In vitro-Untersuchungen

Die in vitro-Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Doreen Jahn im Labor der Firma Novoplant GmbH durchgeführt.

3.4.1 PCR zur Überprüfung der Reinheit des Oozystenmaterials

Um die Reinheit der für die Tierstudien eingesetzten Oozysten zu überprüfen, wurde vor ihrer Verwendung eine PCR zur Speziesbestimmung durchgeführt. Das Oozystenmaterial, das durch Vermehrung der Eimerien in Hühnerküken gewonnen wurde (siehe 3.3.2), wurde mit dem Ausgangsmaterial, erworben vom IAH, Compton, sowie mit Paracox 8^®-Impfstoff als Positivkontrolle verglichen.

Durch die PCR wurde mit Hilfe des Enzyms Taq-Polymerase, einer DNA-Polymerase, bei definierten Reaktionsbedingungen die Vervielfältigung eines spezifischen Anteils der nachzuweisenden Eimerien-DNA ermöglicht. Zur Unterscheidung der verschiedenen Eimerienspezies dienten Regionen der ribosomalen DNA, die „internal transcribed spacer 1 regions“ (ITS1), die eine ausreichende interspezifische Variation aufwiesen. Zur Vervielfältigung dieser Gensequenzen dienten spezifische Primerpaare, die sich an die ITS1-Regionen anlagerten und als Startermoleküle fungierten. Die komplementären Primerpaare zur Vermehrung der rDNA der einzelnen Eimerienspezies sind in Tabelle 5 aufgelistet.

(SCHNITZLER et al. 1998; SCHNITZLER et al. 1999).

Tabelle 5: Spezies-spezifische Primerpaare (SCHNITZLER et al. 1998;

SCHNITZLER et al. 1999)

Eimerienspezies Primerbezeichnung Primersequenz 5' - 3'

E. acervulina EAF (Primer I) GGC TTG GAT GTT TGC TG EAR (Primer II) CGA ACG CAA TAA CAC ACG CT E. brunetti EBF (Primer I) GAT CAG TTT GAG CAAA CCT TCG

EBR (Primer II) TGG TCT TCC GTA CGT CGG AT E. maxima EMaF (Primer I) GTG GGA CTG TGG TGA TGG GG

EMaR (Primer II) ACC AGC ATG CGC TCA CAA CCC E. tenella ETF (Primer I) AAT TTA GTC CAT CGC AAC CCT

ETR (Primer II) CGA GCG CTC TGC ATA CGA CA

Die Durchführung der PCR orientierte sich an der bei SCHNITZLER et al. (1998;

1999) beschriebenen und im Folgenden kurz zusammengefassten Methode.

Die Oozystensuspension wurde zunächst auf 1% SDS eingestellt. Es wurden 100µl Proteinase K/200 µl Suspension hinzugefügt. Zum Aufschluss wurde die Suspension eine Stunde bei 50°C inkubiert. Eine DNA-Reinigung wurde mit Hilfe des Nucleo-Spin Extract II^® von Macherey-Nagel nach Gebrauchsanweisung durchgeführt.

Zur Herstellung von 100 µl des PCR-Reaktionsgemisches wurden 10 µl Reaktionspuffer mit je 2 µl Primer I und Primer II, 12 µl DNA-Präparation, 2 µl dNTPs, 1,5 µl Taq-Polymerase und 70,5 µl Reinstwasser gemischt. Einem ersten Denaturierungsschritt von 3 min bei 95°C folgten 37 PCR-Zyklen nach folgendem Schema:

• Denaturierung (Denaturation): 95°C / 30 sec

• Primer-Anlagerung (Annealing): 58°C / 45 sec

• DNA-Verlängerung (Extension) 72°C / 45 sec

Nach Ablauf der Zyklen fand eine abschließende DNA-Verlängerungsphase von 10 min bei 72°C statt.

Zur Detektion der vervielfältigten DNA mittels Gelelektrophorese wurden Aliquots von je 6 µl des Reaktionsgemisches elektrophoretisch aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht begutachtet. Die Elektrophorese wurde nach der Methode von SAMBROOK und RUSSEL (2001) durchgeführt. Das Agarosegel bestand aus 1% Agarose (Sigma) in TBE (89 mM Tris-Borat, 20 mM EDTA, pH 8,0).

3.4.2 ELISA zur Bestimmung des BA11-Antikörpergehalts in Futter- und Fäzesproben

Testprinzip und Untersuchungsziele

Der ELISA ist ein enzymgekoppelter Immunadsorptionstest zum semi-quantitativen Nachweis von Antigenen bzw. Antikörpern durch eine Kaskade von spezifischen Bindungsreaktionen. Die gebundenen Moleküle werden dabei letztlich durch einen enzymgekoppelten Antikörper nachgewiesen, der eine photometrisch messbare Farbreaktion katalysiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der ELISA eingesetzt, um den Gehalt des Single-chain-Antikörpers BA11 in Futter- und Fäzesproben zu bestimmen. Im Vorversuch zur Fütterung von antikörperhaltigen Erbsen (vergleiche 3.5.3 und 4.3.3) wurden BA11-haltige Erbsen mit dem Futter verabreicht.

Einzelkotproben der Versuchstiere und Rückwaagen des vorgelegten Futters wurden gesammelt, um den darin enthaltenen BA11-Antikörpergehalt mittels ELISA zu untersuchen.

