Tierärztliche Hochschule Hannover
Einfluss des IGF-I Systems auf die uterine Involution beim Rind
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin oder eines Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Karolin Krach
Celle
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Heinrich Bollwein Klinik für Rinder
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Heinrich Bollwein
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Anne-Rose Günzel-Apel
Tag der mündlichen Prüfung: 23.04.2012
Diese Arbeit wurde unterstützt von Pfizer.
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung...1
2 Literatur...3
2.1 Das Puerperium ...3
2.2 Beurteilung der Uterusinvolution unter Anwendung verschiedener Untersuchungsmethoden ...4
2.2.1 Transrektale Palpation ...4
2.2.2 B-Mode Sonographie ...4
2.2.3 Intrauterine Druckmessung...5
2.2.4 Elektromyographie...6
2.2.5 Dehnungsmessstreifen ...7
2.2.6 Sonomikrometrie...8
2.3 Bedeutung ausgewählter Blutparameter / Hormone für das Puerperium ...10
2.3.1 Calcium...10
2.3.2 Freie Fettsäuren und β-Hydroxy-Buttersäure ...11
2.3.3 Hormone ...11
2.4 IGF-I System ...12
2.4.1 Struktur und Funktion des IGF-I Systems ...12
2.4.2 Bedeutung von IGF-I für die uterine Involution ...14
3 Material und Methoden ...16
3.1 Versuchstiere ...16
3.2 Fütterung und Haltung ...16
3.3 Einteilungen der Versuchsgruppen ...16
3.4 Versuchsaufbau und zeitlicher Verlaufsplan ...17
3.5 Messgeräte und räumliche Anordnung ...20
3.6 Prinzip der sonomikrometrischen Messung und Einstellungen ...22
3.7 Implantation des sonomikrometrischen Messsystems ...23
3.7.1 Vorbereitung ...23
3.7.2 Operation ...24
3.8 Geburtsablauf...27
3.9 Behandlung von Erkrankungen im Versuchszeitraum...27
3.10 Durchführung der Sonomikrometrie ...28
3.10.1 Speicherung und Auswertung der Messungen ...28
3.10.2 Fixation der Kristalle ...30
3.11 Transrektale Sonographische Untersuchung ...31
3.11.1 Geräte...31
3.11.2 Strukturen am Uterus und Ovar ...31
3.12 Blutentnahme ...33
3.12.1 Parameter ...33
3.13 Endometriumbiopsie ...34
3.13.1 Entnahmetechnik ...34
3.13.2 Untersuchung der Probe...34
3.14 Kontrollgruppe...35
3.14.1 Tiere, Haltung und Fütterung ...35
3.14.2 Untersuchungen ...35
3.15 Statistische Auswertung ...36
4 Ergebnisse...37
4.1 Anzahl und Einteilung der Versuchstiergruppen ...37
4.2 Alter und Anzahl der Laktationen ...37
4.3 Methodik...37
4.4 Erkrankungen des Genitalapparates...39
4.4.1 Puerperalstörungen ...39
4.4.2 Histologische Befunde der Endometriumsbiopsien...39
4.5 Erkrankungen anderer Organsysteme ...40
4.6 Geburtshilfliche Parameter...41
4.6.1 Trächtigkeitstage ...41
4.6.2 Geburtshilfe ...41
4.6.3 Kälber ...42
4.7 Milchmenge...43
4.8 Sonomikrometrie ...44
4.9 Vergleich der sonographischen Befunde beider IGF-I Gruppe...46
4.9.1 Zervixdurchmesser ...47
4.9.2 Durchmesser des Corpus uteri ...48
4.9.3 Gesamtfläche des Corpus uteri ...49
4.9.4 Endometriumfläche des Corpus uteri...51
4.9.5 Durchmesser des ehemals graviden Uterushorns ...52
4.9.6 Gesamtfläche des ehemals graviden Uterushorns ...53
4.9.7 Endometriumfläche des ehemals graviden Uterushorns ...55
4.9.8 Durchmesser des nichtgraviden Uterushorns ...56
4.9.9 Gesamtfläche des nichtgraviden Uterushorns ...57
4.9.10 Endometriumfläche des nichtgraviden Uterushorns ...58
4.9.11 Ovarien ...60
4.10 Vergleich der sonographischen Befunde von Versuchs- und Kontrollgruppe...60
4.10.1 Zervixdurchmesser ...60
4.10.2 Durchmesser des Corpus uteri ...62
4.10.3 Gesamtfläche des Corpus uteri ...63
4.10.4 Endometriumfläche des Corpus uteri...64
4.10.5 Durchmesser des ehemals graviden Uterushorns ...66
4.10.6 Gesamtfläche des ehemals graviden Uterushorns ...67
4.10.7 Endometriumfläche des ehemals graviden Uterushorns ...69
4.10.8 Durchmesser des nichtgraviden Uterushorns ...70
4.10.9 Gesamtfläche des nichtgraviden Uterushorns ...72
4.10.10 Endometriumfläche des nichtgraviden Uterushorns ...73
4.10.11 Ovarien ...75
4.11 Blutparameter...75
4.11.1 Calcium...75
4.11.2 ß-Hydroxy-Butter-Säure...76
4.11.3 Freie Fettsäuren ...77
4.11.4 Gesamtöstrogen ...78
4.11.5 Progesteron ...80
4.11.6 15-Keto-13,14-Dihydro-Prostaglandin-F2α-Metabolit...81
4.11.7 Insulin-like Growth Faktor-I ...82
5 Diskussion ...85
5.1 Fixation der Kristalle...86
5.2 Erkrankungen des Genitalapparates...87
5.3 Erkrankungen anderer Organsysteme ...87
5.4 Geburtshilfliche Parameter...88
5.5 Milchmenge...89
5.6 Sonomikrometrie ...90
5.7 Vergleich der sonographischen Befunde beider IGF-I Gruppe...92
5.8 Vergleich der sonographischen Befunde von Versuchs- und Kontrollgruppe...93
5.9 Ovulationen ...94
5.10 Calcium ...95
5.11 Freie Fettsäuren und ß-Hydroxy-Buttersäure...95
5.12 Gesamtöstrogen, Progesteron, PGFM...96
5.13 Insulin-like Growth Faktor-I ...97
6 Zusammenfassung...99
7 Summary...101
8 Anhang...103
9 Literaturverzeichnis ...148
10 Abkürzungsverzeichnis ...161
11 Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen...165
1 Einleitung
Das Puerperium ist ein kritischer Zeitraum im Reproduktionszyklus des Rindes (38).
In dieser Phase findet die Größenreduktion des Uterus, die Regeneration des Endometriums, die Elimination der bakteriellen Kontamination und das Einsetzen der zyklischen Ovaraktivität statt (104). Puerperale Störungen, wie Nachgeburtsverhaltungen und Metritiden führen zu einer verzögerten Involution und im Folgenden zu einer verminderten Reproduktionsleistung (21,87,100).
Pathologische Prozesse in diesem Zeitraum haben somit einen relevanten Einfluss auf die Wirtschaftlichkeit der Milchviehhaltung und können hohe Kosten durch mehrfache Besamungen, Behandlungen, Remontierung und Einbußen in der Milchleistung verursachen (62).
Um das puerperale Geschehen beurteilen zu können ist eine objektive Erfassung der uterinen Involution wichtig. Zur Beurteilung der Uterusinvolution gibt es eine Reihe von Studien mit unterschiedlichen Methoden. Neben der transrektalen manuellen Untersuchung (80) wurden die Ultrasonographie (8,59,78,86,114), die Elektromyographie (26,50), die intrauterine Druckmessung (4,6), sowie die Messung mittels Dehnungsmessstreifen (15,17,40) durchgeführt. Alle oben genannten Methoden haben den Nachteil, dass sie keine objektiven Daten über die tatsächliche Größenabnahme im gesamten Puerperium liefern. Mittels Sonomikrometrie hingegen ist es erstmals möglich, die uterinen Größenverhältnisse über den gesamten Verlauf des Puerperiums objektiv zu erfassen und zu dokumentieren (9,67).
Der Verlauf des Puerperiums wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst. Neben der Futteraufnahme (41,125) spielt die Höhe der Milchleistung und somit die Energiebilanz eine große Rolle (61,113,122). Diese Faktoren stehen in engem Zusammenhang mit dem Insulin-like Growth Factor (IGF)-System (70,93).
Individuelle Unterschiede in den IGF-I Spiegeln scheinen genetisch bedingt zu sein und sind bereits ante partum (a.p.) zu beobachten (28). Post partum (p.p.) hängt nicht nur das Einsetzen des Zyklus, sondern auch die uterine Involution von der Höhe der IGF-I Spiegel im peripartalen Zeitraum ab (113). Für eine Beteiligung des IGF-Systems an uterinen Umbauprozessen im Puerperium spricht der Nachweis von
einigen seiner Komponenten im uterinen Gewebe (70). Außerdem wurden bei Kühen mit Metritiden niedrigere IGF-I Spiegel im Plasma gemessen als bei gesunden Tieren (120).
Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob der IGF-I Spiegel a.p. Auswirkungen auf die uterine Involution beim Rind hat.
