Untersuchungen über den embryonalen Einfluss auf die uterine Durchblutung und die endometriale Genexpression
während der Frühgravidität anhand eines Superovulationsmodells beim Rind
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Michael Steufmehl
Leonberg
Hannover 2010
Klinik für Rinder
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Burkhard Meinecke
Tag der mündlichen Prüfung: 9. Dezember 2010
Gefördert von der H. WILHELM SCHAUMANN STIFTUNG, Hamburg, Deutschland
Meinen Eltern
in Liebe und Dankbarkeit
gewidmet
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG... 11
2 MATERIAL UND METHODEN... 22
2.1 Tiere ... 22
2.2 Versuchsanordnung ... 22
2.2.1 Versuchsmodelle... 23
2.2.2 Superovulationsbehandlung... 26
2.2.3 Kriterien im Versuchsmodell... 27
2.3 Klinische Untersuchung... 27
2.4 Farbdopplersonographie und B-Mode-Sonographie ... 28
2.4.1 Auswertung der Dopplerwellen... 28
2.5 Follikelpunktion... 30
2.6 Embryonengewinnung und Embryobeurteilung... 31
2.7 Plasmagewinnung und Steroidhormonbestimmung ... 33
2.8 Endometriumsbiopsien... 34
2.8.1 Probengewinnung ... 34
2.8.2 Histologische Untersuchung... 34
2.8.3 Expressionsanalyse ... 35
2.9 Statistische Auswertung ... 37
3 ERGEBNISSE... 38
3.1 Befunde der klinischen Untersuchung... 38
3.2 Anzahl der Modelldurchläufe ... 38
3.3 Gelbkörperzahl nach hormoneller Behandlung ... 38
3.4 Quantität und Qualität der Embryonen im S-Modell ... 39
3.5 Uteriner Blutfluss ... 40
3.5.1 Pulsatility Index ... 40
3.5.2 Blutflussvolumen ... 41
3.6 Sexualsteroidhormonkonzentration im Plasma ... 43
3.6.1 Plasmaprogesteronkonzentration... 43
3.6.2 Gesamtöstrogenkonzentration ... 44
3.7 Genexpressionsanalyse ... 45
4 DISKUSSION ... 48
4.1 Schlussfolgerung... 56
5 ZUSAMMENFASSUNG ... 57
6 SUMMARY... 60
7 ANHANG... 62
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 65
9 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 85
10 TABELLENVERZEICHNIS ... 87
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A. Arteria
Aa. Arteriae
Abb. Abbildung
AT annealing temperature
BE Blutentnahme
BFV Blutflussvolumen (blood flow volume)
BKCa Kalzium-abhängige Kaliumkanäle
bzw. beziehungsweise
bp Basenpaar (base pair)
C. Cornu
Ca2+ Kalzium
°C Grad Celsius
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat
cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat
cGTP zyklisches Guanosintriphosphat
CL Corpora lutea
cm Zentimeter
Cq Anzahl der Amplifizierungszyklen
d Tag
DNA Desoxyribonukleinsäure
eCG equines Choriongonadotropin
Etot Gesamtöstrogen
EIA Enzymimmunoassay
et al. et alii
eNOS endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase
ER Östrogenrezeptor
Fa. Firma
FA fluorescence acquisition
FSH Follikelstimulierendes Hormon
g Gravitationsbeschleunigung
GnRH Gonadotropin-Releasing-Hormon
h Stunden
Hz Hertz
IFN-τ Interferon tau
i.m. intramuskulär
iNOS induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase IU Internationale Einheiten (international units)
Inc. Incorporation
KB künstliche Besamung
KS-Modell Kontrollsuperovulationsmodell
log Logarithmus
L-NAME L-Nitro-Arginin-Methylester
m Meter
MDF minimale diastolische Frequenzverschiebung
(minimum diastolic frequency shift)
MHz Megahertz
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
mRNA Messenger Ribonukleinsäure
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
NBCS New Born Calf Serum
ng Nanogramm
NO Stickstoffmonoxid
nNOS neuronale Stickstoffmonoxidsynthase
p Irrtumswahrscheinlichkeit
P4 Progesteron
PAF Plättchen aktivierender Faktor (platelet activating factor)
PBS Phosphate Buffered Saline
pg Picogramm
PGE Prostaglandin E
PGF2α Prostaglandin F2α
PGR Progesteronrezeptor
PI Pulsatility Index
PKG cGMP abhängige Proteinkinase
p.o. post ovulationem
PSF maximale systolische Frequenzverschienung (peak systolic frequency shift)
PTGER Prostaglandin E2-Rezeptor
r Korrelationskoeffizient
R. Ramus
RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
s Sekunde
S-Modell Superovulationsmodell
SB Scheinbesamung
SEM Standardfehler
SP Schmelzpunkt
TAMF mittlere maximale Frequenzverschiebung (time averaged maximum frequency shift)
TAMV mittlere maximale Blutflussgeschwindigkeit (time averaged maximum velocity)
uBFV uterines Blutflussvolumen (arithmetisches Mittel aus dem BFV der rechten und linken A. uterina)
UK United Kingdom
U-Modell unstimuliertes Modell
uPI uteriner Pulsatility Index (arithmetisches Mittel aus dem PI der rechten und linken A. uterina)
USA United States of America
V. Vena
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor-Rezeptor
arithmetisches Mittel
% Prozent
1 EINLEITUNG
Die embryonale Mortalität ist eine der Hauptursachen für Fertilitätsstörungen beim Milchrind (INSKEEP u. DAILEY 2005; DISKIN u. MORRIS 2008) und geht jährlich mit erheblichen wirtschaftlichen Verlusten einher (DUNNE et al. 2000; BINELLI et al.
2001). Während bei Hochleistungsrindern die Befruchtungsraten seit vielen Jahren konstant bei 80 bis 90 % liegen (D. P. RYAN et al. 1993; SARTORI et al. 2002;
CERRI et al. 2009), haben sich die Konzeptionsraten in den Milchviehherden in den letzten sechs Jahrzehnten stetig verschlechtert. Lagen sie in den fünfziger Jahren noch bei über 50 % (K.R. JOHNSON et al. 1958; MARES et al. 1961), so kommen einige neuere Studien auf Konzeptionsraten von unter 35 % (DROST et al. 1999;
PANCARCI et al. 2002; NORMAN et al. 2009).
Der Zeitraum, in dem die embryonale Mortalität am häufigsten auftritt, liegt beim Rind in den ersten sechzehn Tagen post inseminationem (DISKIN u. SREENAN 1980;
DISKIN u. MORRIS 2008). Beim Hochleistungsrind wird dieser Zeitpunkt sogar noch früher, nämlich in den ersten acht Tagen post inseminationem, gesehen (DISKIN u.
MORRIS 2008). Dafür sprechen Studien bei Milchkühen, in denen die Anzahl der in vivo gewonnenen degenerierten Embryonen und der Embryonen, die ein abnormales Entwicklungsstadium aufwiesen, schon an Tag 5 (WIEBOLD 1988) bzw. zwischen den Tagen 6 und 7 post inseminationem (AYALON 1978; SARTORI et al. 2002) am höchsten war.
Um eine Trächtigkeit zu etablieren und zu erhalten ist eine intakte embryo-maternale Kommunikation (WOLF et al. 2003; KLEIN et al. 2006) mit einer Vielzahl an Signalen und Interaktionen zwischen dem Konzeptus und der maternalen Umgebung notwendig (THATCHER et al. 1984a; SPENCER u. BAZER 1995; THATCHER et al.
1997). Eine Störung dieses Netzwerkes der embryo-maternalen Kommunikation führt zu einer Asynchronität zwischen der Entwicklung des Embryos und der uterinen Umgebung und damit zum Tod des Konzeptus (GOFF 2002). Als Teil des Netzwerkes der embryo-maternalen Kommunikation scheint neben verschiedener vom Embryo (BAZER 1992; WOLF et al. 2003) und vom mütterlichen Organismus
(THATCHER et al. 1997; AROSH et al. 2004b) produzierter Substanzen auch der uterine Blutfluss bereits vor der Implantation eine wichtige Rolle zu spielen (HONNENS et al. 2008b).
Es wurde gezeigt, dass es beim Rind gegenüber dem Zyklus während der ersten drei Trächtigkeitswochen, also noch vor der Implantation, zu charakteristischen Veränderungen in der uterinen Perfusion kommt (FORD et al. 1979; FORD u.
