Tierärztliche Hochschule Hannover
Pharmakokinetische und thrombolytische Eigenschaften des Plasminogenaktivators Alteplase beim Pferd
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
Vorgelegt von Gudrun Maria Herrling
Karlsruhe
Hannover 2010
Wissenschaftlicher Betreuer: Univ. - Prof. Dr. K. Feige
Klinik für Pferde
1. Gutachter: Univ. - Prof. Dr. K. Feige
2. Gutachter: Univ. - Prof. Dr. R. Mischke
Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2010
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG... 9
2. MANUSKRIPT I... 10
2.1 Zusammenfassung... 10
2.2 Summary ... 12
2.3 Einleitung ... 13
2.4 Material und Methode... 15
2.4.1 Probanden für Blutentnahme ... 15
2.4.2 Blutentnahmetechnik... 15
2.4.3 Plasmagewinnung... 16
2.4.4 Thrombenherstellung ... 16
2.4.4.1 Reagenzien ... 16
2.4.4.2 Vorbereitung ... 17
2.4.4.3 Herstellung der equinen Vollblutthromben... 17
2.4.4.4 Herstellung der humanen Vollblutthromben ... 17
2.4.4.5 Aufhängen der Thromben... 18
2.4.5 Durchführung der Wägung... 18
2.4.6 Lysesystem ... 18
2.4.6.1 Vorbereitung der Lyse ... 18
2.4.6.2 Konzentrationsstufen... 19
2.4.6.3 Durchführung der Lyse ... 19
2.4.7 D-Dimer... 20
2.4.7.1 Probensammlung ... 20
2.4.8.2 Messung der D-Dimere ... 20
2.4.9 Auswertung der Daten ... 21
2.4.10 Statistik ... 21
2.5 Ergebnisse ... 22
2.5.1 Auswertung Pferdedaten... 22
2.5.2 Auswertung Humandaten... 24
2.6 Diskussion ... 25
2.6.1 Methodik ... 26
2.6.2 Ergebnisse ... 27
2.6.3 Schlussfolgerung ... 32
2.7 Legende und Abbildungsverzeichnis ... 33
2.8 Literaturverzeichnis... 44
3. MANUSKRIPT II... 48
3.1 Zusammenfassung... 48
3.2. Summary ... 50
3.3 Einleitung ... 51
3.4 Material und Methode... 53
3.4.1 Studienaufbau... 53
3.4.1.1 Vorversuch ... 53
3.4.1.2 Hauptversuch ... 53
3.4.2 Vorbereitung der Pferde... 54
3.4.3 Rekombinanter Plasminogenaktivator... 54
3.4.4 Dosierung und Applikationstechnik des rTPA ... 54
3.4.5 Probennahme ... 55
3.4.6 Verarbeitung und Aufbewahrung der Proben... 56
3.4.7 Monitoring der Probanden... 56
3.4.8 ELISA... 57
3.4.9 Gerinnungsparameter ... 57
3.4.10 Hämatologie... 58
3.4.11 Pharmakokinetik... 58
3.4.11.1 Erstellen der Kalibrationskurve ... 58
3.4.11.2 Validierung des ELISA... 59
3.4.12 Statistische Auswertung... 59
3.5. Ergebnisse ... 60
3.5.1. Pharmakokinetik... 60
3.5.1.1 Vorversuch ... 60
3.5.1.2 Hauptversuch ... 60
3.5.2. Pharmakodynamik: Allgemeinbefinden, Hämatologie und Gerinnungs- parameter... 61
3.5.2.1 Vorversuch ... 61
3.5.2.2 Hauptversuch ... 61
3.6 Diskussion ... 62
3.6.1 Pharmakokinetik ... 62
3.6.2 Pharmakodynamik ... 67
3.6.3 Schlussfolgerung ... 68
3.7 Legende und Abbildungen ... 69
3.8 Literaturverzeichnis... 82
4. ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ... 87
5. ZUSAMMENFASSUNG ... 91
6. SUMMARY ... 94 7. LITERATURVERZEICHNIS ... 96 8. ANHANG... 97
Abkürzungsverzeichnis
DNA Desoxyribonukleinsäure
ELISA Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (EIA) bzw. Enzyme Linked Immunosorbent Assay
HWZ Halbwertszeit ID Identifikation
IU Internationale Einheiten
KGW Körpergewicht µl Einheit: Mikroliter, 10-6 l
µg Einheit: Mikrogramm, 10-6 kg
MZP Messzeitpunkt
ng Einheit: Nanogramm, 10-9 kg PnHV Pferd n der Hauptversuche PnVV Pferd n der Vorversuche
rTPA rekombinanter-Tissue-Plasminogen-Aktivator s Standardabweichung
Tab. Tabelle
TPA Tissue-Plasminogen-Aktivator
1. Einleitung
Der Plasminogenaktivator Alteplase wird seit den 80er Jahren in der Humanmedizin zur thrombolytischen Behandlung von Herzinfarkt- und Schlaganfallpatienten eingesetzt (Gillis et al. 1995).
Er entspricht im Aufbau dem körpereigenen Gewebe-Plasminogen-Aktivator.
Alteplase aktiviert thrombusständiges Plasminogen zu Plasmin und führt dadurch eine Auflösung des Thrombus in Fibrinspaltprodukte herbei (Gillis et al. 1995;
Wagstaff et al. 1995). Durch seine Fibrinspezifität entfaltet Alteplase seine Wirkung hauptsächlich an thrombusständigem Plasminogen. Dadurch wird eine systemische Plasminogenaktivierung fast vollständig umgangen.
Im Rahmen der Therapie von Pferden kann es durch häufiges Punktieren der Vena jugularis externa, der Verabreichung venenreizender Medikamente oder dem mehrtägigen Einsatz eines Venenverweilkatheters zu einer Thrombusbildung in dieser Vene kommen (Dolente et al. 2005). Je nach Größe des Thrombus kann die Folge ein teilweiser oder vollständiger Verschluss der Vene, verbunden mit einer Reduzierung der Leistungsfähigkeit des Pferdes sein (Hay 1992).
In Kombination mit den in der Pferdemedizin eingesetzten Antikoagulantien kann der Plasminogenaktivator Alteplase eine thrombolytische Therapiemöglichkeit darstellen.
In der vorliegenden Arbeit soll in einer ersten in vitro-Studie das Thrombolysepotenzial des Plasminogenaktivators Alteplase an equinen Thromben untersucht werden. Im zweiten Teil der Arbeit werden die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften von Alteplase an Pferden bestimmt.
2. Manuskript I
Untersuchungen zu den Thrombolyseeigenschaften des Plasminogen- aktivators Alteplase an in vitro erzeugten equinen und humanen Thromben
2.1 Zusammenfassung
In dieser Studie wurden in vitro erzeugte Thromben aus equinem und humanem Vollblut unter standardisierten Bedingungen mit dem rekombinanten Plasminogenaktivator Alteplase lysiert. Dabei sollte das Lysevermögen des Plasminogenaktivators zwischen humanem und equinem Vollblut verglichen und eine für das Pferd geeignete Dosierung gefunden werden.
Es wurde Vollblut von sieben Pferden und drei Menschen gewonnen. Nach Zugabe von Thrombin wurden Thromben gebildet, die vier Stunden im Wasserbad belassen wurden. Die entstandenen Thromben wurden im Anschluss unter Zugabe von Alteplase über vier Stunden aufgelöst. Die equinen Thromben wurden mit rekombinanten Tissue-Plasminogen-Aktivator Konzentration (rTPA-Konzentrationen) von 0,5 µg/ml, 1,5 µg/ml, 3,5 µg/ml und 5 µg/ml aufgelöst. Die rTPA- Konzentrationsstufen, die zur Lyse der humanen Thromben genutzt wurden, waren 0,05 µg/ml, 0,15 µg/ml, 0,5 µg/ml und 1,5 µg/ml. Der Fortschritt der Lyse wurde über stündliches Wiegen der Thromben dokumentiert. Zur Überprüfung der Thrombolyse wurde zusätzlich jede Stunde der D-Dimer-Gehalt mittels des Nycocard-D-Dimer- Single-Testes (NycoCard® Reader II, AXIS-SHIELD PoC AS, Oslo, Norwegen) in dem Lysemedium bestimmt.
Es konnte sowohl bei den humanen, als auch bei den equinen Thromben eine Thrombolyse festgestellt werden. Das Gewicht der equinen Thromben nahm bei einer rTPA-Konzentration von 0,5 µg/ml um 56 % ab. Bei 1,5 µg/ml kam es zu einer Gewichtsreduktion um 86 %. Bei 3,5 µg/ml war nach vier Stunden Lysezeit das Thrombusgewicht um 90 %, und bei einer rTPA-Konzentration von 5 µg/ml um 92 % gesunken. Die Thromben aus Humanblut verloren bei einer rTPA-Konzentration von
0,05 µg/ml nach vier Stunden 90 %, bei 0,15 µg/ml 82 %, bei 0,5 µg/ml 70 % und bei 1,5 µg/ml 62 % ihres Gewichts.
