Einfluss von exogenem Progesteron auf die uterine, luteale und follikuläre Durchblutung sowie die Genexpression im lutealen Gewebe bei zyklischen Kühen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
vorgelegt von Phuong Do Duc Longxuyen-Angiang/Vietnam
Hannover 2015 ( Dr. med. vet.)
Klinik für Reproduktionsmedizin Vetsuisse-Fakultät Universität Zürich
Priv.-Doz. Dr. Kathrin Herzog Klinik für Rinder
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Bollwein 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Sieme
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2015
Sabrina
1 Einleitung ... 1
2 Literatur ... 3
2.1 Progesteron ... 3
2.2 Uteriner Blutfluss ... 20
2.3 Follikuläre Durchblutung ... 21
2.4 Luteale Durchblutung ... 22
2.5 Genexpression im Corpus luteum ... 24
3 Material und Methode ... 28
3.1 Tiere ... 28
3.2 Versuchsanordnung ... 28
3.3 Durchführung der Farbdoppler- und B-Mode-Sonographie ... 31
3.4 Auswertung der Farbdoppler- und B-Mode Bilder ... 32
3.5 Plasmagewinnung und hormonanalytische Methoden ... 36
3.6 Transvaginale Corpus luteum Biopsie unter Ultraschallkontrolle ... 37
3.7 Genexpressionsanalyse ... 39
3.8 Statistische Auswertung ... 41
4 Ergebnisse ... 42
4.1 Zykluslänge ... 42
4.2 Progesteronkonzentration im Plasma ... 43
4.3 Größe des Corpus luteum ... 44
4.4 Durchblutung des Corpus luteum ... 45
4.7 Uteriner Blutfluss ... 48
5 Diskussion ... 52
5.1 Progesteron ... 53
5.2 Genexpression der an der lutealen P4 Synthese beteiligten Enzyme ... 54
5.3 Größe des Corpus luteum ... 56
5.4 Durchblutung des Corpus luteum ... 57
5.5 Größe und Perfusion des Follikels ... 59
5.6 Uterine Perfusion ... 61
5.7 Zykluslänge ... 62
6 Zusammenfassung ... 65
7 Summary ... 67
8 Literaturverzeichnis ... 69
9 Anhang ... 84
A luteale Querschnittsfläche A. ut. Arteria uterina
Aa. ut Arteriae uterinae ad us. vet. ad usum veterinare BCS Body Condition Score
cDNA komplementäre DNA (codierende DNA) CIDR Controlled Intravaginal Drug Release CL Corpus luteum (Gelbkörper)
CYP11A1 cytochrome-P450-side-chain-cleavage-enzyme-complex DF dominanter Follikel
DNA Desoxyribonucleic acid
eNOS endotheliale Stickstoffoxid-Synthase
E2 Östrogen
FDB follikuläre Durchblutung
FS Follikular Size (follikuläre Größe) FSH Follikelstimulierendes Hormon
GH Growth Hormone
GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung GnRH Gonadotropin Releasing Hormone GOI Gene of Interest
hCG human Chorionic Gonadotropin
IFNT Interferon- Tau (Interferon- τ) LDB luteale Durchblutung
LH Luteinisierendes Hormon
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
MHz Megahertz
ml/min Milliliter pro Minute
MM Master-Mix
µM Mikromol
mM Millimol
mRNA Messenger Ribonucleic Acid m/s Meter pro Sekunde
MW arithmetischer Mittelwert
n Anzahl
NaCl Natriumchlorid-Lösung
ng Nanogramm
P4 Progesteron
PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase Kettenreaktion) PDI-Mode Power Doppler Imaging Mode
PGF2α Prostaglandin F2 alpha
PGFM Prostaglandin F2 alpha-Metabolit
PRID® Progesteron release intravaginal device qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction r Korrelationskoeffizient
RI Resistance Index
RIA Radioimmunoassay
ROI Region of Interest RT Reverse Transkription
RT-qPCR Reverse Transkriptase Quantitative Polymerase Chain Reaction
s Sekunde
SD Standardabweichung SEM Standardfehler
StAR Steroidogenic Acute Regulatory Protein
TAMV Time Average Maximum Velocity (Mittlere Blutflussgeschwindigkeit) TR Trächtigkeitsrate
U Enzymeinheit
UBF uteriner Blutfluss
U/min Umdrehungen pro Minute
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor Rezeptor
vs. versus
Mittelwert
1 1 Einleitung
In den letzten Jahrzehnten wurde dank des schnellen züchterischen Fortschritts bei Milchkühen und der Veränderungen im Management eine deutliche Steigerung der Laktationsleistung erreicht (BELL et al. 2011). Im Gegensatz dazu ist eine stetige Verschlechterung der Fruchtbarkeit erkennbar (DISKIN und MORRIS 2008). Die erhöhte Stoffwechselbelastung im Zuge der hohen Milchproduktion hat einen negativen Einfluss auf die Follikelreifung und auf den Zeitpunkt des ersten Zyklus post partum (p.p.) (BEAM und BUTLER 1998).
Es ist weiterhin bekannt, dass eine vermehrte Leberdurchblutung infolge der gesteigerten Trockenmasseaufnahme mit einer erhöhten Metabolisierung des Progesterons (P4) (SANGSRITAVONG et al. 2002) und damit einem verzögerten P4-Anstieg sowie einer verminderten P4-Konzentration einhergeht (FOLMAN et al. 1973). Progesteron (P4) ist entscheidend für die Ovulation eines Follikels mit guter Eizellqualität und die Aufrechterhaltung der Trächtigkeit (INSKEEP 2004). Eine niedrige systemische P4-Konzen- tration vor und nach der Besamung ist eine der Ursachen für eine verminderten Konzeptionsrate bei laktierenden Milchkühen (MANN und LAMMING 1999). Ferner hat ein niedriger P4-Spiegel negative Auswirkungen auf die Follikelentwicklung (SAVIO et al.
1993a; SAVIO et al. 1993b).
In engem Zusammenhang mit den systemischen P4-Konzentrationen stehen des Weiteren die zyklusbedingten Veränderungen sowohl der lutealen Größe (LS) (KASTELIC et al. 1990a) als auch des lutealen Gewichtes (ROBINSON et al. 2006) sowie der lutealen Durchblutung (HERZOG et al. 2010). Zudem scheint eine Korrelation zwischen der Größe des CL und seiner Funktionalität zu bestehen (KASTELIC et al. 1990a). Dementsprechend weist ein kleineres CL eine geringere P4-Sekretion auf als ein größeres CL (ROBINSON et al. 2005).
Es ist bekannt, dass eine frühzeitige exogene P4-Supplementation die periphere P4-Kon- zentration steigern kann (COLAZO et al. 2013; LARSON et al. 2007; WALTON et al. 1990) und dass sie die Follikelentwicklung beeinflusst (ADAMS et al. 1992), sowie dass die erhöhte LH-Pulsfrequenz infolge einer P4-Supplementation die Dominanzphase des Follikels (von zwei bis sieben Tagen auf 14 Tage) verlängert und diese Verlängerung die Fertilität der Oozyte beeinflusst (DISKIN et al. 2002). Ferner wird vermutet, dass das in der frühen Lutealphase exogen verabreichte P4 zu einer negativen Rückkopplung der lutealen
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Entwicklung führt (MUNRO und MOORE 1985; GINTHER 1970a; WOODY et al. 1967;
LOY et al. 1959) und die Funktion des CL hemmt (STEVENSON und MEE 1991; HARMS und MALVEN 1969).
Seit Jahren stellt in der Tiermedizin die Farb-Doppler-Sonographie eine häufig eingesetzte, nicht invasive Methode zur Untersuchung der Durchblutung u.a. des inneren Genitales dar (HERZOG und BOLLWEIN 2007). Es ist denkbar, über die dopplersonographische Erfassung der genitalen Perfusion das Abortrisiko einzuschätzen (BOLLWEIN et al. 2002a).
Ziel dieser Dissertation war es, mittels Farb-Doppler-Sonographie den Einfluss von intravaginal verabreichtem Progesteron während der frühen Phase des Zyklus (Tag 1 bis 8 post ovulationem) auf die uterine Perfusion, das CL und damit auf das Zyklusgeschehen sowie die Entwicklung des präovulatorischen DF zu untersuchen. Da die Durchblutung des inneren Genitales Auswirkungen auf die Fertilität hat, können die erhaltenen Ergebnisse Hinweise auf fertilitätsrelevante Effekte der exogenen P4-Supplementation bei Kühen liefern.
Dafür sollten sowohl die Größe und die Durchblutung des jeweiligen CL und des DF, als auch der beiden Arteriae uterinae über den gesamten Brunstzyklus erfasst werden. Ferner wurde durch transvaginale Corpus luteum-Biopsie in vivo an den Tagen 8 und 15 luteales Gewebe gewonnen. Dieses konnte zur Bestimmung der Genexpression verschiedener Schlüsselenzyme im lutealen Gewebe untersucht werden, um Rückschlüsse zu ziehen, ob und in welchem Ausmaß exogenes P4 Einfluss auf die Entwicklung des Gelbkörpers nimmt.
3 2 Literatur
2.1 Progesteron
Progesteron (P4) ist ein Steroidhormon bestehend aus 21 Kohlenstoffatomen. Ausgehend von Cholesterol stellt es eine Zwischenstufe in der Biosynthese der Androgene, Östrogene und Kortikosteroide dar.
