Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen über die Effekte der Größe, Durchblutung und Funktion des Corpus luteum
sowie einer Progesteronsupplementation auf die Fertilität bei Holstein Friesian Kühen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Lisa Katharina Lang
Schwäbisch Hall
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein Klinik für Rinder
1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. Heinrich Bollwein 2. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. Harald Sieme
Tag der mündlichen Prüfung: 22.November 2012
Meinen Eltern
und meiner über alles geliebten Oma Janne
in Liebe und Dankbarkeit gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ………. 11
2 Literaturübersicht ……….. 15
3 Material und Methoden ………. 25
3.1 Tiere ………... 25
3.2 Studiendesign ……….. 27
3.2.1 Allgemeiner Versuchsablauf (Farbdopplersonographie) ……..……… 27
3.2.2 Allgemeiner Versuchsablauf (Progesteronsupplementation) ………... 29
3.3 Blutproben ………. 31
3.4 Milchproben und Analyse ………... 31
3.5 Manuelle transrektale Untersuchung und Befunderhebung ………. 32
3.6 B-Mode Ultraschall ……….. 34
3.7 Farbdopplersonographie ……… 34
3.7.1 Untersuchungen im Dopplermodus………...……… 34
3.7.2 Auswertung der Dopplerbilder ………..………. 35
3.8 Progesteronsupplementation ……… 35
3.9 Einteilung in die Untersuchungsgruppen ………. 36
4 Chapter I: Evaluation of corpus luteum function in consideration of progesterone production and pregnancy maintenance via colour Doppler ultrasonography on Day 5 after insemination ………... 39
4.1 Abstract ………. 39
4.2 Introduction ………... 40
4.3 Materials and methods ……… 42
4.3.1 Cattle ……….……….. ………. 42
4.3.2 Study design ... 42
4.3.3 Blood sampling and analysis of serum P4 concentration …..………... 43
4.3.4 Milk sampling and analysis of milk P4 concentration ….……… 44
4.3.5 B-mode ultrasound examination for pregnancy diagnosis …..………. 44
4.3.6 B-Mode and colour Doppler ultrasonography, data recording and analysis …….. 45
4.3.7 Assignment to groups ………. 46
4.3.8 Statistical analysis ………... 46
4.4 Results ……….. 48
4.4.1 Clinical findings ……… 48
4.4.2 Pregnancy rates and resulting assignment to groups ………... 48
4.4.3 Descriptive statistics of P4 concentrations, PCS and PLBF ………. 49
4.4.4 Correlations among reproductive and cow-associated parameters and with P4, PCS and PLBF ………. 49
4.4.5 Relationships among P4 concentration, luteal size and luteal blood flow ……….. 49
4.4.6 Relationships of P4, PCS and PLBF with pregnancy outcome ……… 50
4.4.7 Evaluation of cut-offs ………... 51
4.5 Discussion ……… ……… 52
4.6 Conclusion ……… 58
4.7 Figures and Tables ………. …….... 59
5 Chapter II: Low endogenous progesterone concentrations 5 days after insemination reduce pregnancy rate in Holstein Friesian cows, irrespective of subsequent progesterone supplementation …………. 67
5.1 Abstract ………. 67
5.2 Introduction ………... 68
5.3 Materials and methods ……… 70
5.3.1 Cattle ………. 70
5.3.2 Study design ………. 70
5.3.3 Blood samples ……….. 71
5.3.4 Progesterone supplementation ………. 72
5.3.5 Assignment to groups ………. 72
5.3.6 Statistical analysis ………... 73
5.4 Results ……….………. 74
5.4.1 Clinical findings ……… 74
5.4.2 Assignment to groups ………. 74
5.4.3 Changes of serum P4 and parameters influencing P4 concentration ………. 75
5.4.4 Pregnancy rates and parameters influencing pregnancy outcome ………. 76
5.4.5 Relationships among cow-associated parameters ……… 77
5.5 Discussion ………. 78
5.6 Conclusion ……… 84
5.7 Figures and Tables ……….. 85
6 Übergreifende Diskussion ……….. 91
7 Zusammenfassung ……… 97
8 Summary ……….. 101
9 Literaturverzeichnis ……….. 105
10 Abbildungsverzeichnis ……… 131
11 Tabellenverzeichnis ……….. 133
12 Danksagung ……… ……... 135
Abkürzungsverzeichnis
AI artificial insemination
BCS body condition score
B-mode brightness mode
CC control cows
CL corpus luteum
cm2 square centimeter
CS corpus luteum size
CV coefficient of variation
DCL diameter of the corpus luteum
E2 17-ß-estradiol
EEL early embryonic loss
EIA enzyme-linked-immunosorbent assay
g gravitational acceleration
gr gram
GnRH Gonadotropin-Realeasing-Hormon
h hour
HPC high progesterone group
HPP high progesterone + PRID group
IFN-τ interferon-tau
i.m. intramuscular
IPC intermediate progesterone group
IPP intermediate progesterone + PRID group
kg kilogram
LAC number of lactations
LBF luteal blood flow
LH luteinizing hormone
LNS lameness score
LPD luteal phase deficiency
LPC low progesterone group
LPP low progesterone + PRID group
LS luteal size
µl microliter
MAX maximum
MCR metabolic clearance rate
mg milligram
MHz megahertz
MIN minimum
min minute
ml millilter
mm millimeter
mRNA messanger ribonucleic acid
MYAI milk yield at AI
MY305 305 days-milk yield of previous lactation
n number
ng nanogram
NI non-inseminated
NP non-pregnant
NPV negative predictive value
P pregnant
P4 progesterone
PC progesterone supplemented cows
PCS parameters referring to corpus luteum size PGF2α prostaglandin F2α
PLBF parameters referring to luteal blood flow
PPV positive predictive value
PRID progesterone releasing intravaginal device
p.i. post inseminationem
p.ov. post ovulationem
p.p. post partum
QE quality of the estrus
rs Spearman rank correlation coefficient
RIA Radioimmunoassay
rLBF relative luteal blood flow
ROI region of interest
SCP start of cycle after partum
SD standard deviation
SEM standard error of mean
SN sensitivity
SP specificity
SPF size of preovulatory follicle
T threshold
TMR total mixed ratio
UI uterine involution
Einleitung
1 Einleitung
Im Rahmen des schnellen züchterischen Fortschrittes bei hochleistenden Milchkuh- rassen und von Veränderungen im Management von Milchviehherden über die letz- ten Jahrzehnte ist nicht nur eine deutlichen Zunahme der durchschnittlichen Milch- leistung der Kühe [1], sondern auch eine stetige Verschlechterung der Fruchtbar- keitskennzahlen erkennbar [2, 3]. Bei einer Güstzeit von mehr als 90 Tagen belaufen sich die finanziellen Verluste für jedes weitere Umrindern mit nachfolgender Be- samung auf 80 bis 125 € [4]. Die embryonale Mortalität ist eine der Hauptursachen für Fertilitätsstörungen bei der Milchkuh [5, 6]. So liegt der Erstbesamungserfolg in einer durchschnittlichen Milchviehherdeaktuellunter50%[7]. Experimentelle Studien zeigen, dass bei kontrollierter Durchführung der künstlichen Besamung (artificial insemination; AI)mit hochwertigem Sperma die Fertilisationsrate bei annähernd 90% liegt [8, 9]. Die erfolgreiche Befruchtung einer Eizelle führt demnach, legt man einen Erstbesamungserfolg von 50% zu Grunde, in 40% der Fälle nicht zu einer sono- graphisch diagnostizierbaren Trächtigkeit. Während die Fruchtbarkeit bei Kühen mit geringer Milchleistung und Färsen vergleichbar ist, ist sie insbesondere bei Hoch- leistungsmilchkühen deutlich erniedrigt [10].
Es ist bekannt, dass die gesteigerte Stoffwechselbelastung im Zuge der hohen Milch- produktion einen negativen Einfluss auf die Follikelreifung und den Zeitpunkt des ersten Zyklus nach der Kalbung hat und somit die Reproduktionsleistung postpartaler Kühe negativ beeinflusst [11]. Auch ein Progesteronmangel infolge einer erhöhten Metabolisierungdesproduzierten Progesterons (P4) in der Leber sowie ein verzöger- ter Anstieg bzw. eine verringerte Konzentration an P4 sowohl im Zyklus vor [12, 13]
als auch nach der Besamung [14], welcher mit erniedrigten peripheren Serum-P4- Konzentrationen einhergeht, werden mit einer Störung der Entwicklung des Embryos, erhöhter embryonale Mortalität und schlechteren Reproduktionsleistungen in der Frühgravidität in Verbindung gebracht [15, 16].