Die Konzentration an Fibrinspaltprodukten (D-Dimer) stieg bei den equinen Thromben nach vierstündiger Lysezeit auf mittlere, rTPA-dosisabhängige Werte zwischen 4,27 und 10,19 mg/l. Bei der Lyse der Thromben von Menschen stiegen die D-Dimer-Werte auf mittlere, rTPA-dosisabhängige Werte zwischen 2,69 bis 6,15 mg/l.
Es konnte gezeigt werden, dass eine Thrombolyse equiner Thromben mit dem Plasminogenaktivator Alteplase möglich ist, die benötigte Wirkstoffmenge liegt jedoch deutlich höher als die, die zur Lyse von Thromben aus Humanblut nötig ist.
2.2 Summary
In this study the lysis of ex vivo generated human and equine thrombi using the recombinant plasminogen activator Altplase was analysed.
Adding thrombin to whole blood taken from 7 horses and 3 human, thrombi were generated during 4 h in saline solution. After this, different Alteplase concentrations were added to the solution. The extent of lysis was measured by the decrease of the thrombi weight over a period of 4 h. D-Dimer concentration in the lysis medium was also used as a lysis indicator, measured hourly with a Nycocaed D-dimer single test.
In equine thrombi when 0,5 µg/ml; 1,5 µg/ml; 3,5 µg/ml and 5 µg/ml of Ateplase were added a weight decrease of 56 %; 86 %; 90 % and 92 % was detected, while the D- Dimer concentration in the lysis medium increased from 4,27 to 10,58 mg/l. When Alteplase concentration of 0,05 µg/ml, 0,15 µg/ml, 0,5 µg/ml and 1,5 µg/ml were added to human thrombi, a weight decrease of 90 %; 82 %; 70 % and 62 % was detected, and the D-Dimer concentration in the lysis medium increased from 2,69 to 4,93 mg/l.
In conclusion, we could demonstrate that the lysis of ex vivo equine generated thrombi with the recombinant plasminogen activator Altplase is possible as well as in human thrombi. These results might have a potential value for further studies that could allow the use of Alteplase as a therapeutic tool in the improvement of clinical thrombolysis in horses.
2.3 Einleitung
Aseptische venöse Thromben, die beim Pferd hauptsächlich in der Vena jugularis externa vorkommen, können durch unterschiedliche Faktoren zustande kommen (Divers 2003; Dolente et al. 2005). Häufig treten aseptische Thrombophelebitiden auf, die ohne Beteiligung des benachbarten Gewebes einen vollständigen oder teilweisen Verschluss der Vene herbeiführen (Dietz 1996). Gründe für eine teilweise oder vollständige Okklusion der Vene können eine Venenpunktion oder Katheterisierung der Vene im Zusammenhang mit einer Hyperkoagulation sein, die aus einer Septikämie oder anderen systemischen Erkrankungen entsteht (Hay 1992;
Leroux 2003; Traub- Dargatz and Dargatz 1994).
Gastrointestinale Erkrankungen, Salmonellosen oder Hypoproteinämie führen zu einem erhöhten Risiko einer Thrombophlebitis (Divers 2003; Dolente et al. 2005; Hay 1992; Traub- Dargatz and Dargatz 1994). Eine erhöhte Thromboseneigung liegt auch bei einem hypovolämischen Schock oder Krankheiten mit einem erheblichen Gewebetrauma sowie bei hochtragenden Stuten vor (Deegen 1988). Intravenös verabreichte Substanzen mit starker pH-Abweichung vom physiologischen Blut-pH- Wert (Gasthuys and De Moor 2006), hoher Wirkstoffkonzentration oder der Neigung zu Gefäßwandreizung (Gerhards 1987a) sowie PVC- oder Polytetrafluoroethylen- bzw. Teflonkatheter führen zu einer Irritation der Intima und somit zur Koagulation des Blutes mit folgender Thrombosierung der Vene (Bonagura and Reef 1998;
Divers 2003; Morris 1998). Auch die Zeit, die der Verweilkatheter in der Vene verbleibt, ist für das Entstehen eines Thrombus mitbestimmend (Divers 2003).
Abgesehen von den Schmerzen, die durch eine Thrombophlebitis bei dem betroffenen Pferd entstehen, kommt es durch den Verschluss der Vene zu einer Leistungs- und Wertminderung des Pferdes (Dietz 2002; Hay 1992).
Das klinische Bild zeigt in einem solchen Fall meist eine daumenstark verdickte Vene, die auf 10 bis 15 cm durch den Thrombus fast vollständig undurchlässig ist (Dietz 1996; Dietz 2002). Die anderen klassischen Entzündungszeichen, wie z.B.
Wärme und Rötung der Haut, sind weniger stark ausgeprägt (Gerhards 1987a, b).
Aseptische Thrombophlebitiden können heute mit dem Cumarinderivat Phenprocoumon (Bubeck et al. 2005) und, sowohl prophylaktisch als auch
therapeutisch mit Heparin behandelt werden (Dietz 2002; Feige et al. 2003b;
Gerhards and Eberhard 1988; Morries 1998). Beide Wirkstoffe haben jedoch den Nachteil, dass sie die Thromben nicht auflösen können, sondern nur deren Entstehung verhindern oder das Wachstum hemmen. Der Wirkstoff r-Hirudin, ein direkter Thrombininhibitor mit antikoagulatorischer Wirkung, ist bislang nur an gesunden Pferden getestet worden und kommt aus wirtschaftlichen Gründen beim Pferd als Behandlungsalternative nicht in Frage (Feige et al. 2004).
Ein in der Humanmedizin seit den 80er Jahren angewandter Wirkstoff zur antithrombotischen Therapie ist der Plasminogenaktivator Alteplase. Alteplase wird in der Humanmedizin bei Schlaganfall- und Herzinfarktpatienten zur Thrombolyse verwendet (Gillis et al. 1995; Gonzales and Grotta 2006; Hoffmeister 2002; Lyden et al. 2006; Quinn et al. 2008). Der rekombinante Gewebeplasminogenaktivator Alteplase (rTPA) ist eine Serin-Protease, die mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt wird und chemisch dem humanen Gewebe-Plasminogen-Aktivator entspricht. Da das Molekulargewicht 65.000 Dalton beträgt, kann Alteplase keine biologischen Membranen überwinden und wird parenteral, meist intravenös, verabreicht (Semba et al. 2000).
Die Halbwertszeit im Blut beträgt beim Menschen vier bis sechs Minuten und der Wirkstoff wird über die Leber metabolisiert (Gillis et al. 1995; Otter et al. 1992). Der Wirkmechanismus beruht auf einer Komplexbildung zwischen Fibrin, rTPA und Plasminogen (Gulba et al. 1996). Der rekombinante Plasminogenaktivator zeigt dabei eine starke Fibrinaffinität, die von seinem spezifischen Strukturaufbau herrührt.
Dies hat zur Folge, dass hauptsächlich Thrombus assoziiertes Plasminogen aktiviert wird (Agnelli 1990) und die systemische Plasminogenaktivierung geringer ist, als die von Streptokinase (Hoffmeister 2002). Für die Thrombolysetherapie in der Humanmedizin hat sich die Bolus-rTPA-Therapie als eine der erfolgversprechendsten Applikationsarten gezeigt (Semba et al. 2000). Die Dosierung ist gewichtsabhängig und erfolgt bei Patienten über 67 kg mittels einer intravenösen Bolusgabe von 15 mg gefolgt von 0,50 mg/kg für 30 Minuten und 0,50 mg/kg über weitere 60 Minuten (Gillis et al. 1995). Der Gebrauch des rekombinanten
Plasminogenaktivators ist auch zur Behandlung verlegter zentraler Venenkatheter anerkannt (Ragni et al. 2008).
Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, die fibrinolytischen Eigenschaften des Plasminogenaktivators Alteplase an equinem Vollblut im Vergleich zu humanem Vollblut zu untersuchen. Dazu werden in vitro hergestellte Pferde- und Humanthromben unter Zugabe von Alteplase in einem in vitro-Verfahren lysiert.
2.4 Material und Methode
2.4.1 Probanden für Blutentnahme
Bei den Spendertieren handelte es sich um sechs Stuten und einen Wallach der Hannoveraner Zucht. Die Tiere wiesen ein Alter zwischen 4 und 25 (17,0 ± 6,76) Jahren auf. Alle Probanden wurden vor der Blutentnahme allgemeinmedizinisch untersucht und für gesund befunden.
Die drei Spender von humanem Vollblut waren klinisch gesund und nicht unter dem Einfluss von Medikamenten. Ihr Alter betrug zwischen 21 und 23 (22,3 ± 1,15) Jahren.
Ein Tierversuchsantrag wurde nach § 8 Abs. 1 des Tierschutzgesetzes entsprechend der Anlage 1 der Allgemeinen Verwaltungsvorschrift vom 09.02.2000 an das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) gestellt und von diesem genehmigt. AZNr. (09/1796).