2 Literatur
2.1 Das Puerperium
Das Puerperium beginnt mit dem Abgang der Nachgeburt (117) und ist nach vollständiger funktioneller und morphologischer Wiederherstellung des Uterus etwa 40 bis 42 Tage post partum (p.p.) abgeschlossen (39,59,86). Die Involution des Uterus wird von verschiedenen Faktoren, wie der Jahreszeit, der Anzahl der Kalbungen, Stress (71), sowie Uterusinfektionen, Nachgeburtsverhaltungen oder Fehlstellungen des Damms beeinflusst (39).
Die Uterusinvolution unterteilt sich in drei parallel ablaufende Prozesse: die Größenreduktion mit Kontraktionen, Gewebeverluste in Form von Nekrosen und Desquamation des Karunkelgewebes und die Reparatur des Endometriums (39,104,117).
Generell stellen die ersten Tage direkt nach der Geburt den Zeitraum der größten Abnahme in Länge, Durchmesser und Gewicht dar, wobei abgehende Lochien einen wesentlichen Beitrag leisten. Laut Gier und Marion (39) zeigt das ehemals tragende Uterushorn während der Involution am 15. Tag p.p. noch die Hälfte und am 30. Tag p.p. noch ein Drittel seiner Ausgangslänge, während der Durchmesser bereits am 5. Tag p.p. auf 50% reduziert war. Von den 9 kg Durchschnittsgewicht des Uterus direkt nach der Geburt fand eine Gewichtsabnahme auf 1 kg am 30. Tag p.p. und weiter auf 0,75 kg am 50. Tag p.p. statt. Andere Studien beschreiben hingegen eine eher langsame Involution in den ersten vier bis neun Tagen p.p. und eine schnelle Reduktion der Horndurchmesser mit gleichzeitiger Zunahme des uterinen Tonus zwischen den Tagen 10 und 14 (80). Kundig et al. (68) beobachteten unmittelbar nach der Geburt eine uterine Kontraktionsfrequenz von 20 bis 30 Kontraktionen pro Stunde, die sich zwischen dem ersten und vierten Tag p.p. auf eine bis zwölf Kontraktionen pro Stunde verringerte. Vom 5. bis 12. Tag waren nur noch 0,2 bis 0,5 Kontraktionen pro Stunde zu beobachten. Ab dem 13. Tag p.p.
erhöhte sich die Frequenz der Kontraktionen dann wieder auf zwei bis drei Mal pro
Stunde. Die abnehmende Kontraktionsfrequenz in den ersten zwei Wochen p.p. ist dabei auf die sinkenden Östrogengehalte im Blut zurückzuführen.
Die histologischen Regenerationsprozesse beginnen am fünften Tag p.p. mit einer Nekrose der Karunkeln. Um den 11. bis 12. Tag nach der Geburt kommt es dann zur Ablösung der Gewebestücke und bis zum 25. Tag zur Reepithelisierung. Das interkarunkuläre Endometrium hingegen ist bereits acht Tage nach der Geburt vollständig regeneriert (39).
2.2 Beurteilung der Uterusinvolution unter Anwendung verschiedener Untersuchungsmethoden
2.2.1 Transrektale Palpation
Die transrektale Palpation stellt eine einfache Methode zur Beurteilung der Uterusinvolution dar (81). Es können zuverlässige Aussagen über die Größe, Kontraktilität, Symmetrie und Fluktuation des Uterus gemacht werden (45). Als nachteilig erweist sich die eingeschränkte Erreichbarkeit des Organs in den ersten Tagen p.p. und eine generelle Ungenauigkeit (8) und Subjektivität (86) der Beurteilung. In einigen Studien war die uterine Involution um den 40. bis 42. Tag p.p.
abgeschlossen (39,59,86). Andere Autoren hingegen kommen zu abweichenden Ergebnissen. Nach Morrow et al. (80) ist die Involution bei gesunden Tieren um den 25. Tag p.p. und bei Tieren mit postpartalen Störungen am 30. Tag p.p. beendet.
Marion et al. (71) stellten fest, dass die uterine Involution bei pluriparen Kühen (bis zum 40. Tag p.p.) länger dauert als bei primiparen Kühen (bis zum 35. Tag p.p.).
2.2.2 B-Mode Sonographie
Die transrektale Ultraschalluntersuchung stellt ein geeignetes Mittel zur objektiven Beurteilung der uterinen Involution dar (86). Auch in den mit dieser Methode
durchgeführten Studien war die uterine Involution zwischen dem 40. und 42. Tag p.p.
abgeschlossen (59,86). Dabei haben sich Kamimura et al. (59) auf die Beurteilung der Endometriumfläche der Uterushörner (gesamte Qerschnittsfläche abzüglich der Fläche des Lumens) beschränkt, während Okano und Tomizuka (86) darüber hinaus noch den Durchmesser und die gesamte Querschnittsfläche der Uterushörner herangezogen haben.
Mittels B-Mode Sonographie ist nicht nur die Größe des Uterus p.p., sondern auch Art und Menge evtl. vorliegenden Inhalts bestimmbar (8). Als diagnostischen Beweis für das Vorliegen einer Endometritis werteten Bekana et al. (8) schneegestöberartige Flüssigkeit im Uteruslumen und eine Verdickung des Endometriums und der gesamten Uteruswand. Laut Mee et al. (76) ist der Uterus voll zurückgebildet, wenn keine oder wenig anechogene Flüssigkeit vorhanden ist. Das Endometrium ist gefaltet und bildet ein radspeichenförmiges Lumen. Das Vorliegen einer Endometritis unterschiedlichen Grades ist nach Ansicht der letztgenannten Autoren durch ein sternförmig erweitertes Lumen, welches mit echogener Flüssigkeit ausgefüllt ist, charakterisiert.
Nach Griffin und Ginther (42) kann die Ultraschalluntersuchung oft und über eine längere Dauer ohne Störung des Involutionsgeschehens angewendet werden.
Nachteile bestehen aber in der Schwierigkeit, einheitliche Messpunkte zu definieren und dem Problem, dass der Uterus in den ersten Tagen p.p. mittels transrektaler Sonographie nicht komplett darstellbar ist (78).
2.2.3 Intrauterine Druckmessung
Bei der intrauterinen Druckmessung wird mittels transcervical in den Uterus eingeführter Katheter die Kontraktilität gemessen. Es werden geschlossene und offene Katheter sowie Mikrotransducer Systeme unterschieden. Beim geschlossenen System ist der Katheter mit einem flüssigkeitsgefüllten Ballon verschlossen. Er nimmt intrauterin liegend Druckänderungen auf, die graphisch dargestellt werden (30,31).
Ein spezielles geschlossenes System besteht aus einem Mikroballon, der in die
Schleimhaut des Uterus implantiert wird (40). Das offene System arbeitet mit einem nicht verschlossenen Katheter, der mit einer bekannten Menge einer Flüssigkeit gefüllt und mit einem Druckwandler verbunden wird. Über die Flüssigkeitssäule wird so die Druckänderung aufgenommen (4-6). Bei den oft gebrauchten Mikrotransducern befindet sich am vorderen Ende des Katheters ein Drucksensor, der den Druck direkt via Silikonmembran detektiert (53,54,98,99). Bajcsy et al. (4) führten Druckmessungen mit einem offenen Tip-Katheter in den ersten 48 Stunden p.p. an zwölf Kühen durch. Dabei zeigte sich über die Zeit eine signifikante Abnahme der durchschnittlichen Frequenz, Amplitude und der Fläche unter der Kurve, wobei eine große interindividuelle Variabilität in den Kontraktilitätsparametern bestand.
Ferner haben Bajcsy et al. (6) bei fünf Kühen vor der Geburt zusätzlich zur Druckmessung zwei elektromyographische Elektroden unter die Serosa des tragenden Horns platziert. Sie stellten bei diesen Untersuchungen hohe Korrelationen zwischen den Änderungen im Druck und in den Membranpotentialen fest.
Generell handelt es sich bei der intrauterinen Druckmessung um eine einfach anzuwendende, wenig invasive Methode (4), die prinzipiell für die Erfassung uteriner Aktivität im postpartalen Zeitraum unter Stallbedingungen geeignet ist. Allerdings können zwar Uteruskontraktionen zuverlässig erfasst werden, jedoch erlaubt diese Methode keine Rückschlüsse auf den Ort der Kontraktion und die dabei eintretende Größenveränderung des Uterus (24).
2.2.4 Elektromyographie
Die Elektromyographie (EMG) ist die Messung einer elektrischen Potentialdifferenz in der Muskulatur mittels Elektroden (26). Ein Zusammenhang zwischen der Ausbreitung einer elektrischen Erregung und der mechanischen Aktivität der Muskulatur wurde von Toutain et al. (115) sowie von Csapo und Takeda (25) nachgewiesen. Dabei können jedoch keine Aussagen getroffen werden, ob sich die mittels EMG erfasste Erregung als Muskelaktivität in longitudinaler oder circulärer
Richtung ausbreiten, eine tonische oder phasische Aktion darstellt und ob es sich bei der Aktivität des Myometriums um Kontraktionen oder Expansionen handelt (1). Van Engelen et al. (118) führten über 48 Stunden EMG-Messungen am Uterus des Rindes im postpartalen Zeitraum durch. Direkt nach der Geburt waren einzelne Bursts (jeweils eine Aktivitätsserie von mindestens drei dicht aufeinander folgenden bipolaren Voltänderungen) mit dazwischen liegenden inaktiven Phasen zu beobachten, wobei Dauer und Amplitude der Bursts konstant waren. Im weiteren Verlauf nahm die Amplitude stetig um insgesamt etwa 50% ab. Die Frequenz blieb in der ersten Stunde p.p. mit 19,8 Bursts pro Stunde konstant hoch, nahm dann aber bis zum Ende der Messungen (nach 48 Stunden) um 11% ab. Die EMG-Aktivität reduzierte sich über den gesamten Versuchszeitraum insgesamt um 59%.
