Untersuchungen zur Analytik und diagnostischen Aussagekraft des Wachstumsfaktors Vascular Endothelial Growth Factor
(VEGF) bei Hunden mit tumorösen Erkrankungen
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Meike Frenz Flensburg Hannover 2014
Prof. Dr. S. Neumann,
Kleintierklinik des Tierärztlichen Institutes der Georg-August-Universität, Göttingen
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. F.-J. Kaup 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke Tag der mündlichen Prüfung: 14.05.2014
Meiner Familie gewidmet
Serum vascular endothelial growth factor in dogs with haemaniosarcoma and haematoma.
Research in Veterinary Science
Ergebnisse dieser Dissertation wurden als Vortrag auf folgender Fachtagung präsentiert:
FRENZ, M. (2013):
Möglichkeiten der Differenzierung von Milzläsionen bei Hunden mittels Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF).
Vortrag auf der 21. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik“ der DVG.
München: 01.-02.02.2013
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ...11
2 LITERATURÜBERSICHT ...13
2.1 Der „Vascular Endothelial Growth Factor“ VEGF ... 13
2.2 Regulation der VEGF-Gen Expression ... 14
2.3 VEGF-Rezeptoren ... 15
2.4 Rolle von VEGF bei der physiologischen Angiogenese/Vaskulogenese ... 16
2.5 Rolle von VEGF bei der pathologischen Angiogenese ... 17
2.6 VEGF bei Neoplasien des Hundes ... 19
3 MATERIAL UND METHODEN ...23
3.1 Patienten – gesunde Kontrollgruppe ... 23
3.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 25
3.2.1 Geräte ... 25
3.2.2 Verbrauchsartikel ... 25
3.2.3 Reagenzien und Lösungen ... 26
3.3 Gewinnung und Verarbeitung der Proben ... 26
3.3.1 Blutgewinnung ... 26
3.3.2 Aufbereitung der Proben ... 27
3.3.3 Prinzip des ELISA zur Bestimmung von VEGF ... 27
3.4 Durchführung des ELISA ... 28
3.4.1 Testdurchführung „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“ ... 28
3.5 Auswertung ... 29
3.5.1 Auswertung des ELISA ... 29
3.6 Histopathologie ... 29
3.7 Statistik ... 29
4 ERGEBNISSE ...30
4.1 MANUSKRIPT I ... 30
4.1.1 Abstract ... 31
4.1.2 Introduction ... 31
4.1.3 Materials and methods ... 33
4.1.4 Results ... 35
4.1.5 Discussion ... 36
4.1.6 References ... 40
4.2 Manuskript II ... 47
4.2.1 Abstract ... 47
4.2.2 Introduction ... 48
4.2.3 Material and methods ... 49
4.2.4 Results ... 51
4.2.5 Discussion ... 53
4.2.6 References ... 56
5 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ...64
6 ZUSAMMENFASSUNG ...70
7 SUMMARY ...72
8 LITERATURVERZEICHNIS ...74
9 DANKSAGUNG ...96
Abkürzungsverzeichnis
In dieser Arbeit wurden folgende Kurzformen verwendet:
bFGF Basic Fibroblast Growth Factor
ca. Circa
CBC Complete Blood Count
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay et al. Et alii
Fig. Figure
HIF Hypoxia-Inducible Factor HRE Hypoxie Responsive Element
IL Interleukin
MDD Minimum Detectable Dosis
mm Millimeter
OD optische Dichte
pg/ml Pikogramm pro Milliliter Tab. Tabelle bzw. table
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor VPF Vascular Permeability Factor
WBC White Blood Cells z. B. Zum Beispiel
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1 Einleitung
Das Zytokin Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ist ein bedeutender vaskulärer Wachstumsfaktor und spielt daher eine Schlüsselrolle bei der physiologischen und pathologischen Angiogenese (FERRARA 1999a). Dies gilt besonders im Zusammenhang mit Tumorwachstum und –metastasierung, da VEGF ein wichtiger Regulator der Tumorangiogenese ist (Folkmann, 1975).
Der Wachstumsfaktor VEGF wird nachweislich von Tumorzellen und den Stromazellen des Tumors sezerniert (Fukumura et al., 1998) und wurde bisher in zahlreichen Studien bei Mensch und Hund quantitativ mittels ELISA in Blutproben bestimmt. Viele human- und tiermedizinischen Studien kamen zu dem Ergebnis ansteigender Serum- und/oder Plasma- VEGF Level in Tumorpatienten im Vergleich zu gesunden Probanden (GEORGE et al. 2000;
SHIMADA et al. 2001; KARAYIANNAKIS et al. 2002a; CLIFFORD et al. 2001; GENTILINI et al. 2005; KATO et al. 2007; TAYLOR et al. 2007; SOBCZYNSKA-RAK 2009). In einer Vielzahl caniner Tumoren konnte außerdem eine VEGF-Expression nachgewiesen werden, so dass von einem bedeutenden Einfluss des angiogenen Wachstumsfaktors VEGF auf die Tumorgenese auch bei Hunden ausgegangen wird (MAIOLINO et al. 2000; YONEMARU et al. 2006; REBUZZI et al. 2007; TAYLOR et al. 2007; WOLFESBERGER et al. 2007; AL- DISSI et al. 2009; MATIASEK et al. 2009; SHIOMITSU et al. 2009; AMORIM et al. 2010;
MILLANTA et al. 2010).
Bei den bisherigen Studien, die sich mit der Messung der VEGF Konzentration in Serum und/oder Plasma von Hunden mit tumorösen Erkrankungen beschäftigt haben, wurde überwiegend ein Human-ELISA eingesetzt (CLIFFORD et al. 2001; GENTILINI et al. 2005;
KATO et al. 2007; TAYLOR et al. 2007), während der erst kürzlich kommerziell verfügbare canine VEGF-ELISA nur auf sehr wenige Studien beschränkt ist (ABRAMS et al. 2011;
ARESU et al. 2012; MAIOLINI et al. 2013).
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Ziel der vorliegenden Dissertation war daher die Untersuchung der Serum-VEGF Konzentration bei Hunden mit unterschiedlichen Neoplasien unter Verwendung des neuen für Hunde entwickelten ELISA. Für die Validierung wurden beispielhaft Gesäugetumore und Hämangiosarkome gewählt, da diese Tumorentitäten von intensiven Prozessen der Angiogenese begleitet werden. In diesem Zusammenhang wurde auch die Möglichkeit untersucht, ob sich bei der Milz neoplastische Läsionen von nicht-malignen Veränderungen am Beispiel von Hämatomen anhand der VEGF-Serumkonzentration differenzieren lassen.
Die Ergebnisse der Untersuchung wurden in zwei Manuskripten zur Publikation dokumentiert.
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2 Literaturübersicht
Bereits im Jahre 1983 gelangen SENGER et al. die Isolation eines Proteins, das die Gefäßpermeabilität erhöht und das daher den Namen Vascular Permeability Factor (VPF) erhielt (SENGER et al. 1983). Unabhängig davon wurde 1989 durch FERRARA und HENZEL ein endothelzellspezifisches Mitogen identifiziert, der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) (FERRARA u. HENZEL 1989). Weitere Untersuchungen ergaben, dass es sich bei diesen beiden Faktoren um dasselbe Protein handelte (LEUNG et al. 1989).
2.1 Der „Vascular Endothelial Growth Factor“ VEGF
VEGF (auch als VEGF-A bezeichnet) ist ein Polypeptid aus der VEGF-Familie, zu der neben VEGF-B (OLOFSSON et al. 1996), VEGF-C (JOUKOV et al. 1996), VEGF-D (ACHEN et al.
1998) und PIGF (Placenta Growth Factor) (MAGLIONE et al. 1991) auch noch die verwandten viralen Homologen VEGF-E (Orf-virus VEGF) (LYTTLE et al. 1994) und die im Schlangengift vorhandenen VEGF-F gehören (YAMAZAKI et al. 2009).
Das zuerst entdeckte Mitglied VEGF (VEGF-A), ein Heparin-bindendes Glykoprotein, ist ein über eine Disulfidbrücke verbundenes Homodimer mit einem Molekulargewicht von etwa 45 kDa (FERRARA u. HENZEL 1989).
VEGF gilt innerhalb der VEGF-Familie als Hauptregulator der Vaskulogenese, Angiogenese und Gefäßpermeabilität. Bereits die gezielte Ausschaltung von einem VEGF-A Allel führt in Knockout Mäusen zur embryonalen Letalität aufgrund umfassender Blutgefäßmissbildungen (FERRARA et al. 1996; YLA-HERTTUALA et al. 2007). Es wirkt als Mitogen auf Endothelzellen von Arterien, Venen und Lymphgefäßen und fungiert als „Survival Factor“
(Überlebensfaktor) für Endothelzellen (GERBER et al. 1998a; GERBER et al. 1998b;
FERRARA 1999a). Zusätzlich erhöht VEGF durch morphologische Veränderungen des Endothelzellverbandes die Gefäßpermeabilität und spielt damit eine wichtige Rolle bei entzündlichen Prozessen (SENGER et al. 1983; DVORAK et al. 1995). VEGF hat aber nicht ausschließlich Effekte auf Endothelzellen, sondern stimuliert z. B. auch die Chemotaxis von Monozyten (CLAUSS et al. 1990).
