Entwicklung eines Verfahrens zur quantitativen Auswertung nicht-invasiver reflexionsspektroskopischer Messungen
von Beta-Carotin in der Haut
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Frank Niedorf
aus Münster
Hannover 2001
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Ternes
Tag der mündlichen Prüfung: 28. 05. 2001
1 Einleitung
12 Literaturübersicht
22.1 Aufbau und Funktionen der Haut
22.1.1 Epidermis 2
2.1.2 Dermis 3
2.1.3 Tela subcutanea 4
2.1.4 Gefäßversorgung 4
2.2 Grundprinzipien der Spektroskopie
62.2.1 Definitionen 6
2.2.2 Grundsätzliche Vorgänge bei der Absorption 7
2.2.3 Absorption durch Moleküle 8
2.2.4 Qualitative Spektroskopie 8
2.2.5 Quantitative Spektroskopie 9
2.2.5.1 Ermittlung von Spektren 9
2.2.5.2 Das Lambert-Beersche Gesetz 9
2.2.5.3 Die Zweiflußtheorie von Kubelka und Munk 10
2.3 Spektroskopie an biologischen Geweben
102.3.1 Einführung 11
2.3.2 Optische Parameter biologischer Gewebe 11
2.3.3 Photonenweglänge 14
2.4 Beta-Carotin
152.4.1 Physikalisch-chemische Eigenschaften 15
2.4.2 Beta-Carotin-Stoffwechsel 15
Lymphe
2.4.2.4 Transport im Blut 18
2.4.2.5 Aufnahme aus dem Blut und intrazellulärer Transport 19
2.4.2.6 Speicherung 20
2.4.2.7 Eliminierung 20
2.4.3 Pharmakokinetik von Beta-Carotin in der Haut 21 2.4.3.1 Beta-Carotin-Konzentration in der Haut 21
2.4.3.2 Akkumulation in der Haut 21
2.4.3.3 Verteilung in der Haut 22
2.4.3.4 Einfluß von Lichtexposition auf die dermale Beta- 22 Carotin-Konzentration
2.4.3.5 Korrelation zwischen Beta-Carotin-Plasma- und Haut- 22 konzentrationen
2.4.4 Wirkungen von Beta-Carotin 23
2.4.4.1 Provitamin-A-Wirkung 23
2.4.4.2 Antioxidative Wirkung 23
2.4.4.3 Photoprotektive Eigenschaften 24
2.4.4.4 Wirkungen auf das Immunsystem 24
2.5 Das isoliert perfundierte Rindereuter
252.5.1 Anatomie des Rindereuters 25
2.5.1.1 Allgemeiner Aufbau 25
2.5.1.2 Gefäßversorgung 25
2.5.1.3 Innervation 26
2.5.2 Untersuchungen an isoliert perfundierten Rindereutern 26
3 Material und Methoden
283.1 Geräte und Reagentien
283.1.1 Spektroskopische Apparatur 28
3.2 Aufgabenstellung
303.3 Spektroskopische Methode und Ableitung des
31Auswert-Algorithmus
3.3.1 Reflexionsspektroskopische Meßapparatur 31 3.3.2 Transmissionsspektroskopische Meßapparatur 32
3.3.3 Errechnung der Spektren 32
3.3.4 Optische Effekte bei Messung von Beta-Carotin im Gewebe 33 3.3.4.1 Wellenlängenabhängigkeit von Streueffekten 33 3.3.4.2 Effekt wellenlängenabhängig unterschiedlicher 35
Eindringtiefe des Lichtes
3.3.4.3 Effekt unterschiedlicher Oberflächenreflexion 35 3.3.4.4 Effekt additiver Farbmischung durch inhomogenen 39 Lichtweg
3.3.4.5 Effekt additiver Farbmischung durch inhomogene 42 Farbstoffverteilung
3.3.4.6 Ausgleich von Inhomogenitäten 43
3.3.4.7 Lösungsmitteleffekte 44
3.3.5 Spektrenaufnahme 46
3.3.5.1 Beta-Carotin-Reinspektrum 46
3.3.5.2 Reinspektren von Oxy- und Desoxy-Hämoglobin 47
3.3.5.3 Hautspektren 48
3.3.6 Auswertung der Spektren 48
3.3.6.1 Erste Bestimmung des Streuspektrums 50 3.3.6.2 Ausgleich des Lösungsmitteleffektes 52 3.3.6.3 Endgültige Bestimmung des Streuspektrums 53 3.3.6.4 Errechnung der Farbstoffkonzentrationen 53
3.3.6.5 Ausgleich der Inhomogenitäten 54
3.3.6.6 Die „classical least square“-Methode (CLS) 55
3.3.7.3 Errechnung der Reflexion und Transmission 59
3.3.7.4 Monte-Carlo-Simulation 60
3.4 Vergleich reflexionsspektroskopisch ermittelter Kon-
61zentrationen mit Ergebnissen aus HPLC-Messungen