Die Blutentnahme am Menschen fand nach Einwilligung des jeweiligen Probanden statt.
2.4.2 Blutentnahmetechnik
Bei den Spendertieren fand die Blutentnahme unter aseptischen Bedingungen aus der Vena jugularis externa statt. Dabei wurde über eine Kanüle (Braunüle®, Fa.
Braun, Melsungen) das Blut in einen mit Natriumcitrat (1,3 %, 1 Teil Natrium, 9 Teile Blut) gefüllten Flacon (50 ml, Fa. Braun, Melsungen) eingelassen. Nach der Befüllung wurde das Behältnis mit einem Deckel verschlossen und einmal vorsichtig
geschwenkt. Den Tieren wurde pro Blutentnahme ein Liter Blut abgenommen und dies in 20 Flacons mit einem Auffangvermögen von 50 ml eingelassen.
Die Blutentnahme beim Menschen fand unter aseptischen Bedingungen aus der Vena basilica statt. Die Menge betrug zwischen 30 und 50 ml Blut, welches in ein mit Natriumcitrat (1,3 %, 1 Teil Natrium, 9 Teile Blut) gefülltes Flacon (50 ml, Fa. Braun, Melsungen) eingelassen wurde.
2.4.3 Plasmagewinnung
Das frisch gewonnene Citratblut der Spender wurde in den Laboratorien eines pharmazeutischen Unternehmens zentrifugiert (1-LR, Heraeus Zentrifuge, Buckinghamshire, England). Das daraus gewonnene Plasma wurde in Flacons (50 ml, Firma Braun, Melsungen) abpipettiert und anschließend bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (K3120 Comfort, Fa. Liebherr, Bulle, Schweiz.) bei 3 °C gelagert.
2.4.4 Thrombenherstellung 2.4.4.1 Reagenzien
Zur Herstellung der Vollblutthromben wurden Na-Citrat (3,13 %), CaCl2 (1,3 %) und NaCl (0,9 %) verwendet. Diese wurden in einem Labor eines pharmazeutischen Unternehmens hergestellt. Des Weiteren wurde eine Silikonemulsionslösung (Fa.
Roth, Karlsruhe) und eine Ca-Thromboplastinlösung (Thromborel S®, Fa. Dade Behring, Chicago, USA) verwendet.
Das Humanplasma, das als Lysemedium zur Lyse der Humanthromben diente, wurde von einer Blutbank (DRK, Berlin) bereitgestellt. In dieser Studie wurde auf humanes Mischplasma zurückgegriffen, so dass den Spendern des Vollbluts nur die zur Herstellung der Thromben notwendige Menge Blut abgenommen werden musste.
Das equine Plasma, das als Lysemedium für die equinen Thromben diente, wurde von dem jeweiligen Spendertier gewonnen.
2.4.4.2 Vorbereitung
Die zur Herstellung der Thromben genutzten Glasgefäße wurden zuvor für eine Stunde in eine Silikonölemulsion (Verdünnung 1:10 in demineralisiertem Wasser, Fa.
Roth, Karlsruhe) eingelegt und zur Trocknung für eine Stunde in einen Wärmeschrank bei 70 °C verbracht.
Alle Arbeitsvorgänge zur Herstellung und zur Lyse der Thromben wurden in den Laboratorien eines pharmazeutischen Unternehmens durchgeführt.
2.4.4.3 Herstellung der equinen Vollblutthromben
In ein silikonisiertes Reagenzglas (24 ml, Fa. Schott Fiolax, Mainz) wurden 4250 µl isotone NaCl–Lösung, 200 µl Ca-Thromboplastinlösung (Thromborel S®, Fa. Dade Behring, Chicago, USA) und 500 µl CaCl2-Lösung (1,3 %) einpipettiert. Diese Lösung wurde dann für 20 Minuten in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubiert.
Danach wurden 1000 µl Citratblut zugegeben, das Reagenzglas mit Parafilm (Parafilm M®, Firma Brand GmbH und Co AG, Wertheim) verschlossen und vorsichtig um 180 Grad gedreht. Zur Koagulation wurde das Gemisch 10 Minuten im Wasserbad belassen. Zum Ablösen des Koagels wurden die Gläser danach abrupt um die eigene Achse gedreht. Das Gemisch wurde anschließend für vier Stunden zur Formung der Thromben im Wasserbad belassen.
Zur Herstellung der equinen Thromben wurden im Vergleich zum humanen Thrombus unterschiedliche Mengen an Substrat vorgelegt, da die equinen Thromben bei gleicher Substratmenge die Größe der humanen Thromben um das 3-fache überschritten und ein Wiegen der Thromben unmöglich machte.
Die Thromben wogen zu Beginn 2,92 g ± 0,31 g.
2.4.4.4 Herstellung der humanen Vollblutthromben
Für die zum Vergleich humaner und equiner Lyse angefertigten humanen Vollblutthromben wurden 8500 µl isotonischer NaCl-Lösung, 100 µl Ca- Thromboplastinlösung und 500 µl CaCl2-Lösung (1,3 %) in ein Reagenzglas vorgelegt. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten wurden weitere 1000 µl humanes Vollblut hinzu pipettiert. Das weitere Vorgehen entsprach dem der equinen
Die Thromben wogen zu Beginn 0,94 g ± 0,06 g 2.4.4.5 Aufhängen der Thromben
Der equine und humane Thrombus wurde aus dem Reagenzglas in eine Petrischale (Ø 10 cm, Fa. Schott, Mainz) geleert. Zuvor wurde in die Petrischale ein zur Schlinge gebundener Faden (Baumwollfaden, 20 cm Länge) gelegt. Der Thrombus wurde vorsichtig mit einem Mikrospatel (Fa. Roth, Karlsruhe) mittig auf den Faden gehoben und festgebunden.
2.4.5 Durchführung der Wägung
Das Fortschreiten der Thrombolyse wurde mittels Gewichtsermittlung zu Beginn der Lyse und anschließend im einstündigen Turnus ermittelt. Dazu wurden die fertig aufgehängten Thromben in mit 15 ml NaCl (0,9 %ig) gefüllte Bechergläser (20 ml Duran®, Fa. Schott, Mainz) gelegt. Diese wurden auf einer Laborwaage (Mettler AT 261 Delta Range® Fact, Firma Mettler, Giessen) auf zwei Dezimalstellen genau in Gramm gewogen. Anschließend wurden die Thromben in das Thrombolysesystem zurück verbracht und die Bechergläser erneut gewogen. Durch Subtraktion der beiden Werte voneinander wurde das absolute Thrombengewicht ermittelt. Die Messzeit, die die Thromben aufgrund der Gewichtsermittlung nicht in dem Lysesystem verweilten, wurde auf unter 10 Minuten pro Messung festgelegt.
2.4.6 Lysesystem
2.4.6.1 Vorbereitung der Lyse
Die Lyse der Thromben fand in Wasserbädern (5 Liter, JKA-Labortechnik®, Fa. Janke und Kunkel, Stauffen) statt. Diese wurden zuvor mit Wassererhitzern (JKA- Labortechnik®, Fa. Janke und Kunkel, Stauffen) ausgestattet und mit ca. drei Litern destilliertem Wasser aufgefüllt. Um die nötigen 37 °C Wassertemperatur bis zum Beginn der Lyse zu erreichen, war eine Vorlaufzeit von etwa einer Stunde nötig.
Die Thromben selbst wurden an Haken in doppelwandige Badgefäße (40 ml, Fa.
autologen equinem Plasma aufgefüllt worden waren. Die Aufhängung der Thromben ermöglichte eine gleichmäßige Bedeckung mit Plasma von allen Seiten. Zusätzlich lag für eine gleichmäßige Umspülung der Thromben mit Plasma und dem Plasminogenaktivator Alteplase ein Magnetrührer auf dem Boden des Gefäßes, dessen Umdrehungsgeschwindigkeit ca. 150 Umdrehungen pro Minute betrug.
2.4.6.2 Konzentrationsstufen
Bei den in vitro-Versuchen wurde die Lyse der Thromben bei verschiedenen Konzentrationen an rTPA im Vergleich zu Thromben ohne rTPA getestet. Die unterschiedlichen Konzentrationen ergaben sich aus in Vorversuchen getesteten Konzentrationssprüngen.
Die Mengen an rTPA im Plasma entsprachen beim Pferd 0,5 µg/ml (E05), 1,5 µg/ml (E15), 3,5 µg/ml (E35) und 5 µg/ml (E50). Die humanen Thromben wurden mit 0,05 µg/ml (H005), 0,15 µg/ml (H015), 0,5 µg/ml (H05) und 1,5 µg/ml (H15) lysiert. Nach der Bestimmung des Ausgangsgewichts am Messzeitpunkt 0 (MZP 0) wurden die Thromben in jeder Konzentration in stündlichen Abständen über vier Stunden (MZP 1, MZP 2, MZP 3, MZP 4) gewogen. Das entspricht fünf Gewichtsbestimmungen in vier Stunden Lysezeit.