Um einen Progesteronmangel behandeln zu können, sind zum einen dessen früh- zeitige Diagnose und zum anderen die Erforschung verschiedener Möglichkeiten zu dessen Therapie von entscheidender Bedeutung. Unter Praxisbedingungen werden
Einleitung
momentan vor allem die transrektale Palpation [17, 18] und immer häufiger auch die B-Mode-Sonographie [19, 20] zur Bestimmung der Größe des Corpus luteum (CL) genutzt. Die alleinige Palpation ist jedoch aufgrund ihrer Subjektivität bei der Erhebung von Gelbkörpergröße, -form und -konsistenz nur bedingt für die Beur- teilung des CL geeignet [17, 18]. Die B-Mode-Sonographie stellt dagegen ein objek- tiveres Verfahren zur Beurteilung von Gelbkörpergröße und -struktur dar und wird daher immer häufiger zur Absicherung manuell erhobener Befunde herangezogen [21-24]. Studien zeigen, dass zyklusbedingte Veränderungen der P4-Konzentration eng mit denen der lutealen Größe zusammenhängen [18, 25, 26]. Weiterhin ist bekannt, dass das Gelbkörpergewicht an Tag 5 post ovulationem (p.ov.) positiv mit der Hormonkonzentration korreliert [27, 28]. Somit scheint ein Zusammenhang zwischen dem Gelbkörperwachstum bzw. seiner Größe und seiner Funktionalität im Hinblick auf die Hormonsyntheseleistung zu bestehen.
Desweiteren ist für ein schnelles Wachstum des CL und eine adäquate Hormon- produktion die Angiogenese von größter Bedeutung [29, 30]. Die Farbdopplersono- graphie stellt eine seit Jahren auch in der Tiermedizin immer häufiger eingesetzte Methode zur adäquaten Darstellung des Blutflusses u.a. des inneren Genitales dar [31]. Die Tatsache, dass die Durchblutung des Gelbkörpers für dessen Wachstum von entscheidender Bedeutung ist, führt zur Vermutung, dass bei Tieren mit niedrigen peripheren Serum-P4-Konzentrationen auch Größe und Durchblutung des CL reduziert sind.
Es ist bekannt, dass bei einer verminderten körpereigenen Hormonproduktion durch medikamentöse Supplementation die periphere P4-Konzentration deutlich erhöht werden kann [32]. Zudem wurde auch eine Verbesserung der Trächtigkeitsrate durch die Substitution von Progesteron nach der Besamung beschrieben [32-34].
Aufgrund der genannten Zusammenhänge lässt sich ferner vermuten, dass Tiere mit verminderter Größe und Durchblutung des CL von einer exogenen P4-Zufuhr stärker profitieren können, als andere Tiere. Zudem gibt es nach eigenem Kenntnisstand bisher keine Untersuchungen zu der Frage, inwiefern die Höhe der körpereigenen P4-Konzentration vor Beginn der Supplementation Einfluss auf den Nutzen von exogen zugeführtem P4 auf die Trächtigkeitsrate nimmt.
Einleitung
Ziel der Dissertation war es daher, zu untersuchen, ob die Farbdopplersonographie einnützlichesnicht-invasivesHilfsmitteldarstelltumdieFunktionalitäteinesAnbildungs- gelbkörpers zu erfassen. Die Funktionalität des CL wurde anhand seiner Hormon- synthesesleistung und dem nachfolgenden Erstbesamungserfolg beurteilt. Hierfür wurde untersucht, inwiefern die Parameter zur Beurteilung der Gelbkörpergröße (PCS) und -durchblutung (PLBF) in Zusammenhang mit der peripheren P4-Konzen- tration in dieser Entwicklungsphase des CL stehen. Des Weiteren wurde geprüft, ob dieWahrscheinlichkeiteinerTrächtigkeitdurchdie Höhe der körpereigenen Hormon- konzentration sowie durch die Stärke der Gelbkörperdurchblutung beeinflusst wird.
Weiterhin wurde untersucht, ob bei Kühen durch Supplementation von intravaginal verabreichtem Progesteron von Tag 5 bis 19 p.i., also während der Phase des Längenwachstums des Embryos, der embryo-maternalen Erkennung und der nachfolgenden Implantation, eine Verbesserung im Erstbesamungserfolg erreicht werden kann. Zuletzt wurde beurteilt, ob in Abhängigkeit von der körpereigenen Hormonkonzentration der Tiere an Tag 5 p.i., Unterschiede im Nutzen bzw. Schaden der Behandlung bestehen und ob sich die Applikation von P4 insbesondere bei Tieren mit niedrigen körpereigenen Hormonspiegeln positiv auf die Fruchtbarkeit auswirkt.
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
Parallel mit der Zunahme der Milchleistung in den vergangenen 50 Jahren ist bei hochleistenden Milchkühen die Fertilität der Herden deutlich zurückgegangen [35].
Die Ursache dafür ist vor allem ein Anstieg an embryonalen Verlusten [3, 10]. Die meisten Verluste treten in der frühen Entwicklungsphase des Embryos zwischen den Tagen 5 und 16 der Trächtigkeit auf [10, 36-38]. In diesem Zeitabschnitt entwickelt sich der Embryo vom 16-Zellstadium weiter zur Blastozyste, nachfolgend setzt das Längenwachstum ein und die Phase endet mit dem Beginn der embryo-maternalen Erkennung. Frühembryonale Verluste treten bei hochleistenden Milchkühen deutlich häufiger auf als bei Färsen [37].
Es gibt verschiedene Gründe für embryonale Verluste. Wie allgemein bekannt ist, nimmtdasSteroidhormonProgesteron(P4)eineSchlüsselrolleinBezug auf den Erhalt einer Trächtigkeit ein. So konnte gezeigt werden, dass sich niedrige systemische P4- Konzentrationen bereits im Zyklus vor der eigentlichen Besamung nachteilig auf die nachfolgenden Konzeptionschancen auswirken [12, 13]. Der Grund dafür liegt in einer dadurch bedingten Verschlechterung der Oozytenqualität [39]. Auch wenn noch nicht alle für dieses Phänomen verantwortlichen Mechanismen vollständig aufgeklärt sind, ist seit längerem bekannt, dass die pulsatile Ausschüttung von Gonadotropin- Releasing-Hormon (GnRH) und folglich auch des luteinisierenden Hormons (LH) durch P4 unterdrückt wird [40]. Die Höhe der LH-Pulsfrequenz hat entscheidenden Einfluss auf die Entwicklung und Ovulation eines dominanten Follikels. Umgekehrt kommt es bei niedrigen P4-Konzentrationen zu einer erhöhten LH-Pulsfrequenz und damit zu einer längeren Persistenz dominanter Follikel auf dem Ovar. Hierdurch nimmt die Zahl der Follikelwellen ab [41, 42]. Werden solche Kühe mit länger bestehenden präovulatorischen Follikeln besamt, sind die Trächtigkeitsraten relativ niedrig [43, 44], da es nach der Befruchtung von aus diesen Follikeln stammenden Eizellen gehäuft zu einer embryonalen Mortalität kommt [45].
Neben der P4-Konzentration im Zyklus vor der künstlichen Besamung (artificial insemination; AI) scheint insbesondere der postovulatorische Progesteronanstieg zwischen den Tagen 4 und 7 sowie die daraus resultierende periphere Progesteron-
Literaturübersicht
konzentration an den Tagen 5 bis 7 post insemination (p.i.) von großer Bedeutung zu sein [10, 46]. Progesteron nimmt Einfluss sowohl auf das Endometrium des Muttertieres als auch auf die Entwicklung des Konzeptus.
Im Hinblick auf den Uterus kommt P4 eine entscheidende Bedeutung bei der Vorbereitung der Gebärmutter auf die Anheftung und nachfolgende Implantation des Embryos in die Gebärmutterschleimhaut durch Beeinflussung des Genexpressions- musters des Endometriums zu, in dem es u.a. die Expression des Insulin-like growth factor binding protein-1 induziert [47-49]. Überdies kommt es im Endometrium frühträchtiger Tieren zu weiteren auffälligen Veränderungen im Expressionsmuster P4-regulierter Gene [50-52], u.a.von Diacylglycerol O-acyltransferase homolog 2 und Myostatin. Hierbei handelt es sich um Gene, welche für die Triglyceridsynthese bzw.
den Glucosetransport verantwortlich sind, und so als Energiequelle für den heran- reifenden Embryo dienen können [50]. Nach bisherigem Kenntnisstand gleichen sich die Genexpressionsmuster von graviden und zyklischen Tieren in den ersten Tagen post ovulationem (p.ov.) weitgehend. Erst mit Tag 16 p.i., zum Zeitpunkt der embryo- maternalen Erkennung, sind die oben genannten Unterschiede in den Transkriptions- mustern sichtbar [50].