CHENAULT 1981; HONNENS et al. 2008b). So wurde in älteren Studien mittels um die A. uterina implantierter Blutflusssonden beobachtet, dass es bei graviden Kühen zwischen dem 14. und 18. Graviditätstag zu einem vorübergehenden Anstieg im Blutflussvolumen (BFV) auf der Seite des graviden Uterushorns kommt und deshalb wurde vermutet, dass diese Blutflussänderung in Zusammenhang mit der Trächtigkeitserkennung steht (FORD et al. 1979; FORD u. CHENAULT 1981). In einer jüngeren Studie (HONNENS et al. 2008b), in der die Durchblutung in der A. uterina mittels transrektaler Farbdopplersonographie gemessen wurde, zeigte sich bereits zu einem früheren Zeitpunkt der Gravidität ein Anstieg der uterinen Perfusion ipsilateral zum Corpus luteum: die Blutflussgeschwindigkeit (TAMV) in der A. uterina stieg erstmals zwischen dem 9. und dem 11. Graviditätstag an und fiel darauf hin bis zum 18. Graviditätstag auf Minimalwerte ab. Der ebenfalls gemessene Blutflusswiderstand bzw. Pulsatility Index (PI), welcher den Gefäßwiderstand im versorgten Organ widerspiegelt (DICKEY 1997), sank langsam zwischen dem 3. und 11. Graviditätstag ab und stieg, entgegengesetzt zur Blutflussgeschwindigkeit, bis zum 18. Graviditätstag auf Maximalwerte an. Ohne direkte Beweise zu liefern, vermuten die Autoren (HONNENS et al. 2008b), dass der Blutflussanstieg auf die Produktion vasoaktiver Substanzen durch den Embryo oder das Muttertier zurückzuführen sein könnte.
Interessante Ergebnisse lieferte eine weitere dopplersonographische Studie (HONNENS et al. 2008a), in der die uterine Perfusion erstmals im Rahmen eines Multiple Ovulation und Embryo Transfer (MOET)-Programms untersucht wurde. Die mit equinem Choriongonadotropin (eCG) behandelten Kühe wiesen sieben Tage post inseminationem eine doppelt so hohe uterine Durchblutung wie im vorausgegangenen unstimulierten Diöstrus auf. Die Autoren diskutierten zwei
mögliche Ursachen für die bereits am 7. Graviditätstag enorm hohen Blutflusswerte der superovulierten Kühe: da das BFV positiv mit der Zahl der entwickelten Corpora lutea und der Plasmaprogesteronkonzentration am gleichen Tag korrelierte, könne der gesteigerte uterine Blutfluss zum einen auf die höhere Zahl an Corpora lutea zurückzuführen sein. Dies sei möglich, weil die A. uterina scheinbar über eine Blutflussumkehr im R. uterinus der A. ovarica während der Lutealphase des Zyklus und der Gravidität an der Versorgung des Ovars mitbeteiligt ist (LAMOND u. DROST 1974; FORD u. CHENAULT 1981). Als weitere Ursache für die gesteigerte uterine Perfusion zogen die Autoren (HONNENS et al. 2008a) die Entwicklung mehrerer Embryonen in Betracht. Sie vermuten, dass die höhere Zahl an Embryonen mit einer gesteigerten Produktion an vasoaktiven Substanzen einhergeht und dadurch bereits zu einem früheren Zeitpunkt als bei einer Einlingsgravidität eine Blutflusssteigerung ausgelöst wird.
Die Hypothese, dass der Embryo durch die Synthese vasoaktiver Substanzen eine lokale Stimulation des uterinen Blutflusses bedingt, wurde nicht nur für das Rind (FORD 1985; HONNENS et al. 2008b; SILVA u. GINTHER 2010), sondern auch für das Schaf (REYNOLDS et al. 1984), das Schwein (FORD u. CHRISTENSON 1979;
FORD et al. 1982) und das Pferd (BOLLWEIN et al. 2003; SILVA et al. 2005) geäußert. Als mögliche vasoaktive Substanzen werden besonders Östrogene (FORD et al. 1979; FORD 1982; REYNOLDS et al. 1983) und Prostaglandine (LEWIS et al.
1982; THATCHER et al. 1984b; FORD 1985) diskutiert.
Die Produktion von Östrogenen durch den Embryo wurde beim Rind unter in vitro Bedingungen ab Tag 11 nach der Befruchtung nachgewiesen (WILSON et al. 1992).
Der vasoaktive Effekt von Östradiol-17β in Form einer Steigerung der uterinen Durchblutung wurde bereits in Studien an Schafen (KILLAM et al. 1973; MAGNESS et al. 1998) und Rindern (ROMAN-PONCE et al. 1978; KNICKERBOCKER et al.
1986) gezeigt. In den beiden Studien an Rindern wurde bereits 30 Minuten (KNICKERBOCKER et al. 1986) bzw. 45 Minuten (ROMAN-PONCE et al. 1978)
nach der exogenen Applikation von Östradiol-17β ein Anstieg in der uterinen Durchblutung festgestellt.
Die Wirkungsweise der Östrogene auf die uterine Durchblutung ist noch nicht eindeutig geklärt. Es wird sowohl ein nichtgenomischer Effekt (STORMSHAK u.
BISHOP 2008), als auch eine Wirkung über die Induktion von Transkriptions- vorgängen diskutiert (ROSENFELD et al. 1996). Der kurze Zeitabstand zwischen der Applikation von Östradiol-17β und dem vasoaktiven Effekt auf die uterinen Gefäße (KNICKERBOCKER et al. 1986) sprechen für einen direkten, nichtgenomischen Einfluss der Östrogene. Für einen transkriptionsunabhängigen Wirkmechanismus spricht außerdem, dass durch die Blockade des Transkriptionsvorgangs mittels Actinomycin D (RESNIK et al. 1975; PENNEY et al. 1981) die blutflusssteigernde Wirkung der Östrogene auf die uterine Durchblutung nicht unterbunden wird.
Dennoch scheint für die Wirkung der Östrogene die Synthese von Proteinen mit- beteiligt zu sein, da durch die Hemmung der Proteinsynthese mittels Cyclohexamid (KILLAM et al. 1973) der unmittelbare vasoaktive Effekt von Östradiol-17β aufge- hoben werden konnte. Dies führte zu der Annahme, dass Östrogene ihre Wirkung auf den Blutfluss über Mediatoren entfalten (REYNOLDS 1986; ROSENFELD et al.
1996).
Als einer dieser Mediatoren wurde der sehr potente Vasodilatator Stickstoffmonoxid (NO) (PALMER et al. 1987; CAMERON u. CAMPBELL 1998) identifiziert (VANBUREN et al. 1992; ROSENFELD et al. 1996; ROSENFELD et al. 2000;
ROSENFELD et al. 2002). Bei Versuchen an Schafen konnte der blutflussstimu- lierende Effekt von Östradiol-17β mit dem NO-Synthasehemmer L-Nitro-Arginin-Me- thylester (L-NAME) abgeschwächt werden (ROSENFELD et al. 1996). Die Informa- tion zur Neusynthese des Mediators wird über Östrogenrezeptoren vermittelt (CHEN et al. 2004; MAGNESS et al. 2005). Dazu gehören die beiden Östrogenrezepto- ren (ER) ERα und ERβ, die in den uterinen Gefäßen beim Schaf (M. J. BYERS et al.
2005; LIAO et al. 2005) und im Endometrium beim Rind (WALTHER et al. 1999;
SINGH et al. 2008) nachgewiesen wurden. Die Neusynthese von NO wird durch ein System aus NO-Synthasen katalysiert (DIXIT u. PARVIZI 2001). Dazu gehören drei Formen: die beiden von Kalzium bzw. Calmodulin abhängigen Enzyme, die neuro-
nale NO-Synthase (nNOS) und die endotheliale NO-Synthase (eNOS) sowie als dritte Form die von Kalzium unabhängige induzierbare NO-Synthase (iNOS) (NATHAN 1992; CAMERON u. CAMPBELL 1998). Im Endometrium des Rindes konnten während des Zyklus (GROEBNER et al. 2008; JORDAN et al. 2009) und während der Frühgravidität (GROEBNER et al. 2008) die beiden NO-Synthasen iNOS und eNOS nachgewiesen werden. Bei verschiedenen Spezies wurde die eNOS als die dominante Form der NO-Synthasen im zyklischen Endometrium dargestellt (KHORRAM et al. 1999; WELTER et al. 2004). Bislang wurde kein direkter Zusammenhang zwischen dem NO-System und der uterinen Durchblutung beim Rind nachgewiesen (BERTMANN 2005), jedoch deuten neuere Studien auf mögliche Zusammenhänge zwischen dem NO-System und dem uterinen Blutfluss in der Frühgravidität hin: Schwankungen im endometrialen mRNA-Expressionsmuster der NO-Synthasen eNOS und iNOS von Rindern in den ersten drei Trächtigkeitswochen (GROEBNER et al. 2008) ähnelten denen, die für den uterinen Blutfluss beschrieben wurden (HONNENS et al. 2008b).
Beim Schaf wurde die eNOS nicht nur im Endometrium, sondern auch in der Gefäßwand der A. uterina nachgewiesen (MAGNESS et al. 1997; VAGNONI et al.
1998; MAGNESS et al. 2001). Vor allem die eNOS, deren Proteinexpression in den Gefäßen durch Östrogene stimuliert wird (RUPNOW et al. 2001), soll an der NO-Synthese in den Gefäßen verantwortlich sein (JANSSENS et al. 1992; NATHAN u. XIE 1994). Der vasodilatatorische Effekt von NO wird über dessen Bindung an die Hämgruppe der löslichen Form der Guanylylcyclase initiiert. Dadurch wird das Enzym aktiviert und die Umwandlung von zyklischem Guanosintriphosphat (cGTP) in zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) stimuliert, welches die cytosolische Ca2+
Konzentration senkt (NATHAN 1992; VANBUREN et al. 1992; NELSON u. COX 2001).