Im Anschluss an den Versuch wurden die Thromben und das Plasma entsorgt.
2.4.6.3 Durchführung der Lyse
In dem oben beschriebenen Lysesystem wurden pro Messung 20 Thromben eingehängt. Es wurden jeweils mehrere Thromben pro Konzentration angesetzt. Die Thromben wurden stündlich aus Ihren Badgefäßen entnommen, wie oben beschrieben gewogen und wieder in das Badgefäß verbracht.
Im Verlauf der Thrombolyse kam es in Einzelfällen zu einem Lösen des Thrombus vom Faden, bevor dieser vollständig lysiert worden war. Diese Thromben gingen ab diesem Messzeitpunkt nicht mehr in die Auswertung ein, um die Statistik nicht zu verfälschen.
2.4.7 D-Dimer
2.4.7.1 Probensammlung
Es wurden je 200 µl Plasma an den einzelnen Messzeitpunkten im stündlichen Rhythmus aus den Badgefäßen entnommen und in Eppendorf-Gefäßen (Fassungsvermögen 1 ml) aufgefangen. Die Gefäße waren vorher zur Wiedererkennung mit Thrombusnummer und einer Nummer für den Messzeitpunkt beschriftet worden. Zur Bestimmung des Ausgangswertes des D-Dimers an MZP 0 wurde aus dem Badgefäß vor Einbringung des Thrombus eine Plasmaprobe von ebenfalls 200 µl aus dem Plasma entnommen.
An den Messzeitpunkten MZP 1 bis MZP 4 wurde das Plasma nach der Gewinnung zentrifugiert (Eppendorf Centrifuge 5804 R, Fa. Eppendorf, Wesseling-Berzdorf), um Plasma von noch vorhandenen Erythrozyten zu trennen. Das erythrozytenfreie Plasma wurde in Eppendorfgefäße abpipettiert und bis zum Zeitpunkt der D-Dimer- Bestimmung bei einer Temperatur von -20 °C eingefroren.
2.4.8.2 Messung der D-Dimere
Zur Messung der D-Dimer-Konzentration wurde ein Reflektometer eingesetzt (NycoCard® Reader II, AXIS-SHIELD PoC AS, Oslo, Norwegen). Es wurden drei Messungen pro Konzentration durchgeführt und diese als Mittelwert in den Daten zusammengefasst. Die tiefgefrorenen Plasmaproben wurden in einem 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut und danach zentrifugiert. Anschließend wurde das Testplättchen des NycoCard-D-Dimer-Single Tests mit 50 µl der Waschlösung vorgewaschen. Nachdem die Lösung vollständig eingezogen war, wurden 50 µl der Plasmaprobe auf das Testfeld pipettiert und gewartet bis diese wieder vollständig eingezogen war. Als dritter Schritt wurde Konjugat aufgegeben und nach dessen Einziehen abschließend das Feld noch einmal mit Waschlösung gewaschen.
Zum Messen der D-Dimer-Konzentration wurde der Lesestift auf das Testplättchen vertikal aufgesetzt, die Abschirmung herabgezogen und das Messergebnis abgelesen. Der D-Dimer-Wert wurde in mg/l angegeben.
2.4.9 Auswertung der Daten
Es fand eine Auswertung der relativen und absoluten Thrombengewichte sowie der D-Dimer-Werte statt. Beim relativen Thrombengewicht handelt es sich um die Relation der Gewichte an den einzelnen MZP zum Ausgangsgewicht des Thrombus an MZP 0 (100 %).
Zudem wurde über die absoluten Thrombengewichte eine Aussage zu dem Lysepotenzial der einzelnen rTPA-Kontentrationen gemacht. Das Lysepotenzial ist ein Maß für die Gewichtsabnahme der Thromben während 60 Minuten und beschreibt das Vermögen der jeweiligen rTPA-Konzentration, den Thrombus zu lösen. Die Abnahme der Thrombengewichte wurde in vier Zeiträumen (Stunde 1, Stunde 2, Stunde 3, Stunde 4) analog zu den Messzeitpunkten (MZP 1 - 4) bestimmt und jeweils in Prozent des Ausgangswertes angegeben.
2.4.10 Statistik
Die Annahme auf Normalverteilung der Modellresiduen aller Parameter wurde visuell mittels Q-Q-Plot (hier nicht dargestellt) sowie Shapiro-Wilk-Test geprüft.
Von allen Messwerten wurde eine deskriptive Statistik erstellt, welche die Stichprobengröße (n), den Mittelwert (x) und die Standardabweichung (s) beschreibt.
Um den Einfluss der Messzeitpunkte und der rTPA-Konzentration auf die Lyse der Thromben analysieren zu können, wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse mit Berücksichtigung möglicher Interaktionen sowie einem post-hoc Dunnett-Test für multiple Paarvergleiche genutzt. Dabei wurden die Gewichtsabnahme der Thromben bei jeder verwendeten Konzentration ausgehend von dem Gewicht am MZP der Stunde 0 mit den Gewichtsabnahmen an jedem weiteren MZP verglichen.
Der Einfluss der verschiedenen rTPA-Konzentrationen auf die relative Verminderung der Thromben stratifiziert nach Messzeitpunkten wurde über eine einfaktorielle Varianzanalyse mit einem post-hoc Tukey-Test analysiert. Beide Verfahren wurden auch für die D-Dimer-Messungen angewandt.
Unterschiede von p < 0,05 wurden als signifikant, solche mit einem p < 0,01 als hochsignifikant und solche mit p < 0,001 als höchstsignifikant bezeichnet.
Die Auswertungen erfolgten mit dem Statistikprogramm SAS, Version 9.2 (SAS Institute, Cary, NC); für die Auswertung des linearen Modells wurde die Prozedur Mixed benutzt.
2.5 Ergebnisse
Aus den einzelnen Blutspenden wurde pro Pferd eine unterschiedliche Anzahl an in vitro-Thromben hergestellt und mit verschiedenen Konzentrationen an rTPA versetzt (Tab. 1). Aus den einzelnen Blutspenden der Vollblutspenden der Menschen wurde eine Anzahl an in vitro-Thromben hergestellt und mit verschiedenen Konzentrationen an rTPA versetzt (Tab. 2).
2.5.1 Auswertung Pferdedaten
Bei der zweifaktoriellen Varianzanalyse konnte eine zeit-und dosisabhängige Reduktion der Thrombengewichte festgestellt werden (Abb. 1). Vergleiche der Thrombengewichte an MZP 0 zu den Gewichten der Thromben an jedem anderen Messzeitpunkt in einer Konzentration zeigten, dass alle Thromben höchstsignifikante Gewichtsabnahmen (p < 0,001, Dunnet-Test) gegenüber dem Ausgangswert an MZP 0 aufwiesen.
Dabei verloren die Thromben des Leerwerts (E0) nach vier Stunden Lyse 40 % ihres Ausgangsgewichts, während die Thromben von E05 ca. 56 %, E15 86 %, E35 90 % und E50 92 % des ursprünglichen Gewichts verloren (Abb. 1).
Beim Vergleich der Gewichtsabnahmen zwischen den Thromben des Leerwerts (E0) am MZP 1 bis 4 mit den Gewichtsabnahmen der Thromben nach Zusatz von rTPA in den verwendeten Konzentrationen (Tukey-Kramer-Test) zeigten sich in allen rTPA- Konzentrationen eine signifikante bis höchstsignifikante Gewichtsabnahme zum Leerwert (Abb. 2).
Nach viesr Stunden Lyse hatte der Leertwertthrombus noch 60 % seines Ausgangsgewicht, der Thrombus in Konzentration E05 44 %. Bei E15 lagen noch 14 %, bei E35 10 % und bei E50 8 % des ursprünglichen Gewichts vor.
Am letzten Messzeitpunkt, MZP 4, traten zudem zwischen den Gewichtsabnahmen der Thromben bei den Konzentrationen E15 und dem Leertwert (E0) bzw. E15 und E05
höchstsignifikante, beim Vergleich von E15 mit den Konzentrationen von E35 und E50
dagegen keine signifikanten Gewichtsabnahmen auf (Abb. 2).
Die Thromben wogen zu Beginn der Messung durchschnittlich 2,92 g ± 0,31 g. Die Thromben des Leerwerts wogen am MZP 4 noch 1,66 g ± 0,30g, die Thromben der Konzentration E05 wogen noch 1,25 g ± 0,39 g und die Thromben der Konzentration E15 wogen noch 0,43 g ± 0,22 g. Bei den rTPA-Konzentrationen E35 wogen die Thromben noch 0,32 g ± 0,16 g, und bei E50 noch 0,25 g ± 0,07 g.
