Intestinale Glucoseaufnahme beim Rind:
Einfluss der alimentären Stärkeversorgung beim Kalb und der Fettmobilisierung bei hochleistenden
Milchkühen
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften
- Doctor rerum naturalium - (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von Stefanie Klinger
Bückeburg
Hannover 2012
1. Gutachter: Prof. Dr. Gerhard Breves
2. Gutachter: Prof. Dr. Stephan Steinlechner
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2012
Diese Arbeit wurde durch das BMBF (Bundesministerium für Bildung und Forschung) als Teilprojekt des Verbundprojekts MEGA-M (Metabolomische und genomische Analysen der Milch für gesunde Milchkühe) im Rahmen von FUGATOplus
INHALTSVERZEICHNIS
Publikationen ... VII
Abkürzungen und Einheiten... IX
Abbildungsverzeichnis ... XIII
Tabellenverzeichnis ... XVI
1 Einleitung... 1
1.1 Intestinale Glucoseabsorption ... 1
1.2 Intestinale Kohlenhydratverdauung beim Wiederkäuer... 3
1.3 Stoffwechselphysiologie in der frühen Laktation... 7
1.4 Intermediärstoffwechsels in der frühen Laktation ... 9
1.5 Fragestellung... 12
1.5.1 Ist die intestinale Glucoseaufnahme beim Rind durch die Fütterung einer kohlenhydratreichen Diät beeinflussbar? ... 12
1.5.2 Kann eine unterschiedlich hohe Fettmobilisierung bei hochleistenden Milchkühen in der frühen Laktation durch Veränderungen in der intestinalen Kohlenhydratverdauung erklärt werden? ... 13
2 Tiere, Material und Methoden... 14
2.1 Tiere und Probenentnahme ... 14
2.1.1 Kälber: Versuchstiere, Fütterung, Gruppeneinteilung, Probenentnahme .... 14 2.1.2 Laktierende Milchkühe: Auswahl der Versuchstiere und Probenentnahme. 16
2.2 Präparative Methoden ... 18
2.2.1 Präparation von Bürstensaummembranvesikeln (BSMV)... 18
2.2.2 Präparation apikaler Membranfragmente ... 20
2.2.3 Präparation von Lebergewebe: Mitochondrien und Cytosol ... 21
2.3 Analytische Methoden ... 23
2.3.1 Blutparameter (laktierende Milchkühe) ... 23
2.3.2 Bestimmung der Stärke- und Glucosekonzentrationen in Ingestaproben.... 23
2.3.3 Bestimmung des Proteingehalts... 24
2.3.4 Bestimmung der Anreicherung der BSM ... 25
2.3.4.1 Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase ... 25
2.3.4.2 Bestimmung der Aktivität der Na+-K+-ATPase ... 26
2.4 Funktionelle Untersuchungen... 29
2.4.1 Glucoseaufnahme in BSMV ... 29
2.4.1.1 Glucoseaufnahme in BSMV als Funktion der Zeit ... 31
2.4.1.2 Glucoseaufnahme in BSMV als Funktion der extravesikulären Glucosekonzentration ... 31
2.4.2 Enzymaktivitäten des hepatischen Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsels.... 33
2.4.2.1 Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK)... 34
2.4.2.2 Pyruvat-Carboxylase (PC) ... 35
2.4.2.3 Carnitin-Palmitoyl-Transferase I (CPTI)... 36
2.4.2.4 Glycerol-3-Phosphat-Acyltransferase (GPAT) ... 37
-Actin) ... 38
2.5.1 Puffer und Lösungen ... 38
2.5.2 Probenvorbehandlung/SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ... 39
2.5.3 Deglykosylierung von SGLT1 ... 39
2.5.4 Westernblot und Ponceau-Färbung... 40
2.6 Statistische Auswertungen ... 41
3 Ergebnisse... 43
3.1 Untersuchungen an Kälberproben ... 43
3.1.1 Luminale Stärke- und Glucosekonzentrationen im Dünndarm ... 43
3.1.2 Anreicherung der Bürstensaummembran... 44
3.1.3 Glucoseaufnahme in BSMV als Funktion der Zeit ... 44
3.1.4 Glucoseaufnahme in BSMV als Funktion der extravesikulären Glucosekonzentration ... 46
3.1.5 Expression von SGLT1 in jejunalen BSMV von Kälbern ... 48
3.1.5.1 Spezifität des SGLT1-Nachweises ... 48
3.1.5.2 Semiquantitativer SGLT1-Nachweis... 49
3.2 Untersuchungen an Proben von laktierenden Milchkühen ... 50
3.2.1 Blutparameter... 50
3.2.1.1 Freie Fettsäuren (FFS), -Hydroxybutyrat ( -HBS), Glucose.. 50
3.2.1.2 Leber- und Muskel-spezifische Enzyme im Serum... 51
3.2.2 Luminale Stärke- und Glucosekonzentrationen im Dünndarm ... 52
3.2.3 Funktionelle Untersuchungen an BSMV von laktierenden Milchkühen ... 53
3.2.3.1 Lokalisation der Na+-abhängigen Glucoseaufnahme entlang der Dünndarmachse ... 53
3.2.3.2 Anreicherung der BSM ... 55
3.2.3.3 Glucoseaufnahme in BSMV als Funktion der extravesikulären Glucosekonzentration ... 56
3.2.4. Molekularbiologischer SGLT1-Nachweis: Spezifität und semiquantitativer Nachweis ... 59
3.2.5 Funktionelle Untersuchungen zum Leberstoffwechsel ... 61
4 Diskussion... 62
4.1 Untersuchungen an Kälberproben ... 62
4.1.1 Luminale Stärke- und Glucosekonzentrationen im Dünndarm von Kälbern 62 4.1.2 Präparation jejunaler BSMV: Anreicherung der BSM ... 65
4.1.3 Messung der 3H-Glucoseaufnahme in jejunale BSMV ... 65
4.1.3.1 Zeitabhängige 3H-Glucoseaufnahme: Vesikelintegrität ... 65
4.1.3.2 Konzentrationsabhängige 3H-Glucoseaufnahme: Kinetik der Glucoseaufnahme in BSMV... 66
4.1.4 Spezifität des SGLT1-Nachweises ... 68
4.1.5 Semiquantitativer Nachweis der duodenalen und jejunalen SGLT1- Expression ... 69
4.1.6 Mögliche Mechanismen der Regulation der intestinalen Glucoseaufnahme beim Kalb ... 69
4.2 Untersuchungen an Proben von laktierenden Milchkühen ... 74
4.2.1 Tierauswahl ... 74
4.2.2 Probenentnahme... 75
4.2.3 Glucosekonzentration im Blut... 76
4.2.4 Leber- und Muskelspezifische Enzyme im Serum... 78
4.2.5 Luminale Stärke- und Glucosekonzentrationen... 79
4.2.6 Intestinale Na+-abhängige Glucoseaufnahme ... 81
4.2.6.1 Lokalisation der Na+-abhängigen Glucoseaufnahme entlang der Darmachse ... 81
4.2.6.2 Präparation duodenaler und jejunaler BSMV: Anreicherung der apikalen Membran ... 83
4.2.6.3 Messung der 3H-Glucoseaufnahme in duodenale und jejunale BSMV ... 84 4.2.7 Semiquantitativer Nachweis der duodenalen und jejunalen SGLT1-
4.2.8 Leberstoffwechsel ... 86
4.2.8.1 Zur Methodik der Gewebeaufbereitung und der Enzymaktivitätsmessungen ... 86
4.2.8.2 Enzyme des Kohlenhydratstoffwechsels: PC/PEPCK ... 89
4.2.8.3 Enzyme des Fettstoffwechsels: CPTI/GPAT ... 90
4.2.9 Mögliche Ursachen unterschiedlicher Fettmobilisierung bei gleicher Milchleistung ... 91
5 Zusammenfassung ... 95
6 Summary... 98
7 Anhang: Chemiekalien... 100
8 Literaturverzeichnis ... 103
Danksagung ... 120
Publikationen
Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht bzw. auf Tagungen vorgestellt:
Publikationen in Fachzeitschriften
KLINGER, S., B. NOCI, K. MULLER u. G. BREVES (2012):
Intestinal glucose absorption in calves as affected by different carbohydrate sources.
J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. (Berl). doi: 10.1111/j.1439-0396.2012.01277.x. [Epub ahead of print]
Vorträge
KLINGER, S., B. NOCI, K. MÜLLER, M. KUHN, M. ZURICH, G. BREVES (2009):
Effects of different carbohydrate sources on intestinal glucose absorption in calves.
Vortrag, 63. Jahrestagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 10.-12.03.2009 in Göttingen
Abstract in: Proc. Soc. Nutr. Physiol. 18, 135 KLINGER, S., H. MARTENS, G. BREVES (2010):
Intestinal glucose transport in lactating dairy cows with different extent of fat mobilisation.
Vortrag, 64. Jahrestagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 09.-11.03.2010 in Göttingen
Abstract: Proc. Soc. Nutr. Physiol. 19, 121 KLINGER, S., G. BREVES (2011):
Intestinaler Glucosetransport und Leberstoffwechsel bei Hochleistungskühen mit unterschiedlich stark ausgeprägter Fettmobilisierung in der frühen Laktation.