Östrogene entfalten ihre vasodilatative Wirkung aber nicht nur über spezifische Re- zeptoren und NO, sondern auch über periarterielle α-adrenerge Rezeptoren (FORD 1982). Hydroxylierte Östrogenverbindungen, die Katecholöstrogene, sollen den vaso- konstriktorischen Effekt der an den α-adrenergen Rezeptoren wirkenden Transmitter durch die Blockade von potential-abhängigen Ca2+-Kanälen aufheben (STICE et al.
1987b; FORD 1995). Zudem vermuten einige Autoren, dass Östrogene die Fähigkeit besitzen, die Zahl und die Aktivität der α-adrenergen Rezeptoren zu reduzieren (FORD et al. 1977; FORD 1982; REYNOLDS 1986).
Unter den Prostaglandinen wird vor allem Prostaglandin E (PGE), dessen vasodilata- torische Wirkung auf uterine Gefäße unterschiedlicher Spezies, wie denjenigen des Menschen (KIMURA et al. 1995), des Kaninchens (VENUTO et al. 1975) und des Schafes (RESNIK u. BRINK 1978; STILL u. GREISS 1978) bekannt sind, eine ursächliche Beteiligung an der erhöhten uterinen Durchblutung während der Früh- gravidität beim Rind zugeschrieben (THATCHER et al. 1984b; FORD 1985;
REYNOLDS 1986). Außerdem werden die Prostaglandine als Mediatoren der vaso- dilatatorischen Eigenschaften der Östrogene angesehen, da mittels Indomethacin, einem Prostaglandinsynthasehemmer, der vasodilatatorische Effekt der Östrogene gehemmt wird (M. J. RYAN et al. 1974; OSPINA et al. 2003). Verantwortlich für die Wirkung von Prostaglandin E2 (PGE2) an den Zielzellen ist eine Ligand-Rezeptor- Interaktion (COLEMAN et al. 1994; AROSH et al. 2004a). Für PGE2 existieren vier Subtypen an Rezeptoren, von denen der Rezeptor-Subtyp 2 (PTGER2) beim Rind sowohl während der Frühgravidität als auch im fortgeschrittenem Graviditätsstadium am stärksten exprimiert wird (AROSH et al. 2003; AROSH et al. 2004a). Es konnte gezeigt werden, dass das Expressionsmuster von PTGER2 im bovinen Endometrium durch das Trächtigkeitssignal Interferon (IFN)-τ stimuliert wird (AROSH et al. 2004b).
Im Uterus von Ratten und Mäusen konnten die ovariellen Steroidhormone, die Östro- gene und Progesteron, als Regulatoren der PTGER2-Expression identifiziert werden (LIM u. DEY 1997; PAPAY u. KENNEDY 2000). Auch PGE2 selbst, dessen Synthese im Endometrium durch NO stimuliert werden soll (FRANCHI et al. 1994; CAMERON u. CAMPBELL 1998), wurde beim Menschen als expressionssteigernder Faktor für PTGER2 in verschiedenen Geweben identifiziert (JABBOUR et al. 2001; SALES et al. 2001). Nach Aktivierung von PTGER2 vermittelt der Rezeptor seine Wirkung durch die Synthese von cAMP (COLEMAN et al. 1994; AROSH et al. 2004b). Damit tragen PGE2 und PTGER2 unter anderem zur Vasodilatation beim Rind bei (AROSH et al. 2004b). Hinsichtlich des vasorelaxierenden Wirkmechanismus von PGE2
konnte beim Hund ein positiver Zusammenhang zwischen PGE2 und der Freisetzung von NO als aktives Reagenz nachgewiesen werden (KIMURA et al. 1992). Dagegen schränkte beim Menschen die Kombination von PGE2 mit dem NO-Synthasehemmer L-NAME die vasorelaxierenden Eigenschaften von PGE2 nicht ein (KIMURA et al.
1995). Daraus folgerten die Autoren (KIMURA et al. 1995), dass PGE2 unabhängig von NO vasorelaxierend wirkt und einen direkten Einfluss auf die glatte Gefäßmus- kulatur besitzt. An isolierten Koronararterien beim Menschen wurde ein direkter Effekt von PGE2 durch die Aktivierung von Ca2+-abhängigen Kaliumkanälen (BKCa) beobachtet (ZHU et al. 2002). Diese Kanäle wurden durch cGMP-abhängige Proteinkinasen (PKG) aktiviert. ZHU et al. (2002) gingen aber von einer gesteigerten Freisetzung von cAMP durch PGE2 aus, und vermuten, dass die Wirkung von cAMP auf BKCa über eine Kreuzreaktion von cAMP mit PKG vermittelt wird. Kalzium- abhängige Kaliumkanäle, die ebenfalls durch PKG aktiviert werden, wurden auch an den uterinen Gefäßen bei Schafen gefunden (ROSENFELD et al. 2000).
In der Literatur sind unterschiedliche Angaben über den Zeitpunkt der erstmaligen embryonalen PGE2 Synthese zu finden. Es gibt Studien, nach denen der bovine Em- bryo unter in vitro Bedingungen bereits 48 Stunden nach der Befruchtung fähig ist PGE2 zu produzieren (GUREVICH et al. 1993; GUREVICH u. SHEMESH 1994). In anderen Arbeiten konnte dagegen ebenfalls unter in vitro Bedingungen eine PGE2
Synthese durch die bovine Blastozyste erst in der zweiten Woche nach der Befruch- tung, nämlich an den Tagen 10 bzw. 11 (WILSON et al. 1992) und 13 (SHEMESH et al. 1979) nachgewiesen werden.
Nach Stimulation einer Superovulation mittels eCG wurde neben den vom Embryo produzierten Östrogenen und PGE auch das nach hormoneller Stimulation in großen Mengen vom mütterlichen Organismus produzierte Progesteron mit der Blutflussre- gulation während der Frühgravidität in Zusammenhang gebracht (HONNENS et al.
2008a). Der regulatorische Einfluss auf die Kontraktilität der Gefäße wird über die in den Gefäßen befindlichen Progesteronrezeptoren (PGR) vermittelt (PERROT- APPLANAT et al. 1994). Die Wirkung von Progesteron auf den uterinen Blutfluss wird in der Literatur unterschiedlich beschrieben. Einen vasokonstriktorischen Effekt
im uterinen Gefäßbett (FORD et al. 1977; FORD 1982) soll Progesteron durch die Erhöhung der Norepinephrinkonzentration an den periarteriellen α-adrenergen Rezeptoren über die Hemmung der Katechol-O-Methyltransferase (KALSNER 1969) bewirken (FORD et al. 1977). Hingegen wurde in Studien bei der Ratte (CHAN et al.
2001) und beim Schwein (MOLINARI et al. 2001) gezeigt, dass Progesteron in verschiedenen Gefäßsystemen vasodilatatorische Eigenschaften besitzt und dadurch zur Steigerung des Blutflusses beiträgt. Diese vasodilatatorische Wirkung scheint über NO ausgelöst zu werden (CHAN et al. 2001; MOLINARI et al. 2001). Dazu passen die Ergebnisse aus einer Studie, die den Effekt von Östradiol und Proge- steron auf die Expression von eNOS in den uterinen Gefäßen untersuchte (RUPNOW et al. 2001): sowohl Progesteron alleine als auch die Kombination von Progesteron mit Östradiol-17β führte zu einem Anstieg von eNOS im Endothel der A. uterina.
Die uterine Umgebung nimmt für die Entwicklung des Embryos eine Schlüsselrolle ein (GUILLOMOT et al. 1988). Im Laufe der Trächtigkeit kommt es zu zahlreichen morphologischen (KING et al. 1981; GUILLOMOT u. GUAY 1982) und funktionellen (BONAFOS et al. 1995) Änderungen des Endometriums, die unter anderem mit Transformationen im Transkriptomprofil (BAUERSACHS et al. 2008) einhergehen.
Die Dichten der Rezeptoren für Oxytocin und für Östrogene nehmen ab, wodurch vor allem die Luteolyse verhindert werden soll (ROBINSON et al. 1999; KIMMINS u.
MACLAREN 2001; ROBINSON et al. 2001). Es ist aber auch eine vermehrte Vaskulo- und Angiogenese zu verzeichnen (REYNOLDS u. REDMER 1992). Die Angiogenese im Uterus und anderen Reproduktionsorganen nimmt eine Sonder- stellung im adulten Gewebe ein (REYNOLDS et al. 1992). Sie ist über die Induktion der Proliferation und Kulmination von Arteriolen, Kapillaren und Venolen (FOLKMAN u. KLAGSBRUN 1987) an dynamischen Umbauvorgängen des Uterus mitbeteiligt (REYNOLDS et al. 1992). Unter den angiogenen Faktoren sind der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sowie dessen Rezeptoren (VEGFR) von besonderer Bedeutung (FERRARA u. DAVIS-SMYTH 1997; FERRARA et al. 2003).
VEGF vermittelt seine Wirkung mittels zweier von Tyrosinkinasen abhängigen Re- zeptoren, VEGF-Rezeptor 1 (VEGFR1) und VEGF-Rezeptor 2 (VEGFR2) (JUSSILA u. ALITALO 2002; WELTER et al. 2003) und soll an der Regulation der uterinen Durchblutung mitbeteiligt sein (REYNOLDS u. REDMER 2001). Diese Ansicht wird durch die Beobachtung, dass die Applikation von Östradiol bei ovariektomierten Schafen zu einer Stimulation in der endometrialen Genexpression der VEGF-mRNA führt (CULLINAN-BOVE u. KOOS 1993; REYNOLDS et al. 1998b) unterstützt.