2.1.1 Endogenes Progesteron
Neben der Placenta, die für die Aufrechterhaltung der Trächtigkeit ausreichende Mengen an P4 beim Rind nur zwischen dem 180. und 250. Graviditätstag produziert (VON ENGELHARDT 2010; MEINECKE 2005a; GRUNERT 1999), wird P4 hauptsächlich im Corpus luteum (CL) synthetisiert und sezerniert (GRUNERT 1999). Die P4-Sekretion stellt die primäre Aufgabe des CLs dar (NISWENDER et al. 2000). Nach der Ovulation entwickelt sich das CL aus den restlichen follikulären Theka- und Granulosazellen, wobei das Luteinisierende Hormon (LH) einen entscheidenden Beitrag für die Entwicklung und Funktion des CLs, welches überwiegend aus zwei steroidogenen Zelltypen, den großen und kleinen Luteinzellen besteht, leistet. Die großen Luteinzellen bilden sich aus den Granulosa- und die kleinen aus den Thekazellen (HOFFMANN 1994). Über die direkte Aktivierung der Proteinkinase A, einem sekundären Botenstoff, stimuliert LH über LH-spezifische Rezeptoren die P4-Sekretion in den kleinen Luteinzellen. Die große Ansammlung von glattem endoplasmatischem Retikulum und die Dichte der Mitochondrien der großen Luteinzellen charakterisieren sie als den Ort, der mehr P4 produziert als die kleinen Luteinzellen (FIELDS und FIELDS 1996). Weiterhin enthalten die großen Luteinzellen Rezeptoren für Prostaglandin F2α (PGF2α) und scheinen somit eine entscheidende Rolle bei der Luteolyse zu spielen (NISWENDER et al. 2000). Neben diesen beiden lutealen Zelltypen spielen Fibroblasten, verschiedene Arten von Immunzellen und Endothelzellen eine wichtige Rolle in der Funktion des CL, haben jedoch keine direkte Bedeutung in der P4-Synthese (FIELDS und FIELDS 1996). Über die Endothelzellen wird das sezernierte P4 in die Zirkulation gebracht.
4 2.1.2 Exogenes Progesteron
Die exogene Applikation von P4 wird bereits lange in der Praxis während des Zyklus und der Trächtigkeit des Rindes eingesetzt und ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen (LARSON et al. 2007; VILLARROEL et al. 2004; STEVENSON und MEE 1991; VAN CLEEF 1991;
ROBINSON et al. 1989; WOODY und GINTHER 1968; WOODY et al. 1967; SLACK 1963;
RAY et al. 1961; ZIMBELMAN et al. 1959). In den verschiedenen Studien unterscheidet sich die Supplementation dieses Hormons in der Methodik, der Konzentration, im Zeitpunkt und in der Dauer der Administration. Es ergaben sich durch exogene P4-Supplementation unterschiedliche Effekte auf die Trächtigkeit (LARSON et al. 2007; MANN et al. 2006;
ROBINSON et al. 1989; SLACK 1963; JOHNSON 1958), auf die Zykluslänge (GARRETT et al. 1988a; SREENAN und MULVEHILL 1977; WOODY et al. 1967), auf die Funktion des CL (SREENAN und MULVEHILL 1977; WOODY und GINTHER 1968; ZIMBELMAN et al. 1959) und auf die Entwicklung des DF (SAWYER et al. 1995; ADAMS et al. 1992;
SIROIS und FORTUNE 1990).
2.1.2.1 Einfluss von exogenem P4 auf die periphere P4-Konzentration
Während des Proöstrus und des Östrus sind die P4-Konzentrationen beim Rind niedrig. Ihre basalen Werte liegen unter 1 ng/ml (DIAZ et al. 1986; HENRICKS et al. 1970). Nach der Ovulation steigt die P4-Konzentration mit der Ausbildung eines funktionsfähigen CL im Metöstrus und im Diöstrus im Blut an (BOLLWEIN et al. 2000; BAUMGARTNER 1998;
SCHALLENBERGER et al. 1985; TERBLANCHE und LABUSCHAGNE 1981;
HENRICKS et al. 1970). Die höchsten P4-SPiegel werden zwischen den Tagen 11 und 16 erreicht (DIAZ et al. 1986).
SREENAN et al. (1977) behandelten Färsen 10 Tage mit P4-imprägnierten Vaginalzäpfchen (Schwämme), die an Tag 2 (Tag 1 = Ovulation) eingesetzt wurden. Sie beobachteten einen steilen Konzentrationsanstieg des Hormons im Blut innerhalb von 24h nach der Insertion, während sich der P4-Spiegel in der Kontrollgruppe zwischen Tag 2 und Tag 3 nicht veränderte. Im Vergleich zu Kontrolltieren zeigten die supplementierten Tiere erhöhte
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periphere P4-Konzentrationen während der gesamten Behandlungsdauer. Der P4-Peak manifestierte sich bei den behandelten Tieren am Tag 8 des Zyklus. Bereits in einer früheren Studie konnten SREENAN und GOSLING (1977) einen positiven Effekt dieser Supplementation auf die P4-Konzentration im Plasma während einer Behandlungsdauer von 4 Tagen beobachten. Auch hier zeigte sich, dass die P4-Supplementation in dem Zeitraum von Tag 3 bis 6 des Zyklus, also in der frühlutealen Phase in einer signifikant höheren P4- Konzentration (3,3 ± 0,5 ng/ml versus 0,3 ± 0,5 ng/ml) resultierte. Eine Steigerung zeigte sich ebenfalls bei einem Applikationszeitraum von Tag 10 bis 13. Die Differenz zwischen beiden Versuchsgruppen war jedoch nicht signifikant (8,0 ± 0,7 ng/ml versus 6,6 ± 1,0 ng/ml) (SREENAN und MULVEHILL 1977).
Einen schnellen Anstieg der P4-Konzentration in der Milch konnten LARSON et al. (2007) ebenfalls durch eine P4-Substitution in der frühen Phase des Zyklus beobachten. Laktierenden besamten Kühen wurde von Tag 3 bis 9 (Tag 1 = Ovulation) eine CIDR®-Spange eingesetzt.
Die P4-Konzentration wurde an Tag 2, 3 und 21 bestimmt. Zwölf Stunden nach dem Einsetzen der Spange wurde eine signifikante Erhöhung der P4-Konzentration in der Milch bei CIDR®-Kühen um 0,7 ng/ml (1,13 ng/ml für CIDR®-Kühe versus 0,43 ng/ml für Kontrolltiere) nachgewiesen. Dieser Unterschied zeigte sich vor Tag 21 gleichermaßen bei graviden und nicht graviden Kühen. Die Gravidität wurde per transrektaler Palpation nach Tag 39 diagnostisiert.
SHAHAM-ALBALANCY et al. (2001) führten diöstrischen Kühen mit intaktem CL und Kühen ohne funktionelles CL über CIDR®-Spangen exogenes P4 zu. Jedes Tier beider Versuchsgruppen erhielt am Tag 6 des Zyklus je zwei CIDR®-Spangen (1,2 g), die am Tag 9 durch zwei neue, die für drei weitere Tage intravaginal blieben, ersetzt wurden. Die Autoren ermittelten dabei einen signifikanten Unterschied in der peripheren P4-Konzentration zwischen beiden Gruppen. Diöstrische Tiere mit intaktem CL wiesen während des behandelten Brunstzyklus höhere P4-Konzentrationen im Plasma auf als die Tiere ohne funktionelles CL. Der P4-Spiegel bei diesen Tieren war während der Behandlung hoch und stieg kontinuierlich an, während der P4-Spiegel der Tiere ohne funktionelles CL in dem Supplementationszeitraum niedrig war und auch konstant niedrig blieb. Die
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durchschnittlichen P4-Konzentrationen im Plasma der beiden Gruppen lagen am Tag 12 des Zyklus bei 5,8 ng/ml für Tiere mit einem funktionsfähigen CL bzw. 1,4 ng/ml für Tiere ohne funktionsfähiges CL.
Einen ähnlichen Unterschied in der peripheren P4-Konzentration zwischen P4- und Kontrollgruppe unter dem Einfluss von exogenem P4 stellten ADAMS et al. (1992) fest. Die Autoren injizierten Färsen täglich in Distelöl aufgelöstes P4 s.c. von Tag 1 bis 6 (Tag 1 = Ovulation) in abnehmender Dosierung (150, 150, 100, 75, 50 und 25 mg/Tag). Die täglichen Dosen wurden auf zwei Injektionen, die alle zwölf Stunden verabreicht wurden, aufgeteilt.
Kontrolltiere erhielten nach dem gleichen Prozedere ein äquivalentes Volumen (0,5 - 1,5 ml) von Distelöl s.c.. Die P4-Tiere zeigten bereits an Tag 2 einen erhöhten P4-Spiegel. Dieser war und blieb von Tag 3 an dem P4-Spiegel in der mittleren lutealen Phase (Tage 10-11) bei den Kontrolltieren äquivalent. Auch in dieser Studie konnten die Autoren nachweisen, dass eine in der frühlutealen Phase durchgeführte P4-Applikation die systemische P4- Konzentration steigerte.
Zu ähnlichen Ergebnissen kamen MANN und LAMMING (1995), die in ihrem Experiment eine positive Korrelation zwischen der Menge des verabreichten Hormons und der peripheren P4-Konzentration beobachteten. Kühe, die eine höhere P4-Dosis erhielten, wiesen im gleichen Zeitraum höhere P4-Konzentrationen im Plasma auf als Kühe, welche ohne oder mit einer geringeren Dosis behandelt wurden. Die Autoren injizierten ovarektomierten Kühen von zwei Versuchsgruppen intramuskulär (i.m.) von Tag 1 bis 16 zweimal täglich exogenes P4 in steigender Dosis. Die hohen Dosierungen waren 0, 40, 80, 160, 240, 320 und von Tag 8 an erhielt jede Kuh täglich 400 mg P4. Die niedrigen Dosierungen betrugen 0, 40, 80 und von Tag 9 an wurden jeder Kuh 160 mg P4 pro Tag verabreicht. Diese Dosis wurde in zwei Injektionen aufgeteilt und verabreicht. Die P4-Konzentrationen im Plasma waren in beiden Gruppen bis zum Tag 6 gering und unterschieden sich nicht voneinander. Von Tag 7 an lagen jedoch die Konzentrationen in der Gruppe mit hoher Dosis des supplementierten P4 signifikant höher als die Konzentrationen der mit einer geringeren Dosis behandelten Gruppe.