3.5 Messungen am isoliert perfundierten Rindereuter
623.5.1 Testsubstanz 62
3.5.2 Versuchsmaterial 62
3.5.3 Versuchsaufbau 62
3.5.4 Versuchsablauf 63
3.5.5 Vitalität des isoliert perfundierten Rindereuters 65
3.6 Statistische Auswertung
664 Ergebnisse
684.1 Optische Parameter und mittlere Photonenweg-
69länge
4.1.1 Absorptionskoeffizient 69
4.1.2 Streukoeffizient 70
4.1.3 Mittlere Photonenweglänge 71
4.2 Vergleich mit HPLC-Messungen
724.3 Dermale Beta-Carotingehalte unter Perfusion
73mit Tyrodelösung
4.4 Dermale Beta-Carotingehalte bei Perfusion mit Tyrode-
75lösung einer Beta-Carotin-Konzentration von 0,2 µg/ml
lösung einer Beta-Carotin-Konzentration von 20 µg/ml
4.7 Dermale Beta-Carotingehalte bei Perfusion mit Tyrode-
81lösung einer Beta-Carotin-Konzentration von 60 µg/ml
4.8 Dermale Beta-Carotingehalte unter UV-Bestrahlung
834.9 Dermale Hämoglobingehalte
854.9.1 Dermale Hämoglobin-Konzentration unter Perfusion mit 86 Tyrodelösung
4.9.2 Dermale Hämoglobin-Konzentration unter Perfusion mit 87 Tyrodelösung einer Beta-Carotin-Konzentration von 0,2 µg/ml 4.9.3 Dermale Hämoglobin-Konzentration unter Perfusion mit 88
Tyrodelösung einer Beta-Carotin-Konzentration von 2 µg/ml
4.9.4 Dermale Hämoglobin-Konzentration unter Perfusion mit 89 Tyrodelösung einer Beta-Carotin-Konzentration von 20 µg/ml 4.9.5 Dermale Hämoglobin-Konzentration unter Perfusion mit 90
Tyrodelösung einer Beta-Carotin-Konzentration von 60 µg/ml 4.9.6 Dermale Hämoglobin-Konzentration unter UV-Bestrahlung 91
5 Diskussion
925.1 Abschätzung der Methode zur nicht-invasiven Beta-
92Carotin-Bestimmung in der Haut
5.1.1 Interne Abschätzung anhand der Restspektren 93
5.1.1.1 Abschätzung der Präzision 93
5.1.1.2 Abschätzung der Richtigkeit 93
5.1.1.3 Abschätzung der Größe des erzeugten Fehlers 94 5.1.1.4 Rückschlüsse auf Art der Störgröße 96 5.1.2 Interne Abschätzung der Präzision der Meßbedingungen 97 5.1.3 Externe Abschätzung durch Anwendung der Methode an 97
definiertem Probenmaterial
5.1.4 Abschließende Beurteilung der entwickelten Datenanalyse 98 reflexionsspektroskopischer Daten
5.2 Verteilung von Beta-Carotin in die Haut des isoliert
101perfundierten Rindereuters
5.2.1 Beta-Carotin-Basalkonzentrationen in der Rindereuterhaut 101
5.2.2 Invasion in die Haut 102
5.2.3 Abflutung von Beta-Carotin 106
5.2.4 Dermale Beta-Carotin-Konzentration unter UV-Einstrahlung 106
5.3 Schlußfolgerung
1076 Zusammenfassung
1087 Summary
1108 Literaturverzeichnis
1129 Anhangstabellen
129A Absorptionsgrad Abb. Abbildung A/D Analog / Digital CCD coupled charge devide CLS classical least square E Extinktion
f folgende
ff fortfolgende
g Gram
Hb Hämoglobin
HPLC high performance liquid chromatography
l Liter
LDH Laktatdehydrogenase min Minute
ml Milliliter
MSC multiplicative signal correction µg Mikrogramm
n Anzahl der Versuche
ng Nanogram
nm Nanometer
OE Optische Einheiten
R Reflexion
s. siehe S. Seite
T Transmission Tab. Tabelle
UV Ultraviolette Strahlung VIS Sichtbares Licht
1 Einleitung
Obwohl spektroskopische Methoden in der Chemie seit Beginn des 20. Jahrhunderts etabliert sind, wurden sie bis vor wenigen Jahren lediglich für In-vitro-Messungen benutzt. Dabei war es notwendig, gesuchte Substanzen vor der Messung von anderen in der Probe enthaltenen Substanzen zu trennen. Ein direkter Stoffnachweis in biologischer Matrix galt als undenkbar, da das interessierende Signal von einem Rauschen von Störsignalen überlagert ist.