Vortrag: Physiologisches Kolloquium WS 11/12
Poster
KLINGER, S., G. BREVES (2009):
MEGA-M: In vitro Untersuchungen zur intestinalen Glucoseaufnahme bei Hoch- leistungsmilchkühen.
Poster: FUGATOplus Statusseminar 2009 14.-15.10.2009 in Kassel
Abstract: Tagungsband zum 2. FUGATO-Statusseminar 2009
KLINGER, S., G. BREVES (2010):
Intestinale Glucoseaufnahme bei Milchkühen mit hoher Leistung.
Poster: 19. Symposium der Fachgruppe Physiologie und Biochemie der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft
14. - 16.02.2010 in Hannover
Abstract: Tagungsband zum 19. Symposium der Fachgruppe Physiologie und Biochemie der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft, S. 80
KLINGER, S., G. BREVES (2011):
MEGA-M: Funktion und Expression des intestinalen Na+-abhängigen Glucose- transporters (SGLT1) bei laktierenden Milchkühen.
Poster: FUGATOplus Statusseminar 2011 09.-10.02.2011 in Kassel
Abstract: Tagungsband zum 2. FUGATO-Statusseminar 2011
Abkürzungen und Einheiten
Abkürzungen
AP alkalischen Phosphatase
ANOVA analysis of variance, Varianzanalyse
Asn Asparagin
AST Aspartataminotransferase
ATP Adenosintriphosphat
BSM Bürstensaummembran
BSMV Bürstensaummembranvesikel
c Konzentration
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat CPT1 Carnitin-Palmitoyltransferase I
CK Creatinkinase
Extinktionskoeffizient
Extinktion/Extinktionsänderung ENS enterisches Nervensystem
FFS freie Fettsäuren
FM Frischmasse
g Erdbeschleunigung
GIT Gastrointestinaltrakt GLUT2 Glucosetransporter Typ 2
GPAT Glycerol-3-phosphat-Acyltransferase GlDH Glutamatdehydrogenase
-Glutamyl-Transferase
-HBS -Hydroxybutyrat
HRP Meerrettichperoxidase, Horseradish peroxidase
KF Kraftfutter
Km Michaelis-Menten-Konstante
LM niedrigmobilisierend
MAT Milchaustauscher
ME metabolisierbare Energie
MDH Malatdehydrogenase
MJ Megajoule
mRNA messenger RNA
MW Mittelwert
MS Maissilage
n Probenanzahl
NEB negative Energiebilanz NEL Netto-Energie-Laktation NfE Stickstoff-freie Extraktstoffe
PAK Primärer Antikörper
PC Pyruvatcarboxylase
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung, phosphate buffered saline PEPCK Phosphoenolpyruvatcarboxykinase
PEPT1 Peptide transporter 1
p.p. post partum
Rückenfettdicke/Änderung der Rückenfettdicke
RT Raumtemperatur
SAK sekundärer Antikörper
SD Standardabweichung, Standard Deviation SEM Standardfehler, Standard Error of the Mean SGLT1 Na+-dependent glucose transporter 1
T Trockensubstanz
TAG Triacylglyceriden TMR Totale Mischration
UV ultraviolett
VLDL Very-Low-Density-Lipoprotein Vmax maximale Transportkapazität
w/v Gewicht pro Volumen, weight per volume
Einheiten
Bq Becquerel, Radioaktivtät, 1 Bq = 1s
°C Grad Celcius, Temperatur
Da Dalton, Einheit der atomaren Masse
dpm radioaktive Zerfälle pro Minute, disintegrations per minute
g Gramm, Masse
m Meter, Länge
min Minute
mol Mol, Stoffmenge
L Liter, Volumen
s Sekunde, Zeit
U katalytische Aktivität, enzyme unit
V Volumen
V Volt
Vorsätze für Einheiten
k kilo
c centi
m milli
n nano
µ mikro
p piko
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Milchleistung hoch- und niedrig mobilisierender Milchkühe in den ersten 100 Tagen der Laktation.
16
Abbildung 2 A) Abnahme der Rückenfettdicke (
Gruppen HM und LM zwischen dem dritten und 28 Tag p.p.
B) Laktationstag zum Zeitpunkt der Schlachtung der Tiere der Gruppen HM, LM und K. C) 305-Tage Milchleistung der vorangegangenen Laktation.
17
Abbildung 3 Schematische Darstellung der Verläufe der Gesamtglucoseaufnahme, der unspezifischen Glucoseaufnahme sowie der daraus berechneten Na+- spezifischen Glucoseaufnahme in BSMV als Funktion der extravesikulären Glucosekonzentration.
32
Abbildung 4 Stärke- und Glucosekonzentration in Ingestaproben (Mischproben) von Kälbern gefüttert mit Heu, Kraftfutter oder Maissilage.
43
Abbildung 5 3H-Glucoseaufnahme in jejunale BSMV von Kälbern als Funktion der Zeit bei einer konstanten extravesikulären Glucosekonzentration von 0,05 mmol -1 in Na+-Medium und K+-Medium.
45
Abbildung 6 Linearer Bereich der 3H-Glucoseaufnahme in jejunale BSMV von Kälbern als Funktion der Zeit im Bereich von 10 s bis 40 s bei einer konstanten extravesikulären Glucosekonzentration von 0,05 mmol -1 in Na+-Medium.
45
Abbildung 7 Verlauf der Glucoseaufnahme in jejunale BSMV von Kälbern als Funktion der extravesikulären Glucosekonzentration zwischen 0,01 und 1,5 mmol -1 in den Gruppen Heu, Maissilage und Kraftfutter.
47
Abbildung 8 Mittelwerte ± SEM der maximalen Transportkapazität (Vmax) in den Fütterungsgruppen Heu, Maissilage und Kraftfutter.
47
Abbildung 9 Qualitativer SGLT1-Nachweis in BSMV von je einem Tier der Gruppen Heu und Kraftfutter mittels Westernblot- Analyse.
48
Abbildung 11 Konzentration von freien Fettsäuren (A) -Hydroxybutyrat (B) und Glucose (C) im Blut von Tieren der Gruppen HM, LM und K zum Zeitpunkt der Schlachtung.
50
Abbildung 12 3H-Glucoseaufnahme in BSMV unterschiedlicher Darmabschnitte eines Tieres der Gruppe HM als Funktion der Zeit bei einer konstanten extravesikulären Glucosekonzentration von 0,05 mmol -1 in Na+-Medium und K+-Medium.
54
Abbildung 13 Na+-abhängige Komponente der Glucoseaufnahme in BSMV des mittleren und distalen Jejunums sowie des Ileums eines Tieres der Gruppe K als Funktion der extravesikulären Glucosekonzentration.
54
Abbildung 14 Verlauf der Glucoseaufnahme in duodenale BSMV von laktierenden Milchkühen als Funktion der Glucosekonzentration in den Gruppen HM, LM und K.
56
Abbildung 15 Verlauf der Glucoseaufnahme in jejunale BSMV von laktierenden Milchkühen als Funktion der Glucosekonzentration in den Gruppen HM, LM und K.
57
Abbildung 16 Mittelwerte ± SEM der maximalen Transportkapazität (Vmax) des Na+-abhängigen Glucosetransports in duodenale und jejunale BSMV der Gruppen HM, LM und K.
58
Abbildung 17 Mittelwerte ± SEM der Affinität (Km-Wert) des Na+- abhängigen Glucosetransports in duodenale und jejunale BSMV der Gruppen HM, LM und K.
58
Abbildung 18 Expression von SGLT1 entlang der Darmachse eines Tieres der Gruppe HM.
59
Abbildung 19 Semiquantitativer Nachweis der SGLT1-Expression -Actin) in apikalen Membranen von laktierenden Milchkühen der Gruppen HM, LM und K.
60
Abbildung 20 Schematische Darstellung der hypothetischen Entwicklung der intestinalen Substratkonzentration bei Fütterung von Milchaustauscher in Kombination mit stärkearmen und stärkereichen Diäten (A), der SGLT1-Verteilung und - Aktivität unter basalen Substratkonzentrationen (B) sowie möglicher Veränderungen dieser Parametern in Folge eventueller kurzfristiger Änderungen in der luminalen Substratverfügbarkeit durch Milchaustauscherfütterung (C).
73
Abbildung 21 Korrelation A) der Konzentration freier Fettsäuren und der - HBS-Konzentration im Blut aller Tiere B) der nach der Schlachtung gemessenen -HBS-Konzentration mit der Abnahme der Rückenfettdicke (
28. Tag post partum der vorangegangenen Laktation C) der nach der Schlachtung gemessenen Konzentration freier Fettsäuren mit der Abnahme der Rückenfettdicke (
zwischen den 3. und 28. Tag post partum der vorangegangenen Laktation.
