich die Pferde auf einem angrenzenden Paddock.

Bei den insgesamt 49 Warmblut Pferden handelt es sich um 27 Stuten und 22 Wallache im Alter von sechs bis zwanzig Jahren. Alter und Geschlecht der einzelnen Tiere sind Tabelle 3.7 zu entnehmen.

Tab. 3.7: Alter und Geschlecht der Versuchspferde

Pferd Alter Geschlecht Pferd Alter Geschlecht

1 19 Wallach 26 14 Stute

2 19 Stute 27 12 Wallach

3 19 Stute 28 9 Wallach

4 17 Wallach 29 15 Stute

5 20 Wallach 30 12 Stute

6 16 Wallach 31 15 Stute

7 18 Stute 32 14 Wallach

8 17 Stute 33 16 Wallach

9 15 Stute 34 14 Wallach

10 14 Wallach 35 15 Stute

11 17 Wallach 36 13 Stute

12 17 Stute 37 11 Wallach

13 16 Stute 38 13 Stute

14 18 Wallach 39 8 Wallach

15 17 Stute 40 12 Stute

16 14 Stute 41 8 Wallach

17 18 Stute 42 7 Stute

18 18 Stute 43 12 Stute

19 15 Stute 44 9 Wallach

20 17 Wallach 45 6 Wallach

21 15 Stute 46 6 Wallach

22 13 Stute 47 8 Stute

23 17 Wallach 48 7 Stute

24 13 Stute 49 7 Wallach

25 15 Stute

3.3.2 Molekularbiologische Untersuchung

3.3.2.1 Probenentnahme und -lagerung

Bei jedem Pferd wurden Haarfollikelzellen von der Mähnenregion durch Herausziehen einiger Haare gewonnen. Diese wurden in ein mit 1,5 ml RNAlater RNA Stabilization Reagent gefülltes 2 ml-Reaktionsgefäß überführt und bei 4 °C gelagert. Die Proben wurden im Institut

für Tierzucht und Vererbungsforschung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover analysiert.

3.3.2.2 Probenaufbereitung

Die Probenaufbereitung, die aus der RNA-Extraktion und der cDNA Synthese bestand, erfolgte nach der in 3.2.2 beschriebenen Methode.

3.3.2.3 Real-Time qPCR

Die Real Time qPCR erfolgte nach der in 3.2.3 beschriebenen Methode.

3.3.2.4 Auswertung der Real-Time qPCR

Die relative MDR-1-Genexpression in den Haarfollikelzellen wurde mit Hilfe der 2^-ΔΔCt

Methode (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001) berechnet. Zunächst wurde der ΔCt Wert für die Proben nach Gleichung 3.1 berechnet. Anschließend konnte mittels des ΔCt-Wertes die Expression des MDR-1-Gens relativ zu der endogenen Kontrolle berechnet werden. Dies erfolgte mit der 2^-ΔC_t Methode (Gleichung 3.2).

Um die MDR-1-Genexpression der Pferde relativ zu dem Pferd mit niedrigster Expression zu berechnen, wurde die 2^-ΔΔC_t Methode eingesetzt.

Da ein hoher ΔC_t-Wert eine niedrige MDR-1-Genexpression darstellt, wurde das Pferd mit dem höchsten ΔCt-Wert als „normalizer“ in der folgenden Formel eingesetzt. Somit konnte die MDR-1-Genexpression bei den anderen Pferden relativ zu dem mit der niedrigsten MDR-1- Genexpression („normalizer“) berechnet werden.

]

"

"

) (

) [(

2^Ct  C_tMDR1C_tGAPDH Pferd n C_tMDR1C_tGAPDH Normalizer [Gl. 3.3]

3.3.3 Pharmakokinetische Untersuchung

Im zweiten Teil der Arbeit wurden die fünf Pferde mit der niedrigsten MDR-1-Genexpression und die sechs Pferde mit der höchsten MDR-1-Genexpression mit Ivermectin (Ivomec®-P, Merial) behandelt. Bei den insgesamt elf Pferden handelt es sich um zwei Wallache und neun Stuten der Warmblut Rasse im Alter von sieben bis achtzehn Jahren. Zu Versuchsbeginn sowie während des gesamten Versuchablaufes erwiesen sich alle Tiere als klinisch Gesund. Das Alter, Geschlecht und die Rasse der Tiere sind der Tabelle 3.8 zu entnehmen. Nach der Applikation dieses Arzneimittels wurden in regelmäßigen Zeitabständen Blutproben gewonnen.

Anschließend wurden diese Proben aufgearbeitet und auf den Ivermectingehalt untersucht.

Tab. 3.8: Alter, Geschlecht und Rasse der Versuchspferde Hohe MDR-1 Expression

Pferd [Nr.]