Zwischen den Tagen 10 und 17 maßen die P4-Konzentrationen im Plasma 12,4 ± 0,8 ng/ml
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bei der mit hohen und 6,0 ± 0,4 ng/ml bei der mit niedrigen P4- Dosierungen supplementierten Gruppe.
In der Studie von STEVENSON und MEE (1991) wiesen besamte Kühe, welche von Tag 5 bis 13 eine PRID®-Spirale erhielten, am Tag 13 keinen P4-Konzentrationsunterschied im Serum im Vergleich zu Kontrolltieren auf. Die Supplementierung von Tag 13 bis 21 führte jedoch zu einer höheren P4-Konzentration am Tag 21 im Serum ungeachtet des Graviditätsstatus als die Supplementation von Tag 5 bis 13. Die Autoren vermuteten, dass das in der früheren Lutealphase substituierte P4 die Entwicklung des CL beeinträchtigte und damit die endogene P4-Synthese inhibierte.
2.1.2.2 Einfluss von exogenem P4 auf die luteale P4-Synthese
In der Literatur existieren widersprüchliche Aussagen über eine mögliche Beeinflussung der lutealen Syntheseleistung durch exogenes P4.
MANN et al. (2001) überprüften die Hypothese, dass die endogene P4-Synthese durch die P4- Supplementation negativ beeinflusst wird. Um mögliche Beeinträchtigungen der endogenen P4-Sekretion zu minimieren, verwendeten sie eine spezielle CIDR®-Spange, welche nur 50 % des regulären P4-Gehaltes (z.B. 0,95 g statt 1,9 g pro Spange) enthielt. Diese wurde wenig fertilen Kühen, welche nach der ersten Besamung nicht aufgenommen hatten, intravaginal für die Dauer von sieben Tagen (Tag 10 bis 17 des Zyklus) eingesetzt. Während dieser Periode lagen die durchschnittlichen P4-Konzentrationen im Plasma der CIDR®- Tiere bei 10,3 ± 0,8 ng/ml und der Kontrolltiere bei 7,4 ± 0,6 ng/ml. Dieser Wert von 10,3 ± 0,8 ng/ml lag innerhalb des zu erwartenden physiologischen Bereiches. Am Tag 18, einen Tag nach der CIDR®-Entfernung, fiel die Plasma-P4-Konzentration der CIDR®- Tiere auf den Wert der Kontrolltiere zurück. Diese Ergebnisse ließen die Autoren zu der Schlussfolgerung kommen, dass das während der mittleren Lutealphase substituierte P4 die endogene P4-Produktion und -Sekretion nicht beeinträchtigte (MANN et al. 2001). Im Einklang mit den oben genannten Ergebnissen standen die von SREENAN und MULVEHILL (1977) gemachten Beobachtungen. In ihrem Experiment wurden P4-imprägnierte Vaginalzäpfchen bei Färsen in
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der frühen Phase (Tag 3) oder in der mittleren Phase (Tag 13) des Zyklus (Tag 1 = Ovulation) eingesetzt und blieben dort für zehn Tage. Eine höhere P4-Konzentration konnte während der gesamten Behandlungsdauer bei Tieren, denen am Tag 3 P4 supplementiert wurde, nachgewiesen werden. Die Autoren konnten keinen Effekt des während der frühen Phase des Zyklus zugeführten P4 auf die endogene P4-Sekretion aus dem CL beobachten. Bei den Tieren, die am Tag 13 des Zyklus P4-Zäpfchen bekamen, war ein Abfall der peripheren P4- Konzentration nach Tag 18 des Zyklus zu beobachten. Dies deutet auf eine physiologische Regression des CLs hin. Diese Beobachtungen stehen im Widerspruch zu den Ergebnissen von LOY et al. (1960). Die Autoren berichteten über eine Reduktion der Anzahl funktioneller Luteinzellen und damit auch der P4-Konzentration durch eine einmalige subkutane P4- Injektion von 2 mg pro kg Köpergewicht in der frühen Phase (Tag 1 und Tag 5) des Zyklus bei Färsen.
ROBINSON et al. (1989) kamen in ihrer Studie bezüglich der Auswirkung der exogenen P4- Supplementation zu unterschiedlichen Ergebnissen. Die Differenz war abhängig vom Zeitpunkt des Supplementationsbeginns. So zeigten Kühe, welche in der frühen Lutealphase (Tag 6) eine PRID®-Spirale (1,55 g P4) erhielten, an den Tagen 7 bis 9 höhere P4- Konzentrationen als Kontrolltiere. Dagegen führte die am Tag 11, also in der mittleren Lutealphase, eingesetzte PRID®-Spirale mit der gleichen P4-Kozentration lediglich am Tag nach der Insertion zu einem P4-Anstieg. Weiterhin gaben die Autoren an, dass in beiden Experimenten die P4-supplementierten Tiere tendenziell höhere P4-Konzentrationen während der siebentägigen Behandlungsdauer aufwiesen als die Kontrolltiere. Über einen Vergleich der P4-Spiegel zwischen ovarektomierten Tieren unter PRID®-Behandlung und ovarektomierten Tieren ohne Behandlung konnten sie die freigesetzte P4-Menge bestimmen und vermuteten infolge dessen, dass die endogene P4-Synthese bei supplementierten Kühen durch exogenes P4 an den Tagen 11 bis 18 signifikant reduziert wurde , nachdem sie die exogen zugeführte P4-Menge von der gesamten P4-Konzentration subtrahiert hatten. Im Einklang mit den Ergebnissen von SREENAN und MULVEHILL (1977) konnten die Autoren nachweisen, dass die P4-Substitution während der frühen Phase des Zyklus (Tag 6 bis 13) keinen Einfluss auf die P4-Freisetzung aus dem CL hat.
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2.1.2.3 Einfluss von exogenem P4 auf die Gravidität
Progesteron (P4) gilt als das entscheidende Hormon für die Aufrechterhaltung der Gravidität.
Zahlreiche Studien haben die P4-Konzentrationen im Blut mit der Trächtigkeitsrate und mit dem Wachstum der Embryonen in Verbindung gebracht. Niedrige systemische P4-Konzen- trationen können die embryonale Entwicklung während der Frühgravidität (FORDE et al.
2011; LONERGAN 2011; FOLMAN et al. 1973) beeinträchtigen oder Trächtigkeitsverluste zur Folge haben (MANN und LAMMING 1999). Höhere P4-Werte stehen dagegen im Zusammenhang mit gesteigertem embryonalem Wachstum und damit erhöhter Interferon-τ- Produktion sowie mit verbesserten Trächtigkeitsraten (FORDE et al. 2011; MANN et al.
2006; MANN und LAMMING 2001; MANN et al. 2001; MANN und LAMMING 1999).
Dementsprechend kann ein früher und höherer Anstieg der P4-Konzentration in den ersten drei bis vier Tagen post inseminationem (p.i.) eine wichtige Voraussetzung für die Etablierung der Trächtigkeit darstellen (LONERGAN 2011; LUTTGENAU et al. 2011b;
BELTMAN et al. 2009b). Eine P4-Supplementation in der frühen Phase (Tag 1 bis 7 p.i.) der Gravidität führte bei einigen Studien zur Steigerung der Trächtigkeitsrate (FORRO et al.
2012; LARSON et al. 2007; MANN und LAMMING 1999; ROBINSON et al. 1989;
GARRETT et al. 1988a), während andere einen solchen Effekt dementieren (VAN CLEEFF et al. 1996; SLACK 1963). Eine Übersicht über die Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen ist in Tab. 1 dargestellt.
10 Tab. 1:
Zusammenfassung verschiedener Studien über den Einfluss einer Substitution exogenen Progesterons auf die Trächtigkeit. Dargestellt sind Tiergruppen, Methodik der P4-Supple- mentation sowie der Einfluss auf die Trächtigkeitsrate.
Quelle Tiere Methodik Einfluss auf
Trächtigkeitsrate WILTBANK et al.
1956
Nicht laktierende Tiere unterschied- licher Rassen (n = 136)
P4 = 50 mg/Tag bzw.
P4 = 200 mg/Tag 31 Tage (s.c., Beginn am Tag 2 p.i.)
↑11,1% (44,4% vs.
33,3%)
↑12,9% (38,7% vs.
25,8%)
JOHNSON et al.
1958
Jersey- und Holstein-Färsen (n = 139)
P4 (100 mg/Tag, i.m.) (Tag 2, 3, 4, 6 und 9 p.i.)
↑18,3% (72,2% vs.
53,9%)
SLACK et al. 1963 Holstein (n = 594) (H)- bzw.
Guernsey (n = 282) (G)-Kühe
P4 (500mg /Tag, i.m.) (Tag 0, 2, 10 oder 14 p.i.)
↓20,7% (H) (31,4%
vs. 52,1%) bzw.
↓13,5% (G) (25,0%
vs. 38,5%) (Tag 0)
↓3,1% (H) (49,0% vs.
52,1%) bzw. ↓15%
(23,5% vs. 38,5%) (G) (Tag 2)
kein Einfluss (Tag 10 und 14)
SREENAN,J.M. 1975 Hereford-
Kreuzung-Färsen (n = 273)
P4-imprägnierte Schwämme
20 Tage (Verweildauer)
keine signif.