75
Abbildung 22 Korrelation A) der Blutglucosekonzentration und der Konzentration freier Fettsäuren sowie der -HBS- Konzentration im Blut bzw. Plasma aller Tiere zum Zeitpunkt der Schlachtung B) der Blutglucosekonzentration zum Zeitpunkt der Schlachtung und der Abnahme der Rückenfettdicke (
partum der vorangegangenen Laktation.
77
Abbildung 23 Einzeltierwerte der Stärke- und Glucosekonzentrationen der Gruppen HM, LM und K entlang der Darmachse.
80
Abbildung 24 Abhängigkeit der intestinalen Glucosekonzentration von der entsprechenden Stärkekonzentration.
80
Abbildung 25 Einzeltierwerte und Mittelwerte der normierten SGLT1- Expression im Duodenum und proximalen Jejunum der Gruppen HM, LM und K.
85
Abbildung 26 Reproduzierbarkeit der mit den unter 2.4.2 beschriebenen Messmethoden zur Bestimmung der Aktivität von PC, PEPCK, GPAT und CPT1.
88
Abbildung 27 Abhängigkeit der PC- und PEPCK-Aktivität vom Laktationstag zum Zeitpunkt der Schlachtung.
90
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Inhaltsstoffe und Zusammensetzung des verfütterten Milchaustauschers nach Noci (2009).
14
Tabelle 2 Inhaltsstoffe und Zusammensetzung von Heu, Kraftfutter und Maissilage.
15
Tabelle 3 Trockensubstanzaufnahme (kg T -1) der Kälber im Alter von zehn Wochen (NOCI 2009).
15
Tabelle 4 Inkubationsbedingungen zur Immunodetektion von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen mittels spezifischer Antikörper.
41
Tabelle 5 Spezifische Aktivitäten [U -1] und Anreicherungen (P2/P1) der AP und Na+-K+-ATPase
44
Tabelle 6 Aktivitäten [U -1] klinisch chemisch relevanter Enzyme im Serum von laktierenden Milchkühen der Gruppen HM, LM und K.
51
Tabelle 7 Stärke- und Glucosekonzentrationen in Ingestaproben der entnommen Darmabschnitte von laktierenden Milchkühen
52
Tabelle 8 Charakterisierung duodenaler BSMV (Teil A) und jejunaler BSMV (Teil B) von laktierenden Milchkühen: spezifische Aktivitäten [U -1] und Anreicherungen (P2/P1) der alkalischen Phosphatase und Na+-K+-ATPase.
55
Tabelle 9 Aktivitäten [U -1] der Enzyme PEPCK, PC, CPTI und GPAT in Leberpräparationen von laktierenden Milchkühen der Gruppen HM, LM und K.
61
1 Einleitung
1.1 Intestinale Glucoseabsorption
Die Absorption von Glucose aus dem Dünndarm kann sowohl para- als auch transzellulär erfolgen, wobei der parazelluläre Transport mit etwa 10% (KREHBIEL et al. 1996; CANT et al. 1999) einen nur geringen Beitrag zur Gesamtabsorption von Glucose leistet. Der Großteil der Glucose wird durch den in den Enterocyten apikal lokalisierten Glucosetransporter SGLT1 (Na+-dependent glucose transporter 1, SLC5) aus dem Darmlumen in die Enterocyten aufgenommen (HEDIGER et al. 1987;
WRIGHT u. TURK 2004). Der Transport von Glucose und auch Galactose durch dieses integrale Membranprotein erfolgt als sekundär aktiver Transport entlang eines zelleinwärts gerichteten Na+-Gradienten (CRANE et al. 1961), der durch die Aktivität der basolateral lokalisierten Na+-K+-ATPase aufrecht erhalten wird (HORISBERGER et al. 1991). Ein großer Teil der apikal aufgenommenen Glucose wird basolateral durch den Glucosetransporter GLUT2 abgegeben (THORENS et al. 1990;
THORENS 1993) und dem Blutkreislauf zugeführt. Daran sind vor allem die vollständig differenzierten Enterocyten des oberen Abschnitts der Darmzotten beteiligt (FERRARIS u. DIAMOND 1992).
Die Glucoseabsorption in proximalen Abschnitten des Dünndarms durch SGLT1 scheint vornehmlich durch die Verfügbarkeit von Substraten reguliert zu sein. So ist die Na+-abhängige Glucoseaufnahme in vielen Spezies in Abhängigkeit vom Kohlenhydratgehalt der Nahrung bzw. von der luminalen Verfügbarkeit von Zuckern beeinflusst (FERRARIS u. DIAMOND 1997; FERRARIS 2001).
Die SGLT1-mRNA-Expression scheint zwar durch die luminale Kohlenhydratverfügbarkeit beeinflusst zu werden (LESCALE-MATYS et al. 1993;
VAYRO et al. 2001; LIAO et al. 2010), jedoch nicht unbedingt mit Änderungen in der apikalen SGLT1-Menge zu korrelieren (LESCALE-MATYS et al. 1993).
Auf Ebene der Proteinexpression sind als Antwort auf veränderte luminale Substratkonzentrationen langfristige Regulationsmechanismen durch Veränderungen der Proteinexpression (SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991a; MORAN et al. 2010) von
kurzfristigen Mechanismen z.B. durch die posttranslationale Veränderung der apikalen Transportermenge durch Endo- oder Exocytose (HIRSCH et al. 1996;
WRIGHT et al. 1997; KIPP et al. 2003; KHOURSANDI et al. 2004; CASTANEDA- SCEPPA et al. 2010; MORAN et al. 2010) zu unterscheiden. Auch Veränderungen der intrinsischen Transporteraktivität durch Proteinkinase-vermittelte Phosphorylierung (ISHIKAWA et al. 1997; VAYRO u. SILVERMAN 1999;
KHOURSANDI et al. 2004; KIMURA et al. 2005; SUBRAMANIAN et al. 2009) werden diskutiert.
In den letzten Jahren wurde ein weiteres Modell entwickelt. Es beschreibt, dass die SGLT1-Expression neben dem direkten Einfluss von Glucose und der Wirkung verschiedener Modulatoren wie Insulin, die einen Einfluss von der Blutseite ausüben (HARMON u. MCLEOD 2001), maßgeblich durch die Signale eines luminal gelegenen Sensors beeinflusst wird, da in vielen Studien neben dem Einfluss luminaler Glucose auch nicht metabolisierbare oder nicht durch SGLT1 zu transportierende Zucker einen Einfluss auf die Na+-abhängige Glucoseaufnahme ausübten (SOLBERG u. DIAMOND 1987; LESCALE-MATYS et al. 1993;
MIYAMOTO et al. 1993; DYER et al. 2003).
Die Wirkung eines solchen Sensors wird vermutlich durch das enterische Nervensystem (ENS) vermittelt (PFANNKUCHE u. GABEL 2009). Als ein möglicher Sensor könnte SGLT3 eine Rolle spielen (DIEZ-SAMPEDRO et al. 2003; FREEMAN et al. 2006; RAYBOULD 2007). Des Weiteren wird in vielen Studien eine Bedeutung der sweet-taste-Rezeptoren T1R2/T1R3 herausgestellt (DYER et al. 2005; LE GALL et al. 2007; MARGOLSKEE et al. 2007; MACE et al. 2009; MORAN et al. 2010) . Diese Proteine werden auf der luminalen Seite enteroendokriner Zellen im Darm exprimiert. Durch ihre Aktivierung wird eine Signalkaskade in Gang gesetzt, die zur basolateralen Sekretion von Inkretinen führt, die auf das ENS wirken, was letztendlich zu erhöhten cAMP-Spiegeln in den Enterocyten führt. Dies führt zu einer erhöhten SGLT1-Expression (SHIRAZI-BEECHEY et al. 2011).
Der weitaus größte Teil der oben zusammengefassten Arbeiten zur Regulation des intestinalen Glucosetransports wurde an Labortieren oder in Zellkulturmodellen
Glucosekonzentrationen beim monogastrischen Tier weit höher sind als beim Wiederkäuer und stärkeren Schwankungen nach Nahrungsaufnahme unterliegen.
So wurde beispielsweise am Schwein deutlich gezeigt, dass Regulationsmechanismen auf Ebene der mRNA-Expression, der Proteinexpression und der Aufnahme von Glucose in BSMV erst bei der Fütterung von Diäten, die etwa zu 50% aus Kohlenhydraten bestehen, induziert werden (MORAN et al. 2010). Da der Kohlenhydratgehalt der Nahrung und vor allem die intestinale Kohlenhydratverfügbarkeit beim Wiederkäuer deutlich niedriger sind als beim Monogastrier, ist unklar, inwieweit die oben genannten Mechanismen bei Wiederkäuern überhaupt von Bedeutung sein können.
1.2 Intestinale Kohlenhydratverdauung beim Wiederkäuer
In vielen Studien beobachtet man bei präruminierenden Wiederkäuern, analog zum monogastrischen Tier, durchaus eine intestinale Aufnahmekapazität für Glucose und detektiert die Expression von SGLT1 (SCHARRER 1976; SHIRAZI-BEECHEY et al.
1989; WOLFFRAM et al. 1990; SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991a; WOOD et al.
2000).