Außerdem steigt durch die Gabe von Östradiol das Gesamtvolumen des kapillaren Gefäßbetts im Uterus drastisch an (REYNOLDS et al. 1998a). Weiterhin besitzt VEGF die Fähigkeit, die Synthese von NO in den Endothelzellen anzuregen (HOOD et al. 1998; KROLL u. WALTENBERGER 1998; REYNOLDS et al. 2005). Auf diese Weise soll VEGF für die angiogene Wirkung an Endothelzellen verantwortlich sein (MORBIDELLI et al. 1996; PAPAPETROPOULOS et al. 1997).
In einer Studie an Frauen wurde nachgewiesen, dass während der mittleren Luteal- phase eine Zunahme der Serumkonzentrationen von VEGF121 und VEGF165 mit einem gleichzeitigen Anstieg der uterinen Blutflussgeschwindigkeit einhergeht (AGRAWAL et al. 1999). Weiterhin wurden in dieser Arbeit (AGRAWAL et al. 1999) im Blutserum positive Korrelationen zwischen dem VEGF- und dem Progesteron- spiegel während der Lutealphase (r = 0,85) bzw. zwischen den VEGF- und den Östradiolkonzentrationen in der frühen Follikel- (r = 0,67), in der Präovulations- (r = 0,57) und in der Lutealphase (r = 0,68) festgestellt.
Untersuchungen am Endometrium des Schweins zeigen, dass die mRNA Expression von VEGF während der Implantations- im Vergleich zur Präimplantationsphase er- höht ist (WELTER et al. 2003). Zusätzlich wies das Endometrium nach der Applika- tion von Progesteron eine gesteigerte VEGF-mRNA-Expression auf, wohingegen Östradiolbenzoat einen hemmenden Einfluss auf die mRNA-Expression ausübte (WELTER et al. 2003). Die VEGFR1-mRNA wurde von keinem der beiden Steroid- hormone beeinflusst, während die VEGFR2-mRNA durch die Kombination beider Steroide anstieg. Im Gegensatz zum Schwein löste exogen zugeführtes Östra-
diol-17β im Endometrium von Ratten (CULLINAN-BOVE u. KOOS 1993) bzw.
Schafen (REYNOLDS et al. 1998b) einen Anstieg von VEGF-mRNA aus.
Beim Rind wurden besonders in den letzten Jahren mit Hilfe der cDNA Array- Hybridisierung im Endometrium zahlreiche Gene identifiziert, die vermutlich zum Teil an der Regulation der Angiogenese und Durchblutung im Uterus beteiligt sind (KLEIN et al. 2006; BAUERSACHS et al. 2008; MITKO et al. 2008). Die meisten diesbezüglichen Erkenntnisse stammen jedoch aus Untersuchungen an zyklischen Färsen. Über die Expression angiogener Faktoren während der präimplantativen Phase der Frühgravidität der Kuh liegen nur begrenzte Informationen vor. Bei der Untersuchung des endometrialen bovinen Transkriptoms von Färsen am 18. Trächtigkeitstag wurden mittels cDNA Array-Hybridisierung annähernd 200 Gene identifiziert, deren Expressionen sich mindestens um den Faktor zwei von der Expression am 18. Zyklustag unterschieden (BAUERSACHS et al. 2006). Unter ihnen befand sich das endotheliale PAS1-Gen, das bei graviden Rindern höher exprimiert war und über die Aktivierung von VEGF und weiterer Faktoren eine gesteigerte Angiogenese bedingen soll (TAKEDA et al. 2004).
Über die Situation während der frühen Gravidität vor Tag 18 liegen nach unseren Kenntnissen bisher keine Ergebnisse vor. Es ist jedoch zu vermuten, dass vor und während der Elongationsphase des Embryos andere Verhältnisse herrschen als kurz vor der Implantation. Einen Hinweis darauf liefert die Beobachtung, dass in der bereits genannten Blutflussstudie (HONNENS et al. 2008b) die uterine Durchblutung ipsilateral zum Embryo bereits innerhalb der ersten zwei Trächtigkeitswochen vorübergehend angestiegen, an Tag 18 der Gravidität jedoch wieder abgesunken war.
Ziel dieser Studie war es, zu untersuchen, welchen Einfluss der Embryo auf die uterine Durchblutung, die peripheren Spiegel der Sexualsteroidhormone und die endometriale Genexpression superovulierter Kühe in den ersten sieben Tagen nach der Konzeption hat. Dabei sollte die hormonelle Stimulation einer Superovulation und
die damit verbundene Mehrlingsgravidität die Signale zwischen Konzeptus und mütterlicher Umgebung verstärken.
2 MATERIAL UND METHODEN
Das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit hat die vorliegende Studie unter dem Aktenzeichen 33.12-42502-04-08/1551 genehmigt.
2.1 Tiere
Die Untersuchungen wurden an acht nichtlaktierenden Kühen der Rasse Holstein Friesian an der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule durchgeführt.
Die Tiere waren zwischen 3 und 9 Jahre alt ( ± SEM = 5,5 ± 0,8) und hatten zwischen zwei- und dreimal abgekalbt (2,3 ± 0,2). Das Körpergewicht der Kühe betrug zwischen 429 kg und 717 kg (589 ± 34,1 kg) bei einem Body Condition Score von 2,5 bis 3,8 (2,9 ± 0,2).
Die Tiere wurden in einem Laufstall gehalten, hatten freien Zugang zu Wasser und bekamen zweimal täglich Heu zu fressen.
2.2 Versuchsanordnung
Zu Beginn der Studie wurden alle Tiere einer allgemeinen und einer speziellen gynäkologischen Untersuchung unterzogen. Die Kühe wurden nach dem Zufalls- prinzip in zwei Gruppen eingeteilt (Gruppen 1 und 2). Nach einem modifizierten Latin Square Modell durchliefen die Tiere beider Gruppen drei verschiedene Versuchs- modelle (Abb. 2.1): ein unstimuliertes Modell (U-Modell), ein Superovulationsmodell (S-Modell) und ein Kontrollsuperovulationsmodell (KS-Modell). Sowohl in Gruppe 1 als auch in Gruppe 2 durchliefen die Tiere zunächst das U-Modell. Nach Abschluss des U-Modells wurde ein spontaner Brunstzyklus abgewartet und im Anschluss daran in Gruppe 1 mit dem S-Modell und in Gruppe 2 mit dem KS-Modell begonnen.
Anschließend wurden zwei spontane Brunstzyklen abgewartet. Daraufhin durchliefen die Kühe der Gruppe 1 das KS-Modell und diejenigen der Gruppe 2 das S-Modell.
Superovulations-(S)-Modell Kontrollsuperovulations-(KS)-Modell
Superovulations-(S)-Modell Kontrollsuperovulations-(KS)-Modell
1 spontaner Brunstzyklus 2 spontane Brunstzyklen 1 spontaner Brunstzyklus 2 spontane Brunstzyklen
Unstimuliertes-(U)-Modell
Unstimuliertes-(U)-Modell Gruppe 2:
Gruppe1:
Superovulations-(S)-Modell Kontrollsuperovulations-(KS)-Modell
Superovulations-(S)-Modell Kontrollsuperovulations-(KS)-Modell
1 spontaner Brunstzyklus 2 spontane Brunstzyklen2 spontane Brunstzyklen 1 spontaner Brunstzyklus 2 spontane Brunstzyklen2 spontane Brunstzyklen
Unstimuliertes-(U)-Modell
Unstimuliertes-(U)-Modell Gruppe 2:
Gruppe1:
Abb. 2.1: Schematische Darstellung der zeitlichen Abfolge der Versuchsmodelle in den Gruppen 1 und 2.
2.2.1 Versuchsmodelle Unstimuliertes-Modell (U-Modell)
In diesem Modell wurde zunächst der Zyklus der Tiere mittels transrektaler Palpation und sonographischer Untersuchung des Uterus und der Ovarien im Abstand von jeweils 2 Tagen verfolgt. Kamen die Tiere in die Phase des Proöstrus, erkennbar an einer zunehmenden Uteruskontraktilität, einer Größenzunahme des dominanten Follikels auf > 10 mm Durchmesser und einer Rückbildung des Gelbkörpers auf einen Durchmesser < 15 mm, so wurden die Tiere dreimal täglich für jeweils 10 Minuten beobachtet, um den Eintritt der Brunst festzustellen. Sobald die Tiere Auf- sprungversuche anderer Tiere duldeten, und den Abgang von Brunstschleim zeigten, wurden sie jeweils 12 und 24 Stunden später mit Tiefgefriersperma (20 x 106 Sper- mien in 230 µl Verdünner) künstlich besamt (Tag der ersten Besamung = Tag 0;
Abb. 2.2). Das für die künstliche Besamung (KB) eingesetzte Tiefgefriersperma stammte von einem fertilen Bullen der Rasse Deutsches Fleckvieh. Sieben Tage nach der ersten KB erfolgte bei den Tieren eine Uterusspülung zur Gewinnung der Eizellen/Embryonen. Unmittelbar im Anschluss an die Uterusspülung wurden aus beiden Uterushörnern Endometriumsbiopsien entnommen. Im Anschluss daran wurde den Kühen zur Einleitung der Luteolyse ein Prostaglandinanalogon (500 µg Cloprostenol-Natriumsalz, Estrumate®, Essex, München, DE) intramuskulär verabreicht.
