Versuchsanordnung

Zu Beginn der Studie wurden alle Tiere einer allgemeinen und einer speziellen gynäkologischen Untersuchung unterzogen. Die Kühe wurden nach dem Zufalls-prinzip in zwei Gruppen eingeteilt (Gruppen 1 und 2). Nach einem modifizierten Latin Square Modell durchliefen die Tiere beider Gruppen drei verschiedene Versuchs-modelle (Abb. 2.1): ein unstimuliertes Modell (U-Modell), ein Superovulationsmodell (S-Modell) und ein Kontrollsuperovulationsmodell (KS-Modell). Sowohl in Gruppe 1 als auch in Gruppe 2 durchliefen die Tiere zunächst das U-Modell. Nach Abschluss des U-Modells wurde ein spontaner Brunstzyklus abgewartet und im Anschluss daran in Gruppe 1 mit dem S-Modell und in Gruppe 2 mit dem KS-Modell begonnen.

Anschließend wurden zwei spontane Brunstzyklen abgewartet. Daraufhin durchliefen die Kühe der Gruppe 1 das KS-Modell und diejenigen der Gruppe 2 das S-Modell.

Superovulations-(S)-Modell Kontrollsuperovulations-(KS)-Modell

1 spontaner Brunstzyklus 2 spontane Brunstzyklen2 spontane Brunstzyklen 1 spontaner Brunstzyklus 2 spontane Brunstzyklen2 spontane Brunstzyklen

Unstimuliertes-(U)-Modell

Unstimuliertes-(U)-Modell Gruppe 2:

Gruppe1:

Abb. 2.1: Schematische Darstellung der zeitlichen Abfolge der Versuchsmodelle in den Gruppen 1 und 2.

2.2.1 Versuchsmodelle Unstimuliertes-Modell (U-Modell)

In diesem Modell wurde zunächst der Zyklus der Tiere mittels transrektaler Palpation und sonographischer Untersuchung des Uterus und der Ovarien im Abstand von jeweils 2 Tagen verfolgt. Kamen die Tiere in die Phase des Proöstrus, erkennbar an einer zunehmenden Uteruskontraktilität, einer Größenzunahme des dominanten Follikels auf > 10 mm Durchmesser und einer Rückbildung des Gelbkörpers auf einen Durchmesser < 15 mm, so wurden die Tiere dreimal täglich für jeweils 10 Minuten beobachtet, um den Eintritt der Brunst festzustellen. Sobald die Tiere Auf-sprungversuche anderer Tiere duldeten, und den Abgang von Brunstschleim zeigten, wurden sie jeweils 12 und 24 Stunden später mit Tiefgefriersperma (20 x 10⁶ Sper-mien in 230 µl Verdünner) künstlich besamt (Tag der ersten Besamung = Tag 0;

Abb. 2.2). Das für die künstliche Besamung (KB) eingesetzte Tiefgefriersperma stammte von einem fertilen Bullen der Rasse Deutsches Fleckvieh. Sieben Tage nach der ersten KB erfolgte bei den Tieren eine Uterusspülung zur Gewinnung der Eizellen/Embryonen. Unmittelbar im Anschluss an die Uterusspülung wurden aus beiden Uterushörnern Endometriumsbiopsien entnommen. Im Anschluss daran wurde den Kühen zur Einleitung der Luteolyse ein Prostaglandinanalogon (500 µg Cloprostenol-Natriumsalz, Estrumate^®, Essex, München, DE) intramuskulär verabreicht.

Der Blutfluss in der rechten und linken A. uterina wurde zum ersten Mal zum Zeitpunkt des Brunstbeginns (Tag -0,5), also 12 h vor der ersten künstlichen Besa-mung (Tag 0), mittels Farbdopplersonographie untersucht. Die weiteren doppler-sonographischen Untersuchungen fanden 1, 3, 5 und 7 Tage nach der ersten Besa-mung statt (Abb. 2.2). Nach der letzten Blutflussmessung an Tag 7 wurde mittels B-Mode Sonographie die Lokalisation und Anzahl der Gelbkörper auf den Ovarien festgestellt.

Stunden nach Brunstbeginn: 0 12

Tag -0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 2 x KB in 24 h

Dopplersonographie u. BE Dopplersonographie u. BE

Uterusspülung Endometriumsbiopsie

BE = Blutentnahme

Stunden nach Brunstbeginn: 0 12

Tag -0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 2 x KB in 24 h

Dopplersonographie u. BE Dopplersonographie u. BE

Uterusspülung Endometriumsbiopsie

BE = Blutentnahme

Abb. 2.2: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der künstlichen Besamung (KB), der dopplersonographischen Untersuchungen und der Probengewinnung im unstimulierten (U)-Modell. Tag der 1. KB = Tag 0.

Superovulations (S)-Modell u. Kontrollsuperovulations (KS)-Modell

Zu Beginn dieser Modelle wurde, wie oben bereits beschrieben, der Zyklusstand der Tiere bestimmt. Sobald die Tiere in Brunst kamen, wurden die Ovarien alle 12 Stun-den zur Bestimmung des Ovulationszeitpunktes sonographisch untersucht. Die Ovulation war als der Zeitpunkt definiert, an dem der dominante Follikel zum ersten Mal nicht mehr dargestellt werden konnte. Sowohl im S- als auch im KS-Modell wurde zwischen dem 9. und 12. Tag nach der Ovulation mit dem Follikel stimulierenden Hormon (FSH) eine Superovulationsbehandlung eingeleitet (Abb.