Im Gegensatz zum präruminierenden Wiederkäuer oder zum monogastrischen Tier werden die Kohlenhydrate aus der Nahrung beim adulten Wiederkäuer jedoch nur zu einem geringen Teil durch körpereigene Enzyme in Monosaccharide gespalten und intestinal absorbiert, sondern im Pansen durch Mikroorganismen zu kurzkettigen Fettsäuren umgesetzt, die vor allem über das Pansenepithel absorbiert werden.
Insbesondere Propionat wird in der Leber zur Gluconeogenese verwendet (YOUNG 1977). Dies führt dazu, dass mit 5-20% (JANES et al. 1985; HUNTINGTON 1997) nur ein gewisser Teil der mit der Nahrung aufgenommenen Kohlenhydrate als Substrate für intestinale -Amylase und Disaccharidasen (CLARY et al. 1968;
HARMON 1993) zur Verfügung stehen, um dann als Monosaccharide über das Dünndarmepithel absorbiert werden zu können. Dementsprechend findet man beim ruminierenden Wiederkäuer verglichen mit präruminierenden Tieren eine deutlich verminderte intestinale Na+-abhängige Glucoseaufnahme und SGLT1-Expression
(SCHARRER 1973, 1974; SCHARRER et al. 1979; SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991a;
WOOD et al. 2000).
Allerdings ist der Anteil der Kohlenhydrate, der für eine intestinale Verdauung zur Verfügung steht, in Abhängigkeit von der Futterzusammensetzung und der ruminalen Verdaulichkeit der Kohlenhydratquellen durchaus variabel. Unter bestimmten Fütterungsbedingungen, z.B. hohen Anteilen von Maisstärke in der Ration, können bis zu 3,5 kg Stärke den Dünndarm adulter Tiere erreichen (REYNOLDS et al. 1997).
Die Bedeutung der Fragestellung, in welchem Ausmaß die intestinale Kohlenhydratverdauung beim adulten Wiederkäuer relevant sein kann, wird deutlich, wenn man sich vor Augen führt, dass die gewonnene Nettoenergie durch ruminale Fermentation von Kohlenhydraten nur etwa 70% der Energie beträgt, die durch die intestinale Verdauung von Kohlenhydraten gewonnen werden kann (BLACK 1971;
OWENS et al. 1986; HARMON u. MCLEOD 2001). Dieser Vorteil der intestinalen Kohlenhydratverdauung gegenüber dem ruminalen Abbau führt jedoch nur bei einer entsprechend hohen Verdaulichkeit von Kohlenhydraten in postruminalen Kompartimenten des Gastrointestinaltrakts zu einem energetischen Vorteil.
Besonders bei einem hohen Leistungsumsatz und begrenzter Futteraufnahme wie zu Beginn der Laktation ist eine effiziente Nutzung der aufgenommenen Energie von großer Bedeutung (siehe 1.3).
Dementsprechend wurden vielfältige Versuche durchgeführt, die darauf abzielten, zu klären, inwieweit die intestinale Kohlenhydratverdauung beim adulten Wiederkäuer effektiv erfolgen kann.
In unterschiedlichsten Studien wurde deswegen die ruminale und postruminale Kohlenhydratverdaulichkeit beim Rind untersucht. Beispielsweise wurde in einer Studie zur Verdaulichkeit maisbasierter Futtermittel (ZINN 1990) festgestellt, dass die ruminale Stärkeverdaulichkeit zwischen 70 und 86% liegt. Die Menge an Stärke, die den Dünndarm erreicht, wird in diesem zu 50 bis 96% verdaut. Die maximale Stärkemenge distal des Labmagens betrug hier allerdings lediglich 860 g/Tag. Diese wurden intestinal zu 54% verdaut. Höhere Verdaulichkeiten wurden bei deutlich geringeren postabomasalen Stärkekonzentrationen festgestellt (ZINN 1990). Ein
duodenalen Stärkekonzentration wurde in den Untersuchungen von MATTHE et al.
(2001) beobachtet.
Ebenso waren die ilealen Glucose- bzw. Stärkemengen nach abomasalen Infusionen von Glucose oder Maisstärke gut mit den jeweils infundierten Mengen zu korrelieren (KREIKEMEIER et al. 1991; KREIKEMEIER u. HARMON 1995). Eine ebensolche negative Korrelation zwischen der duodenalen Stärkeverfügbarkeit und der Effizienz der intestinalen Kohlenhydratverdaulichkeit wurde in weiteren Studien beobachtet (BRANCO et al. 1999). Allerdings zeigten andere Daten, die auf das Tiergewicht bezogen wurden, durchaus einen linearen Zusammenhang der Stärkemenge und der Stärkeverdauung im Dünndarm (OWENS et al. 1986). Die postruminale Stärkeverdaulichkeit betrug jedoch auch hier lediglich 50%.
Aus diesen und anderen Studien wurde geschlossen, dass die intestinale Kohlenhydratverdauung beim Wiederkäuer limitiert ist. Es stellt sich also die Frage, welche Strukturen möglicherweise die intestinale Kohlenhydratverdauung beim adulten Wiederkäuer begrenzen könnten.
Wichtige Faktoren sind die Aktivität bzw. die Menge an -Amylase und Disaccharidasen (Maltase/Saccharase-Isomaltase) im Dünndarm (SHIRAZI- BEECHEY et al. 1989; SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991b; HARMON 1992, 1993;
KREIKEMEIER u. HARMON 1995; HUNTINGTON 1997). Während von einigen Autoren die -Amylase-Aktivität als begrenzend beschrieben wird (HUNTINGTON 1997), schließen andere diesen Faktor eher aus (KREIKEMEIER u. HARMON 1995).
Entlang der Darmachse findet man eine nahezu konstante (RODRIGUEZ et al. 2004) bzw. nur langsam abfallende (BAUER et al. 2001a; GUIMARAES et al. 2007) Maltase-Aktivität. Dabei sind die Aktivitäten von Maltase und auch Isomaltase beim Wiederkäuer eher niedrig (GALAND 1989) und scheinen weitgehend unbeeinflusst von der Futter- bzw. Ingestazusammensetzung zu sein (JANES et al. 1985;
KREIKEMEIER et al. 1990; SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991b; GUIMARAES et al.
2007). Eine Saccharase-Aktivität konnte bislang bei Rind nicht nachgewiesen werden (KREIKEMEIER et al. 1990; HARMON u. MCLEOD 2001).
Ein weiterer Faktor, der die intestinale Kohlenhydratverdauung beim Wiederkäuer begrenzen könnte, ist die intestinale Absorptionskapazität für Glucose, da auch bei
abomasaler Infusion ansteigender Glucosemengen steigende Glucosemengen in den ilealen Ingesta gefunden wurden (KREIKEMEIER et al. 1991)
Versuche zur Substratinduktion von SGLT1 (siehe 1.1) beim Wiederkäuer wurden vielfach durch den Vergleich der intestinalen Glucoseaufnahme nach ruminaler und postruminaler Infusion verschiedener Substratlösungen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Infusionsversuche gestalten sich sehr unterschiedlich. Beim Schaf beobachtete man nach duodenaler Glucoseinfusion einen vielfachen Anstieg der SGLT1-Expression und Aktivität (SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991a; LESCALE- MATYS et al. 1993) bei nur moderatem Anstieg der SGLT1-mRNA-Expression (LESCALE-MATYS et al. 1993). SGLT1-mRNA findet man beim Rind im Duodenum, Jejunum und Ileum (ZHAO et al. 1998; GUIMARAES et al. 2007; LIAO et al. 2010).
Ruminale und abomasale Stärkeinfusionen beeinflussen dabei die mRNA- Expression im Duodenum und im Ileum (LIAO et al. 2010). Postruminale Infusionen von Stärke- oder Glucoselösungen führen aber beim Rind zu keinen oder nur geringfügigen Anstiegen in der intestinalen Glucoseaufnahme (BAUER et al. 2001a;
BAUER et al. 2001b; RODRIGUEZ et al. 2004; GUIMARAES et al. 2007), wobei die SGLT1-Proteinexpression nicht signifikant durch diese Infusionen beeinflusst wird (RODRIGUEZ et al. 2004; GUIMARAES et al. 2007).
In einem Fütterungsversuch an Rindern konnte weiterhin kein Unterschied in der SGLT1-Expression zwischen Tieren festgestellt werden, deren Rationen unterschiedliche Stärkegehalte aufwiesen (LOHRENZ et al. 2011). Die Autoren dieser Studie diskutierten unter anderem eine veränderte SGLT1-Aktivität.
In Fütterungsversuchen an wachsenden Ziegen konnte jedoch in In-vitro-Versuchen an BSMV durchaus ein Einfluss der alimentären Stärkemenge auf die intestinale Glucoseaufnahmekapazität gemessen werden (ZURICH 2009). Allerdings war dieser Effekt weder in Ussing-Kammer-Versuchen als Unterschied in den Netto-Fluxraten darzustellen, noch konnte eine unterschiedliche Expression von SGLT1 in BSMV gezeigt werden (ZURICH 2009).