Zudem hemmt Progesteron bei zyklischen Tieren gegen Ende der Lutealphase die Bildung seines eigenen Rezeptors über die Unterdrückung von dessen mRNA- Synthese[53-55].HierdurchwirddiehemmendeWirkungdesP4 auf die Prostaglandin- synthese aufgehoben und zudem endet die antiöstrogene Wirkung [55] des P4 auf 17β-Östradiol (E2), so dass dessen Wirkung wieder in den Vordergrund treten kann.
17β-Östradiol stimuliert die Synthese von Prostaglandin F2α (PGF2α)im Endometrium über zwei Wirkmechanismen. Zum einen erhöht E2 die Enzymaktivität von Phospho- lipase A2, welches den limitierenden Faktor bei der PGF2α-Bildung darstellt. Zum anderenerhöhtes die Zahl endometrialer Oxytocinrezeptoren, welche zuvor aufgrund der antiöstrogenen Wirkung von P4 erniedrigt waren [55], da P4 die Genexpression desOxytocinrezeptorsinhibiert[56].Oxytocin seinerseits induziertdurch die Aktivier- ung der Adenylatzyklase die Synthese von PGF2α aus Arachidonsäure [57]. McNeill et al. [58] konnten kürzlich erstmals auch Unterschiede am Endometrium zu einem früheren Zeitpunkt nach der Besamung feststellen. Dabei wirkte sich die Höhe der
Literaturübersicht
systemischen P4-Konzentrationen zwischen den Tagen 0 und 4 p.i. positiv auf die Expression des Retinolbindungsproteins an den Tagen 6 und 8 aus. Es kann vermutet werden, dass solche Veränderungen am Endometrium, welche durch P4- abhängige Gene verursacht werden, in der Lage sind die Entwicklung eines Embryos zu beeinflussen und somit das Zusammenwirken von P4, Endometrium und Embryo einen kritischen Faktor für die erfolgreiche Etablierung einer Trächtigkeit darstellt.
Störungen dieser Abläufe resultieren in einer fehlerhaften Implantation oder einem Absterben des Embryos [7].
Eine positive Wirkung hoher P4-Konzentrationen in der Phase des P4-Anstiegs direkt nach AI auf das Längenwachstum und die Interferon-tau-Produktion (IFN-τ) des Embryos [59, 60] sowie auf dessen Überlebensfähigkeit konnte bereits in mehreren Studien bei Rindern [33, 59, 61] und Schafen [62] nachgewiesen werden. Carter et al.[33]erhöhtendie P4-Konzentration bei Färsen mittels eines progesterone releasing intravaginal device (PRID), beginnend ab Tag 3 p.i.. Sie konnten nach Schlachtung der Muttertiere dreizehn bzw. sechszehn Tage nach der Besamung Embryonen mit einem verstärkten Längenwachstum im Vergleich zu einer unbehandelten Kontroll- gruppe feststellen. Durch eine P4-Supplementation zwischen den Tagen 5 bis 9 p.i.
verdoppelten Mann et al. [59] die P4-Konzentration im Blut und erzielten hierdurch vierfach längere Trophoblasten und eine sechsfach erhöhte uterine IFN-τ-Konzen- tration bei Holstein-Friesian-Kühen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkühen nachweisen.
Der erfolgreiche Verlauf der embryo-maternalen Erkennung und der Erhalt einer TrächtigkeitbeiKühen beruhen auf der Anwesenheit eines gut entwickelten Embryos, der in der Lage ist antiluteolytische Signale in ausreichenden Mengen auszusenden [9]. In Anwesenheit hoher Mengen an IFN-τ unterbleibt die Oxytocin-induzierte Se- kretion von PGF2α aus dem Endometrium [63], während die Produktion eines Prosta- glandin-Synthese-Inhibitors induziert wird [16, 64]. Aufgrund dieser Vorgänge kann die Phase vom 15. bis zum 17. Tag p.ov. bei der Kuh als kritisch für den Erhalt der Trächtigkeit angesehen werden. Darüber, ob P4 direkten Einfluss auf die Entwicklung des Embryos nimmt oder ob es sich dabei um einen indirekten Effekt über die Beeinflussung des maternalen Endometriums handelt, gibt es aktuell noch sehr
Literaturübersicht
gegensätzliche Annahmen. Während einige Autoren von direkten, durch P4 ver- mittelten Einflüssen auf den Embryo berichten [65, 66], konnten diese Zusammen- hänge von anderen Autoren nicht bestätigt werden [58, 67, 68].
Als Gründe für eine niedrige periphere P4-Konzentration kommen sowohl eine redu- zierte Sekretion des Gelbkörpers als auch eine erhöhte Metabolisierung des sezer- nierten Progesterons in Betracht. Die Sekretion von P4 durch das CL wird von mehreren Faktoren beeinflusst. So hat bereits eine Störung der Follikelentwicklung in der präovulatorischen Phase des vorangegangenen Zyklus einen entscheidenden Einfluss auf die Entwicklung und Funktion des CL [69]. Aus kleineren ovulatorischen Follikeln entwickeln sich kleinere CL, welche weniger P4 sezernieren [70]. Zudem geben sowohl human- als auch veterinärmedizinische Studien Hinweise darauf, dass auch die Angiogenese und Durchblutung der Follikelwand des präovulatorischen Follikels [71-73] und des sich daraus entwickelnden CL [29, 74] für die Etablierung einer Trächtigkeit von Bedeutung sind.
Steroide, wie Progesteron, werden durch Glukuronidierung und Sulfatierung in der Lebermetabolisiert.Dieinaktiven,wasserlöslichen Metaboliten werden entweder über den Urin oder die Fäces (Galle) aus dem Körper eliminiert [75]. Bei Rindern erfolgt dieEliminationvorwiegendüberdieFäces,bei anderen Spezies vor allem renal [76].
Beihochleistenden Milchkühen scheint ein verstärktes Risiko für embryonaleVerluste aufgrund von erniedrigten peripheren P4-Konzentrationen in Konsequenz eines ver- stärkten Abbaus von P4 in der Leber zu bestehen. Durch eine größere Futterauf- nahme hochleistender Kühe wird infolge eine Steigerung der hepatischen Blutfluss- rate auch die Clearance von Steroidhormonen in der Leber erhöht, was letztlich zu einem verstärkten Abbau von P4 führt [37]. Somit ergibt sich ein negativer Zu- sammenhang zwischen Milchleistung, Trockenmasseaufnahme und den P4-Konzen- trationen im Blut während der Lutealphase [14].
Aufgrund des Wissens, dass Progesteron ein entscheidendes Hormon in der frühen Entwicklung des Embryos darstellt, wurde bereits in verschiedenen Studien versucht, durchdessen Supplementation eine Verbesserung der Trächtigkeitsraten zu erzielen.
Literaturübersicht
eine Vielzahl von Studien mit teils ähnlichen, teils widersprüchlichen Ergebnissen vor. Während zumeist ein positiver Einfluss [32, 34, 77-79] von exogenem P4 auf die Trächtigkeitsratenachgewiesenwerdenkonnte,zeigtesichineinigen Untersuchungen kein [80-82] oder gar ein negativer Effekt [83] der Supplementation auf den Trächtig- keitserhalt. In Studien, in denen an Stelle der Trächtigkeitsrate die Entwicklung des Embryos unter Einfluss der Supplementation [33, 59, 61] betrachtet wurde, konnte dagegen vorrangig ein positiver Einfluss der SupplementationaufdieEntwicklungdes Konzeptus nachgewiesen werden. Betrachtet man alle Studien, in denen eine P4- Supplementation durchgeführt wurde, in ihrer Gesamtheit, so fällt auf, dass positive Effekte auf die Trächtigkeitsrate v.a. bei Studien erzielt werden konnten, bei denen die Supplementation zeitig nach der Ovulation (Tag 3,5 bis 5) begonnen wurde [32, 84].Außerdemwirktesich die Supplementation insbesondere bei Kühen in den ersten Laktationen positiv auf die Fruchtbarkeit aus [32, 85], während sich bei Färsen sel- tener ein positiver Effekt nachweisen ließ [78, 86-88]. Allerdings wurde die Mehrzahl der bisher gewonnenErkenntnisselediglich anrelativ geringen Tierzahlen (n < 150) erhoben. Eine Übersicht über eine Auswahl bisher durchgeführter Studien gibt Tabelle 1.1.