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VEGF wird dabei von einer Vielzahl an unterschiedlichen Zellarten (u. a. Thrombozyten, Lymphozyten, neutrophilen Granulozyten, Makrophagen, glatten Muskelzellen) sezerniert, zu denen auch Tumorzellen und Tumor-assoziierte Stromazellen gehören (FERRARA et al.
1991; BERSE et al. 1992; FUKUMURA et al. 1998).
Das humane VEGF Gen besteht aus acht Exons, die durch sieben Introns gegeneinander abgegrenzt sind, und ist auf Chromosom 6p21.3 lokalisiert (VINCENTI et al. 1996). Durch alternatives Splicing der mRNA aus demselben Gen werden verschiedene Varianten (Isoformen) des Proteins VEGF von unterschiedlicher Länge hervorgebracht. So wurden im Menschen bisher 9 Isoformen (VEGF 121, VEGF 145, VEGF 148, VEGF 162, VEGF 165, VEGF 165b, VEGF 183, VEGF 189 und VEGF 206) identifiziert, während im Hund 5 Isoformen (VEGF 120, VEGF 144, VEGF 164, VEGF 188 und VEGF 205) bekannt sind (SCHEIDEGGER et al. 1999; ROBINSON u. STRINGER 2001; DICKINSON et al. 2008).
Die Isoformen unterscheiden sich durch ihre Größe (die Nummern entsprechen der Anzahl Aminosäuren im jeweiligen Protein) und biologische Eigenschaften. Die im humanen Organismus vorherrschende Form ist VEGF 165, während im Hund die Isoform VEGF 164 überwiegt. Dabei ist die Aminosäure-Sequenz zwischen Mensch und Hund nahezu identisch (FERRARA 1999a; SCHEIDEGGER et al. 1999).
2.2 Regulation der VEGF-Gen Expression
Die VEGF-Genexpression wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst. Als wichtigster Regulationsfaktor hat sich jedoch der Sauerstoffpartialdruck (pO2) erwiesen. Die VEGF mRNA Expression wird bei sinkendem Sauerstoffpartialdruck gesteigert, das heißt, die Expression von VEGF wird durch Hypoxie induziert (MINCHENKO et al. 1994).
Die Hypoxie-induzierte Transkription der VEGF mRNA ist dabei abhängig von dem „hypoxia- inducible factor 1 (HIF-1). HIF-1 ist ein basisches, heterodimeres Doppelhelix-Protein, das aus zwei Untereinheiten (HIF-1α und HIF-1β) besteht (WANG u. SEMENZA 1995). Unter hypoxischen Bedingungen bindet HIF-1 an das Hypoxie-responsive Element (HRE) am VEGF-Promoter mit nachfolgender Synthese von VEGF. Neben der Hypoxie können weitere Stimuli, wie verschiedene Wachstumsfaktoren, Zytokine, Hormone oder onkogene Mutationen die VEGF-Expression induzieren (FERRARA 2004).
Zu den Wachstumsfaktoren, die zur VEGF-Produktion führen, gehören z. B. Transforming Growth Factor (TGF-β), Epidermal Growth Factor (EGF), Keratinocyte Growth Factor (KGF), Insulin-like Growth Factor (IGF-1), Tumor Necrosis Factor (TNF-α), Fibroblast Growth Factor
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(FGF) und Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) (PERTOVAARA et al. 1994; FRANK et al.
1995; WARREN et al. 1996). Auch proinflammatorische Zytokine, wie z. B. IL-6, bewirken die Induktion der VEGF-Expression (COHEN et al. 1996).
2.3 VEGF-Rezeptoren
Die Interaktion des VEGF mit vaskulären Endothelzellen verläuft über die hochaffinen Rezeptortyrosinkinasen VEGFR-1 (auch Flt-1/fms-like tyrosine kinase genannt) und VEGFR- 2 (auch KDR/kinase-insert-domain-containing receptor genannt), die an die Zellmembran gebunden sind (SHIBUYA et al. 1990; TERMAN et al. 1991). Die Mitglieder der VEGF- Familie binden mit unterschiedlichen Affinitäten an die Rezeptortyrosinkinasen.
VEGFR-3 (Flt-4/fms like tyrosine kinase) ist kein Rezeptor für VEGF, sondern wird nur durch VEGF-C und VEGF-D aktiviert. Seine Expression ist im adulten Organismus weitgehend auf lymphatische Endothelzellen beschränkt (KOWANETZ u. FERRARA 2006).
VEGF (VEGF-A) bindet an die beiden VEGF-Rezeptoren VEGFR-1 und VEGFR-2, die aus sieben extrazellulären Immunglobulindomänen sowie einer Transmembranregion und einer intrazellulären Tyrosinkinase-Sequenz bestehen (SHIBUYA et al. 1990; TERMAN et al.
1991). Eine durch alternatives Splicing entstehende lösliche Form von VEGFR-1 (sFlt-1) besitzt nur 6 extrazelluläre Immunglobulindomänen und fungiert als Inhibitor der mitogenen VEGF-Aktivität (KENDALL u. THOMAS 1993).
Die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren führt zunächst zur Dimerisierung zweier Rezeptoren und anschließender Autophosphorylierung, wodurch letztlich die Tyrosinkinase aktiviert wird. Dadurch werden eine Reihe weiterer intrazellulärer Tyrosinreste phosphoryliert. An die phosphorylierten Tyrosinreste können nun Adaptermoleküle binden und so eine intrazelluläre Signalkaskade in Gang setzen (OLSSON et al. 2006).
VEGFR-1 hat eine deutlich höhere Affinität zu VEGF im Vergleich zu VEGFR-2, zeigt aber nur eine schwache Tyrosin-Autophosphorylierung als Antwort auf die VEGF-Bindung (DE VRIES et al. 1992). Daher scheint VEGFR-1 nicht primär für die Übermittlung von mitogenen Signalen verantwortlich zu sein. Stattdessen stimuliert er vor allem die Monozytenmigration und kann, als sogenannter „decoy“ Rezeptor, inhibitorisch auf die VEGFR-2 vermittelte pro- angiogene Signaltransduktion wirken (PARK et al. 1994; BARLEON et al. 1996; RAHIMI et al. 2000). VEGFR-1 spielt aber eine essentielle Rolle bei der embryonalen Vaskulogenese.
Untersuchungen an Knockout-Mäusen ergaben, dass VEGR-1 defiziente Embryos bereits am Tag 8,5 infolge von Gefäßmissbildungen starben. So kommt es zwar zur Entwicklung von
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Endothelzellen, diese sind aber nicht imstande geeignete Blutgefäßstrukturen auszubilden (FONG et al. 1995; FONG et al. 1999).
Obwohl VEGFR-2 VEGF mit geringerer Affinität bindet als VEGFR-1, gilt er als Hauptvermittler der mitogenen, angiogenen und permeabilitätssteigernden Wirkung von VEGF (FERRARA 2004). Außerdem kommt ihm eine Schlüsselrolle bei der Hämatopoese zu. In VEGFR-2 defizienten Mäuseembryos entwickeln sich keine Endothelzellen oder hämatopoetischen Zellen und die Bildung von organisierten Blutgefäßen bleibt aus. Die Embryonen versterben daher zwischen Tag 8,5 und 9,5 der Embryonalentwicklung (SHALABY et al. 1995).
Die Expression der VEGF-Rezeptoren wird ebenfalls durch Hypoxie sowie durch das Protein VEGF selbst induziert (TUDER et al. 1995; SHEN et al. 1998).
2.4 Rolle von VEGF bei der physiologischen Angiogenese/Vaskulogenese
VEGF spielt nicht nur eine zentrale Rolle bei der Angiogenese im adulten Organismus, sondern ist auch essentiell für die embryonale Vaskulogenese und Angiogenese (CARMELIET et al. 1996; FERRARA et al. 1996).
Unter dem Begriff Angiogenese versteht man das Wachstum neuer Kapillaren aus bereits bestehenden Gefäßen durch Sprossungs- und Spaltungsvorgänge. Diese ist primär für die Entstehung von Blutgefäßen während der späten Embryogenese und im Erwachsenenalter verantwortlich und dient der zellulären Versorgung von Geweben mit Sauerstoff und Nährstoffen (RISAU u. FLAMME 1995).