Der Blutfluss in der rechten und linken A. uterina wurde zum ersten Mal zum Zeitpunkt des Brunstbeginns (Tag -0,5), also 12 h vor der ersten künstlichen Besa- mung (Tag 0), mittels Farbdopplersonographie untersucht. Die weiteren doppler- sonographischen Untersuchungen fanden 1, 3, 5 und 7 Tage nach der ersten Besa- mung statt (Abb. 2.2). Nach der letzten Blutflussmessung an Tag 7 wurde mittels B-Mode Sonographie die Lokalisation und Anzahl der Gelbkörper auf den Ovarien festgestellt.
Stunden nach Brunstbeginn: 0 12
Tag -0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 2 x KB in 24 h
Dopplersonographie u. BE Dopplersonographie u. BE
Uterusspülung Endometriumsbiopsie
BE = Blutentnahme
Stunden nach Brunstbeginn: 0 12
Tag -0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 2 x KB in 24 h
Dopplersonographie u. BE Dopplersonographie u. BE
Uterusspülung Endometriumsbiopsie
BE = Blutentnahme
Abb. 2.2: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der künstlichen Besamung (KB), der dopplersonographischen Untersuchungen und der Probengewinnung im unstimulierten (U)-Modell. Tag der 1. KB = Tag 0.
Superovulations (S)-Modell u. Kontrollsuperovulations (KS)-Modell
Zu Beginn dieser Modelle wurde, wie oben bereits beschrieben, der Zyklusstand der Tiere bestimmt. Sobald die Tiere in Brunst kamen, wurden die Ovarien alle 12 Stun- den zur Bestimmung des Ovulationszeitpunktes sonographisch untersucht. Die Ovulation war als der Zeitpunkt definiert, an dem der dominante Follikel zum ersten Mal nicht mehr dargestellt werden konnte. Sowohl im S- als auch im KS-Modell wurde zwischen dem 9. und 12. Tag nach der Ovulation mit dem Follikel stimulierenden Hormon (FSH) eine Superovulationsbehandlung eingeleitet (Abb.
2.3), nachdem zwei Tage vorher mittels transvaginaler Follikelpunktion unter Ultraschallkontrolle alle Follikel > 8 mm entfernt worden waren. Im S-Modell wurden die Kühe 36, 48 und 60 h nach der letzten FSH-Behandlung mit Tiefgefriersperma (20 x 106 Spermien in 230 µl Verdünner) eines fertilen Bullen der Rasse Deutsches Fleckvieh besamt. Um eine Besamung zu simulieren, ohne jedoch eine mögliche Befruchtung auszulösen, wurden die Tiere im KS-Modell zu denselben Zeitpunkten wie im S-Modell jeweils mit 230 µl einer Mischung aus 8 % Seminalplasma und 92 % Spermaverdünner desselben Bullen ,,schein-besamt’’. Auch in diesen beiden Ver- suchsmodellen erfolgte sieben Tage nach der ersten Besamung/Scheinbesamung eine Uterusspülung zur Gewinnung der Eizellen/Embryonen und im Anschluss daran eine Biopsieentnahme aus dem Endometrium des rechten und linken Uterushorns.
Um eine Luteolyse einzuleiten wurde den Tieren im Anschluss an die Uterusspülung ein Prostaglandinanalogon (500 µg Cloprostenol-Natriumsalz, Estrumate®, Essex, München, DE) intramuskulär verabreicht.
Der Blutfluss in der rechten und linken A. uterina wurde zum ersten Mal 12 h vor (Tag -0,5) der ersten Besamung bzw. Scheinbesamung (Tag 0) mittels Farbdoppler- sonographie untersucht. Die weiteren dopplersonographischen Untersuchungen fanden 1, 3, 5 und 7 Tage nach der ersten Besamung/Scheinbesamung statt (Abb.
3.3). Nach der letzten Blutflussmessung an Tag 7 wurde mittels B-Mode Sonographie die Lokalisation und Anzahl der Gelbkörper auf den Ovarien festgestellt.
Tag -0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 Tage p.o. 09 10 11 12
13 14 13 14 Doppler-
sonographie u. BE
Doppler-
sonographie u. BE
Dopplersonographie u. BE 2 x täglich FSH (i.m.)
2 x PGF2α(i.m.)
3 x SB in 36 h 3 x KB in 36 h
Uterusspülung Endometriumsbiopsie S-Modell
KS-Modell
p.o.= post ovulationem BE = Blutentnahme
Tag -0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 Tage p.o. 09 10 11 12
13 14 13 14 Doppler-
sonographie u. BE Doppler-
sonographie u. BE
Doppler-
sonographie u. BE
Dopplersonographie u. BE 2 x täglich FSH (i.m.)
2 x PGF2α(i.m.)
3 x SB in 36 h 3 x KB in 36 h 3 x KB in 36 h
Uterusspülung Endometriumsbiopsie S-Modell
KS-Modell
p.o.= post ovulationem BE = Blutentnahme
Abb. 2.3: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der hormonellen Behandlung, der künstlichen Besamung (KB) bzw. der Schein- Besamung (SB), der dopplersonographischen Untersuchungen und der Probengewinnung im Superovulations (S)-Modell und im Kontroll- superovulations (KS)-Modell. Tag der 1. KB/SB = Tag 0.
2.2.2 Superovulationsbehandlung
Sowohl im S- als auch im KS-Modell wurde im Diöstrus zwischen dem 9. und 12. Tag post ovulationem mit der Superovulationsbehandlung begonnen (Abb. 2.3). Hierzu erhielten die Tiere zweimal täglich, um 8 Uhr und um 20 Uhr, über vier Tage hinweg eine Gesamtmenge von 400 IU porzinem FSH (Pluset®, Chargennr.: 0807092, Calier, Barcelona, Spanien) in Form intramuskulärer Injektionen. Am ersten Tag der Superovulationsbehandlung wurden den Tieren 150 IU/d, am zweiten 120 IU/d, am dritten 80 IU/d und am vierten Tag 50 IU/d FSH verabreicht. Zur Luteolyse wurde den Kühen am vierten Tag der FSH Applikation zeitgleich mit den beiden FSH Injektionen jeweils ein Prostaglandinanalogon (500 µg Cloprostenol-Natriumsalz, Estrumate®, Essex, München, DE) intramuskulär injiziert.
Zusammen mit der zweiten Besamung im S-Modell und der zweiten Scheinbesamung im KS-Modell erhielten die Tiere eine intramuskuläre Injektion
eines synthetischen Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH) (20 µg Buserelin, Receptal®, Intervet, Unterschleißheim, DE).
2.2.3 Kriterien im Versuchsmodell
Um das nächste Versuchsmodell durchlaufen zu können mussten die Tiere im U-Modell in der am Tag 7 gewonnen uterinen Spülflüssigkeit einen transfertauglichen Embryo aufweisen. Die Einteilung der Embryonen erfolgte nach den Richtlinien der International Embryo Transfer Society (IETS) (ROBERTSON u. NELSON 1998) (Tabelle 2.1). Embryonen der Qualitätsklassen 1 und 2 wurden als transfertauglich angesehen. Wurde dieses Ziel nicht erreicht, musste das U-Modell nach einem spontanen Brunstzyklus wiederholt werden. War auch nach dreimaliger Wieder- holung des U-Modells kein transfertauglicher Embryo in der Spülflüssigkeit zu finden, wurde nach einem spontanen Brunstzyklus mit dem nächsten Modell begonnen.
Im S-Modell mussten am Tag 7 nach der Besamung mindestens vier transfertaug- liche Embryonen in der Uterusspülflüssigkeit vorhanden sein, um dieses Versuchs- modell als erfolgreich zu werten. War dies nicht der Fall, wurde das S-Modell nach zwei spontanen Brunstzyklen noch einmal wiederholt. Wurden auch bei dieser Spülung nicht mindestens vier transfertaugliche Embryonen nachgewiesen, wurde das Tier aus der Studie ausgeschlossen.
2.3 Klinische Untersuchung
Die klinische Allgemeinuntersuchung der Tiere fand nach dem Untersuchungs- schema von STÖBER (1990) statt. Es wurden die Atem- und Herzfrequenz sowie die innere Körpertemperatur bestimmt. Weiterhin wurden Haltung, Verhalten, Pflegezu- stand und Habitus der Tiere beurteilt. Zur speziellen gynäkologischen Untersuchung nach GRUNERT (1990) gehörte die adspektorische und palpatorische Untersuchung des äußeren Genitales sowie die Untersuchung des inneren Genitales mittels transrektaler Palpation (Uterus, Ovarien) und vaginoskopischer Inspektion (Portio uteri, Scheidenkanal).