Der Gelbkörper ist eines der am schnellsten wachsenden und am besten durch- bluteten Organe des Körpers. Bei Säugetieren verdoppelt sich seine Größe und die Anzahl an Zellen während der Anbildungsphase, welche zwischen 8 und 10 Tage andauert, alle 60 bis 70 Stunden (h) [74]. Eine erhöhte Rate an Zellproliferation erfordert eine ausreichende nutritive Versorgung überdasBlut.Beiausgewachsenen Tieren kommt es zur Entwicklung neuer Blutgefäße (Angiogenese) durch Sprossung aus bereits bestehenden Gefäßen. Dieser meistunterpathologischenBedingungen, wie z.B. einem Tumorwachstum auftretende Prozess, ereignet sich unter physio- logischen Verhältnissen nur sehr selten, insbesondereimweiblichen Reproduktions- trakt während des Zyklus und der Gravidität [89]. Eine schnelle und ausreichende Angiogenese ist Voraussetzung für die Ernährung der Steroidhormon produzieren- den Luteinzellen [90], sowie für die Bereitstellung von Cholesterinsubstraten zur Progesteronsynthese und zum Abtransport von P4 in den Kreislauf [91]. Eine verringerte Durchblutung von Follikeln und CL wird in der Humanmedizin bereits seit
Literaturübersicht
längerem mit Fertilitätsstörungen in Verbindung gebracht [92]. Demzufolge kann vermutet werden, dass auch beim Rind entscheidende Zusammenhänge zwischen der lutealen Durchblutung und der Funktion des CL bestehen [93].
Das Gefäßsystem des CL ist in aller Regel unabhängig von dem des übrigen Ovars [94]. Jedes CL wird jeweils von einem [95, 96], manchmal auch von zwei [97] stärker ausgebildeten Endästen der A. ovarica versorgt, welche mäanderförmig an das CL herantreten. Aus ihnen entspringen Kapselarterien, welche das CL korbartig um- geben. Von den zentripetal verlaufenden Septumarterien wird jeweils ein Gelbkörper- läppchen versorgt [98]. Die hieraus abzweigenden Parenchymarteriolen dringen tief in das Läppchen ein und lösen sich in ein dichtes Kapillarnetz, in welches die Lutein- zellen eingebettet sind, auf. Der venöse Abfluss erfolgt analog dem arteriellen Ver- lauf [99]. Ab Tag 5 p. ov. ist das CL allseits von einem weitmaschigem Kapillarnetz durchzogen, welches direkt unter der Oberfläche verläuft. Dieses verdichtet sich nachfolgend und besitzt an Tag 9 p. ov. seine größte Dichte. Während des Blüte- stadiums kommt es zur Sprossung weiterer Gefäße in die Läppchen. Die Regression des CL beginnt zunächst mit der Rückbildung des Kapillarnetzes im Bereich der Kuppe. Danach kommt es durch Verengung größerer Gefäße zur Abnahme der Kapillardichte des gesamten CL [98].
Die Farbdopplersonographie wird seit einigen Jahren sowohl in der Human- [100- 103] als auch in der Veterinärmedizin [31, 104] zunehmend als nicht-invasives Verfahren zur Darstellung der Durchblutung des weiblichen Geschlechtstraktes eingesetzt. Die Doppler-Ultraschalltechnik basiert auf dem Prinzip, dass endsendete Schallwellen an sich bewegenden Strukturen z.B. an Erythrozyten reflektiert werden und dabei ihre Frequenz ändern. Dieses Phänomen bezeichnet man als Doppler- Shift. Anhand des Doppler-Shifts kann die Blutflussrichtung und -geschwindigkeit berechnet werden. DerDoppler-Shift kann farblich codiert und auf den Bildschirmen von Doppler-fähigen Geräten angezeigt werden. Positive Frequenzverschiebungen werden dabei in der Regel rot und negative Frequenzverschiebungen blau dargestellt und die Helligkeiten der Bildpunkte spiegeln die Höhe der Frequenzverschiebungen wieder [105]. Zur Untersuchung der Funktionsgebilde des bovinen Ovars mittels
Literaturübersicht
Doppler-Technik wird i.d.R. der Power-Modus verwendet. Es handelt sich hierbei um eine Technik, welche sich aufgrund einer erhöhten Sensitivität gegenüber dem Spektral-Modus Verfahren insbesondere zur Darstellung sehr niedriger Blutfluss- geschwindigkeiten eignet [106]. Im Gegensatz zur oben beschriebenen Methode wird im Power-Modus nicht die Blutflussgeschwindigkeit, sondern die Intensität des Blutflusses, also die pro Zeiteinheit durch die Blutgefäße strömenden roten Blutkörperchen, farbig dargestellt [107]. Am Uterus konnte durch Untersuchung der A. uterina festgestellt werden, dass während des Zyklus` [31] sowie der Trächtigkeit [31, 108] und im Verlauf des Puerperium [31, 109] charakteristische Veränderungen im uterinen Blutfluss stattfinden. Auch am bovinen Ovar konnten in den letzten Jahren durch die Untersuchung von Follikeln und CL zyklischer Tiere mittels Farbdopplersonographie mehrere neue Erkenntnisse über dessen Physiologie gewonnen werden. Zum einen ergaben sich Hinweise darauf, dass der Blutfluss in der Follikelwand eng mit dessen Wachstum, Atresie und Ovulationzusammenhängt [72, 73]. Zum anderen ließen Untersuchungen des CL einen engen positiven Zusammenhang zwischen den P4-Konzentrationen im Blut, der maximalen Quer- schnittsfläche des CL und dem lutealen Blutfluss imVerlauf eines Zyklus` erkennen [110]. Ferner wurde beobachtet, dass es am Ende des Diöstrus kurz vor der Luteo- lyse zu einem akuten, vorübergehenden Anstieg in der Durchblutung des CL mit nachfolgendem starkem Abfall kommt. Ein solcher Anstieg des Blutflusses mit nachfolgendem Abfall der P4-Konzentration war bei Kühen im frühen Diöstrus, deren CL sich noch in der Refraktärphase befanden, im Gegensatz zu Kühen im späten Diöstrus nicht durch eine Applikation von PGF2α induzierbar [111]. Es wurde daher von den Autoren der Studie gefolgert, dass die Vasokonstriktion lutealer Gefäße einen der Hauptgründe für die Luteolyse bei der Kuh darstellt [112].Seitkurzem gibt es erste Studien über die Einsetzbarkeit der Farbdoppersonographie zur Trächtigkeitsdiagnose, in welchen der luteale Blutfluss (LBF) an den Tagen 15 und 18 [113] bzw. 17, 19 und 21 [114] bei graviden Kühen signifikant höher war als bei nicht graviden Kühen. Da jedoch in beiden Untersuchungen eine hohen Anzahl von Tieren mit early embryonic loss (EEL) auftrat und sich die Durchblutung des CL bei diesen Tieren im Mittel mit denen von tragenden und nicht tragenden Tieren
Literaturübersicht
überschnitt, wurde eine genaue Unterscheidung der letztgenannten Gruppen unmöglich und eine sichere Trächtigkeitsdiagnose war nicht zu stellen.
DieMessungvonP4 stelltgegenwärtigdenGoldstandardfür die Funktionsbestimmung eines Corpus luteum dar [18, 115]. Die zuverlässige Beurteilung des Funktionszu- standes eines bovinen CL ist von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung des Zyklusstandes und Voraussetzung für ein gezieltes medikamentelles Eingreifen u.a.
durchApplikationeinesProstaglandins [116, 117]in den Zyklus der Kuh. Die Hormon- analyse kann zudem auch zur Unterscheidung von Tieren mit physiologischer und verminderter Hormonproduktion herangezogen werden. Funktionelle bzw. PGF2α- sensibleCL,weisenP4-Konzentrationen>1,0ng/mlauf[118-120].Aufgrundder rela- tivehohenKostenunddesZeitfaktors,welchedieBlutprobenentnahme und Hormon- analyse im Labor mit sich bringt, werden die transrektale Palpation und die Sono- graphie der Ovarien als direkt im Betrieb durchführbare Alternativen zur P4-Analyse herangezogen.BeideMethodenbasierenauf einem hohen positiven Zusammenhang zwischenderlutealenGröße(LS)undderP4-KonzentrationimPlasma [17, 18, 25, 26], welcher bereits in mehreren Studien an Färsen und Kühen belegt werden konnte.