Im Folgenden wurde das absolute Clotgewicht analysiert, um eine Aussage zu dem Lysepotenzial treffen zu können. Hier zeigten alle Thromben im Leerwert (E0) und in den verschiedenen Konzentrationen signifikante bis höchstsignifikante Gewichtsverluste in den einzelnen Stunden. Ausgenommen davon waren nur die Thromben der Konzentrationen E35 und E50, die in den Stunden drei und vier keine signifikanten Gewichtsverluste mehr aufweisen konnten (Abb. 3).
Bei den Thromben des Standards reduzierte sich das Thrombusgewicht in jeder Stunde um durchschnittlich 11,81 % ± 1,64 %. Mit steigender Konzentration des rTPA im Plasma erhöhte sich ebenso die Gewichtsabnahme in jeder Stunde (Tab. 3).
Bei den D-Dimer-Werten war ein Anstieg bei allen rTPA-Konzentrationen zu beobachten (Abb. 4). Die D-Dimer-Werte des Leerwerts (E0) blieben über den gesamten Messzeitraum konstant bei 0,1 mg/l. Im Vergleich der D-Dimer-Werte des Standards (E0) zu den D-Dimer-Werten der verwendeten rTPA-Konzentrationen im Plasma an einem Messzeitpunkt wies die Konzentration E15 an allen Messzeitpunkten höchstsignifikante Unterschiede auf (Abb. 5). Beim Vergleich zwischen den D-Dimer-Werten der Konzentration E15 und den übrigen Werten der
verwendeten Konzentrationen zeigte sich, dass die rTPA-Konzentration E35 an allen Messzeitpunkten signifikant geringere D-Dimer-Werte aufwies. Die D-Dimer-Werte der Konzentration E50 lagen an den Messzeitpunkten 1 bis 3 signifikant niedriger, als die der rTPA-Konzentration E15. Die D-Dimer-Konzentration des Standards (E0) war an den Messzeitpunkten 1 bis 4 im Vergleich mit der D-Dimer Konzentration von E15
höchstsignifikant erniedrigt.
2.5.2 Auswertung Humandaten
Bei der zweifaktoriellen Varianzanalyse konnte eine zeit-und dosisabhängige Reduktion der Thrombengewichte festgestellt werden (Abb. 6). Bei dem Vergleich der Thrombengewichte von Messzeitpunkt 0 mit jedem weiteren Messzeitpunkt (Dunnett-Test), zeigten die Thromben des Standards (H0) und der verwendeten rTPA-Konzentrationen hochsignifikante bis höchstsignifikante Gewichtsabnahmen im Bezug auf den Ausgangswert (Abb. 6). Die Thromben verloren in den vier Stunden Lysezeit beim Leerwert 16 % ihres Ausgangsgewichts, während H005 90 %, H015 85 %, H05 70 % und H15 62 % ihres initialen Gewichts einbüßten.
Betrachtete man die Gewichtsabnahmen des Leerwerts (H0) am MZP 1 bis 4 im Vergleich mit den Gewichtsabnahmen nach Zusatz von rTPA in den verwendeten Konzentrationen, so ergaben sich signifikante bis höchstsignifikante Gewichtsunterschiede an allen Messzeitpunkten, ausgenommen am MZP 1 bei der Konzentration H15, welche keine signifikanten Gewichtsunterschiede zu den Gewichten des Standards (H0) erbrachte (Abb. 7).
Im Gewichtsvergleich von H015 mit den verwendeten Konzentrationen an den einzelnen Messzeitpunkten ergab sich am MZP 1 zur Konzentration H15 ein hochsignifikanter Gewichtsunterschied. Am MZP 3 zeigte sich ein signifikanter Unterschied, an MZP 4 ein hochsignifikanter Unterschied im Gewicht bei der Konzentration von H15 zu H015 (Abb. 7).
Die Thromben wogen zu Beginn der Messung durchschnittlich 0,94 g ± 0,06 g. Die Thromben des Leerwerts wogen am MZP 4 noch 0,73 g ± 0,04 g, und die Thromben der rTPA-Konzentration H005 noch 0,15 g ± 0,04 g. Die Thromben der rTPA- Konzentrationen H015 wogen 0,16 g ± 0,07 g, bei H05 wogen die Thromben 0,28 g ±
Beim Vergleich der Lysepotenziale der jeweiligen rTPA-Konzentration, zeigten die Thromben der rTPA-Konzentration H005, H05 und H15 in den ersten drei Stunden hoch- bis höchstsignifkante Gewichtsabnahmen. In Stunde 4 konnte nur der Standardthrombus sein Gewicht signifikant verringern (Abb. 8).
Der Standardthrombus nahm im Mittel in jeder Stunde 4,3 % ± 1,8 % ab. Mit steigender Konzentration des rTPA im Plasma ging die durchschnittliche Gewichtsreduktion in jeder Stunde zurück (Tab. 4).
Bei den D-Dimer-Werten der Humanthromben zeigte sich über die vier Stunden Lysezeit in allen rTPA-Konzentrationen ein kontinuierlicher Anstieg der Werte. Die D- Dimer-Konzentration des Standards (H0) verblieb in den ersten drei Stunden bei einem Niveau von 0,1 mg/l, und stieg in der vierten Stunde auf einen mittleren Wert von 0,12 mg/l (Abb. 9).
Es konnte ein hoch- bis höchstsignifikanter Anstieg der D-Dimer-Werte im Plasma der unterschiedlichen rTPA-Konzentrationen ab dem MZP 2 im Vergleich zum MZP 0 festgestellt werden (Abb.9).
Vergleiche der D-Dimer-Werte des Standards (H0) mit den D-Dimer-Werten der anderen Konzentrationen an den einzelnen Messzeitpunkten zeigten ab dem MZP 1 hoch- bis höchstsignifikante Zunahmen der D-Dimer-Werte der rTPA- Konzentrationen H005, H015 und H05 (Abb. 10).
Bei der Auswertung der D-Dimer-Werte der Konzentration H015 an jedem Messzeitpunkt im Vergleich mit den Werten der anderen verwendeten Konzentrationen zeigte sich nur ein signifikanter Unterschied in den D-Dimer-Werten bei der Konzentration H15 an MZP 2, und hoch - bis höchstsignifikante Unterschiede an allen Messzeitpunkten zu der D-Dimer-Konzentration des Standards (H0) (Abb. 10).
2.6 Diskussion
Im Rahmen dieser Studie sollten die thrombolytischen Eigenschaften des Plasminogenaktivators Alteplase an in vitro hergestellten equinen Thromben untersucht werden. Das Hauptaugenmerk der Versuchsreihe lag darin, eine Dosis-
2.6.1 Methodik
Die Anzahl der menschlichen und tierischen Spender konnte durch die Messwiederholung auf ein Minimum reduziert werden. Bei den humanen Spendern wurde auf Fremdplasma zurückgegriffen, um den Probanden nur die zur Thrombenherstellung erforderliche Menge Blut abnehmen zu müssen. Die Anzahl der Thromben, die aus jeder Spende hergestellt werden konnten, mussten der Größe des Lysesystems von 20 vorhandenen Lyseplätzen und der Praktikabilität der Messungen angepasst werden. Dabei wurde auf eine möglichst kurze Wiegezeit von unter 10 Minuten geachtet, da während der Messung alle Thromben aus dem Lysesystem entnommen wurden. In dieser Zeit war das Einwirken des Plasminogenaktivators Alteplase nicht möglich.
Bei der Herstellung der Thromben wurde auf ein standardisiertes Verfahren zurückgegriffen (Hirthe 2009). Die Herstellung der equinen Thromben musste jedoch geringfügig in den Mengenverhältnissen der verwendeten Substrate angepasst werden. Sie zeigten bei gleicher Vorlage an Substraten einen erheblichen Größenzuwachs im Vergleich zu den humanen Thromben. Aufgrund ihrer vermehrten Größe ließen sie sich nicht am Faden befestigen. Deshalb wurde für die equinen Thromben die vorgelegte Menge an NaCl um die Hälfte reduziert. Trotz dieser geringeren Vorlage an NaCl waren die absoluten Ausgangsgewichte der equinen Thromben um ca. 2 g höher als die der Thromben aus Humanblut. Dies lässt sich durch die höhere Fibrinogenkonzentration im Pferdeblut im Vergleich zu Menschenblut erklären (Mischke, 2005). Dadurch kann der Pferdethrombus an Größe gewinnen. Die Verwendung humanen Thrombins zur Herstellung equiner Thromben wurde schon in einer anderen Studie zur Lyse mit Streptokinase erprobt.
Dabei zeigten die mit humanem Thrombin hergestellten Thromben von Rind, Schaf und Pferd bei Zugabe von Streptokinase eine Lyse, während mit bovinem Thrombin hergestellten Thromben keine Lyse zeigten (Irfan 1968).