Verbesserung
STEVENSON, J.S., M.O. MEE 1991
Lakt.
Holsteinkühe (n = 179)
PRID®-Spirale (Tag 5-13 oder Tag 13-20 p.i.)
kein Einfluss bei der ersten Besamung
↑21% (60% vs. 39%) bei der zweiten Besamung
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Quelle Tiere Methodik Einfluss auf
Trächtigkeitsrate VAN CLEEF et al.
1991
VAN CLEEF et al.
1996
Färsen (n = 314)
Färsen (n = 396)
CIDR®-Spange (1,9 g) (Tag 7-13 p.i.)
CIDR®-Spange (1,9 g) (Tag 1-8 oder 2-9 p.i.)
↑4,3% (57,9% vs.
53,6%)
↓28,2% (18,2% vs.
46,4%)
VILLARROEL, A. et al. 2004
Lakt.
Holsteinkühe – Repeat breeder (n = 291)
PRID®-Spirale (Tag 5-19 p.i.)
↑2,6% (36,4% vs.
33,8%)
LARSON et al. 2007 Lakt.
Holsteinkühe (n = 130)
CIDR®-Spange (Tag 3,5-10 p.i.)
↑13% (48% vs. 35%) bzw. ↑18% (51% vs.
33%) in der 1. bzw.
2. Laktation
ARNDT, W.J. et al.
2009
Lakt.
Holsteinkühe (n = 84) und Färsen (n = 16)
CIDR®-Spange ↓3,9%
(29,1% vs. 33%)
BELTMAN, M.E. et al. 2009
Kreuzungs- fleischrassen (n = 197)
CIDR®-Spange keine signif.
Verbesserung
FORRO, A. et al.
2012
Lakt.
Holsteinkühe (n = 398)
PRID®-Spirale (Tag 4-18 p.i.)
↑5,3% (44,4% vs.
38,1%) (signif.
Anstieg nur bei BCS
≥ 3,25)
COLAZO, M.G. et al.
2013
Lakt.
Milchkühe (n = 223)
PRID®-Spirale (Tag 4,5-11,5 p.i.)
↑16,2% (41,3% vs.
25,1%) (bei Spontan- ovulation)
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In verschiedenen Studien konnte durch regelmäßige P4-Injektionen eine Steigerung der Konzeptions- bzw. Trächtigkeitsrate beobachtet werden. WILTBANK et al. (1956) applizierten nicht laktierenden Kühen verschiedener Rassen 50 mg P4 s.c. täglich von Tag 2 p.i. bis zur Schlachtung an Tag 34. Diese Tiere galten als Repeat-Breeder, da sie mehr als dreimal erfolglos besamt worden waren. Die Autoren erzielten eine Verbesserung der Trächtigkeitsrate um 11,1 % (44,4 % vs. 33,3 %; Tab. 1). Eine Steigerung um 12,9 % (38,7 % vs. 25,8 %) wurde bei einer Dosis von 200 mg/Tag erzielt. Ähnliche Ergebnisse veröffentlichten JOHNSON et al. (1958). Sie injizierten 100 mg P4 i.m. an den Tagen 2, 3, 4, 6, und 9 p.i. und konnten eine Trächtigkeitsrate bei den behandelten Milchkühen von 70 % erzielen, während die nicht behandelten Tiere eine Trächtigkeitsrate von 42 % aufwiesen. Die Steigerung in der Trächtigkeitsrate erklärten die Verfasser damit, dass die P4-Administration die Sekretion der sogenannten uterinen Milch anregt, welche die Nidation unterstützen und somit die Inzidenz der Embryomortalität reduzieren kann. Dass das Wachstum der Embryonen durch exogen verabreichtes P4 positiv beeinflusst wird, konnten GARRETT et al.
(1988b) in ihrer Studie zeigen. In ihrem Experiment wurden Kühen in der frühen Phase (Tag 1 bis 4 p.i.) der Trächtigkeit täglich 100 mg P4 injiziert. Sie stellten zum einen fest, dass die Embryonen, die an Tag 14 der Gravidität den supplementierten Tieren entnommen wurden, weiter in ihrer Entwicklung im Vergleich zu Embryonen der Kontrolltiere waren. Zum anderen konnten die Autoren durch Kultivierung embryonaler und endometrialer Explantate aus den Uterinlavagen an Tag 5 und Tag 14 nachweisen, dass die mit der Aufrechterhaltung der Trächtigkeit assoziierten Polypeptide erhöht waren. Sie kamen zu der Ansicht, dass der P4-Anstieg durch eine P4-Supplementation Veränderungen in der uterinen Sekretion hervorrief, welche ihrerseits direkt oder indirekt das Wachstum und die Entwicklung des Embryos stimulierte. Weiterhin regte exogenes P4 die Sekretion verschiedener Polypeptide des uterinen Endometriums an, welche Entwicklung und Wachstum frühzeitig in einer Weise, wie es bei älteren Embryonen zu beobachten ist, begünstigten. Des Weiteren konnten sie aufgrund der größeren Konzeptuslänge am Tag 14 der Gravidität nachweisen, dass Embryonen P4-substituierter Kühe länger überleben konnten und dass sie morphologisch weiter entwickelt waren als die der Kontrollkühe. Die Autoren schlussfolgerten daraus, dass exogenes P4 die Synthese und Freisetzung der Polypeptide aus dem Endometrium moduliert und somit eine wichtige Rolle in der maternalen Regulation von Embryonenwachstum und -
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entwicklung in der Frühträchtigkeit indiziert. Dieser indirekte, positive Einfluss der P4- Supplementation auf die frühembryonale Entwicklung und somit eine Verbesserung der Trächtigkeitsrate konnte ebenfalls in weiteren Studien (LARSON et al. 2007; LOPEZ- GATIUS et al. 2004; RHODES et al. 2001) beobachtet werden. Die Wirkung der exogenen P4-Substitution trat besonders deutlich bei Tieren auf, die zuvor suboptimale P4- Konzentrationen aufwiesen.
MANN et al. (1998) berichteten, dass vor allem der Zeitpunkt des Behandlungsbeginns eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Trächtigkeit spielte. So führte die Applikation von exogenem P4 an den Tagen 5 bis 9 sowohl zu einer Verbesserung der embryonalen Entwicklung als auch zu einer signifikanten Steigerung der Interferon-τ-Produktion. Zudem beobachteten die Autoren einen engen Zusammenhang zwischen Embryonengröße und uteriner Interferon-τ-Konzentration. Im Gegensatz hierzu zeigte eine P4-Administration an den Tagen 12 bis 16 keine solche Wirkung. Anhand der Analyse der Daten mehrerer Studien, die sich mit der P4-Supplementation beschäftigten, beschrieben MANN et al. (1999) einen Anstieg der Trächtigkeitsrate um 10 %, wenn die P4-Behandlung vor Tag 6 p.i. stattfand.
Ferner konnten MANN und LAMMING (1999) in einem Vergleich einiger Studien eine durchschnittliche Erhöhung der Trächtigkeitsrate um 19 % feststellen, wenn die durchschnittliche Trächtigkeitsrate der Herde unter 50 % lag. Lag dagegen die Trächtigkeitsrate über 50 %, dann hatte die P4-Zufuhr keinen Effekt auf die Fertilität (MANN und LAMMING 1999). Zu guter Letzt postulierten die Verfasser, dass die P4- Konzentration ein wichtiger Determinant für den Ausgang der Trächtigkeit, aber nicht so wichtig wie der Zeitpunkt des postovulatorischen P4-Anstiegs zu sein scheint.
LARSON et al. (2007), die eine intravaginale P4-Applikation (über CIDR®-Spange) von Tag 4 bis 10 p.i. durchführten, kamen zu ähnlichen Ergebnissen. Sie beobachteten mit Hilfe dieser Substitution einen hohen Anstieg der Trächtigkeitsrate bei den behandelten gegenüber den unbehandelten Tieren. Besonders deutlich zeigte sich diese Steigerung bei den Probanden, die sich in der ersten und in der zweiten Laktation befanden (von 33 % auf 51 %).
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Übereinstimmend mit den oben erwähnten Beobachtungen von MANN et al. (1999) konnten MACMILLIAN et al. (1991) bei laktierenden Kühen eine Steigerung der Konzeptionsrate von 65,7 % auf 79,2 % erreichen, obwohl den Tieren exogenes P4 via CIDR®-Spangen erst am Tag 6 bis 8 p.i. für eine Dauer von sechs oder 12 Tagen supplementiert wurde und trotz der Tatsache, dass die initiale Trächtigkeitsrate bereits bei über 60 % lag.
ROBINSON et al. (1989) berichten über eine signifikante Steigerung der Trächtigkeitsrate um 30 %, nachdem sie laktierenden Kühen mittels PRID®-Spiralen (1,55 g) exogenes P4 an Tag 5 oder an Tag 10 p.i. für sieben Tage verabreicht hatten. Tiere beider supplementierten Gruppen wiesen dabei eine Trächtigkeitsrate von 60 % auf, während lediglich 30 % der nicht behandelten Kühe tragend wurden.
FORRO et al. (2012) konnten bei laktierenden Holsteinkühen, die nach der Durchführung eines OvSynch Programms besamt worden waren, und die mittels PRID®-Spiralen von Tag 4 bis Tag 18 p.i. exogenes P4 erhalten hatten, einen positiven Effekt auf die Trächtigkeitsrate feststellen. Diese Wirkung war aber nur bei Tieren mit einem BCS ≥ 3,25 zu beobachten.