In anderen In-vitro-Experimenten an Gewebeproben von Milchkühen in Ussing- Kammern konnte durchaus ein Einfluss der mucosalen Glucosekonzentration auf die
wurde auch festgestellt, dass Epithelien von Milchkühen in der frühen Laktation eine höhere maximale Transportkapazität für Glucose aufweisen als Epithelien von Tieren in späteren Laktationsphasen (OKINE et al. 1994). Allerdings wurden diese Unterschiede erst bei sehr hohen mucosalen Glucosekonzentrationen beobachtet, die beim Wiederkäuer kaum physiologische Relevanz haben dürften (FERRARIS et al. 1990).
Es ist also bislang weitgehend unklar, welche Faktoren die intestinale Kohlenhydratverdauung beim Wiederkäuer begrenzen und welche Rolle die intestinale Glucoseaufnahme beim Rind in-vivo, vor allem in der frühen Laktation spielen könnte.
1.3 Stoffwechselphysiologie in der frühen Laktation
Mit dem Ende der Trächtigkeit und dem Einsetzen der Laktation muss sich der Energiestoffwechsel der Milchkuh grundlegenden Veränderungen im Energiebedarf anpassen. Zum Ende der Trächtigkeit dominiert eine anabole Stoffwechselsituation, wohingegen um den Zeitpunkt der Abkalbung und damit einsetzender Laktation eine katabole Stoffwechselsituation eingeleitet wird.
Dabei tritt zu Beginn der Laktation physiologischerweise bei den meisten Milchkühen eine Zeit negativer Energiebilanz (NEB) auf. Die Energieaufnahme durch das Futter ist also niedriger, als es Erhaltungsumsatz und Leistungsumsatz erfordern. Während der Leistungsumsatz des Tieres vor der Abkalbung vor allem durch die Versorgung des Fetus bestimmt wird, steigt der Leistungsbedarf durch die einsetzende und stetig ansteigende Milchbildung drastisch an und kann bei hochleistenden Milchkühen am Laktationsmaximum ein Vielfaches des Erhaltungsumsatzes betragen.
Die Aufnahme der benötigten Energiemengen mit dem Futter ist in dieser Zeit nicht möglich, da zum einen die Trockensubstanzaufnahmekapazität und der Energiegehalt des Futters begrenzt sind und zum anderen ein physiologischer, durch verschiedene Faktoren bestimmter Abfall der Trockensubstanzaufnahme in den Tagen vor der Geburt zu verzeichnen ist, der erst den folgenden Laktationswochen wieder ausgeglichen werden kann (INGVARTSEN u. ANDERSEN 2000; PETERSON et al. 2005; BREVES u. RODEHUTSCORD 2007).
Eine Steigerung der aufgenommenen Energie durch Erhöhung der Energiedichte im Futter geht mit einer Reduzierung des Strukturanteils der Ration einher und ist aufgrund der verstärkten Fermentationsprozesse und dem damit verbundenen Auftreten subakuter und akuter Pansenazidosen nur begrenzt möglich (ALLEN 1997;
ZEBELI et al. 2012). Die Ausbildung einer negativen Energiebilanz ist also vor allem bei hohen Milchleistungen unvermeidbar.
Man beobachtete in den letzten 50 Jahren nahezu eine Verdopplung der durchschnittlichen Laktationsleistung von ca. 5000 auf 9000 l (SCHWERIN 2009).
Das Ausmaß und die Dauer der NEB werden durch die Zucht auf sehr hohe durchschnittliche Laktationsleistungen deutlich erhöht.
Dies hängt auch damit zusammen, das eine zur Leistung analoge züchterische Selektion auf höhere Futteraufnahmen nur begrenzt möglich ist, da die Heritabilität der Futteraufnahme deutlich unter der der Milchleistung liegt (HOOVEN et al. 1972;
GRAVERT 1985; KORVER 1988). Dementsprechend ist der phänotypische Zusammenhang zwischen Milchleistung und Energieaufnahme vor allem während der frühen Laktation eher gering (HOOVEN et al. 1972).
Der Energiebedarf der Milchkuh in der frühen Laktation kann also insbesondere bei hohen Milchleistungen nicht allein durch die Nahrung gedeckt werden, so dass der Organismus gezwungen ist, anabole Prozesse weitgehend einzustellen und katabole Prozesse zum Zweck der Deckung des Energiedefizits bevorzugt auszuführen.
So wird es, abhängig von der Ausprägung der NEB notwendig, Körperreserven, vor allem Körperfett- aber möglicherweise auch Proteinreserven, zur Kompensation des Energiedefizits zu verwenden.
Geschieht dies zu schnell oder in zu starkem Ausmaß, ist mit verschiedenen metabolischen Entgleisungen zu rechnen, die sich entweder direkt oder indirekt auf die Tiergesundheit, die Milchleistung und letztendlich die Nutzungsdauer auswirken.
So sind verschiedene Erkrankungen, die auch unter den Oberbegriff Produktionskrankheiten zusammengefasst werden, mit hoher Milchleistung bzw. der negativen Energiebilanz in der frühen Laktation assoziiert (GOFF u. HORST 1997;
FLEISCHER et al. 2001; PRIEN 2006). Dazu zählen Ketose, Leberverfettung,
Fruchtbarkeitsstörungen sowie verschiedene Infektionskrankheiten, die durch Immunsuppression verstärkt auftreten.
In den letzten Jahren wurde jedoch auch beobachtet, dass das Anpassungsvermögen hochleistender Milchkühe an die negative Energiebilanz durchaus unterschiedlich ist und dass eine hohe Milchleistung auch bei moderater Mobilisierung von Körperreserven realisierbar sein kann (KESSEL et al. 2008;
HAMMON et al. 2009; VAN DORLAND et al. 2009). Die Grundlagen, die dieser unterschiedlichen Anpassungsfähigkeit zu Grunde liegen, sind jedoch zum jetzigen Zeitpunkt weitgehend unklar.
1.4 Intermediärstoffwechsels in der frühen Laktation
In Zuständen positiver oder ausgeglichener Energiebilanz sind Wiederkäuer fähig, bis zu 90% ihres Glucosebedarfs durch Gluconeogenese zu decken. Lediglich etwa 10% der benötigten Glucose werden direkt aus dem Gastrointestinaltrakt absorbiert (YOUNG 1977). Den Hauptbeitrag zum Pool der Gluconeogenesesubstrate liefert Propionat, aber auch glucoplastische Aminosäuren, Glycerin und L-Lactat und stellen wichtige Glucosevorläufer dar (HUNTINGTON 1990). Mit steigendem Leistungsumsatz bei steigendem Glucosebedarf der Milchdrüse ist die benötigte Glucosemenge nicht allein durch Gluconeogenese aus Propionat, Glycerin, Aminosäuren und Lactat zu decken.
So stellte beispielsweise BELL (1995) auf der Basis verschiedener Studien folgende quantitative Schätzung für Tiere an Tag 4 p.p. auf: Unter der unrealistischen Annahme, dass die aus Propionat und Aminosäuren gebildete Menge Glucose komplett der Milchdrüse zur Verfügung stehen würde, wären lediglich 65% des Glucosebedarfs der Milchdrüse gedeckt. Der obligatorische Glucosebedarf aller anderen Gewebe bleibt bei dieser Schätzung unberücksichtigt. Es wird damit deutlich, dass es unumgänglich ist, bei hoher Milchleistung Körperreserven zu mobilisieren. Neben Aminosäuremobilisierung aus dem Skelettmuskel ist vor allem eine Nettofreisetzung von freien Fettsäuren und Glycerin aus dem Fettgewebe zu verzeichnen. Das dabei freigesetzte Glycerin kann ebenfalls in der Gluconeogenese
verwendet werden und so der Milchdrüse weitere 15 bis 20 % ihres Glucosebedarfs zur Verfügung stellen (BELL 1995).
Im Bezug auf den hepatischen Kohlenhydratstoffwechsel konnte in den letzten Jahren durch verschiedene Untersuchungen das Enzym Pyruvatcarboxylase, das mit der Bildung von Oxalacetat den ersten Schritt in der Gluconeogenese katalysiert, als sensitiv gegenüber metabolischen Veränderungen bezüglich der Energiebilanz des Organismus identifiziert werden. So steigt die hepatische PC-mRNA Expression, die eng mit der Aktivität korreliert ist, um die Geburt stark an, während die mRNA des zweiten wichtigen regulatorischen Enzyms der Gluconeogenese, der Phosphoenolpyruvatcarboxykinase, nur leicht vermehrt synthetisiert wird (GREENFIELD et al. 2000). Dies könnte im Sinne einer Kanalisierung von Gluconeogenesesubstraten in Richtung des oxidativen Abbaus gedeutet werden (GREENFIELD et al. 2000), durch den ein vermehrter A -Oxidation gebildeten Acetyl-Coenzym A ermöglicht würde, was einem Absinken der Substratkonzentration, die für die Ketogenese zur Verfügung steht, gleichkäme. Dies wird bestätigt durch die Beobachtung, dass bei Tieren, die einen hohen Leberfettgehalt aufweisen und entsprechend hohe Konzentrationen freier Fettsäuren im Blut zeigen, eine deutlich höhere PC-mRNA Menge gefunden wurde als bei Tieren mit niedrigem Leberfettgehalt, während PEPCK unbeeinflusst war (HAMMON et al. 2009). Gleiches gilt für Kühe, deren Energieversorgung restirktiv war (VELEZ u.