Für alle Konzentrationsstufen von rTPA im Plasma wurden pro Messung mehrere Thromben zur Lyse hergestellt um mögliche Verzerrungen aufgrund von Messungenauigkeiten zu reduzieren. Zudem konnten nicht alle Thromben über vier Stunden gewogen werden, da sie sich aufgrund der vorangeschrittenen Lyse von der Aufhängung lösten und im Plasmagefäß verblieben. Die hier festgesetzte Lysezeit von vier Stunden wurde an die in der Humanmedizin angewendeten Therapieschemen von drei bis sechs Stunden Thrombolysetherapie bei akuten Herzinfarkt- oder Schlaganfallpatienten angepasst (Lyden et al. 2006). Die Ergebnisse zeigen, dass beim Pferd ab einer Plasmakonzentration von 1,5 µg/ml rTPA und beim Menschen bis zu einer Konzentration von 0,15 µg/ml rTPA eine fast vollständige Lyse der Thromben innerhalb von vier Stunden möglich ist.
Das Lysesystem selbst hat jedoch nur eine bedingte Aussagekraft über die Vorgänge im lebenden Organismus. Denn anders als in einem zirkulierenden System ist hier ein Abbau der Alteplase nicht möglich. Im menschlichen Organismus wird der Plasminogenaktivator Alteplase durch Verstoffwechselung in der Leber mit einer HWZ von vier bis fünf Minuten abgebaut (Collen et al. 1989; Gillis et al. 1995). Das Ziel dieses in vitro-Systems war es, eine Aussage über eine mögliche Dosis- Wirkungsbeziehung des Plasminogenaktivators Alteplase auf equine Thromben machen zu können. Dabei wurden die in der humanmedizinischen Literatur angegebenen Risiken der erhöhten Blutungsgefahr bei mehr als 100 mg Alteplase pro Verabreichung in diesem Versuchsaufbau nicht berücksichtigt (Collen et al. 1989;
Semba et al. 2000; Semba et al. 2001).
Auch die pharmakologischen Wirkungen des Plasminogenaktivators wurden in dieser Studie außer Acht gelassen und sollten Gegenstand einer weiteren pharmakokinetischen Studie am Pferd sein.
2.6.2 Ergebnisse
Um die Lyse der Thromben protokollieren zu können, wurde deren Gewicht zu Beginn und anschließend im 60-minütigen Rhythmus ermittelt. Des Weiteren wurde der Gehalt der Fibrinspaltprodukte (D-Dimer) im Ausgangsplasma (MZP 0) und
zeigen eine Gewichtsabnahme der Thromben und einen Anstieg der D-Dimer- Konzentration.
Die Daten der equinen Thromben zeigen dabei einen kontinuierlichen Abfall ihres Gewichts. Im Vergleich zu den anderen verwendeten Konzentrationen, weist die Konzentration von 1,5 µg rTPA/ml die beste Wirkung auf. Die rTPA-Konzentrationen von 3,5 µg rTPA/ml und 5 µg rTPA/ml weisen nur unwesentlich höhere Lyseraten auf, sind aber aus wirtschaftlicher Sicht inakzeptabel und beinhalten unter Umständen eine erhöhte Blutungsneigung. Eine Überschreitung der empfohlenen Applikationsmenge von insgesamt 100 mg oder 0,95 mg/kg führt beim Menschen zu einer erhöhten Blutungsneigung (Collen et al. 1989, Gonzales and Grotta 2006). Bei arteriellen Thrombosen des Menschen sind zwar Therapieansätze mit 5 mg/h über 24 Stunden beschrieben, diese gehen aber ebenfalls mit einer erhöhten Blutungsneigung einher und bieten im Gegenzug keine bessere Lyse als die Behandlung mit niedrigeren Konzentrationen mit einer Gesamtdosis zwischen 3,5 mg und 37 mg (Wagstaff et al. 1995). Schlussfolgernd sollte dem Risiko von unerwünschten Arzneimittelwirkungen beim Pferd dementsprechend durch Nutzung einer geringeren Dosis in Höhe von 1,5 µg rTPA/ml aus dem Weg gegangen werden.
Im Vergleich zu den equinen Thromben zeigt die Gewichtsabnahme der humanen Thromben ein etwas differenzierteres Bild. Auffällig erscheint hierbei, dass die Thromben, die mit den Konzentrationen von 1,5 µg rTPA/ml und 0,5 µg rTPA/ml behandelt wurden, eine deutlich schlechtere Gewichtsabnahme zeigten als die Thromben bei den Konzentrationen von 0,05 µg rTPA/ml und 0,15 µg rTPA/ml. Die relativen Gewichtsabnahmen bei der rTPA-Konzentration 1,5 µg/ml im Vergleich zu der Gewichtsreduktion der rTPA-Konzentration von 0,15 µg/ml waren zu allen Messzeitpunkten signifikant geringer.
Die Tatsache, dass bei der höchsten verwendeten Konzentration von 1,5 µg rTPA/ml beim Menschen nach vier Stunden noch immer knapp 40 % des Thrombus vorhanden war zeigt, dass eine höhere Konzentration in der Wirkung hier kein besseres Lyseergebnis erbringt. Zu ähnlichen Ergebnisse kommt auch eine am Menschen durchgeführte in vitro-Studie (Sobel et al. 1990). Zusätzlich zu den schlechteren Thrombolyseergebnissen der höheren Konzentrationen, wurde dort
auch eine Reduktion des freien und an Thromben gebundenen Plasminogen gemessen. Da in der Studie von Sobel et al. (1990) durch die Zugabe von Plasminogen in den hohen Konzentrationen gute Lyseergebnisse erzielt werden konnten, ist es möglich, dass in einem in vitro-System nicht genügend Plasminogen für die hohen rTPA-Konzentrationen zur Verfügung steht. Dies ist möglicherweise auch auf das Pferd übertragbar, da hier die hohen Konzentrationen von 3,5 µg rTPA/ml und 5 µg rTPA/ml keine relevanten Verbesserungen im Lyseergebnis zu der Konzentration von 1,5 µg rTPA/ml erbrachten. Fraglich bleibt, ob es zu einem Verbrauch von Plasminogen kommt, oder ob der Plasminogenaktivator in zu hoher Konzentration keine Bindungsmöglichkeit an dem im Thrombus eingelagerten Plasminogen findet. Wie in der Studie an Humanthromben, könnte jedoch auch bei den equinen Thromben eine unzureichende Menge an vorhandenem Plasminogen im Lysesystem, das geringere Lysevermögen der hohen rTPA-Konzentrationen erklären (Sobel et al. 1990).
Dass sowohl bei den humanen, als auch bei den equinen Thromben eine Thrombolyse stattgefunden hat, beweist der Anstieg der D-Dimer-Werte bei allen rTPA-Konzentrationen im Plasma. Die physiologischen Werte dieses Gerinnungsparameters liegen beim Menschen und beim Pferd bei weniger als 0,5 mg/l Plasma (Feige et al. 2003a; Himmelreich and Riess 1991). Ein Anstieg der D-Dimer-Konzentration spricht für eine Aktivierung der Fibrinolyse durch die Freisetzung von quervernetztem Fibrin (Dempfle 2000). Die Sensitivität für den Nachweis an D-Dimeren liegt zwischen 93,5 % (Bick and Baker 1992) und 96 % (Lohr et al. 2006). Der hier verwendete Nycocard-D-Dimer-Test basiert auf dem Immunfiltrationsprinzip und wurde schon in anderen Studien erfolgreich beim Pferd eingesetzt (Feige et al. 2003a; Sandholm et al. 1995). Der Messbereich des Nycocard-D-Dimer-Tests umfasst eine Spanne von 0,1 bis 20 mg/l. Der Test ist kalibriert für einen Bereich von 0,1 und 10 mg/l (Produktbeschreibung D-Dimer-Test).
Die D-Dimer-Werte, die bei beiden Spezies in der hier durchgeführten Studie im Plasma gemessen wurden, lagen bei den Equiden maximal bei 10,19 ± 5,04 mg/l und beim Menschen bei 6,15 ± 2,13 mg/l. Aus diesem Grund müssen die gemessenen Werte als Nachweis einer Fibrinolyse verstanden werden, da sie weit
über den physiologischen Bereich hinaus gehen. Bei lebenden Probanden wurden in keiner Studie bei nachweislich stattgefundener Fibrinolyse höhere Werte als 3,5 mg/l erreicht (Feige et al. 2003a; Sandholm et al. 1995; Stern- Balestra 2000). Zudem sind im Bereich zwischen 10 und 20 mg/l Messungenauigkeiten im Test nicht auszuschließen. Somit sind die erhobenen D-Dimer-Werte in dieser Studie als rein qualitativer Nachweis einer Fibrinolyse zu verstehen.
Da die D-Dimer-Werte in dieser Studie bei beiden Spezies im Standardplasma ohne rTPA-Zusatz keine Zunahme verzeichnen, hat dort keine Thrombolyse stattgefunden.
Dennoch wurde eine Reduktion der Thrombengewichte über die Messdaten ermittelt.