2.3), nachdem zwei Tage vorher mittels transvaginaler Follikelpunktion unter Ultraschallkontrolle alle Follikel > 8 mm entfernt worden waren. Im S-Modell wurden die Kühe 36, 48 und 60 h nach der letzten FSH-Behandlung mit Tiefgefriersperma (20 x 10⁶ Spermien in 230 µl Verdünner) eines fertilen Bullen der Rasse Deutsches Fleckvieh besamt. Um eine Besamung zu simulieren, ohne jedoch eine mögliche Befruchtung auszulösen, wurden die Tiere im KS-Modell zu denselben Zeitpunkten wie im S-Modell jeweils mit 230 µl einer Mischung aus 8 % Seminalplasma und 92 % Spermaverdünner desselben Bullen ,,schein-besamt’’. Auch in diesen beiden Ver-suchsmodellen erfolgte sieben Tage nach der ersten Besamung/Scheinbesamung eine Uterusspülung zur Gewinnung der Eizellen/Embryonen und im Anschluss daran eine Biopsieentnahme aus dem Endometrium des rechten und linken Uterushorns.

Um eine Luteolyse einzuleiten wurde den Tieren im Anschluss an die Uterusspülung ein Prostaglandinanalogon (500 µg Cloprostenol-Natriumsalz, Estrumate^®, Essex, München, DE) intramuskulär verabreicht.

Der Blutfluss in der rechten und linken A. uterina wurde zum ersten Mal 12 h vor (Tag -0,5) der ersten Besamung bzw. Scheinbesamung (Tag 0) mittels Farbdoppler-sonographie untersucht. Die weiteren dopplersonographischen Untersuchungen fanden 1, 3, 5 und 7 Tage nach der ersten Besamung/Scheinbesamung statt (Abb.

3.3). Nach der letzten Blutflussmessung an Tag 7 wurde mittels B-Mode Sonographie die Lokalisation und Anzahl der Gelbkörper auf den Ovarien festgestellt.

Tag -0,5 0 1 2 3 4 5 6 7

Abb. 2.3: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der hormonellen Behandlung, der künstlichen Besamung (KB) bzw. der Schein-Besamung (SB), der dopplersonographischen Untersuchungen und der Probengewinnung im Superovulations (S)-Modell und im Kontroll-superovulations (KS)-Modell. Tag der 1. KB/SB = Tag 0.

2.2.2 Superovulationsbehandlung

Sowohl im S- als auch im KS-Modell wurde im Diöstrus zwischen dem 9. und 12. Tag post ovulationem mit der Superovulationsbehandlung begonnen (Abb. 2.3). Hierzu erhielten die Tiere zweimal täglich, um 8 Uhr und um 20 Uhr, über vier Tage hinweg eine Gesamtmenge von 400 IU porzinem FSH (Pluset^®, Chargennr.: 0807092, Calier, Barcelona, Spanien) in Form intramuskulärer Injektionen. Am ersten Tag der Superovulationsbehandlung wurden den Tieren 150 IU/d, am zweiten 120 IU/d, am dritten 80 IU/d und am vierten Tag 50 IU/d FSH verabreicht. Zur Luteolyse wurde den Kühen am vierten Tag der FSH Applikation zeitgleich mit den beiden FSH Injektionen jeweils ein Prostaglandinanalogon (500 µg Cloprostenol-Natriumsalz, Estrumate^®, Essex, München, DE) intramuskulär injiziert.

Zusammen mit der zweiten Besamung im S-Modell und der zweiten Scheinbesamung im KS-Modell erhielten die Tiere eine intramuskuläre Injektion

eines synthetischen Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH) (20 µg Buserelin, Receptal^®, Intervet, Unterschleißheim, DE).

2.2.3 Kriterien im Versuchsmodell

Um das nächste Versuchsmodell durchlaufen zu können mussten die Tiere im U-Modell in der am Tag 7 gewonnen uterinen Spülflüssigkeit einen transfertauglichen Embryo aufweisen. Die Einteilung der Embryonen erfolgte nach den Richtlinien der International Embryo Transfer Society (IETS) (ROBERTSON u. NELSON 1998) (Tabelle 2.1). Embryonen der Qualitätsklassen 1 und 2 wurden als transfertauglich angesehen. Wurde dieses Ziel nicht erreicht, musste das U-Modell nach einem spontanen Brunstzyklus wiederholt werden. War auch nach dreimaliger Wieder-holung des U-Modells kein transfertauglicher Embryo in der Spülflüssigkeit zu finden, wurde nach einem spontanen Brunstzyklus mit dem nächsten Modell begonnen.

Im S-Modell mussten am Tag 7 nach der Besamung mindestens vier transfertaug-liche Embryonen in der Uterusspülflüssigkeit vorhanden sein, um dieses Versuchs-modell als erfolgreich zu werten. War dies nicht der Fall, wurde das S-Modell nach zwei spontanen Brunstzyklen noch einmal wiederholt. Wurden auch bei dieser Spülung nicht mindestens vier transfertaugliche Embryonen nachgewiesen, wurde das Tier aus der Studie ausgeschlossen.