Daberitz et al. (26) gaben als Nachteil der EMG an, dass der Betrieb von elektrischen Geräten in der Umgebung zu Störsignalen führen kann. Weiterhin kann eine Messung erst erfolgen, wenn die Elektroden an der Implantationsstelle bindegewebig organisiert sind, wobei die Invasivität der Methode ebenfalls als Nachteil zu werten ist (1). Die Autoren kamen aber zu dem Schluss, dass die EMG im Vergleich zu intraluminalen Druckmessungsmethoden einheitlichere und genauere Ergebnisse liefert.
2.2.5 Dehnungsmessstreifen
Das Funktionsprinzip der Dehnungsmessstreifen beruht darauf, dass sich deren Widerstand bei Dehnung oder Stauchung z.B. infolge von Kontraktionen ändert (17).
Burton et al. (15) haben bei zwölf Kühen mit und ohne Nachgeburtsverhaltung direkt nach der Geburt je vier Messdehnungsstreifen auf das zuvor tragende Uterushorn platziert. Eine Behandlung mit einem synthetischen Prostaglandin-F2α Analogon hatte in den Stunden 12, 36, 60 und 84 p.p. keinerlei Auswirkungen auf die uterine Aktivität. Jedoch wiesen Kühe mit Nachgeburtsverhaltung eine erhöhte Frequenz an uterinen Kontraktionen und eine schnellere tubo-zervikale Ausbreitung der Kontraktionswellen auf als Tiere mit rechtzeitiger Ablösung der Plazenta. In einer
ähnlichen Untersuchung führte Östradiol-Cypionat, das 18 Stunden p.p. verabreicht worden war, zu einer Abnahme der Frequenz, Amplitude und Koordinierung der Uteruskontraktionen (13).
Ein Vorteil der Beurteilung der uterinen Aktivität mittels Dehnungsmessstreifen gegenüber der intratuterinen Druckmessung besteht darin, dass mit der erstgenannten Methode nicht in das Uteruslumen eingegangen werden muss und daher eine Messung über ein längeres Zeitintervall möglich ist. Nachteile der Methode mit Dehnungsmessstreifen sind die Invasivität des Eingriffs und die Oxidation der Elektroden bei längerer Nutzungsdauer (17). Unter Berücksichtigung dieser Faktoren halten die Autoren eine Messdauer von zwei bis drei Stunden täglich über die Dauer eines Zyklusintervalls für möglich. Dehnungsmessstreifen gelten als gut geeignetes System für die Detektion von Uteruskontraktionen (14), die Größenänderung des Organs im Verlauf der Uterusinvolution kann jedoch nicht erfasst werden (68).
2.2.6 Sonomikrometrie
Bei der Sonomikrometrie (SMM) wird eine Streckenmessung mittels Ultraschallwellen durchgeführt. Ein Sonomikrometer besteht aus mindestens zwei Kristallen, einer Sendeempfangseinheit und einem Computer. Jeder Kristall kann sowohl als Sender als auch Empfänger fungieren. Durch Anlegen einer Spannung an einen Kristall kommt es zu dessen Verformung und somit zur Abgabe von Ultraschallwellen. Diese durchqueren das Gewebe, treffen auf den anderen Kristall, verformen diesen und erzeugen eine Spannung, die in Volt messbar ist. Die Schallgeschwindigkeit ist im Weichteilgewebe mit 1540 m/s konstant hoch, so dass aus der gemessenen Zeit für die Gewebedurchquerung der Ultraschallsignale die Entfernung der Kristalle voneinander berechnet werden kann. Durch verschiedene Kombinationen von Kristallen und den wechselnden Einsatz der Kristalle als Sender und Empfänger kann mit entsprechender Software ein dreidimensionales Bild vom untersuchten Organ erzeugt werden. Zu beachten ist, dass nur gerade Strecken, die weder von
Gas, noch von Knochen unterbrochen sind, gemessen werden können. Es besteht eine hohe Messgenauigkeit von 0,016 mm (1). Mit Hilfe der Sonomikrometrie können Kontraktionen und Größenveränderungen direkt und kontinuierlich erfasst werden (1). Es kann zwischen Kontraktionen und Expansionen, zwischen tonischen und phasischen Kontraktionen sowie zwischen zirkulären und longitudinalen Kontraktionen unterschieden werden. Jedoch hielten Adelson und Million (1) als Nachteil fest, dass nicht genau zwischen aktiven und passiven Bewegungen differenziert werden kann.
Bisher wurde die Sonomikrometrie an verschiedenen Organen erfolgreich angewandt, wie etwa an der Skelettmuskulatur zur Längenmessung beim Vogel im Flug (11) oder bei der Kröte bzw. dem Frosch im Sprung (2,3). Auch andere Bereiche der quergestreiften Muskulatur, z.B. die Längs- und Querdehnung der Zunge beim Schwein während des Fressvorgangs wurden mittels Sonomikrometrie untersucht (69). Einen anderen Bereich stellt der Einsatz im Gastrointestinaltrakt dar.
Adelson und Million (1) haben Sonomikrometriekristalle in den Rattenmagen, Ouyang und Chen (88) in den Magen des Hundes und Gu et al. (48) in den Schweinedarm implantiert. Haupteinsatzort der Sonomikrometrie sind jedoch experimentelle Messungen im kardiovaskulären Bereich des Schweins. Im Bereich der experimentellen Kardiologie gilt die Sonomikrometrie als Goldstandard zur Erfassung von Herzbewegungen, zumal nachgewiesen werden konnte, dass trotz der Invasivität der Methode keine funktionelle Beeinträchtigungen des Myokards erfolgt (66). Eine neuere Studie führte kardiologische Untersuchungen mittels Sonomikrometrie auch an Hunden durch (116).
Beim Rind wurde die Sonomikrometrie bislang an der Zervix zur Erfassung der Größenänderungen nach der Geburt eingesetzt (118). Dazu wurden innerhalb der ersten zwei Stunden p.p. Sonomikrometriekristalle an den caudalen Rand der Zervix genäht und eine Messung über 48 Stunden bei insgesamt sechs Kühen mit einer Nachgeburtsverhaltung vorgenommen. Hierbei zeigte sich, dass der Verschluss der Zervix in den ersten zwei Tagen p.p. in zwei Phasen abläuft und dass der zervikale Durchmesser von Kontraktionen des Uterus und der Zervix beeinflusst wird.
Am Uterus des Rindes wurde die Sonomikrometrie als Methode zur Bestimmung der Involution p.p. im Rahmen einer vorangegangenen Arbeit etabliert (9). Hierzu wurden drei Wochen a.p. vier Kristalle in Längsrichtung dorsal an der großen Kurvatur des graviden Uterushorns via Laparotomie implantiert. In einem Zeitraum von zwei Wochen a.p. bis vier Wochen p.p. wurden sowohl die Kontraktionen als auch die Größenreduktion des Uterus verfolgt. Die gemessenen Kontraktionen zeigten a.p.
und p.p. eine sehr inhomogene intra- und interindividuelle Ausprägung bezüglich Frequenz, Länge und Amplitude. Die Größenrückbildung war bei einem Großteil der Tiere um den 20. bis 25. Tag p.p. abgeschlossen. Auffällig war, dass zwischen den Tagen 2-7 p.p. nur eine geringe Größenabnahme stattfand. Es wird in der Arbeit letztendlich geschlussfolgert, dass die Methode der Sonomikrometrie primär zur Quantifizierung der Uterusinvolution geeignet ist.
2.3 Bedeutung ausgewählter Blutparameter / Hormone für das Puerperium
2.3.1 Calcium
Calcium stammt aus extra- und intrazellulären Quellen und ist essentiell für das Zustandekommen von Muskelkontraktionen, so auch für die Motorik des Uterus (123). Im Puerperium ist der Bedarf an Calcium durch die einsetzende Laktation im Vergleich zur Trächtigkeit um das Zwei- bis Dreifache erhöht (22). Daher kann gerade bei hochleistenden Milchkühen p.p. eine Hypocalcämie entstehen, die sich negativ auf die uterine Kontraktilität auswirken kann (72). Allerdings zeigten Bajcsy et al. (4), dass der Serumcalciumspiegel in den ersten 48 Stunden p.p. und die Frequenz oder Amplitude der uterinen Kontraktionen nicht zusammenhängen.