Diese Gewichtsabnahme kann durch die physiologische Thrombusretraktion zustande kommen. NaCl wird während der Thrombusformung in das Thrombengerüst eingelagert und im Anschluss über die Zeit wieder freigesetzt. Da die Thromben beider Spezies aus der identischen Menge Blut hergestellt wurden, die Thromben der Pferde aber ein um 2 g höheres Ausgangsgewicht zeigten, ist davon auszugehen, dass mehr NaCl in den equinen Thrombus eingelagert wurde. Durch das Zusammenziehen der Fibrinfäden im Zusammenspiel mit dem aktomyosinähnlichem Protein Thrombosthein, das in Thrombozyten enthalten ist, verfestigt sich der Thrombus im Laufe der Stunden (Weiss und Jelkmann). Diese Retraktion führt beim Pferdethrombus zu einer Gewichtsreduktion von 40 %. Der Thrombus aus Humanblut verliert in der gleichen Zeit nur 18 % seines Ausgangsgewichts. An ex vivo lysierten Thromben wurde zudem festgestellt, dass bei einer Inkubationszeit im Plasma oder Puffer nur ca. 8 % spontane Lyse stattfand (Sabovic and Keber 1996). Somit erscheint die hier verwendete Zusammensetzung der in vitro hergestellten Thromben einen nicht unerheblichen Einfluss auf die Gewichtsabnahme der Thromben zu haben. Eine spontane Fibrinolyse ist dagegen auszuschließen, da in diesem Fall der Nachweis von D-Dimeren im Plasma hätte gelingen müssen.
Betrachtet man die unterschiedlich gewählten Dosierungen an Plasminogenaktivator bei Pferd und Mensch, so fällt auf, dass bei den equinen Thromben erst die 10-fache Menge eine zufriedenstellende Lyse erbrachte. Dies läßt vermuten, das eine Spezies-Spezifität der rTPA-Rezeptoren und des Plasminogens vorliegt. Wie eine
Studie an humanen ex vivo lysierten Thromben zeigte, spielt das verwendete Lysemilieu eine große Rolle bezogen auf den Lyseerfolg (Sabovic and Keber 1996).
Die dort in Plasma lysierten Thromben zeigten eine 50-prozentige Lyse bei einer rTPA-Konzentration von 1 µg/ml. Die Thromben, die in Puffer lysiert wurden, zeigten schon bei 0,1 µg/ml rTPA eine 50-prozentige Lyse und konnten mit einer höheren Konzentration von rTPA auch vollständig aufgelöst werden. Die Autoren erklären die bessere Lyse der Thromben in Puffermilieu durch das Fehlen von α2-Plasmininhibitor (Sabovic and Keber 1996). In der hier durchgeführten Studie ist somit davon auszugehen, dass es durch das Lysieren der Thromben im Plasma und der Anwesenheit von α2-Antiplasmin zu einer geringeren Lyserate als in der Studie von Sabovic und Kleber (1996) kommt. Möglich ist jedoch auch ein erhöhter negativer Einfluss des equinen α2-Antiplasmin auf den humanen rekombinanten Plasminogenaktivator Alteplase. Das wäre ein Erklärungsansatz für die benötigte Dosiserhöhung von rTPA beim Pferd.
Eine wichtige Rolle in der Thrombolysekaskade nimmt das Plasminogen ein. In einer Studie zeigte sich eine signifikant höhere Thrombolyse nach intermittierender Zugabe von Plasminogen und den Aktivatoren Urokinase, Streptokinase oder rTPA.
(Sabovic and Keber 1996). Der positive Effekt des Plasminogens auf das Lyseergebnis wurde zuvor schon in anderen Studien diskutiert (Sobel et al. 1990).
Alteplase ist ein rTPA, das Plasminogen zu Plasmin aktiviert und dadurch die Aufspaltung des Fibrins in lösliche Abbauprodukte herbeiführt (Cesarman-Maus and Hajjar 2005).
In früheren Studien konnte ein ähnlicher Aufbau von menschlichen Plasminogen zu dem des Pferdes sowie anderen Spezies, jedoch mit fraglicher funktioneller Homologie, festgestellt werden. Es stellte sich heraus, dass das Plasminogen des Pferdes keine equimolaren Komplexe mit Streptokinase eingeht, so dass die Autoren eine konzentrationsabhängige Komplexbildung vermuteten (Wohl et al. 1983). In einer weiteren Studie kam es zu keiner Aktivierung des Pferdeplasminogens durch Streptokinase. Die Aktivierung durch rTPA fiel beim Pferd gering aus (Yakovlev et al.
1995).
Zudem nimmt die physikalische Struktur um die Spaltbindungsstelle des Plasminogens beim Pferd unter den verglichenen Spezies eine Ausnahmestellung ein. Dieser unterschiedliche Aufbau, von dem man nicht genau weiß, ob er sich in der primären oder tertiären Struktur manifestiert, führt zu einem 50- bis 100-fachen Anstieg der Michaelis-Menten-Konstante und spricht dadurch für eine niedrige Substratspezifität (Wohl et al. 1983). Der Vergleich der aufgeschlüsselten Proteinsequenzen des Pferdes und des Menschen ergibt eine 79,3 %ige Übereinstimmung der Sequenz (MegAlign, DNASTAR, Inc., version 7.1.0 (44)).
Durch diese nicht vollständige Analogie der Proteinsequenzen könnte eine höhere Konzentration an rekombinantem humanem rTPA nötig sein, um ähnlich gute Lyseergebnisse bei equinen Thromben zu erzielen.
2.6.3 Schlussfolgerung
Alteplase hat nach den vorliegenden Untersuchungsergebnissen einen Einfluss auf die Thrombolyse equiner Thromben in vitro. Dabei ist ein Wirkspiegel von 1,5 µg/ml im Hinblick auf die Dosis-Wirkungsbeziehung und den Kosten-Nutzenrahmen anzustreben. Die Messung der D-Dimer-Werte kann als mögliches Monitoring in die in vivo-Versuche übernommen werden, da sich in vitro gezeigt hat, dass eine Thrombolyse durch den Anstieg der D-Dimer-Werte nachvollziehbar ist.
Da dieser Studienaufbau keine Aussage über die Verträglichkeit des Wirkstoffes Alteplase beim Pferd machen kann, müssen phamakokinetische Studien angeschlossen werden.
2.7 Legende und Abbildungsverzeichnis
Tab. 1: Übersicht über die Versuchstiere und die Aufteilung der Thromben auf die verschiedenen rTPA-Konzentrationen.
Tab. 2: Übersicht über die humanen Probanden und die Aufteilung der Thromben auf die verschiedenen rTPA-Konzentrationen.
Tab. 3: Übersicht über die Gewichtsreduktion der equinen Thromben in Prozent in der angegebenen Stunde (Stunde 1: Min 0 - 60; Stunde 2: Min 61 - 120;
etc.).
Tab. 4: Übersicht über die Gewichtsreduktion der Thromben aus Humanblut in Prozent in dem angegebenen Zeitraum (Stunde 1: Min 1 - 60; Stunde 2:
Min 61 - 120; etc.).
Abb. 1: Reduktion des Thrombusgewichts equiner Thromben in Prozent innerhalb von vier Stunden, Vergleich zwischen Stunde 0 und jeder weiteren Stunde;
* = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001
Abkürzungen in der Legende entspechen den verwendeten Konzentrationen: E0 = 0,0 µg/ml; E05 = 0,5 µg/ml, E15 = 1,5 µg/ml, E35 = 3,5 µg/ml, E50 = 5 µg/ml.
Abb. 2: Reduktion des Thrombusgewichts equiner Thromben in Prozent, Vergleich zwischen dem Standard und jeder weiteren Konzentration zu einem MZP; * = p <0,05; ** = p <0,01;*** = p <0,001; Vergleich zwischen Konzentration 1,5 µg/ml und jeder weiteren Konzentration zu einem MZP
´ = p < 0,05; ´´ = p < 0,01; ´´´ = p <0 ,001
Abkürzungen in der Legende entspechen den verwendeten Konzentrationen: E0 = 0,0 µg/ml; E05 = 0,5 µg/ml, E15 = 1,5 µg/ml, E35 = 3,5 µg/ml, E50 = 5 µg/ml.
Abb. 3 Gewichtabnahme der equinen Thromben in Prozent in der jeweils angegebenen Stunde (Stunde 1: Min 0-60; Stunde 2: Min 61-120; etc.);
* = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p< 0,001
Abkürzungen in der Legende entsprechen den verwendeten rTPA- Konzentrationen: E0 = 0,0 µg/ml; E05 = 0,5 µg/ml, E15 = 1,5 µg/ml, E35 = 3,5 µg/ml, E50 = 5 µg/m.l
Abb. 4: Anstieg der D-Dimere im Verlauf der Thrombolyse innerhalb von vier Stunden beim Pferd ; Vergleich zwischen Stunde 0 und jeder weiteren Stunde; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001
Abkürzungen in der Legende entsprechen den verwendeten rTPA- Konzentrationen: E0 = 0,0 µg/ml; E05 = 0,5 µg/ml, E15 = 1,5 µg/ml, E35 = 3,5 µg/ml, E50 = 5 µg/ml.