2.4 Farbdopplersonographie und B-Mode-Sonographie
Für die sonographischen Untersuchungen kamen ein Toshiba SSA 370A (Toshiba Co., Tokyo, Japan) und ein 7 MHz Mikrokonvex-Schallkopf (PVF-738F, Toshiba Co., Tokyo, Japan) zum Einsatz, wobei immer mit denselben Geräteeinstellungen gearbeitet wurde. Vor jeder dopplersonographischen Untersuchung wurden die Tiere mit einer Epiduralanästhesie (3-3,5 ml Procasel® 2%, Selectavet, Weyarn-Holzolling, DE) anästhesiert. Die Untersuchung der rechten und linken A. uterina dauerte insgesamt ca. 45 min pro Tier. Die Messung des Blutflusses in den Aa. uterinae erfolgte nach der von BOLLWEIN et al. (2000) beschriebenen Methode. Dazu wurde der Schallkopf so auf der A. uterina positioniert, dass die Schallwellen in einem Winkel zwischen 20° und 50° zum Blutstrom im Innern des Gefäßes auftrafen. Die Lokalisation dieser Stelle befand sich in unmittelbarer Nachbarschaft zur A. und V.
iliaca externa. Die Aufzeichnung aller Dopplerwellen und B-Mode-Aufnahmen erfolgte im audio video interleave (avi) Format auf einem tragbaren digitalen Video Recorder (Archos AV 700, Archos Inc., Irvine, USA), um später am PC ausgewertet zu werden.
Um den Gefäßdurchmesser der Aa. uterinae zu bestimmen, wurden unmittelbar nach jeder Blutflussmessung im B-Mode an exakt derselben Messposition drei Aufnahmen im Abstand von jeweils etwa 30 Sekunden vom Gefäßquerschnitt gemacht. Die Bestimmung des Gefäßdurchmessers fand mit Hilfe des im Ultraschallgerät integrierten Messprogramms statt.
2.4.1 Auswertung der Dopplerwellen
Die Auswertung der Dopplerwellen erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms Pixel Flux (Chameleon-Software, Leipzig, DE) an einem Computer. Zur Analyse des Blut- flusses wurden zweimal zwei repräsentative, direkt aufeinander folgende Doppler- wellen mit einem maximalen Verhältnis zwischen Diastole und Systole verwendet (Abb. 2.4).
Abb. 2.4: Farbdopplersonographische Darstellung der A. uterina sinistra (rechts) und der darin gemessenen Dopplerwellen (links). Links: Hüllkurvenmessung mit eingezeichnetem peak systolic frequency shift (PSF) und minimum diastolic frequency shift (MDF). Rechts: Gefäß mit Winkel zwischen Ultraschallstrahl und Blutflussrichtung.
Folgende Parameter wurden anhand der Dopplerwellen ermittelt: der uterine Pulsatility Index (PI) als Parameter für den Gefäßwiderstand im distalen Gefäßbett und das uterine Blutflussvolumen (BFV) als quantitativer Parameter für die Blutversorgung. In die Berechnung des PI gingen die maximale systolische (PSF = peak systolic frequency shift), die minimale diastolische (MDF = minimum diastolic frequency shift) und die mittlere maximale Frequenzverschiebung (TAMF = time-averaged maximum frequency shift), die sich aus der Hüllkurve der Dopplerwelle ergeben, nach folgender Formel ein:
PI =
Zur Berechnung des BFV wurde zunächst die mittlere maximale Blutfluss- geschwindigkeit über den Herzzyklus (TAMV = time-averaged maximum velocity) nach folgender Formel berechnet:
PSF
MDF
Dopplerwellen A. uterina
PSF – MDF TAMF
TAMV [cm/s] =
c = Ausbreitungsgeschwindigkeit des Ultraschalls im Weichteilgewebe (ca. 154.000 cm/s)
F = Sendefrequenz des Schallkopfes
α = Winkel zwischen Ultraschallstrahl und Blutflussrichtung
Unter Hinzuziehung des Gefäßdurchmessers (D) wurde im zweiten Schritt nach folgender Formel das BFV in der A. uterina berechnet:
BFV [ml/min] = TAMV [cm/s] · 60 [s] · (D/2 [cm])2 · π
Der Gefäßdurchmesser ergab sich aus dem Mittelwert der drei Gefäßdurchmesser, die unmittelbar nach der Blutflussmessung gemessen wurden. Die aus den beiden konsekutiven Dopplerwellen errechneten PI- und BFV-Werte wurden für alle weiteren Berechnungen gemittelt.
2.5 Follikelpunktion
Zur Verbesserung der Ovarreaktion auf die hormonelle Stimulationsbehandlung wurden 48 Stunden vor Beginn des Superovulationsregimes alle auf den Ovarien befindliche Follikel mit einem Durchmesser > 8 mm nach der von BUNGARTZ u.
NIEMANN (1994) beschriebenen Methode punktiert. Die Tiere erhielten zunächst eine Epiduralanästhesie (3-3,5 ml Procasel® 2%, Selectavet, Weyarn-Holzolling, DE).
Im Anschluss wurde ein 64 cm langer Kunststoffträger, ausgerüstet mit einer 7,5 MHz Fingertip-Sonde (General Electrics Yokogawa Medical Systems, Tokyo, Japan), verbunden mit einem GE Logiq TM BookXP Ultraschallgerät (General Electrics Medical Systems, Jiangsu, P.R. China), transvaginal eingeführt. Die Follikel (> 8 mm)
(TAMF [Hz] · c [cm/s]) 2 · F [Hz] · cosα
Ovars mittels einer Punktionskanüle (20 G x 2“; Fa. Braun, Melsungen, DE) punktiert und die Follikelflüssigkeit unter Einsatz einer Vakuumpumpe aspiriert.
2.6 Embryonengewinnung und Embryobeurteilung
Am Tag 7 nach der ersten Besamung/Scheinbesamung erfolgte eine transzervikale, unblutige, Uterusspülung. Dazu wurden die Tiere epidural anästhesiert (3-3,5 ml Procasel® 2%, Selectavet, Weyarn-Holzolling, DE). Anschließend wurde unter trans- rektaler Kontrolle ein flexibler Ballonspülkatheter (DISSI CH 18, Minitüb, Tiefenbach, D) in das vordere Drittel des Uterushorns eingebracht und der Sitz des Katheters nach Aufblasen des Ballons überprüft. Zum Einführen in den Uterus war der Spülkatheter kurzzeitig mit einem Mandrin stabilisiert worden.
Über den Katheter wurden insgesamt 530 ml Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) mit einem Zusatz von 1 % New Born Calf Serum (NBCS) in fraktionierten Mengen (3 x 30 ml, 1 x 40 ml, 2 x 50 ml und 5 x 60 ml) über eine 60 ml Spritze in das Uterushorn infundiert. Nach jeder Fraktion wurde die Spülflüssigkeit aktiv über die Spritze zurückgewonnen und aufgefangen. Nach der Rückgewinnung des gesamten Volumens wurde der Embryospülkatheter entfernt, ein neuer Spülkatheter in die kontralaterale Seite eingeführt und dieses Uterushorn nach der beschriebenen Methode gespült.
Die zurückgewonnene Uterusspülflüssigkeit wurde durch ein Analysesieb (Maschenweite: 75 µm; Fa. Edinger, Leinburg, DE) gefiltert und der Überstand darin mit frischer PBS-Spülflüssigkeit in eine Petrischale gespült. Nach einer Sedimen- tationszeit von 15 min fand die Untersuchung der Spülflüssigkeit in den Petrischalen auf Embryonen mit Hilfe eines Stereomikroskops (Olympus SZX-ILLK200, Olympus Cooperation, Tokyo, Japan) statt. Die Einteilung der Embryonen in Qualitätsklassen erfolgte nach den internationalen Leitlinien der IETS (ROBERTSON u. NELSON 1998) (Tabelle 2.1).
Tabelle 2.1: Klassifizierung der Embryonalstadien gemäß den Kriterien der International Embryo Transfer Society (IETS) nach ROBERTSON u.
NELSON (1998).
Qualitätsklasse Einteilungskriterien
1) sehr gut oder gut symmetrische, sphärische Embryonen mit Blastomeren von einheitlicher Größe, Farbe und Dichte. Der Entwicklungsstand entspricht dem Untersuchungszeitpunkt.
Die Zona pellucida ist glatt und weist keine Verformungen auf.
Mehr als 85 % der Zellen sollten intakt sein.
2) mittel mäßige Unterschiede in Größe, Farbe und Dichte der Blastomeren.
Mehr als 50 % des zellulären Materials sollte intakt sein.
3) schlecht die Blastomeren weisen starke Abweichungen in Größe, Farbe und Dichte auf.
Es sollten mindestens 25 % der Zellen intakt und lebensfähig sein.
4) degeneriert oder tot unbefruchtete Oozyten, Embryonen die Retardierungen in der Entwicklung aufweisen:
degenerierte, nicht lebensfähige Embryonen.
2.7 Plasmagewinnung und Steroidhormonbestimmung
Zur Bestimmung der Gehalte an Progesteron (P4) und Gesamtöstrogenen (Etot) im Blutplasma wurde den Tieren nach jeder dopplersonographischen Untersuchung aus der A./V. coccygea mittels eines Vacutainer-Sytsems (BD Vacutainer®, Becton Dickinson, Plymouth, UK) eine EDTA-Blutprobe (10 ml) entnommen. Die Proben wurden unmittelbar darauf für 15 min bei 3500 g und 4°C zentrifugiert. Bis zur weiteren Analyse wurde das abpipettierte Plasma bei -20°C gelagert.