2.3.2 Freie Fettsäuren und β-Hydroxy-Buttersäure
Die β-Hydroxybuttersäure (β-HBS) gehört zu den bei negativer Energiebilanz in der Frühlaktation gebildeten Ketonkörpern und macht mit 81% den Hauptbestandteil der Gesamtketonkörperkonzentration beim Wiederkäuer aus (102). Sie wird als aussagekräftigster labordiagnostischer Indikator für die Beurteilung der Energiebilanz und die Diagnostik einer Fettleber beim Rind angesehen (43). Hauptursache bei der Entstehung einer negativen Energiebilanz stellt dabei das Einsetzen der Laktation und der damit verbundene gesteigerte Energiebedarf dar (22). Als Grenzwert für eine subklinischen Ketose wird ein Wert von über 1,0 mmol/l im Blut angesehen (91).
Freie Fettsäuren (FFS) sind ein Ausdruck vermehrter Fettmobilisation. Mit Einsetzen der Laktation gerät die Kuh durch vermehrten Energiebedarf in ein Energiedefizit und versucht dieses mittels Lipolyse zu kompensieren. Somit stellen die FFS einen Indikator für eine negative Energiebilanz dar (22). Eine vermehrte Bildung gilt als erster Schritt zur Entstehung einer Ketose (44), wobei der Grenzwert bei 700 µmol/l liegt (56).
2.3.3 Hormone
In der postpartalen Phase wird Prostaglandin F2α (PGF2α) im Wesentlichen vom karunkulären Endometrium gebildet und ebenfalls dort zum 15-Keto-13,14-Dihydro- Prostaglandin-F2α-Metaboliten (PGFM) verstoffwechselt (49). PGF2α steigt kurz vor der Geburt an und induziert die Luteolyse und mit der damit verbundenen Abnahme des Progesterons die Geburt (38). Am zweiten bzw. dritten Tag p.p. steigt die Blutplasmakonzentration von PGFM auf Maximalwerte an, um gegen den 15. Tag p.p. wieder Basalwerte zu erreichen. (49). Nakao et al. (84) zeigten, dass Tiere mit Puerperalstörungen in den ersten vier Tagen p.p. signifikant höhere PGFM- Plasmaspiegel aufwiesen als gesunde Tiere. Bei den gesunden Kühen war die Uterusinvolution umso schneller abgeschlossen, je länger die PGFM-Spiegel p.p.
erhöht waren.
Progesteron wirkt hemmend auf die Spontankontraktilität des Myometriums und erhält so die Trächtigkeit (47). Sobald der Progesteronwert unter 1,5 ng/ml absinkt, kommt es mit hoher Wahrscheinlichkeit innerhalb der nächsten 18 Stunden zur Kalbung (89). Nach der Geburt kommt es nach erfolgter Ovulation zu einem erneuten Anstieg der Progesteronwerte. Das durchschnittliche Intervall zwischen Geburt und erster Ovulation beträgt ca. 21 Tage (36).
Die geringe Menge der während der Gravidität gebildeten Östrogene stammt hauptsächlich aus der Plazenta (103). Unmittelbar a.p. kommt es durch den beschriebenen Progesteronabfall zum Anstieg des Östrogen-Progesteron- Verhältnisses (77). Östrogene wirken im Gegensatz zum Progesteron kontraktionsfördernd (47). Postpartal erreichen sie Basalwerte (<5 pg/ml) um den dritten Tag (58), mit fortschreitender Follikelanbildung steigt der Östrogenspiegel wieder an und unterliegt damit zyklusbedingten Schwankungen (7).
2.4 IGF-I System
2.4.1 Struktur und Funktion des IGF-I Systems
Das IGF-System besteht aus verschiedenen Regulationsebenen. Der Hypothalamus hat mittels des dort gebildeten Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH) eine fördernde Wirkung und über Somatostatin eine hemmende Wirkung auf die Freisetzung von Growth Hormone (GH) aus dem Hypophysenvorderlappen. GH, das im Blut zum Teil an Bindungsproteine gebunden ist, hemmt einerseits über einen negativen Feedbackmechanismus seine eigene Freisetzung, während es andererseits die Freisetzung von IGF-I aus der Leber stimuliert. Das IGF-I hemmt seine eigene Freisetzung indirekt, in dem es sich negativ auf die Freisetzung des GH auswirkt (19) (Abb. 1).
Hypothalamus
Hypophysenvorder- lappen
+ -
GHRH Somatostatin
Leber
+
GHIGF-I
- -
___________________________________________________________________
Abb. 1: Aufbau und Regulation des IGF-I Systems (modifiziert nach McCusker 1998)
+ / −: fördernde Wirkung / hemmende Wirkung; GHRH: Growth Hormone Releasing Hormone; GH: Growth Hormone; IGF: Insulin-like Growth Factor
Das IGF-I ist im Blut an verschiedene Bindungsproteine (IGFBP 1-6), vor allem an das IGFBP-3 gebunden. Das acid-labile-subunit (ALS) Protein stammt aus der Leber und wird ebenfalls durch GH reguliert. Es kann sich zusätzlich an den Komplex aus IGF-I und IGFBP-3 anlagern und so die Halbwertszeit von IGF-I im Plasma verlängern (19). Der Komplex mit den Bindungsproteinen wird mittels Proteasen wieder gelöst, die durch einen Mangel an GH stimuliert werden (20). Freies IGF-I kann sich an IGF-I- und IGF-II- sowie Insulinrezeptoren binden (108). Neben dem aus der Leber stammenden, endokrin wirkenden IGF-I gibt es auch eine nicht- hepatische parakrine Form dieses Hormons (124), welches in verschiedenen Geweben wie etwa dem Uterus (95) oder Ovar gebildet wird (92). Dort treten auch IGFBP und IGF-Rezeptoren auf. Über diese Rezeptoren kann endokrin wirkendes IGF-I einen Einfluss auf diese Gewebe haben (35). IGF-I fördert als Wachstumsfaktor die Hypertrophie und Differenzierung (74) und verhindert die Apoptose von Zellen (65).
2.4.2 Bedeutung von IGF-I für die uterine Involution
Die Konzentration von IGF-I im Plasma ist während der Trächtigkeit hoch und fällt in den letzten Tagen a.p. ab, um sieben Tage p.p. Minimalwerte zu erreichen und dann wieder allmählich anzusteigen (90). Dabei bestehen genetisch bedingte Unterschiede in der Höhe der IGF-I Plasmalevel, sowohl vor der Geburt als auch im postpartalen Zeitraum (27,28,94,109). Bei postpartalen Erkrankungen des Reproduktionsapparates sind die IGF-I Plasmalevel über einen längeren Zeitraum erniedrigt und erreichen bis zum Trockenstellen nur selten normale Werte (83,120).
Fenwick et al. (35) stellten fest, dass im frühen Puerperium eine negative Energiebilanz zu einer Abnahme von zirkulierendem IGF-I im Blut führte. Eine gleichzeitige Abnahme der Bindungsproteine im Endometrium führte jedoch zu einer besseren Bioverfügbarkeit des verbleibenden IGF-I durch geringere Bindung. Ein Energiedefizit und niedrige IGF-I-Plasmaspiegel waren mit schlechten Trächtigkeitsraten und Embryonaler Mortalität assoziiert.
Einige Studien zeigen einen Einfluss von IGF-I auf die ovarielle Aktivität und somit auf die Reproduktionsleistung p.p. (35,61,110,125). Tiere mit hohen IGF-I Leveln ovulieren häufiger in den ersten 30 Tagen p.p. als Kühe mit niedrigen IGF-I Spiegeln.
Diese zeigen vermehrt inaktive Ovarien, Zysten oder persistierende Corpora lutea auf (35,125).
Weniger geklärt ist dagegen die Wirkung von IGF-I auf die uterine Involution. Die Komponenten des IGF Systems kommen in den verschiedenen Gewebeschichten des Uterus in unterschiedlich starker Ausprägung vor. Die Expression der IGFs und der Bindungsproteine in den uterinen Gewebeschichten ändert sich sowohl im Verlaufe der Trächtigkeit, Geburt und postpartalen Involution (106), als auch während des ovariellen Zyklusgeschehens (95) und spricht so für eine generelle Einflussnahme des IGF-I Systems auf die uterine Aktivität. Nach Llewellyn et al. (70) lässt das gehäufte Auftreten von IGF-I im subepithelialen Stroma des postpartalen Uterus auf die Beteiligung an extensiven Gewebsumbauprozessen und Reparaturen während der Involution schließen. Das verringerte Vorkommen von IGF-I, IGF-I Rezeptoren und IGFBP-6 im ehemals graviden Horn im Vergleich zum nicht graviden
Horn deutet auf eine unterschiedlich starke Wirkung dieses Systems an den verschiedenen Uterusabschnitten hin. Eine Zunahme von IGF-I, IGF-I Rezeptoren und IGFBP-5 im Myometrium p.p. lässt auf eine Beteiligung an der Wundheilung während des Puerperiums schließen (107). Aufgrund fehlender GH Rezeptoren am Uterus scheint die Expression von IGF-I und dessen Bindungsproteinen 2 und 3 während der Involution von dem übergeordneten GH unabhängig zu sein (64). Von Rhoads et al. (92) wird zwar ein Einfluss von GH indirekt über den GHR auf die Genexpression des IGF-Systems im Uterus festgestellt, allerdings wird eine übergeordnete Steuerung des IGF-Systems im Reproduktionsgewebe ausgeschlossen. Hierzu wurden neun Tage nach jeweils induzierter Ovulation vom Uterus, vom dominanten Follikel und vom Gelbkörper ungefähr an Tag 20, 40 und 60 Biopsien entnommen. Dabei lagen zwar einige Korrelationen von Genen des IGF-I Systems innerhalb eines Gewebes vor, jedoch verhielten sich die Expressionen der gleichen Gene in den verschiedenen Geweben unabhängig zueinander.