Die Angiogenese ist ein komplexer Prozess und wird von einer Reihe pro- und antiangiogener Faktoren reguliert. Einer der wichtigsten pro-angiogenen Faktoren, der an der Gefäßneubildung beteiligt ist, ist VEGF. Er führt zu einer Induktion der Gefäß-Neubildung, der Endothelzell-Proliferation und Migration und zu einer Inhibition der Apoptose von Endothelzellen (ALON et al. 1995; ROSEN 2002).
VEGF ist im Rahmen der physiologischen Angiogenese, die im adulten Organismus nur selten stattfindet, erforderlich bei der zyklischen Blutgefäßproliferation im weiblichen Reproduktionstrakt sowie bei der Wundheilung. Darüber hinaus spielt er eine wichtige Rolle beim Längenwachstum von Knochen durch Beteiligung an der enchondralen Knochenbildung (FERRARA 1999a; GERBER et al. 1999).
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2.5 Rolle von VEGF bei der pathologischen Angiogenese
Die Angiogenese ist auch an pathologischen Vorgängen beteiligt. Allerdings muss hier zwischen überschießender bzw. fehlregulierter und fehlender Angiogenese unterschieden werden.
Zu einer pathologisch gesteigerten Gefäßneubildung kommt es im Rahmen der Tumorangiogenese, diabetischer Retinopathie, altersbedingter Makuladegeneration, rheumatoider Arthritis und Psoriasis (FERRARA 2004).
Tumorangiogenese
Die Angiogenese ist essentiell für das Wachstum von Tumoren sowie für deren hämatogene Metastasierung (Folkman, 1985, 1995).
Um eine ausreichende Sauerstoff- und Nährstoffversorgung sowie einen Abtransport von Stoffwechselabfallprodukten der Tumorzellen zu gewährleisten, ist die Neubildung von Blutgefäßen notwendig. Ohne den Anschluss an das Blutgefäßsystem ist Tumorwachstum nur bis zu einer Größe von 1-2 mm3 möglich, bei der eine Versorgung über Diffusion stattfindet und der Tumor in einem „avaskulären“ Zustand verbleibt (FOLKMAN 1985, 1990;
BERGERS u. BENJAMIN 2003). Beim Übergang in den vaskulären Zustand verschiebt sich das Gleichgewicht zwischen Stimulatoren und Inhibitoren der Angiogenese in Richtung der Stimulatoren und es kommt zum sogenannten „angiogenic switch“ (HANAHAN u. FOLKMAN 1996). Tumorzellen und auch Tumor-assoziierte Stromazellen sind in der Lage die Bildung von Blutgefäßen über die Produktion und Freisetzung von pro-angiogenen Faktoren wie VEGF zu induzieren (FERRARA u. DAVIS-SMYTH 1997; FUKUMURA et al. 1998).
Der „angiogenic switch“ kann durch Hypoxie, genetische Veränderungen in den Tumorzellen sowie über die Aktivierung von Onkogenen beziehungsweise die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen ausgelöst werden (HANAHAN u. FOLKMAN 1996). In Glioblastomen wurde z. B. die höchste VEGF-Expression in hypoxischen Tumorzellen um fokale Nekrosen nachgewiesen (PLATE et al. 1992). Auch laut SHWEIKI et al. (1992) wird die VEGF-Expression in angrenzenden Regionen zu hypoxisch nekrotischen Arealen hochreguliert.
Therapeutische Ansätze/Antiangiogenese:
Die Erkenntnis, dass Tumorwachstum Angiogenese-abhängig ist, macht die Hemmung der Angiogenese zu einem therapeutisch interessanten Ziel.
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Das Konzept der Antiangiogenese bzw. Angiogenese-Hemmung wurde erstmals 1971 formuliert und geht auf FOLKMAN zurück, der die These eines limitierten Tumorwachstums in Abwesenheit von Angiogenese aufstellte (FOLKMAN 1971; FOLKMAN et al. 1971). Es gibt verschiedene Strategien der Angiogenese-Inhibition, um die Neubildung von Gefäßen und damit die Durchblutung des Tumors zu reduzieren.
Als Inhibitoren von VEGF werden monoklonale Antikörper (Anti-VEGF Antikörper) eingesetzt, die spezifisch an VEGF binden und damit das Andocken an den Rezeptor und die anschließende Stimulation der Angiogenese verhindern. KIM et al. zeigten 1993, dass diese Antikörper einen deutlich inhibitorischen Effekt auf das Tumorwachstum haben.
Zu den erfolgreichsten Substanzen in der reinen Angiogenese-Hemmung gehört heute in der Humanmedizin der monoklonale Antikörper Bevacizumab (Avastin®). Dieser wurde 2005 zur Behandlung von Patienten mit metastasiertem Kolon- oder Rektumkarzinom zugelassen und wird mittlerweile auch zur Behandlung von fortgeschrittenem oder metastasiertem Mammakarzinom, nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom, Nierenzellkarzinom und Ovarialkarzinom eingesetzt. Bevacizumab wird in Kombination mit einer Chemotherapie angewendet und führt zu einer statistisch signifikant verlängerten progressionsfreien Überlebenszeit (HURWITZ et al. 2004; SANDLER et al. 2006; ESCUDIER et al. 2007; GRAY et al. 2009; BURGER et al. 2011).
Der Wirkungsmechanismus von Bevacizumab beruht zum einen auf der Hemmung der Gefäßneubildung, zum anderen bilden sich noch VEGF-abhängige unreife Blutgefäße zurück. Zusätzlich wird die in Tumorgefäßen zum Teil herabgesetzte Gefäßpermeabilität normalisiert und die unterversorgten Bereiche damit empfänglicher für die in Kombination eingesetzten Chemotherapeutika (WILLETT et al. 2004; JAIN 2005).
Weitere Angiogenese-Hemmer sind Tyrosinkinaseinhibitoren, deren Angriffsorte die VEGF- Rezeptoren sind. Hier bleibt die intrazelluläre Phosphorylierung und damit auch die Signalkaskade aus. Bekannte VEGFR-Tyrosinkinaseinhibitoren sind z. B. Sorafenib (Nexavar) und Sunitinib (Sutent), die beide zur Behandlung von fortgeschrittenem Nierenzellkarzinom eingesetzt werden (KOWANETZ u. FERRARA 2006).
Der potentiell klinische Nutzen der VEGF-Inhibition ist aber nicht nur auf Tumorwachstum beschränkt. Auch in der Augenheilkunde werden beispielsweise derzeit 2 VEGF-Inhibitoren zur Therapie der feuchten altersbedingten Makuladegeneration genutzt. 2004 wurde der Wirkstoff Pegabtanib (Macugen) zugelassen, ein künstlich hergestelltes RNA-Aptamer
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(Oligionukleotid), das hochspezifisch und mit hoher Affinität an VEGF bindet und damit ebenfalls dessen Wechselwirkung mit dem Rezeptor verhindert (NG et al. 2006). 2007 folgte die Zulassung des humanisierten monoklonalen Antikörperfragments Ranibizumab (Lucentis) gegen VEGF, das, wie Pegabtanib, intravitreal injiziert wird (ROSENFELD et al.
2006).
Im Gegensatz zur Humanmedizin, in der VEGF eine zunehmende Verbreitung in Diagnose und Therapie besitzt, ist die Erkenntnislage beim Hund noch gering.
2.6 VEGF bei Neoplasien des Hundes
Bereits im Jahr 1983 isolierten SENGER et al. VPF/VEGF aus den Kulturmedien verschiedener Tumorzelllinien und aus der tumorbedingten Ascitesflüssigkeit der Hepatokarzinom-Zelllinie 10 beim Meerschweinchen (SENGER et al. 1983). Später zeigten in-situ-Hybridisierungsversuche, dass VEGF mRNA in vielen humanen Tumoren hochreguliert wird (FERRARA u. DAVIS-SMYTH 1997). Heute gilt VEGF als bedeutender Regulator der Tumorangiogenese und ist damit essentiell für Tumorwachstum und dessen Metastasierung.
In einer Vielzahl humanmedizinischer Studien konnten bei Krebspatienten deutlich erhöhte Serum-VEGF Konzentrationen nachgewiesen werden, die häufig mit einer Tumorprogression, dem Auftreten von Metastasen, einer schlechten Prognose oder verkürzten Überlebenszeit einhergingen (YAMAMOTO et al. 1996; SALVEN et al. 1997;
SALVEN et al. 1998; GEORGE et al. 2000; SHIMADA et al. 2001; KARAYIANNAKIS et al.
2002a; KARAYIANNAKIS et al. 2002b).
Verschiedene Studien bei Hunden mit unterschiedlichen tumorösen Erkrankungen, einschließlich Hämangiosarkomen (CLIFFORD et al. 2001), Gesäugetumoren (KATO et al.