Bei der Untersuchung der Futterrückwaagen wurde ein ELISA für die Proben jedes Tieres, das aus der mit dem antikörperhaltigen Futter behandelten Gruppe (n=10) stammte, durchgeführt: In jedem Test wurden dabei die Proben eines Einzeltieres vom 10. bis 17. LT doppelt untersucht. Als Negativkontrollen wurden Messungen mit PBS, 3 % BSA und antikörperfreiem Futter vorgenommen.

Positivkontrollen des Tests waren BA11-Erbsen-Extrakt in einer Verdünnung von 1:10 sowie das im Vorversuch verwendete Futter mit 10% BA11-Erbsen-Anteil. Die aufbereiteten Futterproben wurden in drei Verdünnungsstufen getestet: 0,78 µl, 0,39 µl und 0,195 µl des gewonnenen Zentrifugationsüberstandes pro 100 µl PBS/PMSF (siehe „Durchführung“ unten). Durch die Messung des Antikörpergehalts in den täglichen Futterrückwaagen sollte festgestellt werden, ob die Tiere des Vorversuchs die antikörperhaltigen Erbsen positiv oder negativ aus dem Futter selektierten.

Weiterhin wurden Einzelkotproben der Tiere von zwei Versuchstagen der Antikörperfütterung, dem 11. und 15. LT, in einem ELISA untersucht: Der Zentrifugationsüberstand jeder Kotprobe wurde hierbei unverdünnt eingesetzt und

doppelt untersucht. Als Negativkontrollen dienten PBS, 3 % BSA und antikörperfreie Fäzesproben der Kontrollgruppe des Vorversuchs (n=10). Positivkontrollen waren BA11-Erbsen-Extrakt in drei Verdünnungsstufen (0,078 µl, 0,039 µl und 0,0195 µl pro 100µl PBS/PMSF) sowie Proben des vorgelegten Futters mit 10% BA11-Erbsen-Anteil. Ziel der Untersuchung war es herauszufinden, ob eine Antikörperausscheidung über die Fäzes der Versuchstiere erfolgte oder ob die Antikörper im Digestionstrakt vollständig verbraucht bzw. abgebaut wurden.

ELISA-Durchführung

Die antikörperhaltigen Futter- und Fäzesproben wurden jeweils durchmischt und 3 g Material von verschiedenen Stellen jeder Einzelprobe entnommen. Anschließend wurde dieses Material binnen 1 min mittels einer Kugelmühle fein zermahlen.

Hiervon wurden 250 mg mit 1 ml PBS/PMSF/Tween verrührt und auf Eis für 15 min inkubiert, um den Antikörper zu extrahieren. Das Gemisch wurde danach für 10 min bei 4°C und 10.000 g abzentrifugiert, so dass der antikörperhaltige Überstand im ELISA untersucht werden konnte.

Die Kavitäten einer Mikrotiterplatte wurden mit je 0,3 µl F4-Fimbrien-Antigen (K88) beschichtet, indem sie über Nacht bei 4° C mit 100 µl Antigen-PBS-Lösung pro Kavität inkubiert wurden. Die anschließende Absättigung unspezifischer Bindungen geschah 2 h bei RT mit 3 % BSA/PBS. Es folgten 3 Waschschritte mit PBS in einem Mikrotiterplattenwaschgerät.

Im Falle der Fäzesproben wurden nun 100 µl des durch Zentrifugation gewonnenen Überstandes pro Kavität unverdünnt aufgebracht. Bei den Futterproben wurden zuvor drei Verdünnungsstufen mit PBS/PMSF hergestellt: 0,78 µl, 0,39 µl und 0,195 µl des Überstandes pro 100 µl PBS/PMSF. (Die Verdünnungsstufen waren nach Titration der ersten Proben aufgrund der gemessenen Absorptionswerte festgelegt worden.) Auch hier wurden dann 100 µl des verdünnten Überstandes pro Kavität eingesetzt. Bei den Positivkontrollen war das Verfahren entsprechend. Der zu testende antikörperhaltige Fäzes- bzw. Futterüberstand wurde für 1 h bei RT inkubiert.

Nach einem weiteren Waschvorgang (1x PBS/Tween, 3x PBS) begann der Nachweis des gebundenen scFv Antikörpers BA11 im Fäzes-/Futterüberstand über den His-tag. Dazu wurde als Nachweisantikörper ein POD-konjugierter anti-His-Antikörper 1:2.000 (Quiagen) in 3% BSA/PBS zugegeben und für 1 h bei RT inkubiert. Nach einem weiteren Waschvorgang (1x PBS/Tween, 3x PBS) erfolgte die Zugabe von 100 µl TMB-Substratlösung/Kavität für die Farbreaktion. Diese wurde von der gekoppelten Peroxidase während einer dreißigminütigen Inkubationszeit im Dunkeln katalysiert. Es entstand ein lösliches blaues Endprodukt, das sich durch Zugabe der Stoplösung (50 µl 1M H2SO4/Kavität) gelb färbte. Die Auswertung der Reaktion wurde in einem Photometer (Tecan) bei einer Wellenlänge von 450 nm mit Hilfe der zugehörigen Software (Magellan 2^®) durchgeführt.