DONKIN 2005).
Freie Fettsäuren werden zur Leber transportiert und gehen nach Aktivierung in die -Oxidation ein. Neben Reduktionsäquivalenten sind Acetyl-Coenzym A und Propionyl-Coenzym A Produkte der -Oxidation. Während Acetyl-Coenzym A direkt im Citratzyklus umgesetzt werden kann, wird Propionyl-Coenzym A durch Umsetzung zu Succinyl-Coenzym A der Eintritt in den Citratzyklus ermöglicht.
Als der maßgebende Schritt für den Substratfluss durch die -Oxidation wird vielfach der Import von freien Fettsäuren (FFS) in die Mitochondrien durch
beschrieben (KERNER u. HOPPEL 2000). Für den Wiederkäuer wurde entsprechend gezeigt, dass die CPTI-Aktivität in der frühen Laktation, also bei starker FFS-Anflutung in der Leber, hoch ist und im Verlauf der Laktation bei sinkender Fettmobilisation abnimmt (AIELLO et al. 1984; DANN u. DRACKLEY 2005). Ebenso wurde eine Abhängigkeit der Palmitatoxidation und des Leber TAG- Gehalts von der hepatischen Carnitinkonzentration festgestellt (CARLSON et al.
2007).
Bei einer starken Anflutung freier Fettsäuren in der Leber und damit vermehrt stattfindender -Oxidation wird überschüssiges Acetyl-Coenzym A zu Ketonkörpern umgesetzt. Da dies in der frühen Laktation in großem Umfang stattfindet, besteht die Gefahr der Entwicklung einer Ketose.
Übersteigt die FFS-Aufnahme in die Leber die Möglichkeiten von -Oxidation, Ketogenese und des Exportes als VLDL (Very-Low-Density-Lipoprotein), kommt es darüber hinaus zur Speicherung der FFS in Form von Triacylglyceriden (TAG) und letztendlich zur Ausbildung von Fettlebern. Dafür sind Wiederkäuer prädisponiert, da bei ihnen die VLDL-Bildung beschränkt ist (EMERY et al. 1992; GRUFFAT et al.
1996).
Das erste und damit auch entscheidende Enzym in der TAG-Synthese ist Glycerol-3- phosphat-Acyltransferase (GPAT). CPTI und GPAT stehen somit in Konkurrenz um ihre Substrate und sind als Schaltstelle in der Kanalisierung von Fettsäuren in Richtung Oxidation bzw. Speicherung anzusehen.
Während der Phase der negativen Energiebilanz sind also verschiedene Stoffwechselwege von besonderer Bedeutung: Gluconeogenese, -Oxidation und Ketogenese. Gluconeogenese und -Oxidation stehen in Konkurrenz um Oxalacetat, das sowohl als Substrat der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase als auch als Kondensationspartner des Acetyl-Coenzym A zu dessen Einschleusung in den Citratzyklus von entscheidender Bedeutung für den Ablauf beider Stoffwechselwege ist.
1.5 Fragestellung
1.5.1 Ist die intestinale Glucoseaufnahme beim Rind durch die Fütterung einer kohlenhydratreichen Diät beeinflussbar?
Wie unter 1.2 beschrieben, ist nach wie vor nicht eindeutig geklärt, inwieweit die generell greifenden Mechanismen zur intestinalen Glucoseaufnahme auch beim Wiederkäuer, vor allem unter praxisrelevanten Fütterungsbedingungen, eine Rolle spielen.
Das Modell des Wiederkäuers im Übergang von einer vorwiegend dem monogastrischen Tier entsprechenden Verdauungsphysiologie zu Beginn der Vormagenentwicklung zum ruminierenden Wiederkäuer könnte Hinweise darauf liefern, inwieweit ein entwicklungsbedingter Abfall in der intestinalen Glucoseaufnahmekapazität durch die Fütterung entsprechender stärkehaltiger Rationen beim Absetzen vermindert oder verzögert werden kann.
Zu diesem Zweck wurde zunächst untersucht, inwieweit sich die Fütterung verschiedener stärkehaltiger Rationen auf die Parameter der jejunalen Glucoseaufnahme bei zehn Wochen alten Kälbern auswirkt.
Hieraus könnte man Hinweise darauf erhalten, inwieweit die intestinale Glucoseaufnahme beim adulten Wiederkäuer induzierbar ist bzw. inwieweit die Fähigkeit zur Regulation der intestinalen Glucoseaufnahme die postruminale Kohlenhydratverdauung begrenzt.
Dazu wurden nach 10-wöchiger Fütterung von Kälbern mit verschiedenen Rationen die jejunalen Stärke- und Glucosekonzentrationen gemessen, kinetische Parameter des intestinalen Na+-abhängigen Glucosetransport an isolierten jejunalen BSMV gemessen und die apikale SGLT1-Expression durch Western Blot Analysen semiquantitativ untersucht.
1.5.2 Kann eine unterschiedlich hohe Fettmobilisierung bei hochleistenden Milchkühen in der frühen Laktation durch Veränderungen in der intestinalen Kohlenhydratverdauung erklärt werden?
Wie unter 1.3 dargestellt ist die Anpassungsfähigkeit hochleistender Milchkühe an metabolische Herausforderungen in der frühen Laktation bei gleicher Laktationsleistung durchaus unterschiedlich. Dies spiegelt sich in verschiedenen Parametern wieder, die das Ausmaß einer negativen Energiebilanz anzeigen. Am Beispiel von drei Tiergruppen sollten folgende Fragen beantwortet werden:
1. Ist im Dünndarm adulter, unbehandelter Milchkühe ein intestinaler Na+- abhängiger Glucosetransport bzw. die Expression von SGLT1 nachweisbar?
2. Können in Abhängigkeit von der Fettmobilisierung in der frühen Laktation bei gleicher Milchleistung Veränderungen in der intestinalen Glucoseaufnahme beobachtet werden?
3. Sind die Aktivitäten von Schlüsselenzymen der hepatischen Gluconeogenese oder der -Oxidation bei Tieren mit unterschiedlicher Adaptationsfähigkeit an negative Energiebilanzen beeinflusst?
Diese Fragen wurden anhand von Gewebe- und Blutproben hochleistender Milchkühe untersucht, die bei gleicher Milchleistung eine stark unterschiedliche Mobilisierung von Körperfettreserven in der frühen Laktation zeigten.
2 Tiere, Material und Methoden
2.1 Tiere und Probenentnahme
2.1.1 Kälber: Versuchstiere, Fütterung, Gruppeneinteilung, Probenentnahme Für die Untersuchungen am Intestinum des Kalbes standen Proben des proximalen Jejunums von Kälbern (Deutsche Schwarzbunte x Holstein Friesian) zur Verfügung, die im Rahmen einer Studie der Klinik für Klauentiere, FU Berlin (NOCI 2009) gehalten wurden. Den Ergebnissen dieser Studie ist zu entnehmen, dass die Tiere über den gesamten Versuchszeitraum keine gesundheitlichen Probleme zeigten. Zu Beginn des Fütterungsversuches waren die Tiere zwischen drei und vier Tagen alt.
Die Tiere wurden in fünf Fütterungsgruppen eingeteilt, die zusätzlich zur Milchaustauschertränke (Tabelle 1) verschiedene Diäten bestehend aus Rauh- oder Kraftfutter ad libitum erhielten (Tabelle 2). Die Kontrollgruppe (Gruppe Heu, n=4) erhielt ausschließlich Heu, während der Gruppe MS (n=6) Maissilage mit 5% Stroh und der Gruppe KF (n=4) Kraftfutter angeboten wurde. Zwei weitere Gruppen erhielten Kombinationen aus Kraftfutter und Heu (KF/Heu, n=4) oder Kraftfutter und Maissilage (KF/MS, n=4). Tiere dieser beiden Gruppen nahmen nahezu ausschließlich Kraftfutter auf (Tabelle 3), weshalb diese Tiere der Gruppe KF zugeordnet wurden. Damit ergab sich für diese Gruppe eine Anzahl von n=11 Tieren.
Tabelle 1: Inhaltsstoffe und Zusammensetzung des verfütterten Milchaustauschers nach Noci (2009).
Die Kälber erhielten im Alter von zehn Wochen 2 Liter (125 g l-1) Milchaustauscher pro Tier und Tag.
Rohprotein 21,2 %
Rohfett 17,0 %
Rohfaser 0,0 %
Rohasche 8,7 %
gesamte Kohlenhydrate 50,4 %
Lactose 41,4 %
Tabelle 2: Inhaltsstoffe und Zusammensetzung von Heu, Kraftfutter und Maissilage. Diese Futtermittelanalysen wurden der Arbeit von Noci (2009) entnommen.