2007), Lymphomen (GENTILINI et al. 2005), malignen Melanomen (TAYLOR et al. 2007) und Hauttumoren (SOBCZYNSKA-RAK 2009) belegen ebenfalls ansteigende Serum- und/oder Plasma-VEGF Level im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren.
In der veterinärmedizinischen Onkologie wurde auch die prognostische Bedeutung von VEGF untersucht.
So zeigten z. B. Hunde mit oralen malignen Melanomen signifikant höhere Plasma- und Serum-VEGF Konzentrationen mit fortgeschrittenem Erkrankungsstadium (TAYLOR et al.
2007). Bei Hunden mit Lymphom konnten GENTILINI et al. (2005) dies ebenfalls bestätigen.
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Außerdem wurde hier eine negative Korrelation zwischen hoher VEGF-Konzentration und krankheitsfreiem Intervall beobachtet (GENTILINI et al. 2005).
Zu prognostisch bedeutsamen Ergebnissen kamen auch WERGIN u. KASER-HOTZ (2004).
Sie untersuchten Plasma-VEGF Konzentrationen von Hunden mit unterschiedlichen Tumoren und stellten höchste Plasma-VEGF Level bei Patienten mit besonders aggressiven Tumoren wie oralen Melanomen und Sarkomen fest. Schlussfolgernd hingen Plasma-VEGF Level hier von der Tumorhistologie ab. Eine Korrelation zwischen Plasma-VEGF Konzentration und Erkrankungsstadium oder Tumorvolumen konnte aber nicht nachgewiesen werden (WERGIN u. KASER-HOTZ 2004). KATO et al. (2007) berichtete nicht nur von signifikant erhöhten Plasma- und Serum-VEGF Werten in Hunden mit malignen Gesäugetumoren im Vergleich zu denen mit benignen Gesäugetumoren, sondern stellte auch einen signifikanten Unterschied der Plasma- und Serum-VEGF Konzentrationen zwischen Hunden mit postoperativen Lungenmetastasen und denjenigen ohne Metastasen fest. Die Untersuchungen von TROY et al. (2006) beschäftigten sich mit Plasma-VEGF Konzentrationen in gesunden Hunden sowie Hunden mit Tumoren oder nicht- neoplastischen Erkrankungen. Damit gehört diese Studie zu den ersten, die überhaupt einen Vergleich der VEGF-Konzentrationen zwischen tumortragenden Hunden und Hunden mit nicht-neoplastischer Erkrankung vornimmt. Hier zeigen sich signifikant häufiger nachweisbare Plasma-VEGF Konzentrationen in Tumorpatienten im Vergleich zu den beiden oben genannten Gruppen (TROY et al. 2006).
Weitere Studien beschäftigten sich mit der Untersuchung der VEGF-Expression im Tumorgewebe beim Hund. Die VEGF-Expression wurde bereits in einer Vielzahl caniner Tumoren nachgewiesen, u.a. in Mammakarzinomen (MILLANTA et al. 2010), Hämangiosarkomen, Hämangiomen (YONEMARU et al. 2006), oralen malignen Melanomen (TAYLOR et al. 2007), malignen epithelialen Nasentumoren (SHIOMITSU et al. 2009), Lymphomen (WOLFESBERGER et al. 2007), kutanen Fibrosarkomen (AL-DISSI et al.
2009), kutanen Mastzelltumoren (REBUZZI et al. 2007; AMORIM et al. 2010), intrakraniellen Meningiomen (MATIASEK et al. 2009) und kutanen Plattenepithelkarzinomen (MAIOLINO et al. 2000).
Darüber hinaus lieferten auch hier einige Studien erste Hinweise darauf, dass die VEGF- Expression auch als prognostischer Marker genutzt werden könnte. So stellten QIU et al.
(2008b) eine signifikant höhere VEGF-Expression in caninen malignen Gesäugetumoren als in normalem Mammagewebe oder benignen Gesäugetumoren fest. PLATT et al. (2006)
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berichteten von einer VEGF-Expression in allen untersuchten intrakraniellen Meningiomen und zeigten einen Zusammenhang zwischen erhöhten VEGF-Konzentrationen und kürzerer Überlebenszeit nach chirurgischer Resektion und Bestrahlung.
ROSSMEISL et al. (2007), die sich ebenfalls mit der VEGF-Expression in caninen intrakraniellen Tumorproben beschäftigten, konnten im Hirngewebe gesunder Kontrolltiere kein VEGF-Nachweis erbringen.
Untersuchungen an caninen vaskulären Tumoren zeigten, dass die neoplastischen Zellen in Hämangiomen im Gegensatz zu denen in Hämangiosarkomen nur schwach ausgeprägte oder gar keine VEGF-Expression aufwiesen (YONEMARU et al. 2006). Vermutet wird hier ein Zusammenhang zwischen VEGF-Expression und maligner Proliferation von Hämangiosarkomen.
Die bisher veröffentlichten Untersuchungsergebnisse zur VEGF-Konzentration im Blut bzw.
VEGF-Expression bei caninen Tumorpatienten weisen auf einen bedeutenden Einfluss des angiogenen Wachstumsfaktors VEGF auf die Tumorgenese und Metastasierung hin. Die Höhe der VEGF-Konzentration und/oder VEGF-Expression kann zukünftig eventuell als diagnostischer und/oder prognostischer Marker dienen.
Viele Studien haben sich bereits mit der Messung der Serum- und/oder Plasma-VEGF Konzentration bei Hunden mit tumoröser Erkrankung beschäftigt. Aufgrund der erst kürzlich kommerziellen Verfügbarkeit eines caninen VEGF-ELISA von R&D Systems wurde in den hier beschriebenen älteren Studien aber vorrangig ein Human-ELISA (Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) eingesetzt. Lediglich die Studie von SOBCZYNSKA-RAK (2009) wurde mithilfe eines Maus-ELISA (Quantikine, R&D Systems) durchgeführt.
Aktuell sind nach vorliegendem Kenntnisstand bisher nur drei tiermedizinische Studien bekannt, die Serum und/oder Plasma-VEGF Level in Hunden mit Lymphom (ARESU et al.
2012), Diabetes mellitus (ABRAMS et al. 2011) und Steroid Responsive Meningitis-Arteriitis (MAIOLINI et al. 2013) mittels caninem ELISA untersucht haben.
ARESU et al. (2012) konnten hier statistisch signifikant erhöhte Plasma-VEGF Level bei Hunden mit Lymphom im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe nachweisen. Diese Ergebnisse decken sich mit denen aus der Studie von GENTILINI et al. (2005), der mithilfe des humanem ELISA bei an Lymphom erkrankten Hunden deutlich höhere Serum-VEGF Level als in gesunden Hunden aufzeigte.
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Ziel der vorliegenden Dissertation war daher die Untersuchung der Serum-VEGF Konzentration bei Hunden mit Hämangiosarkom oder Gesäugetumor unter Verwendung des caninen ELISA sowie die Überprüfung einer möglichen Differenzierung zwischen malignen und nicht-malignen Milzläsionen anhand der Serum-VEGF Level.
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3 Material und Methoden
Zur Klärung der Frage, ob Serum oder Plasma VEGF besser zur Analyse geeignet ist, wurde vor Studienbeginn von zehn klinisch gesunden Hunden und 38 Hunden mit unterschiedlichen Erkrankungen neben Serum auch Blut für die Plasmabestimmung von VEGF entnommen.
3.1 Patienten – gesunde Kontrollgruppe
Im Rahmen der zwei vorliegenden Studien wurden bei insgesamt 15 Hunden mit Milzläsionen und 32 Hunden mit Gesäugetumoren aus der Klientel der Kleintierklinik des Tierärztlichen Instituts der Georg-August-Universität Göttingen die VEGF Serumkonzentration bestimmt.
In der Gruppe der Hunde mit Milzläsionen (n=15) stellten Mischlinge (n=5) die größte Gruppe dar. Die übrigen 10 Hunde setzten sich aus unterschiedlichen Rassen zusammen: Golden Retriever (n=2), Deutscher Schäferhund (n=1), Australian Sheperd (n=1), Hovawart (n=1), Border Collie (n=1), Langhaar Teckel (n=1), Riesenschnauzer (n=1), Kromfohrländer (n=1) und Jack Russell Terrier (n=1). 10 der 15 Hunde waren männlich. Davon waren 7 Rüden männlich-intakt und 3 Rüden männlich-kastriert. 5 Hunde waren weiblich. Davon waren 3 Tiere weiblich-intakt und 2 Tiere weiblich-kastriert. Die Hunde mit Milzläsionen waren zwischen 5 und 14 Jahren alt, das mittlere Alter betrug 12 Jahre. 12 der 15 Hunde waren über 9 Jahre alt.