Jedoch ist bei der transrektalen Palpation der Ovarien auch bei erfahrenen Unter- suchern die Irrtumswahrscheinlickeit selbst beim Nachweis von Blütegelbkörpern relativ hoch [18]. Der Nachweis von An- und Rückbilungsgelbkörpern stellt sich als noch schwieriger dar. Und auch die Irrtumswahrscheinlichkeiten zwischen Unter- suchern mit unterschiedlicher Erfahrung unterscheidet sich beträchtlich [119].
Der Einsatz der Sonographie eröffnet neue Möglichkeiten für eine verlässliche Funk- tionsbestimmung des bovinen CL. Durch Einsatz dieser Methode kann die Größe des CL weitaus präziser erfasst werden als mittels manueller transrektaler Palpation.
Bicalho et al. [119] untersuchten in ihrem Experiment an den Tagen 21 und 24 p.i.
dieGenauigkeit, mit welcher anhand von transrektaler Palpation und B-Mode Sono- graphie zwischen einem funktionellen Gelbkörper (CL in Blüte) und einem CL in Re- gression unterschieden werden kann. Hierbei stellten sie fest, dass für die trans- rektale Palpation die Sensitivität (SN) gering und die Spezifität (SP) hoch war, während es sich für die B-Mode-Sonographie genau gegensätzlich (SN hoch/ SP
Literaturübersicht
niedrig) darstellte. Durch die Ermittlung eines Grenzwertes für den CL-Durchmesser (DCL) konnte jedoch die Genauigkeit der Sonographie gegenüber den beiden zuvor genannten Methoden wesentlich gesteigert werden. Eine optimale Kombination aus Sensitivität und Spezifität wurde für einen Grenzwert von 23 mm an Tag 21 p.i. und 22 mm an Tag 24 p.i. erzielt.
Literaturübersicht
Tabelle 1.1: Übersicht über die Ergebnisse verschiedener Studien zum Effekt einer Progesteronsupplementation auf die Trächtigkeitsrate, durchgeführt an Rindern verschiedener Nutzungs- und Haltungsrichtungen.
Beginn (Tag p.i.)
Dauer
(Tage) Kühe Med Trächtigkeitsrate
supplementierte
Trächtigkeitsrate
Kontrolle Effekt Quellenangabe
0 Färsen Umrinderer 35,0% (7/20) 5,0% (1/20) + 30,0% Henrick (1953)
4 Kühe 46,8% (22/47) 16,7% (3/18) + 30,1% Dawson (1954)
5 Kühe 73,7% (14/19) 45,0% (9/20) + 18,7% Sreenan and Diskin (1983)
10 Kühe 65,4% (102/156) 61,1% (102/167) + 4,3% Sreenan and Diskin (1983)
5 7 Milchkühe PRID 60,7% (17/28) 30,0% (9/30) + 30,7% Robinson et al. (1989)
10 7 Milchkühe PRID 59,3% (16/27) 30,0% (9/30) + 29,3% Robinson et al. (1989)
5 7 Umrinderer PRID 61,5% (8/13) 57,1% (8/14) + 4,4% Walton et al. (1990)
5 - Umrinderer Progestin 75,0% (9/12) 57,1% (8/14) + 17,9% Walton et al. (1990) 5 8 Milchkühe PRID 36,1% (13/36) 42,4% (39/92) - 6,3% Stevenson & Mee (1991) 13 8 Milchkühe PRID 50,0% (18/36) 42,4% (39/92) + 7,6% Stevenson & Mee (1991)
4 Kühe 74,6% (344/461) 66,3% (309/466) + 8,3% Macmillan et al. (1991)
14 Kühe 64,0% (329/514) 63,6% (300/472) + 0,4% Macmillan et al. (1991)
7 6 Färsen (Milchrasse) CIDR 57,9% (92/159) 53,6% (83/155) + 4,3% Van Cleef et al. (1991)
5 14 Umrinderer PRID 57,1% (52/91) 51,0% (50/98) + 6,1% Villaroel (2004)
5 4 Umrinderer CIDR 55,0% (22/40) 30,0% (12/40) + 25,0% Ghasemzadeh-Nava (2007)
5 14 Umrinderer CIDR 41,7% (15/36) 30,0% (12/40) + 11,7% Ghasemzadeh-Nava (2007)
3,5 10 Milchkühe CIDR 47,8% (32/67) 34,9% (22/63) + 12,9% Larson et al (2007) 14 21 Milchkühe CIDR 53,9% (68/126) 52,9% (91/172) + 1,0% Alnimer et al. (2008)
0 7 Färsen (Fleischrasse) CIDR 90,4% (66/73) ⃰ 50,0% (33/66) + 40,4% Carter et al. (2008)
4 14 Milchkühe und –färsen CIDR 29,1% 39,5% - 10,4% Arndt et al. (2009)
3 3,5 Färsen (Fleischrasse) CIDR 34,4% (22/64) 42,0% (29/69) - 7,6% Beltman et al (2009) 4,5 3,5 Färsen (Fleischrasse) CIDR 48,4% (31/64) 42,0% (29/69) + 6,4% Beltman et al (2009) 5 7 Fleischrinder CIDR 53,4%(125/234) 55,3% (131/237) - 1,9% Larson et al (2009) 5
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Tiere
Die Studie wurde zwischen August 2009 und Juli 2011 auf zwei Milchviehbetrieben in den Bundesländern Sachsen und Brandenburg an laktierenden, primi- und pluriparen Kühen der Rasse Holstein-Friesian durchgeführt. Es wurden 1000 Tiere in die Unter- suchungen eingeschlossen. An 180 Tieren erfolgten farbdopplersonographische Un- tersuchungen und an allen Tieren Studien zum Effekt einer exogenen Progesteron- supplementation auf die Graviditätsrate.
Es wurden nur klinisch gesunde Kühe ohne pathologische Veränderungen des Geschlechtstrakts für die Untersuchungen im Rahmen der beiden Studien ver- wendet. Auch Kühe mit einem Body Condition Score (BCS) von 1 oder 5 sowie Kühe mit einem Lahmheitsgrad (LNS) nach der Definition von Sprecher et al.[121] von 5 wurden von weiterführenden Untersuchungen ausgeschlossen. Eine Übersicht über alle Ausschlusskriterien aus dem Versuch sowie deren Definition gibt Tabelle 1.2.
In beiden Betrieben wurden die Kühe in einem Kaltstall in Form eines Laufstalles mit Hochboxen und Vollspaltenboden gehalten. Die Fütterung auf Betrieb 1 bestand aus einer TMR (Hauptbestandteile: Gras- und Maissilage, Mineralfutter) ad libitum mit leistungsbezogener Zufütterung von Kraftfutter mittels Transponder, wohingegen in Betrieb 2 eine Voll-TMR (Hauptbestandteile: Gras- und Maissilage, Kraftfutter und Mineralfutter) ad libitum angeboten wurde. Alle Tiere hatten stets freien Zugang zu Trinkwasser. Die Anzeige des Tierversuchs wurde für beide Betriebe bei den zu- ständigen Behörden eingereicht und genehmigt (Aktenzeichen: Landesdirektion Leipzig, A19/09; Land Brandenburg, 23-2347-A-19-1-2010).
Material und Methoden
Tabelle 1.2: Übersicht über alle Erkrankungen und Kriterien, die zum Ausschluss aus dem Versuch geführt haben, sowie deren genaue Definition Ausschlusskritierien Definition
Endometritis Entzündung der Gebärmutterschleimhaut;
mukopurolenter bis purulenter vaginaler Ausfluss
Ovarialzysten Thekazysten Luteinzysten
persitierender Graafscher Follikel Follikeldurchmesser > 25 mm Luteale Wandstärke < 3mm
Follikeldurchmesser > 25 mm; evtl. mit Septen Luteale Wandstärke > 3mm
Azyklie
Unterbrechung des Sexualzyklus auf Grund hormoneller Störungen;
beide Eierstöcke ohne Funktionskörper
Verwachsungen im Genitaltrakt Uteruskörper bzw. -hörner nicht mehr frei beweglich Sectio cesarea Operative Schnittentbindung zur Entwicklung des
Kalbes
Dislocatio abomasi Verlagerung des Labmagens auf die linke bzw.
rechte Körperseite ggf. mit Torsion
Pathologische Umfangsver- mehrungen des Ovar
(z.B. Ovartumor, Ovarhämatom)
unphysiologische Ovargröße u./od.
veränderte Textur bei Palpation und Sonographie
BCS 1 oder 5 hgr. Abmagerung bzw. hgr. Verfettung
LNS 5 hgr. Lahmheit;
vollständige Entlastung mind. einer Gliedmaße
Hypocalcämie Postpartales Festliegen u. Nachweis von Calciumspiegel im Blutserum unter 2,2 mmol/l
Torsio uteri Drehung des graviden Uterus um die Längsachse mit Einengung des Geburtsweges
Mastitis acuta
akute Entzündung der Milchdrüse;
Eutergewebe warm und geschwollen; Sekret optisch verändert; CMT positiv, Temp. > 39,5°C
Allgemeinerkrankungen mit Temperatur > 39,5°C
Material und Methoden
3.2 Studiendesign
3.2.1 Allgemeiner Versuchsablauf (Farbdopplersonographie)
Zwischen den Tagen 30 und 40 p.p. wurde bei allen Tieren eine Puerperalkontrolle manuell und mittels Ultraschall durchgeführt. Hierbei wurden der Involutionsgrad des Uterus sowie krankhafte Veränderungen an Uterus und Ovarien erfasst.