Daneben zeigten die Genexpressionen eines Gewebes an den drei verschiedenen Zeitpunkten keine Unterschiede, so dass auch ein Einfluss der wechselnden Energiezufuhr, der zunehmenden Milchleistung und abnehmenden Körperkondition ausgeschlossen werden konnte. Anstatt einer koordinierten übergeordneten Regulierung der verschiedenen Komponenten würde eher eine gewebespezifische und tierindividuelle Regulierung vorliegen.
Auf Grund der positiven Korrelation von IGF-I Plasma Werten und den Konzeptionsraten bei pluriparen Tieren stellt die Messung von IGF-I in Plasma ein geeignetes Mittel zur Beurteilung der Fertilität dar (113). Kühe mit IGF-I Spiegeln über 25 ng/ml in der ersten Woche nach der Geburt wurden bei der Erstbesamung elfmal häufiger tragend als Kühe, deren IGF-I Plasmakonzentrationen darunter lagen (113). Lag der IGF-I Plasmawert bei mindestens 50 ng/ml zum Zeitpunkt der ersten Besamung, dann war die Erstbesamungsrate fünfmal höher als in den Fällen, in denen die Werte unter diesem Schwellenwert waren. Im Gegensatz dazu war bei uniparen Tieren ein erhöhter IGF-I Level a.p. (durchschnittlich 131 ng/ml) mit einer längeren Güstzeit verbunden, während unipare Tiere mit geringeren Werten (durchschnittlich 116 ng/ml) bereits bei der ersten Besamung aufnahmen.
3. Material und Methoden
3.1 Versuchstiere
Die Studie fand an der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover an 14 pluriparen gesunden Kühen der Rasse Holstein Friesian statt. Alle Tiere stammten aus einem Milchviehbetrieb mit einer Bestandsgröße von 1100 Tieren. Der Tierversuch wurde unter dem Aktenzeichen 33.9-42502-04-09/1696 vom Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelqualität Niedersachsen genehmigt.
3.2 Fütterung und Haltung
Auf dem Ursprungsbetrieb wurden die Tiere in Boxenlaufställen mit Spaltenboden in Gruppen von 50 bis 100 Tieren gehalten und mit einer Totalen-Misch-Ration versorgt.
In der Klinik für Rinder folgte eine Aufstallung der Versuchstiere über den gesamten Versuchszeitraumes in Einzelboxen mit Stroheinstreu. Gefüttert wurde vor der Abkalbung zweimal täglich 1 kg Kraftfutter; p.p. erfolgte die Kraftfuttergabe entsprechend der täglichen Milchleistung. Als Grundfutter wurde Heu und Maissilage während des gesamten Zeitraums ad libitum zur Verfügung gestellt. Nach der Abkalbung wurden die Kühe zweimal täglich im Stall gemolken.
3.3 Einteilungen der Versuchsgruppen
Die Einteilung der Tiere erfolgte in zwei Gruppen mit hohen (Gruppe 1) bzw.
niedrigen (Gruppe 2) IGF-I Spiegeln a.p.. Zur Ermittlung des Grenzwertes wurde vor Versuchsbeginn bei 126 Tieren des Betriebes je eine Blutprobe zwischen den Tagen 244 und 254 der Gravidität untersucht und der Mittelwert von 140 ng/ml IGF-I im
Serum als Grenzwert festgelegt. Bei in Frage kommenden Versuchstieren wurden innerhalb des gleichen Zeitraumes vorab auf dem Betrieb Blutproben entnommen und entsprechend anhand der Serumwerte ausgewählt. Schwerwiegende Erkrankungen innerhalb des Versuchszeitraumes führten zum Ausschluss aus der Studie.
3.4 Versuchsaufbau und zeitlicher Verlaufsplan
Vier Wochen vor dem errechneten Abkalbetermin (280 Tage post inseminationem) verbrachte man die Tiere von dem Bestand in die Klinik. Täglich wurde eine Allgemeinuntersuchung der Tiere nach dem Untersuchungsschema von Stöber (1990) (111) durchgeführt (Score siehe Anhang, Tabelle 7). Traten abweichende Befunde auf, wurde das entsprechende Organsystems einer speziellen Untersuchung unterzogen (Stöber 1990). Die ersten sieben Tage dienten der Eingewöhnung in die neue Umgebung. Die Laparotomie zur Implantation der Sonomikrometriekristalle (SMM-Kristalle) wurde etwa drei Wochen a.p.
vorgenommen. Zwischen der Operation und dem 2. Tag a.p. fanden sporadische Messungen mit dem SMM-System statt, um die Funktion der Kristalle zu überprüfen.
Es folgten vom 2. Tag a.p. bis zum 14. Tag p.p. täglich und ab Tag 15 bis 28 p.p.
jeden zweiten Tag Messungen. Während des gesamten Geburtsvorganges wurden kontinuierliche sonomikrometrische Messungen bis zum Abgang der Nachgeburt bzw. 12 Stunden p.p. durchgeführt. Relevante Daten des Abkalbeverlaufes wurden erhoben und gegebenenfalls Geburtshilfe geleistet.
An den Tagen 28 bis 10 a.p. fand einmal wöchentlich und von da an bis Tag 28 p.p.
täglich eine Blutprobenentnahme aus der Vena jugularis statt. Zur Erleichterung der Blutentnahme wurde einen Tag vor der Operation für den gesamten Zeitraum des Versuchs ein Venenverweilkatheter in eine Jugularvene gelegt. Aus den antepartalen Proben wurden wöchentlich IGF-I, aus allen postpartalen Proben IGF-I, Progesteron (P4), 13,14-dihydro-15-keto-ProstanglandinF2α (PGFM), Gesamtöstrogene (Eges), Calcium (Ca), β- Hydroxy- Buttersäure (β-HBS) und freie Fettsäuren (FFS) bestimmt.
Ab Tag 10 a.p. erfolgte täglich eine Untersuchung des P4-Gehalts zur Geburtsüberwachung.
Ab dem 10. Tag p.p. wurde im Anschluss an jede Messung zusätzlich eine transrektale, sonographische Untersuchung des Genitalapparates vorgenommen.
Nach Abschluss des Versuches hat man bei allen Tieren Endometriumbiopsien entnommen. Am 10. Tag p.p. wurden nur bei sieben der 14 Versuchtiere Endometriumbiopsien entnommen, da sich bei zwei Tieren nach Perforation der Uteruswand eine Peritonitis entwickelte (Abb. 2).
-28 IGF-I OP -21 IGF-I -14 IGF-I -10
-9 -8
-7 IGF-I -6
-5 P4
(SMM) -4 -3 -2 -1
IGF-I IGF-I 0
1 2 3 SMM 4
5 6
7 Biopsie
8 9 10 11 12
13
14 SMM und US 16 18 20 22 24 26
28 Biopsie
Abb. 2: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der durchgeführten Untersuchungen. In der zentralen schwarzen Zeitachse stellen negative Zahlen die Tage ante partum, positive Zahlen die Tage post partum und der Tag 0 den Tag der Geburt bzw. den 280. Trächtigkeitstag dar.
Täglich:
IGF-I, P4, Eges, PGFM, Ca, FFS, β-HBS
SMM = Sonomikrometrie
IGF-I = Insulin-like Growth Factor-I P4 = Progesteron
Eges = Gesamtöstrogen PGFM = Prostaglandinmetabolite Ca = Calcium
FFS = Freie Fettsäuren β-HBS = β-Hydroxy-buttersäure US = transrektale
sonographsche Untersuchung Biopsie = Endometriumbiopsie
OP = Operation zur Implantation der Messsysteme
3.5 Messgeräte und räumliche Anordnung
Eine Übersicht über die für die sonomikrometrischen Messungen verwendeten Geräte wird in Tabelle 1 gegeben.
Tabelle 1: Übersicht der verwendeten Geräte zur sonomikrometrischen Messung mit Angabe des jeweiligen Herstellers
Geräte Hersteller
4 piezoelektrische Kristalle Sonometrics Corp., London, Ontario, Canada TRX Series Transceiver Unit (TRX-Box) Sonometrics Corp., London, Ontario, Canada Sonometrics Data Acquisition Computer Sonometrics Corp., London, Ontario, Canada Channel-Selector-Box Sonometrics Corp., London, Ontario, Canada
Oszilloskop Hewlett Packard, Modell 54600B 100 MHz, Palo Alto,
CA, USA
Webcam USB PC Camera DLV-B01, Importeur: DeLUX GmbH,
Hamburg, Deutschland
Videokamera S-VHS C Movie Camera MV-S 77, Panasonic Corp.,
Japan
Die vier piezoelektrischen Kristalle bestanden aus Keramik und waren zur Isolierung mit Epoxidharz überzogen. Hinter dem Kristallkopf befand sich ein 1 cm langer Schrumpfschlauch. Die Verbindungskabel zum Skin-Button waren etwa zwei Meter lang und bestanden aus verdrilltem, rostfreiem Stahl, der mit einem reizarmen, elastischen und isolierenden Silikon überzogen war (Silastic®; Abb. 3).