Bei den Hunden mit Gesäugetumoren (n=32) stellten Mischlinge (n=13) ebenfalls die größte Gruppe dar. Des Weiteren waren unterschiedlichste Rassen beteiligt: Golden Retriever (n=4), Deutscher Schäferhund (n=2), Bayerischer Gebirgsschweißhund (n=2), Altdeutscher Hütehund (n=2), Labrador Retriever (n=1), Boxer (n=1), Border Collie (n=1), Beagle (n=1), Pudel (n=1), Deutsche Wachtel (n=1), Katalanischer Schäferhund (n=1), Deutsch Kurzhaar (n=1) und Schapendoes (n=1). 5 der 32 Hündinnen waren weiblich-kastriert und 27 Hunde weiblich-intakt. Die Hunde mit Gesäugetumoren waren zwischen 3 und 16 Jahren alt und das mittlere Alter betrug 10 Jahre.
Zusätzlich zur Messung der VEGF Serumkonzentration wurde bei den erkrankten Hunden eine hämatologische und klinisch-chemische Blutuntersuchung durchgeführt. Hunde mit Milzläsionen wurden nur in die Studie aufgenommen, wenn histopathologisch ein
24
Hämangiosarkom oder Hämatom vorlag. Die Blutprobenentnahmen erfolgten stets vor dem chirurgischen Eingriff (Splenektomie bzw. Mastektomie) aus der V. cephalica antebrachii.
Als gesunde Kontrollgruppe dienten 23 Hunde unterschiedlicher Rasse und unterschiedlichen Alters: Mischlinge (n=9), Deutscher Schäferhund (n=3), Jack Russell Terrier (n=2), Rhodesian Ridgeback (n=1), Weimaraner (n=1), Bayerischer Gebirgsschweißhund (n=1), Australian Shepherd (n=1), Bearded Collie (n=1), Briard (n=1), Dalmatiner (n=1), Hovawart (n=1) und Entlebucher Sennenhund (n=1). 12 der 23 Hunde waren weiblich. Davon waren 7 Tiere weiblich-intakt und 5 Tiere weiblich-kastriert. Die übrigen 11 Hunde waren Rüden. 8 Tiere waren männlich-intakt und 3 Tiere männlich- kastriert. Die gesunden Hunde waren zwischen 7 Monaten und 13 Jahren alt, das mittlere Alter entsprach 5 Jahren. Diese wurden einer klinischen Allgemeinuntersuchung sowie einer abdominalen Ultraschalluntersuchung unterzogen. Labordiagnostisch wurden zusätzlich eine hämatologische Untersuchung (Leukozytenzahl, Zahl der neutrophilen Granulozyten, der Lymphozyten, der Monozyten, der eosinophilen Granulozyten, der basophilen Granulozyten und der Erythrozyten, Hämoglobin, Hämatokrit, mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin (MCH), mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), Thrombozyten) und eine klinische Chemie (Glucose, Fructosamin, Gallensäuren, Glutamatdehydrogenase, Alaninaminotransferase, Aspartataminotransferase, Gesamt- bilirubin, alkalische Phosphatase, Gesamteiweiß, Albumin, Kreatinin, Harnstoff, Calcium, Phosphor, alpha-Amylase, Cholesterin, Lipase, Kreatinkinase, Kalium, Natrium, C-reaktives Protein, Globuline) angefertigt. In die Kontrollgruppe sind nur klinisch gesunde Hunde aufgenommen worden.
25 3.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien 3.2.1 Geräte
Zentrifuge: Eppendorf Centrifuge 5424 (Fa. Eppendorf AG, Hamburg)
Zentrifuge: Hettich EBA 20 (Fa. Hettich, Bäch, Schweiz)
Analyseautomat klinische Chemie: Konelab 20i (Fa. Thermo Fischer Scientific Inc., Dreieich)
Analyseautomat Hämatologie: Abbott Cell-Dyn®3700 (Fa. Abbott GmbH & Co KG, Wiesbaden)
Vortexer: Vortex-Genie 2 (Fa. Scientific Industries, New York)
Waschvorrichtung für Mikrotiterplatten: Nunc-Immuno ™wash 8 (Fa. NUNC, Wiesbaden)
Multifunktionslesegerät: TECAN GENios Pro (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Österreich)
Pipettierhilfe: pipetus®-akku (Fa. Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt)
Pipetten: Pipetman P100/P200/P1000 (Fa. Gilson, Villers Le Bel/Frankreich)
Mehrkanalpipette: Pipetman Ultra Multichannel (20-300µl, Fa. Gilson, Villers Le Bel/Frankreich)
Multipipette: Eppendorf Multipipette® plus mit Combitips® plus in den Volumengroßen 2,5 und 5ml (Fa. Eppendorf AG, Hamburg)
3.2.2 Verbrauchsartikel
Serumröhrchen: Microtube 1,3 ml mit Serum-Gerinnungsaktivator (Fa. Sarstedt AG &
Co, Nümbrecht) zur Blutabnahme für die klinische Chemie sowie für die Bestimmung von VEGF aus Serum
EDTA K-Röhrchen: mit 1,6 mg EDTA/ml Blut angereicherte 2 ml Polypropylenröhrchen (Fa. Sarstedt AG & Co, Nümbrecht) zur Blutabnahme für die Hämatologie sowie für die Bestimmung von VEGF aus Plasma
Reagiergefäße: Sarstedt-Reagiergefäß 1,5 ml (Fa. Sarstedt AG & Co, Nümbrecht)
26 3.2.3 Reagenzien und Lösungen
Reagenzien und Lösungen des „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“ CAVE00 (Fa. R & D Systems, Minneapolis, USA):
Mikrotiterplatte, beschichtet mit einem monoklonalen Antikörper gegen VEGF
VEGF-Konjugat:
o Polyklonaler Antikörper gegen VEGF, an Meerrettichperoxidase konjugiert
VEGF-Standard:
o Rekombinantes VEGF in einer gepufferten Proteinbasis
Assay Diluent RD1W: Gepufferte Proteinlösung zur Blockierung unspezifischer Bindungen und zur Herstellung eines äquimolaren Milieus
Calibrator Diluent RD6U:
o Mit Konservierungsmitteln versehenes Tierserum zum Auflösen des VEGF Standard, zur Herstellung der Verdünnungsreihe und als Negativkontrolle
Waschpufferkonzentrat
Farbreagenz A
o Stabilisiertes Wasserstoffperoxid
Farbreagenz B
o Stabilisiertes Chromogen (Tetramethylbenzidin)
Stopplösung
o 2 N Schwefelsäure
3.3 Gewinnung und Verarbeitung der Proben 3.3.1 Blutgewinnung
Die Blutabnahme erfolgte bei allen erkrankten Hunden im Rahmen der präoperativen Vorbereitung am unsedierten Tier. Nach dem Scheren und Desinfizieren der entsprechenden Hautstelle wurde den Hunden aus der V. cephalica antebrachii mittels Punktion mit einer sterilen Einmalkanüle 20G 0,9 x 40 mm (Fa. Terumo, Leuven, Belgien) Blut entnommen.
Zur Anfertigung der hämatologischen Untersuchung wurde Blut in ein mit 1,6 mg EDTA/ml Blut angereichertem Polypropylenröhrchen aufgefangen und mittels eines automatischen Auszählverfahrens ausgewertet (Abbott Cell-Dyn 3700). Das für die klinische Chemie benötigte Blut wurde in Serumröhrchen aufgefangen und im Anschluss in einer Eppendorf Centrifuge 5424 bei 3000 Umdrehungen/min für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einem Pipetman P1000 abpipettiert und im Konelab 20i photometrisch bestimmt.
27
Die Blutproben für die Bestimmung von VEGF aus Serum wurden jeweils in Serumröhrchen aufgefangen. Für die Bestimmung von VEGF aus Plasma wurden mit 1,6 mg EDTA/ml Blut angereichertem Polypropylenröhrchen genutzt. Alle Blutproben wurden im Anschluss weiter bearbeitet.
3.3.2 Aufbereitung der Proben
VEGF wird sowohl aus Serum als auch teilweise aus Plasma bestimmt. Für die Messung aus Serum müssen die Blutproben zunächst 2 Stunden bei Raumtemperatur gerinnen. Im Anschluss wird das Blut mit der Eppendorf Centrifuge 5424 für 30 Minuten bei 1000 x g zentrifugiert. Das Serum wird daraufhin mit einem Pipetman P200 abpipettiert. Das Serum wird aliquotiert und bei ≤ -20°C eingefroren.
Für die Gewinnung von Plasma wurde EDTA-Blut herangezogen. Dieses wird innerhalb von 30 Minuten nach Gewinnung für 30 Minuten bei 1000 x g in der Zentrifuge Hettich EBA 20 zentrifugiert. Danach wird der Überstand abpipettiert, aliquotiert und bei ≤ -20°C eingefroren.