Im Laufe der letzten Jahre wurden Lösungen für zahlreiche der Probleme spekroskopischer Messungen in biologischer Matrix gefunden. Dies ist neben der Einführung hochempfindli- cher und driftarmer „coupled charge device“- (CCD)-Arrays in erster Linie auf Fortschritte in der elektronischen Datenverarbeitung zurückzuführen, welche die mathematisch komplexe Analyse von Reflexionsspektren erst ermöglichen. Aufgrund dieser Entwicklungen sind ne- ben natürlich im Organismus vorkommenden Substanzen auch Fremdstoffe einem nicht- invasiven spektroskopischen Nachweis zugänglich (KAKIZOE et al. 1992, ROBINSON et al.
1992, WEERSINK et al. 1997, MOURANT et al. 1999).
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, eine Methode zum nicht-invasiven Stoffnachweis in biologischer Matrix an dem realistischen Modell eines isoliert perfundierten Organs zu ent- wickeln. Zu diesem Zweck wurde eine Studie am Modell des isoliert perfundierten Rinder- euters unter Verwendung von Beta-Carotin als Testsubstanz durchgeführt.
2 Literaturübersicht
2.1 Aufbau und Funktionen der Haut
Die Haut bildet die äußere Körperdecke. Sie ist damit eine wichtige Barriere gegen das Ein- dringen äußerer Noxen und den Verlust von Wasser und Elektrolyten. Weiterhin dient sie über zahlreiche Sinnesrezeptoren dem Kontakt zur Umwelt und ist an der Thermo- und der Blutdruckregulation sowie an spezifischen Immunreaktionen beteiligt. Durch ihre Fähigkeit zur Vitamin D3-Synthese trägt sie zur Kalziumhomöostase bei (LEONHARDT 1990, BANKS 1993).
Die Säugetierhaut besitzt einen dreischichtigen Aufbau aus der ektodermalen Oberhaut (Epi- dermis), und den mesodermalen Schichten Lederhaut (Dermis) und Unterhaut (Tela sub- cutanea).
2.1.1 Epidermis
Die Epidermis ist die oberste Schicht der Haut. Es handelt sich um ein mehrschichtiges Plat- tenepithel, das zu 90% aus Keratinozyten besteht. Weitere Zellen sind Melanozyten, die für die Pigmentierung der Haut mit Melanin verantwortlich sind, Langerhans-Zellen und Lym- phozyten als Zellen des Immunsystems sowie Merkelzellen als neuroendokrine bzw. Sinnes- zellen (FRITSCH 1998).
Die Keratinozyten werden ständig in den basalen Schichten neugebildet und wandern an die Oberfläche. Dabei wandeln sie sich von wenig differenzierten, teilungsfähigen Zellen zu hochdifferenzierten, nicht mehr teilungsfähigen Zellen, und sterben schließlich unter Ausbil- dung der funktionstragenden Hornschicht ab. Die unterschiedlichen Differenzierungsstadien führen zu einer Unterteilung der Epidermis in vier beziehungsweise fünf Lagen (ECKERT 1992).
Zuunterst befindet sich das Stratum basale als einlagige Schicht hochprismatischer Zellen, die über Hemidesmosomen fest mit der Basallamina verbunden sind und so die Epidermis in der darunterliegenden Dermis verankern. Hier erfolgt die zyklische Erneuerung der Keratino- zyten, die im darüber liegenden, am Rindereuter aus bis zu acht Zellagen bestehenden Stra- tum spinosum beginnen zu keratinisieren (LUDEWIG et al. 1996, LIEBICH et al. 1999).