Im Gegensatz zur letztgenannten Arbeit konnten COLAZO et al. (2013) durch die P4- Substitution mittels PRID®-Spiralen im Anschluss an eine OvSynch keine positive Auswirkung auf die Trächtigkeitsrate feststellen. In ihrer Studie führte eine P4- Supplelmentation von Tag 4 bis 11 p.i. bei Kühen mit einem BCS ≥ 2,75 zu keiner Steigerung der Trächtigkeitsrate (44,4 % mit PRID® vs. 49,8 % ohne PRID®). Eine Interaktion zwischen PRID®-Behandlung vor- und nach der Besamung konnten die Autoren ebenfalls nicht feststellen.
In einer späteren Phase der Trächtigkeit und für eine längere Dauer supplementierten LOPEZ-GATIUS et al. (2004) hoch laktierenden Kühen P4. Die Autoren setzten PRID®- Spiralen über einen Zeitraum von 28 Tagen ab Tag 36 bis 42 der Trächtigkeit ein und erzielten auf diese Weise eine Reduktion des Trächtigkeitsverlusts um 6,7 % (5,3 % bei PRID®-Tieren versus 12 % bei Kontrolltieren). Daraus schlussfolgerten sie, dass eine intravaginale P4-Supplementation das Potenzial besitzt, die Inzidenz von
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Trächtigkeitsverlusten auch während der spätembryonalen oder frühfetalen Periode zu reduzieren.
Im Widerspruch zu den obengenannten Arbeiten hatte die Applikation von exogenem P4 in einigen anderen Studien keinen Einfluss auf die Trächtigkeitsrate (BELTMAN et al. 2009a;
VILLARROEL et al. 2004; STEVENSON und MEE 1991; VAN CLEEF 1991). VAN CLEEF et al. (1991) konnten keine signifikante Verbesserung der Konzeptionsrate von behandelten Tieren (56,2 %) gegenüber der unbehandelten Tiere (55,3 %) beobachten. In ihrer Studie war Färsen exogenes P4 via CIDR®-Spange (1,9 g) an Tag 7 p.i. substituiert worden. Diese Spange wurde nach sechs Tagen wieder entfernt. Es zeigte sich, dass einige Färsen trotz initialer Anzeichen einer Gravidität wieder in Östrus kamen. Die Autoren vermuteten, dass eine frühembryonale Mortalität bei diesen Tieren stattgefunden hatte. Als Grund hierfür nahmen sie an, dass eine Störung oder Asynchronizität des maternalen Uterusmilieus und der Embryonalentwicklung durch den übermäßigen und rapiden Anstieg der P4-Konzentration auftrat. In einer späteren Studie, in der sie (VAN CLEEFF et al. 1996) Färsen P4 über eine CIDR®-Spange (1,9 g) in der frühen Phase der Gravidität (Tag 1 oder 2 p.i.) für sieben Tage supplementierten, stellten sie eine Trächtigkeitsrate bei substituierten Färsen von 18,2 % fest, während die Kontrollfärsen eine Trächtigkeitsrate von 46,4 % aufwiesen. Die Verfasser schlossen daraus, dass eine P4-Supplementation innerhalb der ersten beiden Tage nach der Besamung für eine Dauer von sieben Tagen die Fertilität supprimierte.
Das Ergebnis bestätigte die Beobachtungen einer anderen Studie (SLACK 1963), in der von einem negativen Effekt auf die Trächtigkeitsrate durch exogenes P4 berichtet wurde. In dieser Studie wurde P4 (500 mg/Tier/Tag i.m.) einmalig an Tag 0, 2, 10 oder 14 p.i. injiziert. Die Behandlung führte zur Senkung der Konzeptionsrate in unterschiedlicher Ausprägung. Die P4-Supplementation am Tag der Insemination senkte die Trächtigkeitsrate bei Holstein- Kühen um 20,7 %, während die Supplementation an Tag 2 p.i. eine Senkung der Trächtigkeitsrate um 3,1 % zur Folge hatte. Dagegen hatte die P4-Supplementation an den Tagen 10 und 14 keine Auswirkungen auf die Trächtigkeitsrate (Tab. 1).
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2.1.2.4 Einfluss von exogenem P4 auf das Follikelwachstum
Die ovarielle Follikelentwicklung ist ein dynamischer Prozess. Sie beginnt bereits im Fetalalter und setzt sich bis zur zyklisch wiederkehrenden Ovulation des dominanten Follikels oder bis zu Erschöpfung des Eizellenvorrats fort. Während eines Brunstzyklus beim Rind findet das Wachstum von Follikeln mit einer Größe von 3 - 5 mm oder größer in zwei bis drei aufeinander folgende Follikelwellen statt (GINTHER et al. 1989; SAVIO et al. 1988; SIROIS und FORTUNE 1988). Der funktionelle Wachstumsverlauf einer Follikelwelle kann in Rekrutierung, Selektion, Dominanz und Ovulation oder Atresie eingeteilt werden (IRELAND 1987). Mit Beginn der ersten Follikelwelle eines Zyklus, d.h. am Tag vor der Ovulation, tritt eine Gruppe von drei bis sechs Follikeln, auch Kohorte genannt, aus dem Gesamtfollikelvorrat des Ovars in Erscheinung, die weiterwachsen, bis ihr Durchmesser mehr als 4-5 mm beträgt (GINTHER et al. 1996). Die zweite Follikelwelle beginnt etwa zehn Tage nach der Ovulation, während die dritte Welle am Tag 16 des Zyklus startet (GINTHER et al.
1996). Der Mechanismus dieser Rekrutierung ist noch unbekannt, aber es ist nachgewiesen, dass ein Anstieg in der FSH-Konzentration diesen Prozess stimuliert (LUCY et al. 1992).
Einige Tage nach der Rekrutierung beginnt die Selektionsphase, bei der ein Follikel schneller wächst, während der Rest der Kohorte in der Größe abnimmt (GINTHER et al. 1996; LUCY et al. 1992; GINTHER et al. 1989; SAVIO et al. 1988). Der größte Follikel wird als dominanter Follikel (DF) bezeichnet. Beim Rind ist der DF in der Lage, das Wachstum der anderen Follikel auf dem Ovar zu unterdrücken, indem er durch Östradiol-Produktion ein negatives Feedback auf die Ausschüttung von FSH hervorruft sowie durch eine verstärkte Exprimierung der LH-Rezeptoren. Dadurch besitzt der DF nach GINTHER et al. (1997) in der frühen Entwicklungsphase einen Vorteil gegenüber anderen Follikeln derselben Kohorte.
Da er schneller wächst, erreicht er die Deviationsphase früher als der Rest der Kohorte (GINTHER et al. 1997). Der DF der ersten Welle kann ovulieren, wenn eine Luteolyse durch PGF2α an Tag 5 bis 8 des Zyklus eingeleitet wird (KASTELIC et al. 1990). In unbeeinflussten Zyklen bildet sich der erste DF jedoch zurück und wird durch die neue Kohorte der zweiten bzw. dritten Welle ersetzt (SAVIO et al. 1988; SIROIS und FORTUNE 1988). Die Lebensspanne der großen Follikel ist unter anderem von der pulsatilen Sekretion des LHs abhängig (LUCY et al. 1992). Es wird angenommen, dass der DF aufgrund der
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geringen Frequenz der LH-Pulse während der mittleren lutealen Phase der Atresie unterliegt (SAVIO et al. 1993a; SIROIS und FORTUNE 1990). P4 nimmt somit eine wichtige Stellung bei der Entwicklung der Follikel ein, da es eine negative Rückkopplung auf die GnRH-Frei- setzung des Hypothalamus und damit einen hemmenden Effekt auf die Ausschüttung von LH aus der Hypophyse ausübt. Auf diese Weise beeinflusst P4 über eine Inhibition der GnRH- Sekretion die Follikelentwicklung in der Lutealphase und verhindert eine Ovulation (AUSTIN et al. 2002; STOCK und FORTUNE 1993).
In einigen Studien konnte gezeigt werden, dass exogenes P4 die Ovulation des DF unterdrückt. So verzögerten SALVIO et al. (1993a) mittels P4-Implantaten die Ovulation bis zum Zyklustag 18, obwohl sie bereits am Tag 8 post ovulationem mit PGF2α die Luteolyse induziert hatten. Auch ANDERSON und DAY (1994) konnten durch eine orale P4- Verabreichung in Abwesenheit eines CL die Ovulation unterdrücken. Erst nach Abbruch der P4-Zufuhr kam es zu einer Ovulation. In einer früheren Studie von ULBERG et al. (1951) wurde ebenfalls beobachtet, dass exogenes P4 das Potenzial besitzt, bei Milchrindern Brunst und Ovulation während der Behandlungsdauer zu unterdrücken. Abhängig von der Injektionsdosis und dem Zeitpunkt der Behandlung konnte exogenes P4 Einfluss auf das Follikelwachstum nehmen. Am stärksten trat dies bei einer Injektion von 50 mg P4 pro Tag zutage. Dennoch konnte bei einigen Tieren während der 13- bis 17-tägigen Supplementation beginnend an Tag 14 oder Tag 15 des Zyklus eine reduzierte follikuläre Entwicklung nachgewiesen werden. Die folgende Ovulation fand durchschnittlich fünf Tage nach Behandlungsende statt. Zudem ovulierte in keinem Fall in dieser Studie der Follikel mit dem größten Durchmesser. Bereits bei einer Reduzierung der Dosis auf 25 mg pro Tag waren diese Resultate nicht mehr so deutlich ausgeprägt. Die Injektion von 12,5 mg pro Tag führte zur Bildung größerer Follikel. Eine tägliche P4-Dosis von weniger als 12,5 mg hatte dagegen keine Auswirkungen auf die follikuläre Entwicklung. Darüber hinaus musste das Intervall der P4-Administration vor dem Tag 15 des Zyklus beginnen, damit das exogene P4 einen Einfluss ausüben kann. Im Gegensatz hierzu zeigte sich in einer weiteren Studie, dass der DF der ersten Welle unter frühem exogenem P4-Einfluss ein vermindertes Wachstum aufwies (ADAMS et al. 1992). Im Vergleich zum DF der Kontrollgruppe hatte dieser einen geringeren Durchmesser (12,7 ± 0.9 mm versus 15,3 ± 0,7 mm). Gemäß den Autoren unterdrückte das in
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der Wachstumsphase von Tag 6 bis Tag 20 verabreichte P4 dosisabhängig (30 mg, 150 mg oder 300 mg pro Tag) den DF in seiner Entwicklung. In einer weiteren Studie wird von einer signifikanten Reduktion des follikulären Wachstums berichtet, wenn der größte Follikel zum Zeitpunkt der P4-Behandlung einen Durchmesser von mehr als 9 mm aufwies (GINTHER et al. 2001). Follikel mit einem Durchmesser von weniger als 7 mm zum Zeitpunkt des Behandlungsbeginns zeigten dagegen keine Beeinträchtigung in ihrem Wachstum. Im Widerspruch zu diesen Ergebnissen konnten AUSTIN et al. (2002) unter dem Einfluss exogenen P4s keine Veränderung des Follikelwachstums aus der ersten Welle beobachten.