3.3.3 Prinzip des ELISA zur Bestimmung von VEGF
Bei dem Testsystem „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“ (Fa. R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) handelt es sich um einen Sandwich-ELISA, der die quantitative Bestimmung von VEGF ermöglicht. Die Mikrotiterplatte ist mit Antikörpern beschichtet. Im Falle des „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“ handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch für VEGF ist. In einem ersten Schritt wird ein Probenverdünnungsmittel (Assay Diluent) in jedes Well pipettiert. Im Anschluss folgen dann Standards und Proben. Vorhandenes VEGF wird nun an die immobilisierten Antikörper gebunden. Es schließt sich ein Waschvorgang an, bei dem alle ungebundenen Substanzen entfernt werden. In der Folge wird ein enzymgekoppelter polyklonaler Antikörper, der spezifisch für das bereits im ersten Schritt immobilisierte VEGF ist, hinzugegeben. Dieser bindet an die bestehenden VEGF-Antikörper-Komplexe. Nach einem weiteren Waschvorgang, bei dem nicht gebundene enzymgekoppelte Antiköper entfernt werden, wird eine Substrat-Lösung in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Die an den polyklonalen Antikörper gekoppelte Meerrettichperoxidase reagiert mit dem Substrat. Die enzymatische Reaktion führt zu einem Farbumschlag. Es entsteht der blaue Farbstoff Tetramethylbenzidin. Die Intensität der daraus resultierenden Färbung ist proportional zur Menge des im ersten Schritt gebundenen Analyten. Die Farbreaktion wird durch Zugabe einer Stopplösung gestoppt. Die blaue Farbe schlägt dabei nach Gelb um. Anschließend wird die optische Dichte eines jeden Wells mit einem Photometer gemessen.
28 3.4 Durchführung des ELISA
3.4.1 Testdurchführung „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“
Vor der Durchführung des ELISA werden alle Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht.
Daraufhin werden die Waschlösung sowie der Standard vorbereitet. Für die Waschpufferlösung werden 20 ml des Waschpufferkonzentrates mit 480 ml deionisiertem Wasser vermischt. Der lyophilisierte VEGF-Standard wird in 1 ml Calibrator Diluent RD6U gelöst und für mindestens 15 Minuten stehen gelassen. Es entsteht eine Stammlösung mit einer Konzentration von 2500 mg/ml. Aus dieser Stammlösung wird anschließend eine 2- fache Verdünnungsreihe hergestellt. Dazu werden in 6 Reagiergefäße jeweils 500 µl Calibrator Diluent RD6U vorgelegt. In das erste Reagiergefäß werden außerdem 500 µl der Stammlösung gegeben und gründlich vermischt. Aus diesem Gemisch werden wiederum 500 µl Lösung in das nächste Gefäß übertragen. Diese Prozedur wird mehrfach wiederholt und so entsteht eine Verdünnungsreihe mit den Konzentrationen 1250 pg/ml, 625 pg/ml, 313 pg/ml, 156 pg/ml, 78,1 pg/ml und 39,1 pg/ml. Der unverdünnte VEGF-Standard dient als höchster Standard mit 2500 pg/ml, der Calibrator Diluent RD6U dient als Negativkontrolle mit einer Konzentration von 0 pg/ml.
Danach wird mit der eigentlichen Testdurchführung begonnen. In jedes Well der Mikrotiterplatte werden 100 µl eines Probenverdünnungsmittels (Assay Diluent RD1W) gegeben. Im Folgenden werden jeweils 100 µl Standard oder Proben in die Wells pipettiert und die Platte mit einer selbstklebenden Folie abgedeckt. Es folgt eine zweistündige Inkubationsphase bei Raumtemperatur. Anschließend folgt ein dreimaliger Waschvorgang.
Dafür wird der Inhalt der Wells zunächst ausgeschüttet und die Wells mit je 400 µl Waschlösung befüllt. Die Befüllung erfolgt mittels des Nunc-Immuno ™wash 8 (Fa. NUNC, Wiesbaden). Zur vollständigen Entfernung der Waschlösung nach dem Ausschütten, wird die Mikrotiterplatte auf ein sauberes Papiertuch geklopft. Im Anschluss werden in jedes Well 200 µl VEGF-Konjugat pipettiert. Die Mikrotiterplatte wird mit einer neuen selbstklebenden Folie abgedeckt und erneut für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgt wieder ein dreimaliger Waschvorgang mit Waschpufferlösung. Dann werden 200 µl Substratlösung in jedes Well gegeben. Die Substratlösung wird zuvor aus zwei gleichvolumigen Farbreagenzien (Farbreagenz A und B) hergestellt. Die Substratlösung muss innerhalb von 15 Minuten nach deren Ansatz verwendet werden. Die Mikrotiterplatte wird erneut mit einer frischen selbstklebenden Folie versehen. Es folgt eine 25-minütige Inkubationszeit, die vor Licht geschützt stattfinden muss. Nach Ablauf der 25 Minuten wird die Farbreaktion durch die
29
Zugabe von 50 µl Stopplösung je Well unterbrochen. Die Messung der optischen Dichte soll innerhalb von 30 Minuten nach Abstoppen der Farbreaktion erfolgen. Die Messung erfolgte mithilfe des TECAN GENios Pro (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Österreich) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Korrekturwellenlänge von 570 nm.
3.5 Auswertung
3.5.1 Auswertung des ELISA
Die Auswertung der detektierbaren Farbreaktion erfolgte photometrisch mit Hilfe des TECAN GENios Pro (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Österreich) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Korrekturwellenlänge von 570 nm. Aus der sich hier ergebenden optischen Dichte wurde die Konzentration von VEGF rechnerisch ermittelt.
3.6 Histopathologie
Von den Patienten wurde im Rahmen der Studie Operationsmaterial zur histologischen Diagnostik gewonnen und an die Abteilung Infektionspathologie des Deutschen Primatenzentrums Göttingen (Leiter: Prof. Dr. F.-J. Kaup) zur weiteren Bearbeitung verschickt.
Das in 4 % Formalin fixierte Gewebemateriall wurde routinemäßig in Paraffin im Automaten Shandon Excelsior ES (Fa. Thermo Scientfic, Dreieich) eingebettet, nach laborüblichen Protokoll geschnitten und mit Haematoxylin-Eosin ebenfalls im Automaten (Varistain Gemini, Fa. Thermo Scientfic, Dreieich) gefärbt. Nach Eindecken der Glasobjekträger mit Eukitt wurden die Proben von Fachtierärzten für Pathologie befundet.
3.7 Statistik
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe der Programme SAS-Sytem (Version 9.3, SAS Institute, Cary, NC, USA) und Statistika (Version 10.0; StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA).
Unterschiede zwischen den Gruppen „Hunde mit Milzläsionen/Hunde mit Gesäugetumoren“
bzw. „gesund“ wurden mit dem Fisher´s Exact Test untersucht.
Für den Vergleich der VEGF Konzentrationen zwischen Hunden mit Milzläsionen und gesunder Kontrollgruppe sowie zwischen Hämangiosarkom- und Hämatompatienten wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet.
Zur Beurteilung von Korrelationen wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman angewendet.
Die statistische Signifikanz wurde bei p-Werten < 0,05 angenommen.
30
4 Ergebnisse
Die vorliegenden Ergebnisse wurden in zwei Manuskripten dokumentiert. Das erste Manuskript beschreibt die Messungen zu VEGF im Zusammenhang mit dem Auftreten von Milzveränderungen und vergleicht die Werte von Hämaniosarkomen und Hämatomen. Das zweite Manuskript geht auf den Zusammenhang zwischen VEGF und Mammatumoren ein.
4.1 MANUSKRIPT I
Serum vascular endothelial growth factor in dogs with haemangiosarcoma and haematoma
Meike Frenz1, Franz-Josef Kaup2, Stephan Neumann1
1Tierärztliches Institut, Universität Göttingen, Burckhardtweg 2,
37077 Göttingen, Germany
Tel.: 0551-3933387; Fax : 0551-3913919;
Email: meike.frenz@googlemail.com
2Deutsches Primatenzentrum, Göttingen, Kellnerweg 4,
37077 Göttingen, Germany
31 4.1.1 Abstract
Splenic haemangiosarcoma are frequently seen in dogs. Because of their bad prognosis differentiation from other benign splenic lesions are of prognostic importance.
However, because haemangiosarcoma is a tumour of the vascular system, we hypothesized that vascular endothelial growth factor (VEGF) may play a major role in tumour growth and might thus be increased in the blood of affected dogs.
The aim of this study was to investigate the clinical relevance of differences in serum VEGF concentrations between dogs with splenic haemangiosarcomas and those with non- malignant splenic lesions (haematomas) and healthy subjects using a canine ELISA.
Serum VEGF levels were significantly higher in dogs with splenic masses compared with healthy dogs, but did not differ significantly between dogs with haemangiosarcomas and haematomas.
VEGF has a potential clinical utility as a diagnostic marker for dogs with splenic lesions but may not be useful to differentiate among the various splenic lesions.