In vierzehntägigem Rhythmus wurde ab Tag 50 p.p. bei jeweils 5 klinisch und gynä- kologisch gesunden Kühen, welche sonographisch ein CL>20mm im Durchmesser auf mindestens einem Ovaraufwiesen (n=150), die Brunst durch Injektion von 25mg PGF2α(Dinoprost,EnzaprostT®,CEVA,Libourne,Frankreich)i.m. synchronisiert.
Nachfolgend wurde zweimal täglich für 30 min eine Brunstbeobachtung durchgeführt und die Kühe 12 h nach erstmals beobachteter Duldung künstlich besamt. Während des gesamten Versuches wurde die künstliche Besamung innerhalb eines Betriebes stets durch denselben Besamungstechniker durchgeführt. Fünfzehn nach dem Zufallsprinzip ausgewählte Kühe blieben trotz sichtbarer Brunst unbesamt und dienten nachfolgend als zyklische Vergleichsgruppe. Zum Zeitpunkt der Besamung (Hauptbrunst bei unbesamten Tieren) wurde der Befund beider Ovarien einschließ- lich der Größe aller Funktionskörper mittels transrektaler Ultraschalluntersuchung erfasst und nachfolgend in 12-stündigem Abstand eine Ovulationskontrolle durch- geführt. Kühe, welche innerhalb von 24 h nicht ovuliert hatten und noch Brunst- symptome zeigten, wurden erneut besamt und die Ovulation kontrolliert. Alle Tiere, welche keine Anzeichen von Brunst innerhalb von 96 4 h nach der PGF2α-Injektion zeigten, sowie alle Tiere, bei welchen die Ovulation nicht innerhalb von 30 2 h nach der letzten Besamung erfolgte, wurden von der Studie ausgeschlossen. Der erste Tag, an dem der dominante Follikel nicht mehr auf dem Ovar darstellbar war, wurde als Tag 1 des Brunstzyklus definiert.
An Tag 5 post inseminationem (p.i.) wurde von allen Kühen, welche in die Studie auf- genommen worden waren, eine Blutprobe zur Bestimmung der peripheren P4-Kon- zentration entnommen und nachfolgend eine Ultraschalluntersuchung des CL (im B- Mode und Power-Modus) durchgeführt. Weitere Blutprobenentnahmen erfolgten an den Tagen 9, 14, 19 und 20 p.i..
Material und Methoden
Um nicht gravide Kühe zu erkennen, wurde ab Tag 19 p.i. bei allen Kühen erneut zweimal täglich eine Brunstbeobachtung durchgeführt. Zusätzlich wurde an den Tagen 22 und 25 p.i. eine Milchprobe zur Bestimmung der Progesteronkonzentration in der Vollmilch gewonnen. Die Progesteronkonzentration in der Milch wurde vor Ort aufdemBetriebmittelseinesSchnelltests(eProCheck®,Minitüb,Tiefenbach, Deutsch- land) semiquantitativ gemessen. Der Grenzwert (< 3 ng/ml) zur Feststellung einer Brunst wurde in einer Vorstudie an 25 brünstigen Tieren festgelegt. Kühen, bei denen bis Tag 25 eine Brunst beobachtet werden konnte, sowie Kühe mit einem Milchprogesterongehalt ≤ 3 ng/ml bis Tag 25 p.i., wurden erneut transrektal sono- graphisch untersucht. Tiere mit vorhandenem präovulatorischen Follikel und einem Cl < 20 mm wurden als nicht gravid erachtet und erneut besamt. Bei allen übrigen Tieren wurde an Tag 30 p.i. eine transrektale Ultraschalluntersuchung im B-Mode (Tringa L®; Esaote Pie Medical, Köln, Deutschland) zur Trächtigkeitsdiagnose durch- geführt. In fraglichen Fällen wurde die transrektale Ultraschalluntersuchung nach 3 Tagen wiederholt durchgeführt. Bei allen in der sonographischen Erstuntersuchung als gravid diagnostizierten Tieren wurde an Tag 42 p.i. eine erneute Untersuchung auf das Vorliegen einer Gravidität mittels manueller transrektaler Palpation durch- geführt.
Zusätzlich zu den oben genannten Untersuchungen wurden von jeder Kuh die folgenden Reproduktions- und Kuh-assoziierten Parameter mittels der Eintragungen des Betriebstierarztes in das Herdenmanagementprogramm (Herde®; dsp-Agrosoft GmbH, Ketzin, Deutschland) oder anhand von eigens erhobenen Daten erfasst: Alter der Kuh (age), Laktationsnummer (LAC), Tagesmilchleistung zum Zeitpunkt der Besamung (MYAI), 305-Tagemilchleistung in der vorangegangenen Laktation (MY305), Verlauf der Kalbung (calving ease), Beginn des ersten Zyklus nach der Kalbung (SCP), Uterusinvolution im Puerperium (UI), Qualität der für die Besamung genutzten Brunst (QE), Größe des präovulatorischen Follikels (SPF) sowie, zum Zeitpunkt der Besamung, die Körperkondition (body condition score; BCS) und der Lahmheitsgrad (lameness score; LNS) nach Sprecher et al. [121].
Material und Methoden
3.2.2 Allgemeiner Versuchsablauf (Progesteronsupplementation)
In vierzehntägigem Rhythmus wurden bei jeweils ca. 60 Kühen, welche sich zwischen den Tagen 45 und 80 p.p. befanden, manuell und sonographisch Ovar- und Uterusbefunde erhoben. Hiervon wurden 30 gynäkologisch und klinisch gesunde Tiere mit einem BCS > 2 und < 4, einem Lahmheitsgrad nach der Definition von Sprecher et al. [121] < 4 und einem sonographisch darstellbaren Durchmesser des CL > 20 mm für die Studie nach dem Zufallsprinzip ausgewählt. Bei allen Kühen mit einem CL > 20 mm wurde die Brunst durch Injektion von 25 mg PGF2α (Dinoprost, Enzaprost T ®, CEVA, Libourne, Frankreich) i.m. induziert und nachfolgend auf des- sen Auftreten geachtet. Bei Kühen mit einem CL < 20 mm wurde in den nachfolgen- den Tagen zweimal täglich auf das Auftreten einer natürlichen Brunst geachtet.
Dieses Vorgehen wurde gewählt, um die Wirkung der exogenen Progesteron- supplementation bei induzierten und natürlichen Brunsten vergleichen zu können.
Zum Zeitpunkt der Besamung wurde bei allen Tieren der Ovarbefund mittels Ultraschall erhoben, um den Zeitpunkt der Ovulation objektiver beurteilen zu können.
Anschließend wurden beide Ovarien erneut nach 12, 24 und 30 Stunden bis zur erfolgten Ovulation sonographisch untersucht. Kühe, welche innerhalb von 24 h nach der ersten Besamung nicht ovuliert hatten, wurden ein zweites Mal besamt und die Ovulation erneut alle 12 Stunden kontrolliert. Alle Tiere, welche keine Anzeichen von Brunst innerhalb von 96 4 h nach der PGF2α-Injektion (bzw. Erstuntersuchung bei Tieren mit CL < 20 mm) zeigten, sowie alle Tiere, bei welchen die Ovulation nicht innerhalb von 30 2 h nach der letzten Besamung erfolgte, wurden von der Studie ausgeschlossen. Der erste Tag, an dem der dominante Follikel nicht mehr auf dem Ovar darstellbar war, wurde als Tag 1 des Brunstzyklus definiert.