Die Bestimmung der P4-Konzentration im Plasma erfolgte mit Hilfe eines kommer- ziellen Festphasen Radioimmunassays (Coat A Count Progesterone, Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Los Angeles, USA) nach der von SRIKANDAKUMAR et al. (1986) beschriebenen Methode. Hierzu wurden 100 µl Blutplasma zusammen mit
125I-markiertem P4 in ein mit P4-spezifischen Antikörpern beschichtetes Polypropylen- röhrchen gegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Überstand verworfen und das an den Antikörpern gebundene 125I-mar- kierte P4 in einem Gamma-Counter gemessen. Die gemessenen Counts waren umgekehrt proportional zu den tatsächlichen P4-Konzentrationen im Blutplasma, die dann durch den Vergleich mit einer Standardkurve abgeleitet wurden. Die untere Nachweisgrenze dieses Tests lag bei 0,1 ng/ml und die Intra- und Inter-Assay- Varianzen betrugen 6,1 % und 10,3 %.
Die Quantifizierung des Etot im Plasma erfolgte übern einen kompetitiven Doppelanti- körper-Enzymimmunoassay (EIA) nach der von MEYER et al. (1990) beschriebenen Methode. Dafür wurde das im Plasma enthaltene Etot zunächst hydrolytisch gespal- ten und anschließend mit Hilfe eines Ethergemischs (30 % Buthyl-Methyl-Ether und 70 % Petrolether) extrahiert. Als Festphasenantikörper dienten E2/3 Pool 1-Antikör- per (AK), die zu 100 % mit Östradiol-17β, zu 66 % mit Östradiol-17α und zu 100 % mit Östron reagierten. Als enzymmarkiertes Hormon für die kompetitive Hemmreak- tion diente die 17β-Östradiol-Hemisuccinat-Meerrettichperoxidase. Die untere Nachweisgrenze dieses Tests lag bei 8,0 pg/ml und die Intra- und Inter-Assay- Varianzen lagen unter 10 %.
2.8 Endometriumsbiopsien 2.8.1 Probengewinnung
Unmittelbar nach der Uterusspülung erfolgte die Entnahme je einer Gewebeprobe aus dem Endometrium im kranialen Drittel des rechten und linken Uterushorns. Zur Probenentnahme wurde eine Biopsiezange nach Kevorkian (Fa. Eickemeyer, Solingen, DE) unter transrektaler Kontrolle transvaginal bis zur entsprechenden Entnahmestelle vorgeführt und ein ca. 10 x 5 x 5 mm großes Gewebestück entnom- men. Die Gewebeproben wurden längs geteilt und die eine Hälfte der Probe sofort in DNase- und RNase-freie Cryoröhrchen (Fa. Brand, Wertheim, DE) in flüssigem Stick- stoff tiefgefroren und bis zur mRNA Expressionsanalyse bei -80°C gelagert. Die andere Hälfte der Probe wurde zur weiteren histologischen Untersuchung sofort in neutral gepuffertes Formalin nach Lillie (3,7 % Formaldehydlösung) verbracht und für 48 h bei 7°C darin gelagert.
2.8.2 Histologische Untersuchung
Durch die histologische Untersuchung sollte überprüft werden, ob es sich bei den Gewebeproben um Anteile des interkarunkulären Bereichs des Endometriums han- delte; da davon auszugehen ist, dass sich die Genexpression im karunkulären von der im interkarunkulären Bereich des Endometriums unterscheidet (KIMMINS u.
MACLAREN 2001; M. L. JOHNSON et al. 2006). Zur weiteren Verarbeitung der für 48 Stunden in Formalin fixierten Gewebeproben wurden diese aus der Formalde- hydlösung jeweils in eine Kunststoffkapsel (Fa. Brenzinger, Walldorf, DE) überführt.
Zur Einbettung kamen die Proben zunächst zur Entwässerung in eine aufsteigenden Alkoholreihe und anschließend in Xylol, um dann in Paraffin (SAV Liquid Production, Fa. Flintsbach am Inn, DE) eingebettet zu werden. Aus den Paraffinblöcken wurden mit einem Rotationsmikrotom (Leitz 1512; Ernst Leitz Wetzlar GmbH, Wetzlar, DE) 3- 4 µm dicke Gewebestücke geschnitten. Zur Entfernung des Paraffins aus den Gewe- beproben wurden diese zunächst in Xylol gegeben und dann in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert. Die Schnitte wurden anschließend einer Hämatoxylin-Eosin- Färbung unterzogen.
Zur Verifizierung des interkarunkulären Ursprungs der Endometriumbioptate wurden diese unter dem Lichtmikroskop (Olympus BX60F5, Olympus Cooperation, Tokyo, Japan) histologisch beurteilt.
2.8.3 Expressionsanalyse
Aus den Bioptaten für die Expressionsanalyse wurde mittels TRIzol® (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) die Gesamt-RNA isoliert. In diesem Isolat erfolgte die Bestimmung der mRNA-Expression des Progesteronrezeptors (PGR), der Östrogen- rezeptoren α und β (ERα, ERβ), des Rezeptors (Typ 2) für Prostaglandin E (PTGER2), der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS) und des Vascular Endothelial Growth Factors (Isoform 121; VEGF121), sowie dessen Rezeptor (Typ 2;
VEGFR2). Hierfür wurde eine zweistufige quantitative Real-Time RT-PCR mit dem LightCycler®-DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics, Mannheim, DE) nach der Methode von ULBRICH et al. (2009) durchgeführt. Zur Amplifizierung der aus- gewählten Genabschnitte kamen die entsprechenden Primer zum Einsatz (Tabelle 2.2). Es wurden die entsprechenden Temperaturen zur Abkühlung und damit für das Erreichen der Primer-Anlagerung (AT = annealing temperature), für die spezifischen Schmelzpunkte (SP) der amplifizierten Genabschnitte und für ein definiertes Fluoreszenzsignal (FA = fluorescence acquisition) verwendet. Zur Bestimmung der benötigten Anzahl an Amplifizierungszyklen (Cq) für ein festgelegtes SYBR green Fluoreszenzsignal wurde das Computerprogramm LightCycler (Version 3.5.28) eingesetzt. Cq korrelierte umgekehrt proportional zum Logarithmus der anfänglichen Probenkonzentration. Die Normalisierung von Cq (∆Cq) wurde an Ubiquitin und Histon durchgeführt.
Um negative Zahlenwerte bei einem Vergleich zweier Gene zu vermeiden, wurden alle normalisierten Daten (∆Cq) in Form des Mittelwerts mit Standardfehler ( ± SEM) als Differenz von dem willkürlich gewählten Wert 20 dargestellt. Ein hoher Wert für ∆Cq stellte somit einen hohen Anteil an entsprechenden Gentranskripten im Probenmaterial dar (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001).
Tabelle 2.2: Nukleotidsequenzen und Datenbanknummern (acc.no.) der PCR Primer für die in der Real Time RT-PCR untersuchten Gene mit der PCR-Fragmentlänge und den Temperaturen für den Annealingvorgang (AT), die fluorescence acquisition (FA), und den Schmelzpunkt (SP) des entstehenden PCR-Produkts.
Gene Referenz [acc.no]
Vorwärts-Primer [5´-3´]
Rückwärts-Primer [5´-3´]
PCR-Produkt [bp]
AT [°C]
FA [°C]
SP [°C]
Ubiquitin Histon PGR ERα ERβ eNOS VEGF121
VEGFR2 PTGER2
NM_174133 NM_174133 XM_583951 NM_001001443 NM_174051 NM_181037 NM_174216 NM_001110000 NM_174588
AGATCCAGGATAAGGAAGGCAT ACTGCTACAAAAGCCGCTC GAGAGCTCATCAAGGCAATTGG AGGGAAGCTCCTATTTGCTCC GCTTCGTGGAGCTCAGCCTG AGGAGTGGAAGTGGTTCCG CCCAGTTCGTTTCAGTGCC AGACTGGTTCTGGCCCAAC CTACTTTGCCTTTTCCATGACC
GCTCCACCTCCAGGGATGT ACTTGCCTCCTGCAAAGCAC CACCATCCCTGCCAATATCTTG CGGTGGATGTGGTCCTTCTCT AGGATCATGGCCTTGACACAGA GCCCCGGTACTACTCTGTCA CGGCTTGTCACAATTTTTCTTGTC GAAGCCTTTCTGGCTGTC GATGAAGCACCACGTCCC
198 233 227 234 262 126 280 379 210
60 60 65 60 64 66 60 60 60
83 80 81 81 81 87 82 81 85
88 87 84 86 86 93 88 85 90
PGR = Progesteronrezeptor; ERα = Östrogenrezeptor alpha; ERβ = Östrogenrezeptor beta; eNOS = endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase; VEGF121 = Vascular Endothelial Growth Factor (Isoform 121); VEGFR2 = Rezeptor (Typ 2) für den Vascular Endothelial Growth Factor; PTGER2 = Prostaglandin E-Rezeptor (Typ 2)
2.9 Statistische Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe des Statistikprogramms SAS® Version 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, MC, USA). Alle Werte in den Tabellen und Graphen wurden als arithmetische Mittelwerte mit Standardfehler ( ± SEM) dargestellt. Der Einfluss des Versuchsmodells und des Versuchstages auf PI, BFV, P4 und Etot wurde mit Hilfe einer zweifaktoriellen Varianzanalyse für abhängige Stichproben (repeated measurements) überprüft. Der Effekt des einzelnen Versuchstages innerhalb des Versuchsmodells auf die oben genannten Parameter wurde mit Hilfe der einfak- toriellen Varianzanalyse für abhängige Stichproben untersucht. Um zu prüfen, ob sich die Mittelwerte von PI und BFV innerhalb des Versuchsmodells an den einzel- nen Tagen unterschieden, fand der Student’s t-Test für verbundene Stichproben Anwendung. Auch um die Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsmodellen an den entsprechenden Tagen zu ermitteln wurde der Student’s t-Test für verbun- dene Stichproben verwendet. Für den Vergleich der an Tag 7 gewonnen endometrialen Gentranskripte für PGR, ERα, ERβ, VEGF121, VEGFR2, eNOS und PTGER2 wurde der Student’s t-Test und der Wilcoxon’s signed-rank-Test für verbundene Stichproben verwendet.