Neben der Hemmung des Follikelwachstums verhindert exogenes P4 im Östrus den vorübergehenden Anstieg der LH-Konzentration, die gemäß GINTHER et al. (2001) die Deviation der Follikel bei Färsen begleitet, und reduziert zudem die Frequenz der LH-Pulse (AUSTIN et al. 2002). Die verminderten LH-Konzentrationen sind mit einem reduzierten Wachstum des größten Follikels assoziiert, beeinflussen jedoch nicht die Entwicklung und Rückbildung des nächstgrößeren Follikels. Bei anöstrischen Kühen war die exogene P4- Supplementation mit einem vorübergehend initialen Rückgang sowohl der Frequenz der LH- Pulse als auch der mittleren LH-Konzentrationen am Tag nach der Insertion der CIDR®- Spange assoziiert. Die beiden Parameter stiegen jedoch nach Tag 4 der Behandlung wieder zu den vor der Substitution gemessenen Ausgangswerten an (NATION et al. 2000). Bei Kühen mit zystischen Ovarfollikeln reduzierte exogenes P4 die abnorm hohen LH-Pulse (CALDER et al. 1999). Dies führte zu Rückbildung der zystischen Ovarfollikel, so dass sich daraufhin ein neuer dominanter Follikel heranbilden und somit nach dem Ende der Supplementation eine Ovulation stattfinden konnte (LUCY et al. 2004; CALDER et al. 1999).
2.1.2.5 Einfluss von exogenem P4 auf die Zykluslänge
Ergebnisse diverser Studien zeigten, dass exogenes P4 die Lebensspanne des CL und damit die Zykluslänge beeinflusst (GARRETT et al. 1988a; SREENAN und MULVEHILL 1977;
HARMS und MALVEN 1969; WOODY et al. 1967; LOY et al. 1960). So konnten LOY et al.
(1960) einen zeitabhängigen Einfluss exogenen P4s auf die luteale Entwicklung und auf die Zykluslänge feststellen. Eine am Tag 1 (Tag 1 = Ovulation) durchgeführte Einzelinjektion
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von 2 mg P4 pro kg Körpergewicht hatte einen negativen Effekt auf das luteale Gewicht und auf die Funktion der am Tag 14 des Zyklus extrahierten Luteinzellen, während das am Tag 5 supplementierte P4 keine derartigen Veränderungen hervorrief. Auch WODDY et al. (1967) beobachteten nach zehntägiger s.c. Applikation von 100 mg P4, beginnend am Tag des Östrus, eine Verkürzung der Zyklusdauer von 20,7 Tagen auf 16,7 Tage. Allerdings kam es in einer weiteren Studie (WOODY and GINTHER 1968) zu der Einschränkung, dass diese Fähigkeit des exogenen P4 nur bei intaktem Uterushorn der ipsilateralen Seite zum CL auftrat. Das Fehlen (z.B. einseitige Hysterektomie) des ipsilateralen Hornes unterdrückte weitestgehend diese Wirkung. Fehlte dagegen das Uterushorn auf der kontralateralen Seite, so blieb dieser verkürzende Einfluss bestehen. Die Autoren vermuteten, dass die Fähigkeit des exogenen P4, die CL-Regression zu beeinflussen, von einer direkten Verbindung des ovulierenden Ovars zum uterinen Horn abhängig und somit vom Uterus vermittelt ist. Zudem übte das exogene P4 scheinbar eine größere reduzierende Wirkung auf die Zykluslänge aus, wenn die Injektionen beginnend mit dem Östrus verabreicht wurden als eine Applikation z.B.
zwei Tage später. Die Fähigkeit des exogenen P4, die Zykluslänge zu verkürzen, konnten HARMS und MALVEN (1969) ebenfalls in ihrer Studie nachweisen. So berichteten sie von einer maximalen Effektivität der P4-Substitution von 100 mg/Tag, wenn die i.m. Injektion bereits am Tag 1 (Tag 1 = Ovulation) des Zyklus verabreicht und bis zum Tag 3 fortgeführt wurde. Wurde die Behandlung erst nach Tag 2 angewandt, musste sie über Tag 3 des Zyklus hinaus fortgesetzt werden, um einen Einfluss auf die Zykluslänge auszuüben. Die Autoren machten jedoch keine Angabe darüber, wie lang die P4-Behandlung fortzusetzen ist.
Übereinstimmend mit den Ergebnissen von LOY et al. (1960) stellten sie eine Verminderung des lutealen Gewichtes durch die P4-Zufuhr von Tag 2 bis 6 fest. Jedoch konnten sie die von LOY et al. (1960) beobachtete Verminderung der P4-Konzentration in CLs von Tag 14 nicht bestätigen. Sie vermuteten, dass der Grund für diese Diskrepanz im Alter des CL zum Zeitpunkt der Gewebeentnahme liegen könnte, da die Lutektomie in ihrer Studie bereits am Tag 8 stattfand. Da andere supplementierte Färsen am Tag 15 nach der P4-Behandlung in Brunst kamen, ist zu vermuten, dass sich eine Abnahme des P4-Spiegels in den CLs hätte gezeigt haben, wenn sie am Tag 14 entnommen worden wären (HARMS und MALVEN 1969).
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Wie WOODY et al. (1967) konnten GARRETT et al. (1988a) eine Zyklusverkürzung um mehr als vier Tage (21,6 Tage bei Kontrolltieren versus 16,7 Tage bei P4-Tieren) durch exogenes P4 beobachten. Sie verabreichten zyklischen Rindern 100 mg P4 i.m. pro Tier und Tag an den Tagen 1, 2, 3 und 4 des Zyklus. Neben einer Senkung der peripheren Plasma-P4- Konzentration stellten die Autoren einen Anstieg des Prostaglandins fest. Sie folgerten daraus, dass exogenes P4 einen vorzeitigen Abschluss der endometrialen Entwicklung bewirke. Dies führe zu einer frühzeitigen Freisetzung des PGF2α,das eine Luteolyse einleite und den Diöstrus bei den Kühen verkürze.
2.2 Uteriner Blutfluss
Die uterine Perfusion ändert sich nicht nur während der Gravidität, sondern auch während des Zyklus. Endotheliale vaskuläre Veränderungen während des Zyklus sind teilweise auf die Einflüsse der Steroidhormone zurückzuführen. Der uterine Blutfluss wurde in verschiedenen Studien über chirurgisch implantierte Blutflusssonden oder über nicht invasive Methoden bestimmt (BOLLWEIN et al. 2002a; BOLLWEIN et al. 2000; BAUMGARTNER 1998;
BOLLWEIN et al. 1998; WAITE et al. 1990; FORD et al. 1979). BOLLWEIN et al. (2002c) etablierten mittels der transrektalen Farbdopplersonographie erstmalig die nicht invasive Methode zur Untersuchung der uterinen Blutgefäße. Damit kann die uterine Perfusion ohne chirurgische Eingriffe über einen längeren Zeitraum an denselben Tieren verfolgt werden. Mit Hilfe dieser Methode konnte unter anderem gezeigt werden, dass neben dem Zyklusstand auch der Reproduktionsstatus (z.B. Gravidität) die uterine Perfusion beeinflusst (BOLLWEIN et al. 2002a; BOLLWEIN et al. 2000; BAUMGARTNER 1998; BOLLWEIN et al. 1998;
WAITE et al. 1990; FORD et al. 1979).
BOLLWEIN et al. (2000) untersuchten die Veränderungen des Resistance Index (RI) und der mittlere Blutflussgeschwindigkeit (TAMV = Time Average Maximum Velocity) während des Zyklus. Dabei galten ein niedriger RI und eine hohe TAMV als Indikatoren für eine erhöhte uterine Perfusion. Der höchste RI und die niedrigste TAMV waren am Tag 1 (Tag 0 = Ovulation) des Zyklus festzustellen, während der niedrigste RI und die höchste TAMV zwischen den Tagen -2 und 0 gemessen wurden (BOLLWEIN et al. 2000). Des Weiteren
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konnten die Autoren eine positive Korrelation zwischen TAMV und der Östrogen (E2)- Konzentration, sowie eine negative Korrelation zwischen RI und der E2-Konzentration beobachten. Zudem war TAMV negativ mit der peripheren P4-Konzentration korreliert.