Abb. 5: Anstieg der D-Dimere im Verlauf der Thrombolyse beim Pferd; Vergleich zwischen dem Standard und jeder weiteren Konzentration zu einem MZP;
* = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001
Vergleich zwischen Konzentration 1,5 µg/ml und jeder weiteren Konzentration zu einem MZP;´ = p < 0,05; ´´ = p < 0,01; ´´´= p < 0,001
Abkürzungen in der Legende entsprechen den verwendeten rTPA- Konzentrationen: E0 = 0,0 µg/ml; E05 = 0,5 µg/ml, E15 = 1,5 µg/ml, E35 = 3,5 µg/ml, E50 = 5 µg/ml.
Abb. 6: Reduktion des Thrombusgewichts der Thromben aus Humanblut in Prozent innerhalb von vier Stunden, Vergleich zwischen Stunde 0 und jedem weiteren MZP im Standard und in jeder Konzentration;
* = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001
Abkürzungen in der Legende entsprechen den verwendeten rTPA- Konzentrationen: H0 = 0,0 µg/ml; H005 = 0,05 µg/ml, H015 = 0,15 µg/ml, H05 = 0,5 µg/ml, H15 = 1,5 µg/m.
Abb. 7: Reduktion des Thrombusgewichts der Thromben aus Humanblut in Prozent, Vergleich zwischen dem Standard und jeder weiteren Konzentration zu einem MZP; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p <0,001 Vergleich zwischen Konzentration 0,15 µg/ml und jeder weiteren Konzentration zu einem MZP ´ = p < 0,05; ´´ = p < 0,01; ´´´ = p < 0,001
Abkürzungen in der Legende entsprechen den verwendeten rTPA- Konzentrationen: H0 = 0,0 µg/ml; H005 = 0,05 µg/ml, H015 = 0,15 µg/ml, H05 = 0,5 µg/ml, H15 = 1,5 µg/m.
Abb. 8: Gewichtabnahme der Thromben aus Humanblut in Prozent in der jeweils angegebenen Stunde (Stunde 1: Min 1 - 60; Stunde 2: Min 61 - 120; etc.);
* = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001
Abkürzungen in der Legende entsprechen den verwendeten rTPA- Konzentrationen: H0 = 0,0 µg/ml; H005 = 0,05 µg/ml, H015 = 0,15 µg/ml, H05 = 0,5 µg/ml, H15 = 1,5 µg/m.
Abb.9: Anstieg der D-Dimere im Verlauf der Thrombolyse innerhalb von vier Stunden in menschlichem Plasma; Vergleich zwischen Stunde 0 und jeder weiteren Stunde im Standard und in jeder Konzentration; * = p < 0,05;
** = p < 0,01; *** = p < 0,001
Abkürzungen in der Legende entsprechen den verwendeten rTPA- Konzentrationen: H0 = 0,0 µg/ml; H005 = 0,05 µg/ml, H015 = 0,15 µg/ml, H05 = 0,5 µg/ml, E15 = 1,5 µg/m.
Abb. 10: Anstieg der D-Dimere im Verlauf der Thrombolyse in menschlichem Plasma; Vergleich zwischen dem Standard und jeder weiteren Konzentration zu einem MZP; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001 Vergleich zwischen Konzentration 0,15µg/ml und jeder weiteren Konzentration zu einem MZP; ´ = p < 0,05; ´´ = p < 0,01; ´´´ = p < 0,001
Abkürzungen in der Legende entsprechen den verwendeten Konzentrationen: H0 = 0,0 µg/ml; H005 = 0,05 µg/ml, H015 = 0,15 µg/ml, H05 = 0,5 µg/ml, H15 = 1,5 µg/m.
Tab. 1
ID Geschlecht Alter Anzahl der Thromben
Leerwert E0
rTPA 0,5 µg/ml
E05
rTPA 1,5 µg/ml
E15
rTPA 3,5 µg/ml
E35
rTPA 5 µg/ml
E50
1 Wallach 25 20 4 4 4 4 4
2 Stute 21 20 4 4 4 4 4
3 Stute 14 20 4 4 4 4 4
4 Stute 17 18 4 4 4 3 3
5 Stute 21 6 3 - 3 - -
6 Stute 4 6 3 - 3 - -
7 Stute 17 6 3 - 3 - -
Tab. 2
ID Geschlecht Alter Anzahl der Thromben
Leerwert H0
rTPA 0,05 µg/ml
H005
rTPA 0,15 µg/ml
H015
rTPA 0,5 µg/ml
H05
rTPA 1,5 µg/ml
H15
1 Weiblich 23 20 4 4 4 4 4
2 Weiblich 23 20 4 4 4 4 4
3 Männlich 21 20 4 4 4 4 4
Tab. 3
Konzen- tration
MZP 1 MZP 2 MZP 3 MZP 4 MW ±
s
Leerwert
E0 14,1 ± 7,8
10,6 ± 5,1
10,6 ± 11,4
12,0 ± 7,5
11,8 ± 1,6
rTPA 0,5 µg/ml E05
23,3±
8,7
14,8 ± 6,0
16,3 ± 7,7
20,4 ± 8,5
18,7 ± 3,9
rTPA 1,5 µg/ml E15
41,8 ± 10,4
36,0 ± 28,2
41,9 ± 10,9
44,7 ± 21,1
41,1 ± 3,7
rTPA 3,5 µg/ml E35
50,5 ± 15,1
42,9 ± 4,9
50,4 ± 16,7
43,5 ± 7,8
46,8 ± 4,2
rTPA 5 µg/ml E50
54,4 ± 14,4
43,8 ± 15,0
59,1 ± 16,3
63,4 ± 25,6
55,2 ± 8,4
Tab. 4
Konzen- tration
MZP 1 MZP 2 MZP 3 MZP 4 MW ±
s
Leerwert
H0 6,2 ± 2,5
1,9 ± 3,0
4,8 ± 1,6
4,3 ± 1,1
4,3 ± 1,8 rTPA
0,05 µg/ml H005
28,5 ± 7,2
38,5 ± 3,8
47,3 ± 19,3
64,6 ± 31,4
45,0±
13,6 rTPA
0,15 µg/ml H015
44,9 ± 26,9
27,5 ± 25,0
43,8 ± 14,9
30,1 ± 31,0
36,6 ± 9,0
rTPA
0,5 µg/ml H05
30,0 ± 8,4
32,2 ± 6,4
22,4 ± 3,5
16,8 ± 4,7
25,3 ± 7,1
rTPA
1,5 µg/ml H15
17,0 ± 4,9
28,8 ± 8,0
23,9 ± 18,4
22,8 ± 24,4
23,1 ± 4,8
Abb. 1
***
***
*** ***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
*** ***
***
***
*** ***
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 1 2 3 4
MZP
Lyse in Prozent
Standard, E0 E05 TPA 1,5µg/ml TPA 3,5µg/ml TPA 5µg/ml
Abb. 2
'''
'''
''' '''
* '''
* '''
* '''
*** '''
***
***
***
***
***
*** ''
*** ***
*** ''
*** ''
*** ***
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 1 2 3 4
MZP Thrombusgewicht in %Gewichtsreduktion in %
Abb. 3
***
***
***
***
***
**
***
***
***
***
* ***
***
**
**
**
***
**
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Stunde 0 Stunde 1 Stunde 2 Stunde 3 Stunde 4 Stunde 5
Gewichtsabnahme in %
4 3
2
1 Stunde
Abb. 4
*
***
***
**
*** ***
***
*** ***
**
** *** ***
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0 1 2 3 4
MZP
D-Dimer in mg/l
Abb. 5
''' ''' '''
''' '
***
***
***
*** ***
***
' ' ' ' '
' ' *
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0 1 2 3 4
MZP
D-Dimer in mg/l
Abb. 6
*** ***
** ***
***
***
***
***
*** ***
***
***
*** ***
***
***
*** ***
***
**
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 1 2 3 4
MZP
Gewichtsreduktion in %
Abb. 7
''' ''' ''' '''
***
***
***
**
*** ***
***
***
*** ***
***
***
*** ''
*** '
**
''
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 1 2 3 4
MZP
Thrombolysegewicht in %
Abb. 8
**
***
***
**
***
***
*
**
**
*
**
*
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
Stunde 0 Stunde 1 Stunde 2 Stunde 3 Stunde 4 Stunde 5
Gewichtsabnahme in %
3 4
1 2 Stunde
Abb. 9
*
**
***
***
*
***
*** ***
*
** *** ***
**
*** **
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 1 2 3 4
MZP
D-Dimer in mg/l
Abb. 10
''' '' '' '''
**
***
***
**
**
***
***
**
*
*** ** *
** '
**
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 1 2 3 4
MZP
D-Dimer in mg/l