Heu Kraftfutter Maissilage
Trockensubstanz [g kg-1] 928 889 307
Rohprotein [g kg T-1] 143 203 87
Rohfett [g kg T-1] 15,1 42,4 26,5
Rohfaser [g kg T-1] 298 128 195
Rohasche [g kg T-1] 109 83,1 37,7
Stärke [g kg T-1] 2,2 157 274
NfE [g kg T-1] 435 544 654
ME [MJ kg T-1] 8,6 11,5 10,7
Tabelle 3: Trockensubstanzaufnahme (kg T/Tag) der Kälber im Alter von zehn Wochen (NOCI 2009).
Tiere der Gruppen KF/Heu und KF/MS nahmen vergleichbare Mengen Kraftfutter auf wie Tiere der Gruppe KF, während die Aufnahme von Heu, Maissilage und Stroh in den Gruppen KF/Heu und KF/MS niedrig blieb.
Heu Kraftfutter Maissilage Stroh
Gruppe Heu 1,79 ± 0,14 - - -
Gruppe MS - - 1,10 ± 0,32 0,14 ± 0,04
Gruppe KF - 2,56 ± 0,61 - -
Gruppe KF/Heu 0,12 ± 0,18 2,88 ± 0,33 - -
Gruppe KF/MS - 2,71 ± 0,81 0,11 ± 0,12 0,02 ± 0,02
Nach zehnwöchiger Versuchsphase wurden die Tiere durch Bolzenschuss betäubt und entblutet. Die Organentnahme erfolgte schnellstmöglich nach Betäubung durch Bolzenschuss und Entbluten. Unmittelbar nach Eröffnung der Bauchhöhle wurden Proben des proximalen Jejunums entnommen. Diese wurden mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gespült, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert. So sollte es gelungen sein, Degradationsprozesse, z.B. durch die Aktivität von Proteasen, auf ein Minimum zu reduzieren. Des Weiteren wurden bei einigen Tieren (Heu-Gruppe n=3, MS-Gruppe n=3, KF-Gruppe n=5) Mischproben des Darminhalts des gesamten Dünndarms entnommen, die bei -20°C gelagert wurden. Die Entnahme solcher Proben gestaltet
sich schwierig, da davon auszugehen ist, dass schon während der Tötung des Tieres und vor allem während der Organentnahme Durchmischungsprozesse stattfinden
2.1.2 Laktierende Milchkühe: Auswahl der Versuchstiere und Probenentnahme Als Parameter zur Charakterisierung der Stoffwechselsituation von Milchkühen wurde die Abnahme der Rückenfettdicke (RFD) in der frühen Laktation verwendet (STAUFENBIEL et al. 2003). Zur Auswahl der in dieser Arbeit verwendeten Tiere wurden dabei Daten aus einer vorangegangenen Studie (Prof. Dr. Holger Martens, FU Berlin, Institut für Veterinärphysiologie) zugrunde gelegt, in der der Verlauf der Abnahme der Rückenfettdicke von 96 Färsen und 162 Kühen in den ersten 100 Tagen der Laktation verfolgt wurde. Dabei konnten die Tiere, geordnet nach Abnahme der RFD zwischen dem 3. Tag p.p. und dem 28. Tag p.p., in drei Gruppen unterteilt werden (Abb. 1): Tiere mit starker Abnahme der Rückenfettdicke und hoher Milchleistung ( RFD 16-27 mm: hoch mobilisierend, HM), Tiere mit geringer Abnahme der Rückenfettdicke und ebenfalls hoher Milchleistung ( RFD 8-12 mm:
niedrig mobilisierend, LM) sowie Tiere, die bei geringer Abnahme der RFD eine noch höhere Milchleistung als HM-Tiere zeigten ( RFD 8-12 mm: LM mit hohen Milchleistungen).
Abbildung 1: Milchleistung hoch- und niedrig mobilisierender Milchkühe in den ersten 100 Tagen der Laktation. Daten und Abbildung: Prof. Dr. Holger Martens, FU Berlin, Institut für Veterinärphysiologie.
Tage p.p.
0 20 40 60 80
Milch (kg/d)
10 20 30 40 50 60
LM (n=86) HM (n=86)
LM-Tiere mit hohen Milchleistungen (n=15)
HM LM 0.0
2.5 5.0 7.5 10.0
12.5 ***
A)
∆ RFD [mm]
HM LM K
0 50 100 150 200 250 300 350 400
450 *
*
C)
Laktationstag
Es standen je fünf Tiere der HM- und LM-Gruppe für die Untersuchungen dieser Arbeit zur Verfügung. Der Unterschied in der Abnahme der RFD zwischen dem 3.
und 28. Tag p.p. ist auch innerhalb dieser kleinen Stichprobe hochsignifikant (Abb.
2A), wohingegen die Milchleistung der der Schlachtung vorangegangenen Laktation der beiden Gruppen nicht signifikant verschieden ist (Abb. 2B). Als Kontrollgruppe (K) ohne Fettmobilisierung bzw. ohne NEB wurden drei Tiere in späteren Phasen der Laktation verwendet (Abb. 2C).
Abbildung 2: A) Abnahme der Rückenfettdicke ( RFD) der Tiere der Gruppen HM (n=5) und LM (n=5) zwischen dem dritten und 28 Tag p.p.; MW ± SEM, Student`s t-Test:
***p<0,001.
B) Laktationstag zum Zeitpunkt der Schlachtung der Tiere der Gruppen HM (n=5), LM (n=4) und K (n=3); MW ± SEM, Student`s t-Test: K vs HM und K vs LM *p<0,05.
C)305-Tage Milchleistung der vorangegangenen Laktation. HM (n=5), LM (n=4) und K (n=3).
Die Tiere wurden im Juli 2009 sowie im Juli und September 2010 in Berlin euthanasiert (Institut für Veterinärphysiologie, FU Berlin/Klinik für Klauentiere, FU Berlin). Vor Betäubung und Euthanasie der Tiere wurden mit den entsprechenden Monovetten Blutproben (Vena jugularis) entnommen und zur Gewinnung von Serum, Lithium-Heparin- sowie EDTA-Plasma zentrifugiert (1.000 g, 10 min, 20 °C).
Nach ventraler Eröffnung der Bauchhöhle entlang der Linea alba wurde der Gastrointestinaltrakt entnommen. Es wurden Proben des Duodenums, des proximalen, mittleren und distalen Jejunums sowie des Ileums entnommen. Des Weiteren wurden Proben des Darminhalts aus den einzelnen Abschnitten, soweit vorhanden, entnommen. Ingestaproben wurden auf Trockeneis eingefroren. Die
HM LM K
0 2500 5000 7500 10000 12500
Milchleistung [kg]
B)
Gewebeproben wurden schnellstmöglich mit kalter physiologischer Kochsalzlösung (0,9% (w/v) NaCl) gespült. Nach mesenterialer Eröffnung des Darmrohrs wurde die Tunica mucosa von der Tunica serosa und Tunica muscularis getrennt und in flüssigem Stickstoff gefroren. Leberproben wurden nach Spülung mit kalter physiologischer Kochsalzlösung ebenfalls in flüssigem Stickstoff gefroren. Alle Proben wurden zunächst auf Trockeneis gelagert. Nach Transport wurden Gewebeproben bei -80°C, Blut- sowie Ingestaproben bei -20°C gelagert.
2.2 Präparative Methoden
2.2.1 Präparation von Bürstensaummembranvesikeln (BSMV)
Prinzip
Die zur Trennung basolateraler und apikaler Membranteile angewandte Methode beruht auf einer unterschiedlichen Ladungsverteilung und Ladungsdichte in diesen Membranteilen (SHEIKH et al. 1982). Aufgrund dieser heterogenen Verteilung haben basolaterale und apikale Membranen eine unterschiedliche Affinität zu divalenten Kationen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine modifizierte Mg2+-EGTA Präzipitationsmethode verwendet (KAUNE et al. 1992; SCHRODER u. BREVES 1996) die darauf beruht, dass basolaterale Membranteile mehr Mg2+-Ionen binden, bzw. durch sie quervernetzt werden (SCHMITZ et al. 1973; WILSON u. WEBB 1990b) und durch Differentialzentrifugation von apikalen Membranen getrennt werden können.
Lösungen und Puffer
Präparationspuffer 1 300 mmol -1 Mannit 5 mmol -1 EGTA
12 mmol -1 TRIS, pH 7,1 (RT) Präparationspuffer 2 60 mmol -1 Mannit
5 mmol -1 EGTA
1 mmol -1 TRIS, pH 7,1 (RT) Präparationspuffer 3 100 mmol -1 Mannit
100 mmol -1 KCl 10 mmol -1 HEPES
1 mmol -1 TRIS, pH 7,4 (RT)
MgCl2-Lösung 1 mol -1 MgCl2
Durchführung
Alle Schritte zur Präparation von BSMV aus Darmproben von Kälbern bzw.
Mucosaproben von laktierenden Milchkühen wurden auf Eis durchgeführt. Benötigte Lösungen und Puffer sowie alle Glasgeräte wie Messzylinder, Bechergläser oder Pottergefäße wurden vor Verwendung auf 4°C gekühlt. Alle Zentrifugationsschritte wurden mit der Kühlzentrifuge Sorvall® RC-5C (Sorvall Instruments, Du Pont Company, Wilmington USA) und den jeweils angegebenen Rotoren durchgeführt.