An Tag 5 p.i. wurde bei alle Kühe das Vorhandensein eines CL mittels transrektaler B-Mode Ultraschalluntersuchung überprüft. Hierfür wurde die Anzahl, die Lokalisation und der maximale Durchmesser etwaiger Gelbkörper erfasst. Kühe ohne sichtbaren Gelbkörper wurden von weiteren Untersuchungen ausgeschlossen. Nachfolgend wurde bei allen in der Studie verbliebenen Kühen eine Blutprobe zur Bestimmung der peripheren Serum-P4-Konzentration gewonnen. Nach erfolgter Probenentnahme er- hielten dieKühe nach dem Zufallsprinzip (Losverfahren) ein Progesteronfreisetzungs-
Material und Methoden
system(1,55 gr Progesteron, PRID®Delta, CEVA, Libourne, Frankreich)intravaginal verabreicht oder blieben unbehandelt. Tiere mit induzierter und natürlicher Brunst wurden gleichmäßig auf die Gruppe der P4-supplementierten und unsupplemen- tierten Kühe verteilt. Weitere Blutprobenentnahmen erfolgten an den Tagen 7, 14, 19 und 21 p.i.. Die Blutprobe an Tag 5 wurde nachfolgend zur weiteren Einteilung der Kühe in 6 Versuchsgruppen auf Basis der Serum-P4-Konzentration herangezogen.
Bei allen Kühen, behandelt und unbehandelt, wurden beginnend an Tag 19 erneut zweimal täglich für 30 min Brunstbeobachtungen durchgeführt.BeibrünstigenKühen wurde eine neuerliche transrektale sonographische Untersuchungdurchgeführt.Tiere mit vorhandenempräovulatorischen Follikel undeinemCl <20 mm wurden als nicht gravid erachtet und erneut besamt. Bei allen übrigen Tieren wurdeanTag 30 p.i. eine transrektale Ultraschalluntersuchung im B-Mode (Tringa L®; Esaote Pie Medical, Köln, Deutschland) zur Trächtigkeitsdiagnose durchgeführt. In fraglichen Fällen wurde die transrektale Ultraschalluntersuchung nach 3 Tagen wiederholt durchge- führt. Bei allen in der sonographischen Erstuntersuchung als gravid diagnostizierten Tieren wurde an Tag 42 p.i. eine erneute Untersuchung auf das Vorliegen einer Gravidität mittels manueller transrektaler Palpation durchgeführt.
Zusätzlich zu den oben genannten Untersuchungen wurden von jeder Kuh die folgenden Reproduktions- und Kuh-assoziierten Parameter mittels der Eintragungen des Betriebstierarztes in das Herdenmanagementprogramm (Herde®; dsp-Agrosoft GmbH, Ketzin, Deutschland) oder anhand von eigens erhobenen Daten erfasst: Alter der Kuh (age), Laktationsnummer (LAC), Tagesmilchleistung zum Zeitpunkt der Besamung (MYAI), 305-Tagemilchleistung in der vorangegangenen Laktation (MY305), Verlauf der Kalbung (calving ease), Qualität der für die Besamung genutzten Brunst (QE) sowie, zum Zeitpunkt der Besamung, die Körperkondition (body condition score; BCS) und der Lahmheitsgrad (lameness score; LNS) nach Sprecher et al. [121].
Material und Methoden
3.3 Blutproben
Bei jeder Probenentnahme wurden 10 ml Blut mittels Vakuumröhrchen (Monovette®;
Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) aus der Schwanzvene entnommen. Die Blutpro- ben wurden sofort nach der Entnahme auf Eis gekühlt und innerhalb einer Stunde nach der Entnahme 15 min mit 2.050 g zentrifugiert (EBA 20®; Hettich Lab Techno- logy, Tuttlingen, Deutschland). Anschließend wurden je zwei Eppendorf Tubes (Safe- Lock Gefäß®; Eppendorf, Hamburg, Deutschland) mit 4 ml Serum bei -20 °C bis zur Analyse im Labor tiefgefroren. Die Serum-P4-Konzentrationen wurden im Labor mittels eines kommerziell erhältlichen RIA (coat-a-count® Radioimmunassay Pro- gesteron PITKPG-9, Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, CA, USA) bestimmt.
Die Spezifität des Antikörpers beträgt 100% für Progesteron; 9,0% für 5-α-Pregnan- 3,2-dion;3,2%für5-β-Pregnan-3,2-dion;3,4%für17α-Dihydropro-gesteron; 2,2% für 11-Deoxycorticosteron und 0,9% für Kortikosteron. Die Intra- und Inter-Assay-Varia- tionskoeffizienten (CV%) betrugen 3.5 % bzw. 3.9 %. Die untere Nachweisgrenze für P4 lag bei 0,02 ng/ml.
3.4 Milchproben und Analyse
Die Milchprobe wurde stets aus der hinterenrechtenZitzeinnicht-sterilePolyethylen- Zentrifugenröhrchen mit Hohldeckel (10 ml; Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) er- molken und sofort nach der Entnahme gekühlt. Es wurde stets Nachgemelk ge- wonnen. Innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme wurde die Vollmilch mittels eines automatisierten, semiquantitativen Progesteronschnelltests auf Basis eines EIA (eProCheck®, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) vor Ort untersucht. Für die Studie wurdedieTestvariantemitzweiStandardsausgewählt,wobeiStandard1stets0 ng/ml und Standard 2 stets 16,8 ng/ml Progesteron entsprach. Der Schlitten für die Proben umfasste8Kavitäten,sodassnebenden 2 Standards gleichzeitig 6 Proben analysiert werden konnten. In jede Kavität wurden zu Analysezwecken je 30 µl gut homogeni- sierte Vollmilch aus dem Nachgemelk mit Hilfe einer Pipette (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) überführt und der mit Testflüssigkeiten gefüllte Reagenzienblock einge-
Material und Methoden
setzt. Für jedes Tier wurde ein dreifacher Probenansatz pipettiert, wobei die Ergeb- nisse anschließend gemittelt wurden. Die Angabe der Werte erfolgte in ng/ml. Der Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen 16 % und 23 %. Die untere Nachweisgrenze für P4 lag bei 0,1 ng/ml.
3.5 Manuelle transrektale Untersuchung und Befunderhebung
Im Rahmen der Puerperalkontrolle sowie an Tag 50 p.i. und zur Trächtigkeitsunter- suchung wurde eine manuelle transrektale Untersuchung von Uterus und Ovarien durchgeführt. Diese wurde mit Ausnahme der Trächtigkeitsuntersuchung an Tag 45 p.i. stets in Verbindung mit einer sonographischen Untersuchung von Uterus und Ovarien im B-Modus durchgeführt. Die Befunddokumentation der manuellen trans- rektalen Untersuchungen erfolgte stets gemäß GRUNERT et al. [122]. Es wurden Befunde am Uterus, den Ovarien und etwaige sonstige Auffälligkeiten erhoben und dokumentiert. Am Uterus waren dies die Größe, Symmetrie und Kontraktilität sowie etwaige Füllungen, an den Ovarien deren Größe, die Art der vorhandenen Funktions- gebilde und die Konsistenz eventuell vorhandener Follikel. Die Größe der Ovarien wurde dabei in Länge x Breite x Höhe in cm angegeben. Tabelle 1.3 beinhaltet eine ausführliche Darstellung der Befundschlüssel für die einzelnen Merkmale.