Unterschiede zwischen abhängigen Stichproben bzw. Beziehungen zwischen zwei Parametern mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) < 0,05 wurden als signifikant bezeichnet.
3 ERGEBNISSE
3.1 Befunde der klinischen Untersuchung
Während der Versuchsperiode zeigte keines der acht Tiere Symptome einer klinischen Allgemeinerkrankung und es konnte bei keinem Tier eine pathologische Veränderung des Genitaltraktes beobachtet werden.
3.2 Anzahl der Modelldurchläufe
Das Kriterium für den erfolgreichen Abschluss des U-Modells, das Auffinden eines transfertauglichen Embryos, erfüllten drei Kühe beim ersten Durchlauf dieses Versuchsmodells. Bei einem Tier konnte erst nach Wiederholung des Modells ein transfertauglicher Embryo gefunden werden und bei einem Tier wurden dafür drei Modelldurchläufe benötigt. In der uterinen Spülflüssigkeit dreier Tiere konnte auch nach dreimaliger Wiederholung des U-Modells kein transfertauglicher Embryo nach- gewiesen werden. Aus diesem Grund wurden für alle statistischen Auswertungen, die das U-Modell beinhalteten, nur fünf Tiere in die Berechnungen einbezogen.
Im S-Modell wurde bei sechs Tieren bereits nach dem ersten Durchgang die benötigte Anzahl von mindestens vier transfertauglichen Embryonen in der Uterusspülflüssigkeit gefunden. Bei einem Tier musste das S-Modell wiederholt werden, um dieses Kriterium zu erreichen. Bei einem Tier konnten auch nach zweimaliger Wiederholung des S-Modells keine vier transfertauglichen Embryonen gefunden werden. Deshalb wurden für alle statistischen Auswertungen, die das S- mit dem KS-Modell verglichen, sieben Tiere in die Berechnungen miteinbezogen.
3.3 Gelbkörperzahl nach hormoneller Behandlung
Die Kühe wiesen im KS- und im S-Modell die gleiche Zahl an Corpora lutea auf den Ovarien auf (p > 0,05; Tabelle 3.1). Die Verteilung der Corpora lutea auf das rechte und linke Ovar war in beiden Modellen ausgeglichen (p > 0,05).
Tabelle 3.1: Zahl der Corpora lutea (CL) auf den Ovarien im Kontrollsuperovulations (KS)- und im Superovulations (S)-Modell an Tag 7 (n=7).
KS-Modell S-Modell
± SEM Min Max ± SEM Min Max
CL gesamt 12,7 ± 1,8 8 21 12,1 ± 1,1 9 17
CL rechtes Ovar 07,1 ± 1,1 4 11 07,3 ± 0,9 4 11
CL linkes Ovar 05,6 ± 0,9 4 10 04,8 ± 0,6 4 08
3.4 Quantität und Qualität der Embryonen im S-Modell
In den zehn durchgeführten Uterusspülungen nach hormoneller Stimulation der Follikelentwicklung mit nachfolgender Besamung konnten insgesamt 102 Embryonen/Eizellen gewonnen werden. Aus diesen zehn Uterusspülungen wurden 4,6 ± 1,4 transfertaugliche Embryonen gewonnen. In den für die statistischen Auswertungen berücksichtigten sieben Uterusspülungen wurden 6,7 ± 1,0 transfer- taugliche Embryonen und 2,1 ± 0,8 nichttransfertaugliche Embryonen gefunden. Die Minimalzahl der transfertauglichen Embryonen lag entsprechend dem Kriterium für dieses Versuchsmodell bei 4 und die Maximalzahl betrug 11 transfertaugliche Embryonen. Die transfertauglichen Embryonen waren gleichmäßig (p > 0,05) auf das linke und rechte Uterushorn verteilt, wobei im linken Uterushorn 3,0 ± 0,8 und im rechten Uterushorn 3,7 ± 0,7 transfertaugliche Embryonen gefunden wurden.
3.5 Uteriner Blutfluss 3.5.1 Pulsatility Index
In den drei Versuchsmodellen waren keine Unterschiede (p > 0,05) zwischen den Pulsatility Indizes (PI) der Aa. uterinae der rechten und der linken Seite festzustellen (Daten siehe Anhang: Tabelle 7.1). Aus diesem Grund wurden jeweils die arithmetischen Mittelwerte aus den PI-Werten der A. uterina sinistra und A. uterina dextra berechnet, als ,,uterine PI-Werte’’ (uPI) definiert und für die weiteren Auswertungen herangezogen.
Ein Einfluss des Modells auf die uPI-Werte lag nicht vor (p > 0,05; Abb. 3.1).
Tage vor / nach der 1. KB / SB
0 1 2 3 4 5 6 7
PI
0 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
Unstimuliertes (U)-Modell
Kontrollsuperovulations (KS)-Modell Superovulations (S)-Modell -0,5
1. KB/SB
a
b,c b
c c
a
b
b b
b
a
b
c c
c
Abb. 3.1: Uteriner Pulsatility Index (uPI) ( ± SEM) von 5 Tieren im unstimulierten (U)-, und 7 Tieren im Kontrollsuperovulations (KS)- und Superovulations (S)-Modell. Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb der Modelle unterscheiden sich (p < 0,05). KB/SB = künstliche Besamung/
Scheinbesamung.
In allen drei Modellen wurde hingegen ein Einfluss des Untersuchungstages auf uPI festgestellt (p < 0,05; Abb. 3.1).
Die niedrigsten uPI-Werte waren in allen drei Modellen an Tag -0,5 zu beobachten.
Zwischen den Tagen -0,5 und 1 stiegen (p < 0,05) die uPI-Werte sowohl im U-Modell als auch im KS- und S-Modell auf etwa das Doppelte an. Während die uPI-Werte im U-Modell bis Tag 3 und im KS-Modell sogar bis Tag 7 auf konstant (p > 0,05) hohem Niveau blieben, fielen (p < 0,05) sie im S-Modell zwischen den Tagen 1 und 7 um ein Drittel ab. Nach einem Rückgang (p < 0,05) der uPI-Werte zwischen den Tagen 3 und 5 blieb uPI auch im U-Modell bis Tag 7 auf einem konstanten (p > 0,05) Niveau.
3.5.2 Blutflussvolumen
In den drei verschiedenen Versuchsmodellen konnten zu keinem Zeitpunkt Unterschiede (p > 0,05) zwischen den Blutflussvolumina (BFV) in den Aa. uterinae der rechten und der linken Seite festgestellt werden (Daten siehe Anhang: Tabelle 7.2). Aus diesem Grund wurden die arithmetischen Mittelwerte aus den BFV-Werten der A. uterina sinistra und A. uterina dextra berechnet, als ,,uterine BFV-Werte’’
(uBFV) definiert und für die weiteren Auswertungen herangezogen.
Das uBFV war sowohl vom Modell (p < 0,05) als auch vom Untersuchungstag (p < 0,05) abhängig (Abb. 3.2). In allen drei Modellen starteten die Kühe an Tag -0,5 auf gleichem Niveau (p > 0,05) mit maximalen uBFV-Werten, die bis Tag 1 in allen Modellen gleichermaßen (p > 0,05) um etwa die Hälfte abfielen (p < 0,05). Nach einem weiteren Abfall (p < 0,05) im U-Modell zwischen den Tagen 1 und 3 blieb uBFV bis Tag 7 auf einem konstant (p > 0,05) niedrigen Niveau. In den KS- und S-Modellen war im Gegensatz dazu zwischen den Tagen 1 bis Tag 7 ein Anstieg (p < 0,05) im uBFV zu verzeichnen: im KS-Modell um ein Viertel und im S-Modell um die Hälfte. Genauer gesagt blieb uBFV im KS-Modell zwischen den Tagen 1 und 5 konstant (p > 0,05) und stieg (p < 0,05) dann zwischen den Tagen 5 und 7 an. Im S- Modell war von Tag 1 bis Tag 7 ein Anstieg (p < 0,05) um insgesamt 50 % zu verzeichnen. Dabei trat ein erster Anstieg (p < 0,05) zwischen den Tagen 3 und 5