Keywords: Vascular endothelial growth factor, Dog, Haemangiosarcoma, Angiogenesis, Spleen, Canine ELISA
4.1.2 Introduction
Angiogenesis is controlled by a multitude of pro- and anti-angiogenic factors. It is essential for tumour growth, especially in tumours greater than 2-3 mm in diameter, in which growth depends on adequate supplies of oxygen and nutrients (Folkman, 1985). Angiogenesis also plays a role in metastasis by providing routes for the dissemination of tumour cells (Folkman, 1975, 1995).
Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a dimeric heparin-binding glycoprotein and is one of the most potent angiogenic growth factors. It is an endothelial-cell-specific mitogen that increases vascular permeability, and is also a survival factor for endothelial cells (Ferrara, 2004). Ferrara (1999) reported that VEGF is a fundamental regulator of normal and abnormal angiogenesis. It is produced and secreted by several cell types including platelets,
32
lymphocytes, neutrophils, macrophages, smooth muscle cells and fibroblasts (Ferrara et al., 1991; Berse et al., 1992). Cellular VEGF expression is stimulated by a variety of factors including hypoxia, inflammatory cytokines, growth factors, hormones and oncogenic mutations, though oxygen tension appears to play a key role in VEGF up-regulation (Ferrara, 2004). VEGF is expressed by a variety of tumors in humans, and high serum levels are often associated with tumor progression, the presence of metastasis, poor prognosis and poor treatment response (Salven et al., 1997; 1998; George et al., 2000; Shimada et al., 2001;
Cooper et al., 2002; Karayiannakis et al., 2002). In addition to tumour cells, tumour- associated stromal cells also secrete VEGF (Fukumura et al., 1998).
Increased serum and/or plasma VEGF concentrations have been found in dogs with haemangiosarcoma, mammary gland tumours, osteosarcoma, lymphoma and other tumour types, suggesting that it may play a role in canine tumour growth and metastasis (Clifford et al., 2001; Gentilini et al., 2005; Kato et al., 2007; Taylor et al., 2007; Thamm et al., 2008;
Sobczynska-Rak, 2009).
VEGF may therefore represent a potential diagnostic marker of malignancy and may have particular relevance in haemangiosarcomas, which are highly malignant and highly vascularised tumours arising from the vascular endothelium. Furthermore, the presence of systemic metastases and local infiltration occur early in the disease, with the lung and liver being the most frequently affected organs (Brown et al., 1985; Hosgood, 1991).
Haemangiosarcomas are the most frequent malignant splenic neoplasms in dogs, and represent about 50% of all splenic neoplasms. However, non-neoplastic or benign lesions occur in over 50% of cases. Non-neoplastic lesions are primarily haematomas or hyperplastic nodules, which are often associated (Prymak et al., 1988; Spangler and Culbertson, 1992; Spangler and Kass, 1997).
The better prognosis of non-neoplastic lesions means that it is clinically relevant to distinguish between malignant and non-malignant splenic masses. There is currently no established method for differentiating between haemangiosarcoma and other splenic lesions, prior to histopathological analysis.
Abdominal radiography and ultrasonography are useful methods for identifying lesions in the spleen when they reach a certain size, but non-malignant splenic lesions such as haematomas, hyperplastic nodules or haemangiomas often appear identical to haemangiosarcomas. In addition, non-invasive fine-needle aspiration of splenic masses is difficult and has a poor sensitivity (Ballegeer et al., 2007).
33
Now, Campos et al. (2012) reported significantly higher VEGF expression in splenic haemangiosarcomas than splenic haemangiomas.
This study therefore investigated the ability of serum VEGF levels to differentiate between splenic haemangiosarcomas and other non-malignant splenic masses in dogs using a canine commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
4.1.3 Materials and methods 4.1.3.1 Animals and samples
Fifteen dogs with splenic masses treated in the Small Animal Clinic of the University of Göttingen were investigated in this prospective study. All dogs underwent splenic surgery with resection of the organ. Dogs with a histological diagnosis of haemangiosarcoma or haematoma were included in the study. Serum samples for measurement of VEGF levels were collected from the cephalic vein prior to surgery.
The dogs with splenic masses were of several different breeds: mixed breed (=5), Golden Retriever (=2), German Shepherd (=1), Australian Shepherd (=1), Hovawart (=1), Border Collie (=1), Dachshund (=1), Giant Schnauzer (=1), Krom (dog) (=1), Jack Russell (=1). The median age of the dogs was 12 years (range, 5-14 years), and 12 of 15 dogs were older than 9 years. Ten male (seven intact and three neutered) and five female (three intact and two neutered) dogs were investigated.
Eight dogs had haematomas and seven had haemangiosarcomas in the spleen. One dog with a haematoma showed simultaneous hyperplastic nodules in the spleen, and three dogs with haemangiosarcomas showed metastases in the liver.
The control group consisted of blood samples from 23 dogs confirmed as healthy based on a physical examination, clinical pathology (complete blood count (CBC), serum chemistry) and abdominal ultrasonography. The control group consisted of 12 female (seven intact and five neutered) and 11 male (eight intact and three neutered) dogs with a median age of 5 years (range, 7 month-13 years). The breeds were: mixed breed (=9), German Shepherd (=3), Jack Russell (=2), Rhodesian Ridgeback (=1), Weimaraner (=1), Bavarian Mountain Scenthound (=1), Australian Shepherd (=1), Bearded Collie (=1), Briard (=1), Dalmatian (=1), Hovawart (=1), and Entlebuch Mountain Dog (=1).
34
All serum samples were kept at room temperature for 2 hours to allow them to clot before centrifugation (30 min, 1000 g), then stored at -20°C until required for analysis. Salven et al.
(1997) reported that serum VEGF concentrations were unaffected by a freeze-thaw cycle.
Biochemical parameters were analyzed according to standardized procedures using an analyser (Konelab 20i; Fa. Thermo Fischer Scientific Inc., Dreieich, Germany) and commercial kits. Haematology parameters were measured using a CellDyn 3500 Analyzer (Fa. Abbott GmbH & Co KG, Wiesbaden, Germany).
Histopathological examinations were performed by a board-certified pathologist (European College of Veterinary Pathologists) using surgical biopsies fixed in 10% buffered formalin, and routinely embedded in paraffin and stained with hematoxylin and eosin.
The best source for measuring VEGF was determined by preliminary analysis of serum and plasma from 10 healthy dogs and 38 dogs with different diseases. VEGF was not detectable in the serum or plasma of healthy dogs. VEGF was detected in the serum of 17 dogs with different diseases, but only in 2 plasma samples. Serum samples were therefore used in the current study.
4.1.3.2 VEGF assay
Serum VEGF levels were measured using a commercially available canine VEGF quantitative ELISA kit (Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) following the manufacturer’s instructions.
In brief, 100 μl of assay diluent was added to each well of a microtitre plate, which had been coated with VEGF-specific monoclonal antibody, followed by the addition of 100 μl of standard or serum sample into each well. The microtitre plates were incubated for 2 hours at room temperature, followed by washing to remove unbound substances. Two hundred microliters of an enzyme-linked polyclonal antibody specific for VEGF were then added to the wells, followed by incubation for 2 hours at room temperature to bind to the immobilized VEGF.
The plates were washed a further three times. Two hundred microliters of substrate solution were then added to the wells and the colour developed in proportion to the amount of VEGF bound in the initial step. The preparation was incubated for 25 minutes at room temperature and was protected from light. Finally, 50 μl of a stop solution was added and the intensity of the colour was measured.
35
Samples were analyzed using a TECAN microplate reader (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Austria) at an optical density of 450 nm and a wavelength correction of 570 nm.
Calibration was performed using a standard series of dilutions of recombinant canine VEGF.
Each standard and sample was conducted in triplicate and the mean values were calculated.
The average optical density value of the zero standard was then subtracted and the optical density of the standard solutions was plotted against their corresponding concentrations to generate a standard curve for the determination of VEGF concentrations for all samples.
According to the manufacturer’s instructions, the assay measures the predominant isoform VEGF164, and the minimum detectable dose of VEGF was defined as typically less than 19.5 pg/ml. The assay shows no cross-reactivity with a series of cytokines and growth factors (R&D Systems). The manufacturer reported mean intra- and inter-assay coefficients of variation were 5.4 and 7.3%, respectively.
Values read as ≤ 0 pg/ml were all considered negative for circulating VEGF.
4.1.3.3 Statistical analysis
Statistical analysis was performed using the program SAS-system (version 9.3, SAS Institute, Cary, NC, USA) and Statistica (version 10.0; StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA). For the purposes of analysis, dogs with VEGF values ≤ 0 pg/ml were set at 0 pg/ml.