Abb. 3: Sonomikrometriekristalle mit Schrumpfschlauch (schwarz), Verbindungskabel und Skin-Button
Vom Skin-Button am Tier wurde mittels eines etwa 10 m langen Kabels eine Verbindung zur Sendeempfangseinheit (TRX-Box) hergestellt. Hier erfolgte die Umwandlung der analogen Kristallsignale in digitale Signale. Der angeschlossene Sonometrics Data Acquisition Computer verarbeitete die Informationen mittels des Computerprogramms SonoSOFT® (Version 3.4.30 RC1) Interface für SonoLAB und SonoVIEW (Firma Sonometrics Corp., London, Ontario, Canada). SonoLAB diente der Erfassung und Konvertierung der Daten, während SonoVIEW die Darstellung und Analyse der Ergebnisse ermöglichte. Ebenfalls an die TRX-Box angeschlossen war die Channel-Selector-Box. Sie bestand aus zwei Drehschaltern, mit denen je ein Sende- und Empfangskristall ausgewählt werden konnte. Die so bestimmte Strecke war auf dem ebenfalls an der TRX-Box angeschlossenen Oszilloskop sichtbar, so dass eine Kontrolle dieser Paarung hinsichtlich der optimalen Empfindlichkeitseinstellung möglich war. Alle elektrischen Komponenten befanden sich in einem separaten, der Box benachbarten Überwachungsraum, um die empfindlichen Geräte zu schonen und das Versuchstier nicht zu stören.
Zur Bewegungsüberwachung der Kuh kamen zwei Kameras zum Einsatz. Die Dokumentation erfolgte mit einer Videokamera, die hinter der Kuh auf einem Stativ
aufgestellt wurde. Ein 15 m langes S-VHS-Kabel übermittelte das Videosignal zu einem im Überwachungsraum liegenden USB-Wandler (DVD-Creator USB 2.0, Importeur: Conrad Electronic SE, Hirschau, Deutschland) und von hier aus zu einem separaten Computer. Hierauf wurden die Videos mit Hilfe des Programms Movie-maker® (Windows Microsoft®, Immeuble Laccolith, Luxembourg S.à.r.l.) aufgenommen und gespeichert. Die visuelle Beobachtung fand durch eine in der Box ebenfalls hinter dem Tier angebrachte Webcam statt. Über ein 15 m langes USB-Verstärkerkabel war diese mit einem separaten Computer im Überwachungsraum verbunden, auf dem während der Messung eine Darstellung in Echtzeit erfolgte.
3.6 Prinzip der sonomikrometrischen Messung und Einstellungen
In einem Messzyklus sendete jeder Kristall einmal und empfing von den anderen drei Kristallen je ein Signal. Auf diese Weise entstanden zeitgleich zwölf Messstrecken (Abb. 4).
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Abb. 4: Schematische Darstellung aller gleichzeitig gebildeten Messstrecken (Benz 2010)
Die Variablen Dauer des Ultraschallimpulses (400 ns) und Anzahl der Messzyklen (25 Hz) wurden während der gesamten Messung konstant gehalten. Die minimale
Zeitdifferenz zwischen Sende- und Empfangsimpuls (fungierte als Schwelle für die Sendedauer eines Impulses) und die Sensitivität der Kristalle (fungierte als Schwelle für die Signalstärke) wurden während der Messungen entsprechend der Signalqualität angepasst.
3.7 Implantation des sonomikrometrischen Messsystems
3.7.1 Vorbereitung
Einen Tag vor der Operation wurde um jeden der Messkristalle eine ca. 1 cm lange Silikonmanschette direkt hinter dem Kristallkopf angebracht, um den Halt der Fixationshefte zu verbessern (Abb. 5).
Abb. 5: Sonomikrometriekristalle mit Silikonmanschette
Die Kristalle und Kabel exklusiv des Skin-Buttons mussten etwa zwei Stunden vor Beginn der Operation zur Sterilisation für je eine Stunde zunächst in eine 2%ige Chlor-Cresol-Chlor-Benzyphenol-Lösung (Helipur® H plus N, Braun GmbH, Melsungen, Deutschland) und anschließend in eine 1%ige Poly-(1-vinyl- 2-pyrrolidon)-Jod-Komplex Lösung (Vet-Sept®-Lösung, aniMedica GmbH, Senden- Bösensell, Deutschland) eingelegt werden. Das Operationsfeld wurde rasiert, mit 70%igen Alkohol entfettet und mit Jod desinfiziert. Eine paravertebrale Leitungsanästhesie der Wirbel L2-Th12 in Kombination mit einer
Infiltrationsanästhesie der Schnittlinie mit 180 ml Procainhydrochlorid mit Sperrkörper Epinephrin (Isocain 2%, Selectavet Dr. Otto Fischer, Weyarn-Holzolling, Deutschland) erfolgte zur Schmerzausschaltung. Eine Tokolyse konnte mit Clenbuterolhydrochlorid (Planipart®, 0,8 µg/kg KGW i.m., Boehringer-Ingelheim vetmedica GmbH, Ingelheim, Deutschland) erzielt werden.
3.7.2 Operation
Die Implantation der sonomikrometrischen Kristalle fand via Laparotomie in der linken Flanke am stehenden Tier statt. Nacheinander wurden alle Schichten der Bauchwand eine Handbreit vor dem Hüfthöcker und unter den Lendenwirbelquerfortsätzen senkrecht nach ventral auf einer Länge von etwa 30 bis 35 cm eröffnet. Dann wurden die vier Kristalle mittels eines Trokars nach Christiansen drei bis fünf fingerbreit kaudodorsal des dorsalen Wundrandes von außen nach innen durch die Bauchwand geführt. Nach Vorlagerung des Uterus fixierte man die Kristalle unter der Serosa des graviden Uterushorns in die äußere longitudinale Muskelschicht der Tunica muscularis, quer zu deren Verlaufsrichtung.
Eine Fixation und Versenkung der Kristallköpfe erfolgte durch zwei nicht perforierende Sultan´sche Diagonalhefte mit Seide (Naturseide-S schwarz, metric 2, Catgut GmbH, Markneukirchen, Deutschland). Um eventuellen Zugkräften der Kabel auf die implantierten Kristallköpfe vorzubeugen, wurde mit dem Kabel direkt hinter den Kristallen eine ca. 2 cm große Schlaufe gelegt und diese mit je drei Einzelheften mittels Seide auf der Serosa befestigt (Abb. 6)
Abb. 6: Fixation eines Sonomikrometriekristalls im Myometrium mittels Sultan`scher Diagonalhefte mit Schlaufenbildung
Die Anordnung der Kristalle folgte dabei der Längsachse des Horns auf der großen Kurvatur in einem Abstand von jeweils 10 cm. Die farblich markierten Kristalle wurden laufend durchnummeriert, wobei der am weitesten kranial liegende Kristall die Nummer eins bekam (Abb. 7). Die Bauchhöhle wurde mit 500 ml 5%iger Poly- (1-vinyl-2-pyrrolidon)-Jod-Komplex Lösung (Vet-Sept®-Lösung, aniMedica GmbH, Senden-Bösensell, Deutschland) versorgt. Der Verschluss des Peritoneums und des Musculus transversus erfolgte mit einer Matratzennaht und einer rückläufigen Kürschnernaht mit Perlonfaden (Filovet-Bengen extra, metric 6, WDT eG, Garbsen, Deutschland). Nach Adaption der Muskulatur durch Sultan`sche Diagonalhefte mit Polyglycolsäurefaden (Marlin, metric 8, Catgut GmbH, Markneukirchen, Deutschland) wurden 3 Mio I.E. Benzylpenicillin (Procain-Penicillin, Albrecht GmbH, Aulendorf, Deutschland) in die Wunde gegeben. Der Verschluss der Haut erfolgte mittels Donatiheften mit Seide (Silk, metric 10, S.M.I. AG, Hünningen, Belgien).
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Abb. 7: Schematische Darstellung der Lokalisation der Kristalle am Uterus für die sonomikrometrische Messung (Benz 2010)
Beginnend an der Austrittsstelle wurden die Kristallkabel subkutan bis auf die Lendenwirbelquerfortsätze verlegt. Hierzu eröffnete man die Haut und verschloss sie wieder über den Kabeln mit einer Naht nach Reverdin mit einem Perlonfaden (Filovet-Bengen extra, metric 6, WDT eG, Garbsen, Deutschland). Es folgte eine zusätzliche Befestigung des Skin-Buttons mit zwei Hautheften. Zur Abdeckung der Wunde kam abschließend eine Wundauflage zum Einsatz. Ab dem Tag der Operation wurden die Kühe antibiotisch für fünf Tage mit Enrofloxacin (Enro- Sleecol®, 2,5mg/kg KGW s.c., Albrecht GmbH, Aulendorf, Deutschland) und für weitere fünf Tage mit Benzylpenicillin s.c. (Procain-Penicillin®, 20.000 I.E./kg KGW s.c., Albrecht GmbH, Aulendorf, Deutschland) versorgt. Als Antiphlogese bekamen die Tiere an den ersten drei Tagen Flunixin-Meglumin (Finadyne®, 2,2mg/kg KGW s.c., Intervet Deutschland GmbH, Unterschleissheim, Deutschland) verabreicht. Die Fäden wurden 14 Tage post operationem gezogen.