Bereits in früheren Studien, in denen elektromagnetische Blutflusssonden (FORD und CHENAULT 1981) oder dopplersonographische Transducer (WAITE et al. 1990) chirurgisch in bzw. um die uterinen Arterien angebracht wurden, wurde wie bei BOLLWEIN et al. (2000) von einer positiven Korrelation zwischen uteriner Perfusion und der systemischer E2- Konzentration, sowie von einer negativen Korrelation zwischen uteriner Perfusion und der systemischen P4-Konzentration berichtet (FORD und CHENAULT 1981).
2.3 Follikuläre Durchblutung
Die erhöhte Blutversorgung der einzelnen Follikel scheint mit dem follikulären Wachstum und der Follikeldeviation assoziiert zu sein, während eine reduzierte Vaskularisation eng mit der follikulären Atresie in Verbindung steht. Vor der Follikelselektion der ersten follikulären Welle konnten sowohl ACOSTA et al. (2005) als auch MATSUI und MIYAMOTO (2009) mit Hilfe der Dopplersonographie keinen Unterschied in der Vaskularisation zwischen den größten und den nächstgrößten Follikeln feststellen. Erst nach der follikulären Selektion kam es zur Abnahme der Blutversorgung der nächstgrößeren Follikel. Die genannten Autoren gaben an, dass die Erhaltung der follikulären Vaskularisation und der Blutversorgung der größten Follikel essentiell für die Follikeldominanz war und dass die Veränderung der Blutversorgung bei einem individuellen Follikel in enger Beziehung mit dem follikulären Wachstum der ersten Follikelwelle stand. In einer weiteren Studie konnten ACOSTA et al.
(2003) beobachten, dass die Perfusion des präovulatorischen Follikels initial auf einen kleinen Bereich der Follikelwand beschränkt war und dass das durchblutete Areal im Laufe der follikulären Entwicklung kontinuierlich anstieg. Bei Tieren mit einer spontanen Ovulation stieg die vaskularisierte Fläche parallel mit der E2-Konzentration im Plasma graduell an und blieb bis zur Ovulation hoch, wohingegen der durchblutete Bereich in der Follikelwand bei der induzierten Ovulation 30 Minuten nach einer GnRH-Injektion plötzlich expandierte und bis zur Ovulation größer blieb als das Areal bei der spontanen Ovulation (ACOSTA et al.
2003). Ferner stellten die Autoren eine temporäre Beziehung des durchbluteten Areals,
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welches als semiquantitativer Parameter für die follikuläre Durchblutung herangezogen wurde, und der TAMV sowohl mit dem Plasma-Konzentrationsanstieg von E2 als auch mit dem Anstieg von LH fest. Die höchste TAMV in der Wand des präovulatorischen Follikels wurde während des LH-Konzentrationsanstiegs sowohl in der spontan ovulierenden als auch hormonell behandelten Gruppe beobachtet. Des Weiteren stieg bei Kühen mit GnRH- induzierter Ovulation der follikuläre Blutfluss simultan mit der Plasma-Konzentration von LH sowie von E2 an und blieb bis zur Ovulation relativ unverändert hoch. Dagegen begann bei Tieren mit einer spontanen Ovulation der follikuläre Blutfluss bereits zu steigen, obwohl die LH-Konzentration im Plasma noch niedrig war (ACOSTA et al. 2003). Aus den beobachteten Ergebnissen schlussfolgerten ACOSTA et al. (2003), dass es eine funktionale Assoziation zwischen dem Blutfluss in der Follikelwand und der Plasma-Konzentration von E2 und LH während der präovulatorischen Phase bei der Kuh existiert. Darüber hinaus wurde in einer Studie die follikuläre Perfusion bei zyklischen Kühen in Verbindung mit der Höhe der P4- Konzentration gebracht. So berichteten LÜTTGENAU et al. (2011a), dass eine niedrige P4- Konzentration im peripheren Blut einen größeren dominanten Follikel (DF) der ersten Follikelwelle zur Folge hatte als eine höhere P4-Konzentration. Dagegen war der Durchmesser des präovulatorischen DF unabhängig von der P4-Konzentration (LUTTGENAU et al. 2011a). Am Tag 7 (Tag 1 = Ovulation) ihres Experiments konnten die Autoren einen signifikant geringeren follikulären Blutfluss bei der niedrigen als bei einer höheren P4-Konzentration beobachten. Das war der einzige Tag, an dem zwischen Tieren mit niedrigen und hohen P4-Werten ein Unterschied bezüglich der follikulären Perfusion festzustellen war (LUTTGENAU et al. 2011a).
2.4 Luteale Durchblutung
Das bovine CL ist relativ zu seiner Größe das bestdurchblutete Organ des Körpers und weist die höchste Durchblutungsrate pro Gewebeeinheit des Gesamtorganismus auf (WILTBANK et al. 1988). Seine Durchblutung kann mittels Dopplersonographie bestimmt werden. Die luteale Durchblutung zeigt charakteristische Veränderungen nach spontaner (MATSUI und MIYAMOTO 2009; MIYAMOTO et al. 2005) sowie induzierter (GINTHER et al. 2007;
SHIRASUNA et al. 2004; ACOSTA et al. 2002) Luteolyse. Gleiches konnte auch während
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des Zyklus festgestellt werden (TAKASAKI et al. 2009). In verschiedenen Studien (SINGH et al. 1998; TOM et al. 1998; KASTELIC et al. 1990b) wurde beobachtet, dass auch die luteale Größe einem typischen Verlauf unterliegt. Das CL nimmt bis Tag 10 des Zyklus an Größe zu, erreicht dann eine Plateauphase, um dann zwei Tage nach Beginn der Luteolyse, welche über den Abfall der peripheren P4-Konzentration bestimmt wird, kleiner zu werden.
In einigen Studien wurde von einer geringen lutealen Durchblutung (LDB) während der ersten drei Tage des Zyklus (BOLLWEIN et al. 2002b; NISWENDER et al. 1976) berichtet.
ACOSTA et al. (2003) wiesen einen graduellen Anstieg der LDB parallel mit dem Anstieg des lutealen Volumens von Tag 2 bis 5 des Zyklus nach. Zwischen den Tagen 3 und 4 nahm sowohl das durchblutete Areal als auch das Volumen des jungen CLs um das Zwei- bis Dreifache zu (ACOSTA et al. 2003). Eine annähernde Verdopplung der LDB von Tag 4 bis Tag 7 konnten HERZOG et al. (2010) in ihrer Untersuchung beobachten. Während der statischen Phase (Tag 8-16) nahm die LDB noch einmal um fast das Zweifache zu und erreichte maximale Werte an den Tagen 14 und Tag 16. In der Regressionsphase war dagegen ein rapider Abfall der LDB nachweisbar, der im Gegensatz zur Größe des CL parallel mit dem Abfall des P4-Spiegels einherging (HERZOG et al. 2010).
Während der spontanen (MATSUI und MIYAMOTO 2009; MIYAMOTO et al. 2005) und der induzierten (MATSUI und MIYAMOTO 2009; GINTHER et al. 2007; ACOSTA et al.
2002) Luteolyse wurde vor dessen Abfall ein kurzzeitiger initialer Anstieg der LDB beobachtet. Einen solchen Anstieg konnten GINTHER et al. (2007) in ihrem Experiment durch sowohl systemische als auch intrauterine PGF2α-Administration induzieren und bestätigten somit die Schlussfolgerung von MIYAMOTO et al. (2005), die das Phänomen auf die Stimulierung des vasodilatativ wirkenden NO durch PGF2α zurückführten.
In anderen Studien konnte in den ersten Tagen des Zyklus eine sehr gute (BOLLWEIN et al.
2002c) und während der mittleren lutealen Phase eine gute (TAKASAKI et al. 2009; FORD und CHENAULT 1981; NISWENDER et al. 1976) Korrelation zwischen der Größe des durchbluteten Areals im CL und der P4-Konzentration im Serum festgestellt werden. Jedoch konnten WILTBANK et al. (1988) keine Veränderung des Gefäßwiderstandes innerhalb des CL durch eine Hemmung der P4-Produktion mittels Aminoglutethimid-Applikation
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induzieren. In der Studie von LÜTTGENAU et al. (2011a) wurde eine Korrelation zwischen systemischen P4-Konzentrationen und der lutealen Perfusion beschrieben. So wiesen zyklische Kühe mit einer niedrigen P4-Konzentration ein kleineres CL mit einer geringeren luteale Durchblutung auf als Kühe mit einer physiologischen P4-Konzentration. In einer jüngst veröffentlichten Studie (PUNSMANN 2013) wurde frühtragenden, laktierenden Kühen exogenes P4 über CIDR®-Spange supplementiert. Hierbei konnte kein Einfluss exogenen P4s auf die Größe oder auf die Durchblutung des CLs beobachtet werden. Zudem konnte im Gegensatz zu den Ergebnissen von LÜTTGENAU et al. (2011a) keine Korrelation zwischen peripherer P4-Konzentration und den genannten lutealen Parametern festgestellt werden.
2.5 Genexpression im Corpus luteum
Das Corpus luteum (CL) ist der Hauptort der P4-Produktion während der lutealen Phase im Brunstzyklus des Rindes.
Als Ausgangssubstanz für die Steroidhormone gelangt das an Lipoprotein gebundene Cholesterol über das Blut zu den Luteinzellen. Im Anschluss wird Cholesterol durch das Steroidogenic Acute Regulatory (StAR)-Protein von der äußeren zur inneren Membran der Mitochondrien transportiert. Dieser Vorgang ist der entscheidende Schritt in der gesamten Synthese des Steroidhormons. Er allein bestimmt die Geschwindigkeit der P4-Biosynthese (MILLER 2007; CHRISTENSON und STRAUSS 2000; STOCCO und CLARK 1996). An der mitochodrialen Innenmembran wandelt das Cytocrome-P450-side-chain-cleavage-Enzym (P450scc, CYP11A) durch die Hydoxylierung am C20 und C22 mit anschließender Seitenkettenabspaltung das Cholesterol in Pregnenolon um. Am glatten endoplasmatischen Retikulum setzt es das 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase-Enzym (HSD-3β) über eine Dehydierung zum Keton und eine Umlagerung der Doppelbindung schließlich Pregnenolon zu Progesteron um.