Dieser Prozeß ist von der Synthese verschiedener Proteine und Lipide sowie von Zytokerati- nen abhängig und von einem enzymatischen Abbau aller Zellorganellen begleitet (FRITSCH 1998). Die „stachelförmigen“ Zellen des Stratum spinosum sind durch Desmosomen fest mit- einander verbunden. Im darüber liegenden Stratum granulosum werden die Zellen flacher.
Namengebend sind histologisch auffällige, intrazelluläre basophile Granula (LEONHARDT 1990).
Die Umwandlung lebender Keratinozyten in die Korneozyten der Hornschicht erfolgt am Übergang vom Stratum granulosum zum Stratum corneum unter Aggregation der vorher gebildeten Produkte, Dehydration, Abplattung und Absterben der Zellen (FRITSCH 1998).
Zwischen diesen Schichten ist teilweise ein sich histologisch als durchgehend azidophile Schicht darstellendes Stratum lucidum ausgebildet, welches jedoch am Rindereuter fehlt (LEONHARDT 1990, LUDEWIG et al. 1996).
Das Stratum corneum besteht aus kernlosen, plättchenartigen, miteinander über zahlreiche Desmosomen verzahnten Korneozyten. Diese enthalten in einer amorphen Proteinmatrix Ke- ratinfilamente; der Innenseite ihrer Zellmembran sind stark quervernetzte Proteine als soge- nanntes „cornified envelope“ angelagert, die die hohe Rigidität der Hornzellen erklären (FRITSCH 1998). Zwischen den Korneozyten liegt die in den Zellen des Stratum spinosum gebildete und von den Zellen des Stratum granulosum sezernierte, lipidreiche Interzellular- substanz, die entscheidend zur Barrierefunktion der Hornschicht beiträgt (ELIAS 1983). Im Stratum corneum disjunctum zerfällt die Hornschicht durch intakt gebliebene Enzyme in Ein- zelzellen, was zum regelgerechten Abschilfern der Hornzellen führt (FRITSCH 1998).
Die Dicke der Epidermis des Rindes liegt inklusive Stratum corneum zwischen 40 µm und 60 µm, am Euter schwankt sie aufgrund des ausgeprägten Papillarkörpers zwischen 60 µm und 200 µm (MEYER et al. 1978, LUDEWIG et al. 1996).
2.1.2 Dermis
Die unter der Epidermis liegende Dermis ist von dieser durch eine durchgehende Basalmem- bran getrennt. Sie besteht aus einem dichten Geflecht kollagener und elastischer Fasern, die der Haut Reißfestigkeit und Verformbarkeit verleihen (LEONHARDT 1990).
Die Dermis unterteilt sich aufgrund der unterschiedlichen Dichte und Anordnung des kolla- gen-elastischen Grundgerüstes in zwei Schichten. Das obere Stratum papillare besteht aus
lockerem Bindegewebe und ragt mit zahlreichen Fortsätzen in die Epidermis. Es enthält haar- nadelförmig verlaufende Kapillarschlingen, Nerven und Ansammlungen von Immunzellen und erfüllt mechanische, nutritive, sensorisch-sensible und immunologische Aufgaben. In diese Schicht sind vorzugsweise Haare, Talg- und Schweißdrüsen als epidermale Strukturen eingelagert. Das untere Stratum reticulare ist eine faserreiche und zellarme Bindege- websschicht (BANKS 1993, LIEBICH et al. 1999).
2.1.3 Tela subcutanea
Die Unterhaut ist ein lockeres Bindegewebe, das die Haut verschieblich mit unterliegenden Faszien oder der Muskulatur verbindet (LEONHARDT 1990). Sie enthält beim Rind nur we- nig Fettgewebe und ist relativ spärlich und grobfaserig entwickelt (MEYER et al. 1978). Die Unterhaut des Rindereuters hebt sich von der Dermis nur undeutlich ab. Auffällig ist das völ- lige Fehlen von Adipozyten (LUDEWIG et al. 1996).