Material und Methoden
Tabelle 1.3: Befundschlüssel für die transrektale Untersuchung des Gebärmutter und der Eierstöcke (modifiziert nach GRUNERT 1990)
Uterus
Größe G I Uterus unter der Hand versammelbar, Hörner etwa fingerstark G II Uterus unter der Hand versammelbar, Hörner etwa
zweifingerstark
G III Uterus unter der Hand versammelbar, Hörner etwa drei-bis vierfingerstark
G IV Uterus nach cranial noch mit der Hand abgrenzbar, männerarmstark bis brotlaibgroßes Organ
G V Uterus nicht mehr nach cranial abzugrenzen Symmetrie S Cornua uteri gleichgroß
As Cornua uteri unterschiedlich groß
+++As linkes Horn deutlich größer als rechtes Horn As+ rechtes Horn geringfügig größer als linkes Horn
Kontraktilität K I schlaffer Uterus; keine bis geringe Kontraktionsbereitschaft K II mäßige Kontraktionsbereitschaft
K III starke Kontraktionsbereitschaft Ovar
Größe Länge x Breite x Höhe in cm Funtionsgebilde CL Corpus luteum
F Follikel
Zy Zyste (Follikel > 2,5 cm) Vagina
Vaginitis 0 keine Vaginitis:
blassrosa Vaginalschleimhaut; kein Eiter oder Blut sichtbar
1
geringgradige Vaginitis:
geringe Mengen an Eiter, kein Blut und mäßig gerötete Vaginalschleimhaut
2
mittelgradige Vaginitis:
große Mengen an Eiter, Spuren von Blut und stärker gerötete Vaginalschleimhaut
3
hochgradige Vaginitis:
sehr große Mengen an Eiter, mit
Blutbeimengungen, hochgradig gerötete Vaginalschleimhaut
Material und Methoden
3.6 B-Mode Ultraschall
BeiDurchführungderStudiewurdezu verschiedenen Untersuchungszeitpunkten (Tag der Brunstinduktion,BesamungundOvulationskontrolle;Tag5p.i.;Trächtigkeitsunter- suchung an Tag 30) eine transrektale Ultraschalluntersuchung der Ovarien bzw. des Uterusim B-Modus durchgeführt. Diese erfolgte mit einem portablen Ultraschallgerät (TringaL®;Esaote Pie Medical, Köln, Deutschland), welches mit einem 7 MHz Linear- schallkopf ausgestattet war. Hierbei wurde die Dicke und Struktur der Uteruswand beurteilt und auf etwaige Füllungen von Uterusköper und -hörnern geachtet. Nach- folgend erfolgten die Untersuchung beider Ovarien und die Darstellung von etwaig vorhandenen Funktionsgebilden. Alle vorhandenen Corpora lutea sowie alle Follikel
>0,5 cm wurden erfasst und ihr maximaler Durchmesser vermessen. Zum Zeitpunkt der sonographischen Trächtigkeitsuntersuchung an Tag 30 p.i. erfolgte eine Darstel- lung beider Ovarien mit einem etwaig vorhandenen Corpus luteum graviditatis sowie eine systematische Untersuchung des Uteruskörpers und beider Hörner. Kühe, bei denen Fruchtwasser sowie ein Embryo mit darstellbarem Herzschlag vorhanden war, wurden als gravid diagnostiziert.
3.7 Farbdopplersonographie
3.7.1 Untersuchungen im Dopplermodus
An Tag 5 p.i., 96 4 h nach erfolgter Ovulation, wurde eine Ultraschalluntersuchung mittelseinesportablen,farbdopplerfähigenUltraschallgerätes(Titan®, 7,5 MHz Linear- sonde; Sonosite, Bothell, USA) durchgeführt. Für die sonographischen Untersuch- ungen wurden die Tiere separiert und in einen Untersuchungsstand verbracht. Die durchschnittliche Untersuchungszeit je Kuh lag bei 20 Minuten. Zu Beginn jeder Untersuchung wurde das CL im B-Mode dargestellt und drei Querschnittsbilder im Bereich der größten darstellbaren Querschnittsfläche angefertigt und digitalisiert.
KonntezusätzlicheinHohlraumnachgewiesen werden, wurden hiervon separat eben- falls drei Bilder angefertigt und digitalisiert. Anschließend wurde der luteale Blutfluss (luteal blood flow / LBF) im Power-Modus untersucht. Dabei wurden weitere drei
Material und Methoden
Bilder des CL im Bereich des größten Durchmessers erstellt. Geringfügige Abweich- ungen von dieser Ebene wurden toleriert, um die maximale Anzahl an Farbpixeln innerhalb des Gelbkörpergewebes zu erreichen. Es wurde stets darauf geachtet, das gesamte CL im Doppler-Auswahlfenster zu platzieren, um die gesamte durchblutete Fläche des CL berechnen zu können.
3.7.2 Auswertung der Dopplerbilder
Alle Berechnungen zur Gelbkörpergröße und -durchblutung wurden im Anschluss an die Untersuchung im Stall an einem Computer durchgeführt. Hierfür wurden die digitalisierten Bilder auf einen Computer übertragen. Anschließend wurden mittels der Bildanalyse-Software PixelFlux® (Version 1.0, Chameleon Software, Leipzig, Deutschland) nachfolgend genannte Messungen durchgeführt. Für jedes der drei an- gefertigten Bilder im B-Mode wurde der maximale Durchmesser (DCL) sowie die maximale Querschnittsfläche des Gelbkörpers (Corpus luteum size / CS) errechnet.
Wies das untersuchte CL keinen Hohlraum auf, so stimmte CS mit der maximalen Fläche an lutealem Gewebe (luteal size / LS) überein. Enthielt das CL einen Hohl- raum, so wurde die Hohlraumfläche (cavity size / CVS) separat errechnet. Nach- folgend konnte die LS durch Subtraktion der Hohlraumfläche von der CS berechnet werden (LS = CS – CVS). Bei allen im Power-Modus angefertigten Bildern wurde mit Hilfe von PixelFlux® die farbig codierte Fläche im CL bestimmt. Diese wurde als semi-quantitativer Parameter für die Gelbkörperdurchblutung (LBF) erachtet. Der absolute (aLBF) und relative (rLBF) Blutfluss des CL wurde anhand des Quotienten aus LBF und LS bzw. CS errechnet. Für die weitere Datenanalyse wurden für alle berechneten Parameter stets die Mittelwerte aus den drei angefertigten Aufnahmen ermittelt und verwendet.
3.8 Progesteronsupplementation
Nach erfolgter Blutprobenentnahme an Tag 5 wurden 441 Kühe für die Studie ausge- wählt und nach dem Zufallsprinzip mit einem Progesteronfreisetzungssystem (1,55gr
Progesteron, PRID® Delta; CEVA, Libourne, Frankreich) intravaginal behandelt
Material und Methoden
(n = 206) oder blieben unbehandelt (n = 235) und dienten als Kontrolle. Das intravaginale Wirkstofffreisetzungssystem wurde, nach vorheriger Reinigung der Scham und nach Entfernung der für die Entnahme vorgesehen Schnur, unter Zuhilfe- nahme des hierfür vorgesehenen Applikators und wenig Gleitgel an den Wirkort verbracht. Nach dem Einlegen in die Scheide wurde das Medikament für 14 Tage am Wirkungsort belassen und am Tag 19 p.i. durch manuelles Eingehen in die Scheide mit einer behandschuhten Hand unter Verwendung von reichlich Gleitgel wieder entfernt. Am Tag der Präparatentfernung wurden zusätzlich die Verlustrate und die lokale Reaktion der Scheide auf das Medikament erfasst. Eine etwaig vorhandene Vaginitis wurde in drei Stufen unterteilt: geringgradig, mittelgradig und hochgradig (Tabelle 1.3).
3.9 Einteilung in die Untersuchungsgruppen
Farbdopplersonographie
Um eine Aussage bezüglich Abhängigkeit der Parameter P4-Konzentration, CS, LS und LBF vom Trächtigkeitsstatus treffen zu können, wurden alle Tiere nach erfolgter Trächtigkeitsuntersuchung retrospektiv in eine von vier Tiergruppen eingeteilt:
(1) gravid [pregnant / P]
Fruchtwasser und Embryo mit Herzschlag sichtbar an Tag 30 p.i.
(2) frühembryonaler Verlust [early embryonic loss / EEL]
kein Fruchtwasser und Embryo sichtbar an Tag 30 p.i.; keine sonographisch bestätigte Brunst und/oder Besamung bis Tag 25 p.i.
(3) nicht gravid [non-pregnant / NP]
sonographisch bestätigte Brunst und/oder Besamung bis Tag 25 p.i.
(4) unbesamt [non-inseminated / NI]
keine Besamung im Anschluss an Brunstinduktion
Material und Methoden
Progesteronsupplementation
Bei allen Kühen, welche Progesteron erhielten, wurde nach erfolgter Analyse der P4- Konzentrationen im Blutserum an Tag 5 retrospektiv eine Einteilung in 6 Versuchs- gruppen vorgenommen.
[LPP] geringe P4-Konzentrationen/ PRID [LPC] geringe P4-Konzentrationen/ Kontrolle [IPP] mittlere P4-Konzentrationen/ PRID [IPC] mittlere P4-Konzentrationen/ Kontrolle [HPP] hohe P4-Konzentrationen/ PRID [HPC] hohe P4-Konzentrationen/ Kontrolle.
Zur Unterscheidung zwischen Tieren mit niedrigen, mittleren und hohen Progesteron- werten wurden als Grenzwerte(threshold/T) das 25 % Quartil mit einem P4-Wert von 1,0 ng/ml und das 75 % Quartil mit einem P4-Wert von 1,7 ng/ml gewählt. Somit ergab sich die Einteilung in Versuchsgruppen mit niedrigen, mittleren und hohen Pro- gesteronkonzentrationenwiefolgt:Kühe mit geringen P4-Konzentrationen 1,0 ng/ml;
Kühe mit mittleren P4-Konzentrationen von 1,1 – 1,6 ng/ml und Kühe mit hohen P4- Konzentrationen von 1,7 ng/ml im Serum.