3.8 Geburtsablauf
Traten Anzeichen einer bevorstehenden Geburt auf bzw. sank der P4-Wert unter 1,0 ng/ml, wurde mit der SMM-Messung begonnen. Zusätzlich protokollierte man den Verlauf der Geburt. War durch Abweichungen der Lage, Stellung oder Haltung oder der relativen oder absoluten Größe des Kalbes ein Eingreifen nötig, wurde Geburtshilfe geleistet. Zur Erweichung des Geburtweges kamen 40 mg Denaverinhydrochlorid (Sensiblex®, i.m., Veyx-Pharma GmbH, Schwarzenborn, Deutschland) zum Einsatz. Die Einteilung der geburtshilflichen Maßnahmen sah wie folgt aus: keine Hilfe, leichte Hilfe (eine Person muss für ca. 5-10 Minuten Zughilfe leisten), mittlere Hilfe (zwei Personen müssen für ca. 5-10 Minuten Zughilfe leisten) und schwere Hilfe (zwei Personen müssen für >10 Minuten Zughilfe leisten). Nach der Geburt des Kalbes wurde eine manuelle geburtshilfliche Nachuntersuchung durchgeführt. Es folgte nach Reinigung des äußeren Genitales mit warmer Seifenlösung eine Befundung von evtl. vorliegenden Verletzungen des weichen Geburtsweges. Im Anschluss erfasste man das Gewicht und Geschlecht des Kalbes.
Die SMM-Messungen wurden bis zum Abgang der Nachgeburt bzw. 12 Stunden p.p.
fortgeführt. Nach Abschluss erfolgte eine manuelle nachgeburtshilfliche Untersuchung, bei der die Zervix hinsichtlich des Öffnungsgrades, die Lochien bezüglich Aussehen, Konsistenz und Geruch und das Vorliegen von Nachgeburtsteilen beurteilt wurden. Waren 12 Stunden p.p. noch Nachgeburtsteile intrauterin erreichbar bzw. die abgegangene Nachgeburt unvollständig, musste die Diagnose Retentio secundinarum gestellt werden.
3.9 Behandlung von Erkrankungen im Versuchszeitraum
Alle im Versuchszeitraum auftretenden klinischen und subklinischen Erkrankungen wurden nach den im Anhang 8 (Tabelle 8) angegebenen Behandlungsschemas behandelt.
Bei Verdacht auf Puerperalstörungen wurde eine manuelle vaginale Untersuchung (siehe Kapiel 3.8) vorgenommen. Lagen geruchliche Abweichungen der Lochien vor, musste die Diagnose Metritis nach der Einteilung von Sheldon et al. (105) gestellt werden. Bei Vorliegen einer Dislocatio abomasi sinistra erfolgte eine Laparotomie mit Omentopexie nach Dirksen (29).
3.10 Durchführung der Sonomikrometrie
Alle Messungen erfolgten vormittags von 9 bis 13 Uhr kontinuierlich über vier Stunden. Während der Messung waren die Kühe an einem langen Strick festgebunden, um zu verhindern, dass sie sich aus dem Sichtfeld der Kameras heraus bewegen. Zusätzlich zu den Videoaufzeichnungen wurden anhand der Übertragung durch die Webcam alle Kuhbewegungen manuell in ein Messprotokoll eingetragen. Während der Messung erfolgte mit dem Oszilloskop eine kontinuierliche Überprüfung der Signalqualitäten der einzelnen Strecken, so dass die minimale Zeitdifferenz zwischen Sende- und Empfangsimpuls und die Sensitivität der Kristalle an der TRX-Box entsprechend korrigiert werden konnten.
3.10.1 Speicherung und Auswertung der Messungen
Die nach jedem Messtag in SonoLAB gespeicherten Messdateien mussten mit Sonosoft® in vier Sonosoft®-Files (je eine Messstunde) konvertiert werden und waren so für das Interface SonoVIEW lesbar. Mittels SonoVIEW wurden alle zwölf Kombinationsmöglichkeiten in graphischer Form (Distanzverlauf in mm) dargestellt und die jeweils qualitativ bessere Strecke (z.B. 1-2 oder 2-1) ausgewählt, so dass insgesamt sechs mögliche Kristallkombinationen übrig blieben. Zur Reduzierung der Ausreißerwerte wurden diese sechs sonomikrometrisch erfassten Strecken zunächst gleichzeitig mit dem Sonosoft® Filter „Remove outliers of all active TRX traces“-Filter und anschließend jede separat mit dem „Replace out of bounds points of active
trace“-Filter bearbeitet und erneut als Sonosoft®-File abgespeichert. Der erste Filter setzte einzelne Ausreißer in die graphisch dargestellte Strecke zurück, solange es sich um Einzelereignisse handelte. Waren mehrere Datenpunkte in Folge entrückt, erkannte dieser Filter sie nicht als Ausreißer. Hier setzte der zweite Filter an.
Verschob man die zu filternde graphisch wiedergegebene Messstrecke in ihrem Darstellungsfeld so, dass die Ausreißer über die Feldbegrenzung hinaus geschoben wurden, wurden sie durch den Filter als Ausreißer erkannt und zurückgeführt.
Nachdem auf diese Weise jede einzelne sonomikrometrisch erfasste Messstrecke einer jeden Messstunde optimiert wurde, fand ein Abgleich mit dem manuell erstellten Messprotokoll statt, um Signalereignisse und Streckenänderungen, die durch Tierbewegungen verursacht wurden, zu identifizieren und mit Sonosoft® auszuschneiden. In unklaren Fällen konnte man die Videoaufzeichnungen heranziehen. Die Daten der so zurechtgeschnittenen Messstrecken lagen als ASC-II Files gespeichert vor und konnten als Datentabelle in Excel2007 (Microsoft Office®, Immeuble Laccolith, Luxembourg S.à.r.l.) eingelesen werden. Ein komplett unbeschnittener Datensatz einer Stunde hatte 90180 Datenpunkte, bzw. je nach Menge der ausgeschnitten Datenpunkte entsprechend weniger. War eine Streckenmessung so schlecht, dass nur sehr wenig Daten verwertbar waren (<25%), wurde die betroffene Strecke für diese Stunde ganz verworfen. Die Werte einzelner Stunden von verschiedenen Strecken wurde exemplarisch mit dem Shapiro-Wilk- Test auf Normalverteilung geprüft. Da alle Werte nicht normalverteilt waren, wurde folgend der Median für jede Strecke einer jeden Stunde ermittelt und aus den vier Stundenmedianen eines Messtages der Tagesmedian jeder der sechs Messstrecken in mm berechnet. Für die Involutionskurven wählte man als Ausgangswert den Tagesmedian einer Messung zwischen dem dritten und achten Tag a.p. aus. Von diesem Ausgangswert (100%) wurde der prozentuale Anteil der postpartalen Tagesmediane berechnet und daraus für jede Strecke eine relative Involutionskurve erstellt. Zusätzlich wurde aus den relativen Werten der Strecken 1-2, 2-3 und 3-4 eines jeden Messtages ein gemeinsamer Mittelwert gebildet und daraus eine gesamte Involutionskurve erstellt.
3.10.2 Fixation der Kristalle
Löste sich ein Kristall aus seiner Fixation im Myometrium, stellte sich dies in den Messwerten auf verschiedene Weise dar. Fiel ein Signal bei allen drei möglichen Paarungen des betroffenen Kristalls gleichzeitig aus oder verschlechterte sich dieses qualitativ ohne ersichtlichen Zusammenhang zum Verhalten der Kuh (Urinieren, Kotabsatz, Brüllen etc.), galt dieser Kristall als gelöst. Daneben traten spontane, extreme Sprünge der angezeigten Distanz auf, die sich zu den benachbarten Kristallen nach kranial und kaudal jeweils gegenteilig verhielten (z.B. eine Verkleinerung der Strecke 1-2 um 3 cm bei gleichzeitiger Vergrößerung der Strecken 2-3 und 2-4 um 3 cm und unverändertem Abstand der Strecken 1-2 und 3-4 wurde als gelöster, umherschlagender Kristall 2 gewertet). Dabei wurden die Streckenverhälnisse, die der Messstrecke in noch ungelöster Form weitestgehend entsprachen als „richtige“ Lage und die dazu deutlich abweichenden Streckenkombinationen als „falsche“ Lage gewertet. In Abhängigkeit von der Auswertbarkeit der Messstrecke der gelösten Kristalle wurden diese in auswertbar, teilweise auswertbar und nicht auswertbar klassifiziert. Die auswertbaren gelösten Kristalle zeigten zwar extreme Sprünge, jedoch konnten die Messabschnitte, in denen der Kristall in „falscher“ Position lag, deutlich abgegrenzt und die Datenpunkte mittels Software ausgeschnitten und verworfen werden. Bei den teilweise auswertbaren Messstrecken waren einzelne Tage auf Grund von durchgehender Qualitätsmängel und zu starken Umherschlagens der Kristalle nicht zu verwenden.