Darmproben von Kälbern wurden am Vorabend der Präparation von -80°C auf -20°C umgelagert. Eine entsprechende Menge Gewebe (Kälber: 30-35 g Rinder: 20-25 g) wurde mit einem Hammer zerkleinert und mit der zweifachen Menge Präparationspuffer 1 versetzt. Nach dem langsamen Auftauen des Gewebes auf Eis wurden die Proben zur Abtrennung der Enterocyten vom restlichen Gewebe 10 min mit einem Vibromixer (Chemap AG, 8604 Volketswil, Schweiz behandelt. Das verbleibende Gewebe wurde durch ein Sieb abgetrennt. Der Aufschluss der Enterocyten erfolgte osmotisch durch Zugabe von Aqua dest. (vierfaches Gewebevolumen). Nach 15 minütiger Inkubationszeit erfolgte ein weiterer Aufschlusschritt mit einem Messerhomogenisator (Turboblender, Modell D70;
Moulinex) , 3 mal 1 min mit je 3 min Pause). Der entstandene Schaum wurde mit
einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Nach der Entnahme der Kontrollprobe P1 (Homogenat, 4x250µl, weitere Lagerung bei -20°C) erfolgte die erste Fällung durch Zugabe von MgCl2 (Endkonzentration 10 mmol -1) unter Rühren. Nach 15 minütiger Inkubation auf Eis wurden basolaterale Membranfragmente und Zellorganellen pelletiert (Rotor SLA1500, 3.300 g, 18 min, 4°C). Aus dem Überstand wurden durch weitere Zentrifugation (Rotor SLA 1500, 26.900 g, 40 min, 4°C) verbliebene, vornehmlich apikale, Membranbestandteile abgetrennt. Um die Anreicherung apikaler Membranbestandteile in dieser Fraktion zu erhöhen, wurde ein weiterer Fällungsschritt durchgeführt. Hierzu wurde das Pellet in einem Pottergefäß mit einem Teflonstempel in 35 ml Präparationspuffer 2 resuspendiert (10 Schübe auf höchster Stufe). Nach einem Fällungsschritt wie oben beschrieben wurden wiederum zunächst basolaterale Membranen pelletiert (Rotor SS34, 3.300 g, 18 min, 4°C) und dann aus dem Überstand apikale Membranen erhalten (Rotor SS34, 26.900 g, 40 min, 4°C).
Dieses Pellet wurde wie oben beschrieben in 35 ml Präparationspuffer 3 resuspendiert und erneut zentrifugiert (Rotor SS34, 34.500 g, 45 min, 4°C). Das Pellet wurde durch Aufziehen durch Kanülen (0,45 x 25 mm) in 2-3 ml Puffer 3 resuspendiert und aliquotiert. Kontrollproben P2 (4x90 µl) zur Bestimmung der Anreicherung und des Proteingehalts wurden entsprechend der Kontrollproben P1 bei -20°C gelagert, während Proben zur Bestimmung der Glucoseaufnahme sowie für Western Blot Analysen in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert wurden.
2.2.2 Präparation apikaler Membranfragmente
Prinzip
Diese Methode macht sich, ebenso wie die Präparationstechnik zu Herstellung von BSMV, der unterschiedlichen Affinität basolateraler und apikaler Membranen zu divalenten Kationen zu Nutze. Im Gegensatz zur Präparation von BSMV wird dabei Ca2+ verwendet und lediglich ein Fällungsschritt mit anschließender
Puffer
Homogenisierungspuffer 2 mmol -1 TRIS
50 mmol -1 Mannit, pH 7,1
Resuspensionspuffer 10 mmol -1 TRIS
150 mmol -1 NaCl, pH 7,4 ;
15 µl Proteaseinhibitor-Mix/ml Puffer
CaCl2-Lösung 100 mmol -1CaCl2
Durchführung
Für die Präparation apikaler Membranfragmente wurde eine modifizierte CaCl2- Fällungsmethode verwendet. 1 g Gewebe wurde mit 9 ml Homogenisierungspuffer versetzt und in einem Pottergefäß durch einen Teflonstempel homogenisiert. Nach langsamer Zugabe von 1 ml CaCl2-Lösung (cE=10 mmol -1) und 30 minütiger Inkubation unter leichtem Rühren auf Eis wurden Zelltrümmer und Zellkerne durch Zentrifugation (Sorvall® RC-5C, Sorvall Instruments, Du Pont Company, Wilmington USA) abgetrennt (Rotor SM24, 2.000 g, 20 min, 4°C). Aus dem Überstand wurden nach weiterer Zentrifugation (Rotor SM24, 25.000 g, 30 min, 4°C) apikale Membranen als Pellet erhalten. Das Pellet wurde je nach Größe in 300-1000 µl Resuspensionspuffer mit Proteaseinhibitoren resuspendiert, aliquotiert, in flüssigem Stickstoff gefroren und dann bei -20°C gelagert.
2.2.3 Präparation von Lebergewebe: Mitochondrien und Cytosol
Mitochondrienpuffer 200 µmol -1 EDTA
10 mmol -1 TRIS/HCl
250 mmol -1 Saccharose, pH 7,8 Cytosolpuffer 20 mmol -1 KH2PO4/K2HPO4
1 mmol -1 EDTA, pH 7,4
Durchführung Mitochondrienpräparation
Lebergewebe wurde abgewogen und unter flüssigem Stickstoff gemörsert. Pro g Gewebe wurden 5 ml Mitochondrienpuffer zugegeben und das Gewebe mit einem Teflonstempel im Pottergefäß homogenisiert (10 Schübe auf höchster Stufe). Nach Zentrifugation (Sorvall® RC-5C, Sorvall Instruments, Du Pont Company, Wilmington USA), Rotor SM24, 1.000 g, 10 min, 4°C) wurde das Pellet verworfen und der Überstand erneut zentrifugiert (Rotor SM24, 12.000 g, 15 min, 4°C). Das Pellet wurde zweimal mit Mitochondrienpuffer mit Proteaseinhibitoren (10 µl ml-1) gewaschen und jeweils zentrifugiert (Rotor SM24, 12.000 g, 15 min, 4°C).
Anschließend wurde das Pellet je nach Größe in 1-3 ml Mitochondrienpuffer mit Proteaseinhibitoren resuspendiert, aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.
Durchführung Cytosolpräparation
Lebergewebe wurde abgewogen und unter flüssigem Stickstoff gemörsert. Pro g Gewebe wurden 5 ml Cytosolpuffer zugegeben und das Gewebe mit einem Teflonstempel im Pottergefäß homogenisiert (10 Schübe auf höchster Stufe). Der Überstand nach Zentrifugation (Rotor SM24, 49.460 g, 30 min, 4°C) sollte größtenteils cytosolische Bestandteile enthalten. Aliquots wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.
2.3 Analytische Methoden
2.3.1 Blutparameter (laktierende Milchkühe)
Die Blutglucosekonzentration wurde zum einen direkt nach Blutentnahme (Vena jugularis) vor der Schlachtung der Tiere im Vollblut bestimmt (Accuchek Compakt).
Zur Bestätigung dieser Ergebnisse wurde die Blutglucosekonzentration ebenfalls im Serum durch das Labor der Klinik für Rinder, Tierärztliche Hochschule Hannover, bestimmt. Des Weiteren wurden durch das Labor der Klinik für Rinder, Tierärztliche Hochschule Hannover die Konzentrationen von freien Fettsäuren (FFS) - Hydroxybutyrat ( -HBS) sowie die Aktivitäten der Enzyme Aspartataminotransferase (AST), Glutamatdehydrogenase (GlDH), -Glutamyl-Transferase ( GT), Creatinkinase (CK) und der alkalischen Phosphatase (AP) im Serum gemessen. Die Konzentrationen der Aminosäuren Alanin, L-Isoleucin, Valin, Tyrosin, Glutaminsäure und Glycin im Serum wurden durch das Institut für Funktionelle Genomik der Universität Regensburg mittels NMR-Spektroskopie ermittelt.
2.3.2 Bestimmung der Stärke- und Glucosekonzentrationen in Ingestaproben
Probenvorbereitung
Ingestaproben wurden zunächst bei 4°C über Nacht aufgetaut. Nach Bestimmung der Frischmasse (FM) wurden die Proben bei 60°C im Trockenschrank bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Anschließend wurden die Proben in einem Exikator gelagert.
Um Stärke zunächst in eine lösliche Form zu bringen, wurde ein Aufschluss mit Dimethylsulfoxid (DMSO) und Salzsäure (HCl) durchgeführt wie in dem zur Stärke- und Glucosebestimmung verwendeten Kit (UV-Test zur Bestimmung von nativer Stärke und von Stärkepartialhydrolysaten in Lebensmitteln und anderen Probematerialien Fa. R-Biopharm AG) empfohlen. Zu 0,5-1,5 g gemörserter Probe wurden unter Rühren 5 ml Salzsäure (8 mol -1) und 20 ml DMSO gegeben. Der mit