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Abb. 1: Schematische Darstellung der Progesteron-Synthese in der Lutealzelle (modifiziert nach SENGER 2003).
Es liegen nach PESCADOR et al. (1996) zwei Isoformen von StAR mRNA mit einer Größe von 2,9 bzw. 1,8 kb im bovinen CL vor. Die Transkription dieses für den Transport erforderli- chen Gens erfolgt nach HARTUNG et al. (1995) in Abhängigkeit von der 3’ Polyadenylie- rung. Bereits 24 Stunden nach der Ovulation konnte eine StAR mRNA Expression im CL nachgewiesen werden, jedoch nur in geringem Ausmaß (PESCADOR et al. 1996;
HARTUNG et al. 1995). Dagegen waren die beiden Transkripte des StAR in den CL der mittleren und späten Zyklusphase hoch exprimiert (HARTUNG et al. 1995). Nach PESCADOR et al. (1996) steigen sie bis Tag 10 des Zyklus um das Neun- bis 15-fache an.
Die Konzentrationen von StAR mRNA blieben bis Tag 17 konstant und verschwanden während der Regression des CL (TANIGUCHI et al. 2009; PESCADOR et al. 1996). Es wurde eine hohe Korrelation zwischen StAR mRNA und StAR Protein während des gesamten Brunstzyklus beobachtet (TANIGUCHI et al. 2009; PESCADOR et al. 1996). Die Expression von P450scc und HSD-3β zeigte einen ähnlichen Verlauf mit einem charakteristischen Rückgang während der lutealen Regressionsphase (TANIGUCHI et al. 2009). Entsprechend der mRNA Expression waren alle drei korrespondierenden Proteine während der mittleren
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(Tag 8-12) und späten (Tag 15-17) lutealen Phase in höherer Zahl im CL vorhanden als zum Zeitpunkt der Regression (Tag 19-21) (TANIGUCHI et al. 2009).
Unter dem Einfluss einer exogenen P4-Supplementation wurde in einer jüngeren Studie ein Anstieg der relativen Expression von StAR mRNA zwischen Tag 6 und Tag 12 beobachtet (PUNSMANN 2013). Es wurde kein signifikanter Einfluss des exogenen P4 auf die Bildung des für den P4-Metabolismus verantwortlichen StAR-Proteins festgestellt. In einem früheren in vitro-Versuch inkubierten KOTWICA et al. (2004) Luteinzellen von CLs, die an den Tagen 5 bis 10 des Zyklus von Kühen entnommen wurden, mit exogenem P4 für zwei, vier oder acht Stunden. Chronologisch zu der Inkubationslänge zeigte HSD-3β einen entsprechenden Anstieg an Aktivitäten. REKAWIECKI et al. (2005) konnten ebenfalls in einem in vitro- Versuch eine Steigerung der Genexpression von StAR und HSD-3β in Luteinzellen von CLs der Tage 6 bis 10 sowie der Tage 11 bis 16 des bovinen Brunstzyklus nachweisen. In ihrem Experiment inkubierten die Autoren Luteinzellen mit exogenem P4 für die Dauer von drei, sechs, 18 und 24 Stunden. Bereits nach sechs Stunden Inkubation konnten sie einen Anstieg der mRNA-Konzentrationen für StAR und HSD-3β feststellen.
In engem Zusammenhang mit der Luteinisierung und Formation des CLs stehen Veränderungen in der lutealen Vaskularisation (REYNOLDS et al. 1992). Für die Angiogenese ist unter anderem der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) verantwortlich (BERISHA et al. 2000). Er gilt nach BERISHA et al. (2000) als der wichtigste Faktor in der Regulation der normalen und abnormalen Angiogenese. Seine biologischen Aktivitäten sind an der Kaskade von Vorgängen, welche zur Angiogenese führen und damit essentiell für die Entwicklung des CLs sind, beteiligt. In ihrer Studie konnten die oben angeführten Autoren alle Komponenten des VEGF-Systems im bovinen CL während des Brunstzyklus und während der Trächtigkeit nachweisen. Das luteale Gewebe exprimiert jedoch überwiegend die zwei kleinsten Isoformen (VEGF120 und VEGF164) und in sehr geringer Menge VEGF188. Die höchste mRNA Expression für VEGF und VEGF- Rezeptoren 2 (VEGFR-2) wurde während der frühen Lutealphase (Tag 3-4) nachgewiesen.
Die Expressionsintensität von VEGF sank nach Tag 7 des Zyklus signifikant auf den niedrigsten Level während der Regression des CLs ab. Nach BERISHA et al. (2000) stellen die lutealen Zellen den Hauptort der VEGF mRNA-Synthese dar. Während die VEGFR-1
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mRNA-Expression zwischen den verschiedenen Untersuchungsphasen nicht differierte, war die VEGFR-2 mRNA an Tag 3 bis 4 des Zyklus am höchsten exprimiert. Darauf folgte dann ein signifikanter Rückgang. Ein ähnliches Expressionsmuster wurde bei Wasserbüffeln beschrieben (CHOUHAN et al. 2013). Die Häufigkeit der Transkripte von VEGF-Isoformen und ihren Rezeptoren (VEGFR-1 und VEGFR-2) variierte während der Lutealphasen. Jedoch wies das VEGF-System die höchste mRNA-Expression in dieser Studie nicht nur während der frühen, sondern auch während der mittleren Lutealphase auf. Danach nahm sie stetig ab und erreichte während der lutealen Regression den niedrigsten Wert (CHOUHAN et al. 2013).
Bezüglich der lutealen Durchblutung konnten LÜTTGENAU et al. (2011b) eine negative Korrelation zwischen relativem lutealen Blutfluss und VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2 sowie HSD-3β beobachten.
Wie VEGF reguliert Stickstoffmonoxid (NO) verschiedene biologische Funktionen. Das gasförmige Molekül ist ein potenter Vasodilatator. Es nimmt eine wichtige Rolle in der Angiogenese unter anderem im CL ein. Die NO-Bildung wird von der NO-Synthase- Konzentration (NOS) reguliert (ALDERTON et al. 2001). Zwei Isoformen von NOS, die iNOS (induzierte, Ca2+-unabhängige NOS) und eNOS (endotheliale, Ca2+- abhängige NOS), wurden von ROSIANSKY-SULTAN et al. (2006) im bovinen CL nachgewiesen. Die genannten Autoren untersuchten die Konzentrationen für iNOS und eNOS mRNA im CL von Schlachthofovarien. Nach optischer Beurteilung wurden die vorliegenden CLs in eine frühe (Tag 1 bis 5), eine mittlere (Tag 8 bis 15) und eine späte (Tag 16 bis 18) Lutealphase eingeteilt. Die Autoren konnten zunächst eine hohe Konzentration sowohl von eNOS (mRNA und Proteine) als auch von iNOS feststellen, wobei eNOS zu jedem untersuchten Zeitpunkt in zehnmal höheren Konzentrationen als iNOS vorlag. Die Expression von mRNA beider Enzyme nahm mit dem Alter des CLs ab, jedoch in unterschiedlicher Ausprägung. Zudem konnten die genannten Autoren einen Rückgang der Expression von eNOS in der mittleren Lutealphase um 70 % im Vergleich zu der frühen Lutealphase beobachten, während die Konzentration von iNOS mRNA in der mittleren Lutealphase nur leicht zurückging. Darüber hinaus zeigte sich iNOS in der späten Lutealphase um das Sechsfache reduziert, im Vergleich zu der frühen Lutealphase (ROSIANSKY-SULTAN et al. 2006).
28 3 Material und Methode
3.1 Tiere
Für die vorliegende Studie standen von Januar 2011 bis Januar 2012 sieben nichtlaktierende, unipare Kühe der Rasse Deutsch Holstein der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung. Die Entwicklung ihrer Kälber geschah via Sectio Caesarea. Die Tiere waren klinisch gesund und ohne pathologische Veränderungen des Genitaltraktes. Sie wogen bei einem Body Condition Score (BCS) von 3,25 ± 0,25 (Mean ± SD) im Mittel 664 ± 75 kg (Mean ± SD). Ihr Alter betrug 5,0 ± 1,7 Jahre (Mean ± SD).
Die Tiere wurden in Einzelboxen gehalten mit freiem Zugang zu Wasser und einer ad libitum Fütterung mit Heu. Die Anzeige des Tierversuches wurde bei der zuständigen Behörde eingereicht und genehmigt (Aktenzeichen: 11/0416, Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Oldenburg).
3.2 Versuchsanordnung
3.2.1 Ovulationsinduktion
Zu Beginn der Studie wurde der Zyklus der Tiere mit Hilfe eines Ovulation-Synchronisation- Protokolls (OvSynch-Protokoll) synchronisiert (Abb. 2).
1. GnRH PGF-2α 2. GnRH
Abb. 2: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs des OvSynch-Protokolls
Unabhängig vom Zyklusstand wurde jedem Versuchstier ein GnRH-Analogon (10 µg Buserelin; Receptal®, Intervet, Unterschleißheim, Deutschland) i.m. verabreicht. Ferner wurde nach sieben Tagen ein Prostaglandin-Analogon (500 µg Cloprostenol-Natriumsalz,
Tag -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2