Von diesen teilweise auswertbaren Messstrecken war der Großteil der Messtage nutzbar. Die nicht auswertbaren Messstrecken zeigten über den gesamten Messzeitraum eine schlechte Qualität und eine nicht definierbare Lage des Kristalls und mussten somit verworfen werden.
3.11 Transrektale Sonographische Untersuchung
3.11.1 Geräte
Die Untersuchungen erfolgten mit dem Gerät CO LTD, Typ GE Logiq Book XP der Firma GE Medical Systems (Jiangsu, China), welches mit einem linearen Schallkopf vom Typ i739L (4-10 MHz) ausgestattet war. Die Geräteeinstellungen blieben für alle Untersuchungen im jeweiligen Modus konstant. Die Standbilder wurden im B-Modus bei 10 MHz aufgenommen und zur Auswertung auf einen separaten Computer übertragen.
3.11.2 Strukturen am Uterus und Ovar
Am Uterus wurden die Zervix, das Corpus uteri und ca. 3 cm kranial der Bifurkation das ehemals gravide und nichtgravide Horn sonographisch untersucht. Von jeder Lokalisation erfasste und speicherte man je drei Bilder im Querschnitt. Mit dem Programm Pixelflux (Chameleon-Software, Leipzig, Deutschland) wurden alle Bilder in Bitmap-Dateien konvertiert, so dass sie nachfolgend mit Hilfe des Bildbearbeitungsprogramms FixFoto® (Version 2,74, Fa. Joachim Koopmann Software, Wrestedt-Stederdorf, Deutschland) ausgewertet werden konnten. Von den drei Bildern der jeweiligen Lokalisationen wurde das qualitativ Beste ausgewählt und zur Vermessung herangezogen.
Der Zervixdurchmesser definierte sich als Senkrechte zwischen den dorsal und ventral liegenden Serosen. Sowohl beim Corpus als auch bei den Cornua wurden je drei Parameter erhoben. Der Durchmesser wurde aus dem Mittelwert der maximalen Länge und Breite, die in einem Winkel von 90° zuein ander ausgerichtet waren, berechnet. Als Gesamtfläche definierte man die Endometriumfläche inklusive der Fläche des Inhalts. Die Endometriumfläche war die Gesamtfläche abzüglich der Fläche des Inhalts (Abb. 8).
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Abb. 8: Ultrasonographische B-Mode Darstellung der Zervix (a) und des Uterushorns (b-d) (nach Brömmling 2011)
a: Zervixdurchmesser (Pfeil = Senkrechte von Serosa zu Serosa durch die Mitte des Organs)
b: Durchmesser Uterushorn (Pfeile = maximale Länge und Breite im 90°
Winkel zueinander)
c: Gesamtfläche (Markierung = Endometriumfläche inklusive Fläche des Inhalts)
d: Endometriumfläche (Markierung = Gesamtfläche abzüglich der Fläche des Inhalts)
Die Ovarien wurden mit dem Schallkopf systematisch in verschiedenen Ebenen auf das Vorhandensein von Follikeln und Gelbkörpern hin untersucht.
a b
c d
90
3.12 Blutentnahme
Zur Blutgewinnung kam ein kurz vor der Operation in eine der beiden Jugularvenen gelegter Venenverweilkatheter (WVI Jugularis-Katheter, Firma Walter Veterinär- Instrumente e. K., Baruth/Mark, Deutschland) zum Einsatz. Je nach Versuchstag (siehe Abb. 1) wurden zwei Ethylendiamintetraacetat- (EDTA) und ein Serumröhrchen zu je 10 ml (Sarstedt, Nürnbrecht) mit Blut befüllt. Die Proben wurden zentrifugiert (10 Minuten bei 4°C und 3500 g ) und das Plasma bzw. Serum in zwei bzw. vier Eppendorfgefäße (2 ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) pipettiert.
Bis zur Analyse wurde das Blutplasma/-serum bei -20°C zwischengelagert.
3.12.1. Parameter
Im Endokrinologischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover wurden die Konzentrationen von totalem IGF-I, P4, PGFM und Eges aus dem Blutplasma bestimmt. Für die Bestimmung der Blutkonzentrationen von Eges und PGFM kam ein Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und für die P4-Analye ein Radioimmunoassay (RIA) zum Einsatz. Die totale Konzentration von IGF-I im Plasma wurde mit einem active IGF-I coated tube immunoradiometric assay (DSL-5600, Beckman Coulter, Inc., CA, USA) bestimmt. Die P4-Konzentration a.p.
wurde aus dem Serum mit einem kompetitiven Immunoassay ermittelt (IMMULITE® 2000, Siemens Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). Im Klinisch Chemischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover wurden im Blutserum die Ca-Konzentrationen mit einem Analysevollautomaten (Cobas-Mira, Fa. Hoffmann-La Roche & Co. AG Diagnostika, Basel, Schweiz) bestimmt. Die Konzentrationen an FFS und β-HBS ermittelte man photometrisch mit dem ABX Pentra 400® (Fa. HORIBA, Medical, Kyoto, Japan).
3.13 Endometriumbiopsie
3.13.1 Entnahmetechnik
Nach trockener Reinigung der Vulva wurde unter transrektaler Fixation der Zervix das sterile Entnahmegerät nach KEVORKIAN (Fa. Hauptner Herberholz GmbH&Co.
KG, Solingen, Deutschland) vaginal bis in den Uterus vorgeschoben. Zwischen dem 7. und 12. Tag p.p. wurden die Proben aus dem Corpus vom dorsal liegenden Endometrium und zwischen dem 28. und 47. Tag p.p. aus beiden Hörnern ebenfalls jeweils vom dorsal liegenden Endometrium etwa zwei cm kranial der Bifurkation unter transrektaler Fixation des Uterus entnommen. Alle Proben mussten mit einer sterilen Kanüle aus dem Biopsiegerät entnommen und in je ein Röhrchen mit 4%igem, gepuffertem Formalin überführt werden.
3.13.2 Untersuchung der Probe
Die formalinfixierten Proben untersuchte man histopathologisch am Anatomischen Institut der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Sie wurden nach dem Standardverfahren mit dem Automaten Leica EG 1150H (Fa. Leica, Wetzlar, Deutschland) in Paraplast® (Fa. Leica, Wetzlar, Deutschland) eingebettet. Mittels Rotationsmikrotom (Fa. Leitz, Wetzlar, Deutschland) wurden Schnitte mit einer Dicke von 3-4 µm gefertigt und anschließend mit einer H.E.-Färbung angefärbt. Eine Untersuchung der Schnitte erfolgte lichtmikroskopisch mittels 4er, 10er, 20er und 40er Objektive eines Standardmikroskops der Fa. Zeiss (Oberkochen, Deutschland).
Alle Bioptate wurden bezüglich histopathologisch erfassbarer inflammatorischer Veränderungen nach dem Schema von Rodenbusch (96) beurteilt. Als Endometritis galten alle entzündlichen Prozesse entsprechend der Einteilung im Anhang (Tabelle 9).
3.14 Kontrollgruppe
Um einen negativen Einfluss der implantierten Kristalle auf die uterine Involution auszuschließen, wurden in gleicher Weise wie unter Kapitel 3.11 beschrieben Ultraschalluntersuchungen an unmanipulierten Kühen durchgeführt.
3.14.1 Tiere, Haltung und Fütterung
Die Kontrollgruppe bestand aus zwölf pluriparen, laktierenden Kühen der Rasse Holstein Friesian des Lehr- und Forschungsguts Ruthe der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Sie wurden zufällig aus der gesamten Herde (ca. 80 Tiere) ausgewählt. Um die beiden Gruppen vergleichen zu können, war der Anteil an Tieren mit Puerperalstörungen (Retentio secundinarum und Metritis) in beiden Gruppen gleich groß. Die Tiere wurden in zwei Gruppen gehalten. Die Hälfte der Tiere war in einem Boxenlaufstall (Hochboxen) mit Spaltenboden aufgestallt und wurde mit einem Melkroboter gemolken. Die andere Hälfte war auf planem Boden mit Schieberentmistung und angeschlossenem Tiefstreustall untergebracht. Diese Gruppe wurde zweimal täglich in einem 8er Autotandem-Melkstand gemolken. Beide Gruppen erhielten eine Totale-Misch-Ration mit transpondergesteuerter, leistungsgerechter Zufütterung von Kraftfutter.
3.14.2 Untersuchungen
Die Untersuchungen erfolgten zwischen dem 10. und 28. Tag p.p. im Zwei-Tages- Rhythmus. Die Geräte, die Klassifizierung der Strukturen am Uterus, die Methodik und das Vorgehen bei der Auswertung der ultrasonographischen Untersuchungen waren analog zur Versuchsgruppe.