VEGF results of dogs with splenic masses and healthy dogs were compared using Fisher’s exact test. VEGF concentrations of dogs with splenic masses and healthy dogs were compared using the Mann-Whitney U test. To compare VEGF level between dogs with haemangiosarcoma and haematomas the Mann-Whitney U test was used, too.
The relationships between white blood cell (WBC) count (reference range, 6-12x103/μl), hematocrit (reference range, 44-52%) and platelet count (reference range, 200-400x10 3/μl) and VEGF concentrations in dogs with splenic masses, were analyzed using Spearman’s rank correlation coefficient.
A P value < 0.05 was considered statistically significant.
4.1.4 Results
Data were inspected for normality and found to be non-normally distributed because of the presence of outliers. Measureable concentrations of VEGF were found in only 2 of 23 serum
36
samples from the healthy dogs included in the study (3 and 17 pg/ml, respectively). In contrast, 10 of 15 dogs with splenic masses had detectable concentrations (4.83 ‒ 183.5 pg/ml), with a mean value of 35 pg/ml.
Dogs with splenic masses showed significantly (P < 0.001) higher levels compared with healthy dogs (Fig. 1).
Based on histopathological examinations, dogs were classified as having either haemangiosarcoma or haematoma. VEGF concentrations in dogs with haemangiosarcoma ranged between 24.8 ‒ 146.3 pg/ml (median 24.8 pg/ml), while concentrations in dogs with haematomas ranged between 4.8 ‒ 183.5 pg/ml (median 12.9 pg/ml) (Fig. 2). These values were not significantly different, suggesting that haemangiosarcomas and haematomas in dogs could not be distinguished on the basis of serum VEGF.
Three dogs with haemangiosarcomas had liver metastases, and these dogs had detectable VEGF concentrations. VEGF detection may therefore be associated with an increased, though not statistically significant risk of advanced stage of disease.
No statistical relationships were identified between serum VEGF levels in dogs with splenic masses and platelet count or hematocrit. However, dogs with splenic masses showed an almost significant positive correlation between WBC count and serum VEGF concentration (P = 0.06).
Only two of the healthy dogs had detectable VEGF concentrations, and the relationships between VEGF concentration and WBC count, hematocrit and platelet count were not tested.
4.1.5 Discussion
In the present study, we evaluated serum VEGF levels in dogs with splenic masses and in healthy controls using a canine ELISA kit, which mainly detects the most abundant VEGF 164 isoform of canine VEGF. This kit has only recently become commercially available, and to our knowledge, there is only 1 study available in veterinary oncology using the same canine ELISA kit (ARESU et al., 2012).
However, several studies have demonstrated increased serum VEGF levels in dogs with different tumor types using a human VEGF ELISA (Gentilini et al., 2005; Kato et al., 2007;
Thamm et al., 2008). This ELISA is designed to measure VEGF 165 levels and its reliability in dogs has already been reported (Troy et al., 2006). Clifford et al. (2001) showed increased plasma VEGF levels in dogs with haemangiosarcomas compared with healthy dogs, but no
37
studies have compared serum VEGF concentrations in dogs with malignant and non- malignant splenic masses.
In this study, serum VEGF concentrations were significantly higher in dogs with splenic masses compared with healthy dogs, which is consistent with the results of other studies in tumour-bearing dogs (Clifford et al., 2001; Kato et al., 2007). Dogs with splenic masses have a higher probability to have detectable serum VEGF concentrations (10/15). In our opinion this could be a consequence of tissue release from the splenic lesions. However, VEGF was detectable in six of eight dogs with haematomas and in four of seven dogs with haemangiosarcomas, suggesting that serum VEGF levels may be not useful for differentiating between haemangiosarcomas and haematomas.
VEGF, as a promoter of tumor angiogenesis, may be especially increased in haemangiosarcoma patients, because of the vascular-endothelial origin of the tumour.
Splenic haemangiosarcomas are often accompanied by a cavernous structure, whereas haematomas are more organized and associated with clotted blood (Spangler and Culbertson, 1992). VEGF may be involved in the pathophysiology and/or the reorganization of an existing haematoma. In a study of chronic subdural haematomas, Nanko et al. (2009) suggested that VEGF was an important element for haematoma development because of its ability to induce angiogenesis and increase vascular permeability. In this case, VEGF was detectable in both haematoma fluid and serum.
In the current study, only two young dogs in the control group (2/23) had detectable concentrations of VEGF. Both (one female mixed breed and one male Bavarian Mountain Scenthound) were intact, under 1 year old, and showed low-grade leukocytosis. Some studies identified a relationship between VEGF concentrations and certain hematologic variables in dogs. Troy et al. (2006) recently demonstrated that increased plasma VEGF was associated with increased WBC and platelet counts in dogs with neoplasia. Clifford et al.
(2001) reported no associations between hematocrit, WBC and platelet counts and increased plasma VEGF concentrations in dogs with haemangiosarcoma.
Serum VEGF concentrations did not correlate with platelet count or hematocrit in the present study, though we did detect a positive correlation between VEGF concentration and WBC counts in dogs with splenic masses (P = 0.06). This observation may account for the detectable VEGF concentrations in the two healthy dogs.
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There has been considerable debate regarding the use of serum or plasma VEGF levels for analysis, because of the release of VEGF by platelets and leukocytes during blood clotting, which may affect circulating serum VEGF concentrations (Banks et al., 1998; Jelkmann, 2001).
Several investigators have suggested that platelets are the main source of VEGF in the serum, and that serum VEGF levels are higher than plasma VEGF levels in individual cancer patients and/or healthy subject (Verheul et al., 1997; Banks et al., 1998; Salven et al., 1999;
Gunsilius et al., 2000). Previous studies have therefore proposed that plasma or whole-blood should be used for the measurement of VEGF (Banks et al., 1998; Webb et al., 1998;
Jelkmann, 2001).
Some authors, however, have used serum VEGF for the measurement of circulating VEGF in cancer patients. Although serum VEGF concentration may be affected by the platelet count, this platelet-derived VEGF also reflects the biology of the tumour cells (Lee et al., 2000).
Platelets may store circulating VEGF secreted by the tumor. This theory is based on the finding that platelets from cancer patients contained more VEGF than those from healthy controls (Salven et al., 1999; Salgado et al., 2001). A study by George et al. (2000) supported the hypothesis that platelets store circulating tumour-derived VEGF, because VEGF concentration per platelet increased with advancing stage in colorectal cancer patients, and the median platelet VEGF load was higher in cancer patients than in patients with benign disease.
Another study showed that the platelet load of VEGF correlated with tumour VEGF expression, and therefore supported the use of serum VEGF, instead of plasma VEGF, for evaluating circulating VEGF, because of its greater biological significance (Poon et al., 2003).
Taylor et al. (2007) showed that serum and plasma concentrations of VEGF were significantly correlated in dogs with oral malignant melanoma, suggesting that serum or plasma could be used with similar results.
It is important to recognize that measured serum concentrations of VEGF include both freely circulating VEGF and VEGF stored in platelets or leukocytes, which is released during the clotting process.
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The highest serum VEGF value measured in the dogs with splenic masses was 183.5 pg/ml.
This dog, which had a splenic haematoma, also had a pancreatitis. VEGF up-regulation has been implicated in various inflammatory diseases, and recent studies demonstrated significantly elevated serum VEGF levels in patients with acute and chronic pancreatitis compared to a healthy control group (Ueda et al., 2006; Talar-Wojnarowska et al., 2010).
It is therefore not clear which disease was responsible for the high serum VEGF concentration in this dog.
The undetectable serum VEGF concentrations in some dogs with splenic masses (5/15) may have been a consequence of measuring the VEGF 164 isoform, which may not be the dominant angiogenic factor in haemangiosarcomas and haematomas. Five isoforms of VEGF are generated in dogs by alternative splicing (VEGF 120, VEGF 144, VEGF 164 and VEGF 188, VEGF 205), of which VEGF 164 is the predominant isoform (Scheidegger et al., 1999).
The manufacturer reported that the ELISA kit measured VEGF 164 because this was the dominant isoform in dogs. Other isoforms may have been present, but these were not tested for.
Further studies should investigate the possible roles of other pro-angiogenic factors, such as basic fibroblast growth factor, in tumour angiogenesis.
In conclusion, we measured serum VEGF concentrations in healthy dogs and dogs with splenic masses, using a commercial canine ELISA kit. Serum VEGF concentrations were significantly increased in dogs with splenic masses, but it was not possible to differentiate between dogs with haemangiosarcomas and haematomas on the basis of VEGF levels.
This study was limited by the low number of investigated dogs and the lack of the analysis of tissue VEGF expression to complement the serum VEGF levels within individual dogs.
Further evaluation of VEGF concentrations in a larger population of dogs with non-malignant and malignant splenic masses, and in dogs with haemangiosarcomas in different stages of the disease may help to detect the diagnostic and prognostic values of VEGF.