Alter [Jahre]

Geschlecht Rasse

13 16 Stute Trakehner

14 18 Wallach Hannoveraner

15 17 Stute Hannoveraner

19 15 Stute Hannoveraner

22 13 Stute Oldenburger

40 15 Stute Württemberger

Niedrige MDR-1 Expression Pferd

[Nr.]

Alter [Jahre]

Geschlecht Rasse

25 15 Stute Hannoveraner

28 9 Wallach Hannoveraner

35 15 Stute Warmblut

42 7 Stute Oldenburger

48 7 Stute Oldenburger

3.3.3.1 Testsubstanz

In der Studie wurde die Substanz Ivomec®-P der Firma Merial verwendet. Eine Ivomec®-P Applikationsspritze mit 6,42 g Paste enthält:

Ivermectin 0,120 g

Propylenglycol 5,144 g

Hyprolose

Titandioxid (E 171)

Glyceroltris (12-hydroxyoctadecanoat)

Chargennummer: ABO 21/10 (Verwendbar bis: 04/2013)

Das Präparat wurde einmalig in der vom Hersteller empfohlenen Dosierung eingesetzt.

3.3.3.2 Versuchsablauf

Direkt vor Beginn des Versuchs wurden alle Pferde gewogen, um die Dosierung des Präparates genau auf das Körpergewicht der einzelnen Tiere abstimmen zu können. Die Dosierung von Ivermectin betrug 0,2 mg/kg Körpergewicht. Ivomec®-P wurde den elf Pferden einmalig oral verabreicht.

Eine Stunde vor Applikation der Testsubstanz wurde von allen Pferden eine Blutprobe gewonnen, welche als Leerprobe diente. Anschließend wurden zu den in Tabelle 3.9 angegebenen Zeitpunkte Blutproben gewonnen. Das Blut wurde in jeweils 8 ml fassenden, mit Lithium-Heparin beschichteten und mit integriertem Trenngel vorgesehenen Vacutainer®

Röhrchen (BD GmbH, Heidelberg) aufgefangen.

Tab. 3.9: Entnahmezeitpunkte der Blutproben Proben-Nr.: Zeit [Stunde]

1 -1

2 0

3 2

4 3

5 4

6 6

7 12

8 24

9 48

10 72

11 96

12 120

Das zum jeweiligen Entnahmezeitpunkt entnommene Vollblut wurde direkt bei 3000 rpm für 6 min zentrifugiert. Anschließend wurde das Plasma in ein 10 ml fassendes Kunststoffgefäß mit Kunststoffschraubdeckel überführt. Die Plasmaproben wurden bis zur Aufarbeitung bei -20 °C gelagert.

3.3.3.3 Aufarbeitung der Plasmaproben zu Analyse

Zur Messung der Ivermectinkonzentration im Plasma wurde die von DE MONTIGNY et al.

(1990) entwickelte Methode modifiziert. Die Aufarbeitung der Plasmaproben für die Ivermectin Messung bestand aus zwei Schritten: Extraktion und Derivatisierung. Diese sind in Abbildung 3.1 schematisch dargestellt.

Bei der Aufarbeitung der Plasmaproben wurden tägliche Kalibrationskurven mit zehn Kalibrationspunkten erstellt. Die gewählten Kalibrationspunkte deckten den gesamten Arbeitsbereich ab und richteten sich nach den erwarteten Konzentrationen der Plasmaproben.

Abb. 3.1: Schema der Aufarbeitung von Plasmaproben von Pferden zu Bestimmung der Ivermectinkonzentration (modifiziert nach DE MONTIGNY et al. 1990)

Probenvorbereitung

500 µl Plasma im Eppendorfgefäß

+ 1µg Doramectin (interner Standard)

(10µl einer Acetonitril (ACN) Lösung die 100 µg/ml Doramectin enthält)

+ 1ml Acetonitril-Wasser (80:20), 5 s schütteln (Vortex) und 10 min bei 15.000 rpm zentrifugieren (4°C)

Überstand auf präkonditionierte C18ec Säule überführen (Präconditionierung mit 1 ml Methanol und 1 ml Wasser)

Trocknen mittels Luftfluss (Vakuumpumpe; P=5, ΔP=5) für 10 min

Spülvorgang mit 1 ml Wasser und anschließende Ivermectinelution mit 2x 1 ml Ethylacetat

Eindampfen Trockener Rückstand:

+ 200 µl N-Methylimidazole in ACN (1:1) + 300 µl Trifluoressigsäureanhydrid in ACN (1:2)

5 s Schütteln, 30 s ruhen lassen

400 µl in HPLC- Messgefäß überführen