2.1.4 Gefäßversorgung
Die Haut wird durch ein in der Unterhaut lokalisiertes, weit verzweigtes Zu- und Ableitungs- system versorgt, das auch als subkutaner Plexus bezeichnet wird (BANKS 1993). Dabei ver- sorgen die zuführenden Arterien jeweils runde Hautbezirke von einigen Zentimetern Durch- messer (FRITSCH 1998). In der Haut des Rindes besteht dieses Netz aus gemeinsam verlau- fenden und über Anastomosen verbundenen Arterien und Venen, die verschieden starke Ge- fäße an die Oberfläche entlassen (LOEFFLER 1966).
Diese verzweigen sich in tiefen Dermisschichten in ein horizontal ausgerichtetes Gefäßnetz, das auch als tiefer oder kutaner Plexus bezeichnet wird (FRITSCH 1998). Auch hier zeigen Arterien und Venen in der Haut des Rindes im wesentlichen den gleichen Verlauf (LOEFFLER 1966).
Weitere, in oberflächliche Schichten des Stratum papillare der Dermis aufsteigende Gefäße, die meist eine Fortsetzung der aus dem subkutanen Plexus kommenden Äste darstellen, zwei- gen sich an der Epidermisgrenze quirlartig auf, und bilden oberflächlich ein weiteres, weit verzweigtes horizontales Netz, den so genannten subepithelialen oder auch subpapillären Ple- xus (LOEFFLER 1966). Zwischen tiefem und oberflächlichem Netz verlaufen vertikale Ver- bindungsgefäße, die auch eigene Plexus der Hautadnexe versorgen (FRITSCH 1998).
Aus dem oberflächlichen Plexus entspringen Kapillaren ins subpapilläre Gebiet und bilden bevorzugt in den Papillarkörpern haarnadelförmige Kapillarschlingen. Ohne die begrenzende Basallamina zu übertreten, liegen dabei die Kapillarwände der Epidermis nahezu direkt an, wodurch die Ernährung der oberen Deckschichten über Diffusion durch den Interzellularraum ermöglicht wird. Im Rückfluß sammeln sich die Kapillaren wieder in Venolen und Venen, die in der Unterhaut Anschluß an größere Venennetze finden (LIEBICH et al. 1999).
Insgesamt ist die Blutgefäßversorgung der Haut für die bloße Versorgung des Gewebes über- proportioniert. Der Grund hierfür liegt in der Rolle der Haut für die Thermoregulation. Die Durchblutung der Haut kann zum Zwecke der Wärmeabstrahlung durch Vasodilatation um das 10 – 20 fache gesteigert werden, wobei die Rolle des Wärmeabstrahlers in erster Linie dem oberflächlichen Plexus zukommt. Die Regulation von Vasokonstriktion und Vasodilatation erfolgt nerval und mediatorvermittelt, ist jedoch bislang nur unvollständig aufgeklärt (FRITSCH 1998). In der Haut des Rindereuters entspricht die Blutgefäßversorgung diesem allgemein beschriebenen Aufbau mit auffällig weitlumigen Venen in der Unterhaut (LUDEWIG et al. 1996). Die Mikrovaskulatur der Haut ist in Abb. 1 schematisch dargestellt.
.
Abb. 1: Mikrovaskulatur der Haut (nach ACKERMAN 1997)
Papilläre Dermis
Retikuläre Dermis
Unterhaut
Papillengefäße Oberflächlicher Plexus
Vertikale
Verbindungsgefäße
Tiefer Plexus Zu- und
Ableitungssystem
2.2 Grundprinzipien der Spektroskopie
2.2.1 Definitionen
Spektroskopie ist im engeren Sinne die Lehre von der Erzeugung, Beobachtung, Aufzeich- nung und Interpretation von Spektren. Ihre Grundlage ist die Interaktion zwischen elektro- magnetischer Strahlung und Materie (BÖCKER 1997). Unter Absorptionsspektroskopie versteht man die qualitative und quantitative Messung des Absorptionsvermögens eines Stof- fes als Funktion der Wellenlänge (KORTÜM 1969).
Reflexion bezeichnet die Rückstrahlung elektromagnetischer Wellen an den Grenzflächen zweier Medien mit unterschiedlichen Brechungsindizes. Man unterscheidet zwei Grenzfälle, die vom Größenverhältnis der auftreffenden Welle zu den Unebenheiten auf der Grenzfläche abhängen. Bei der regulären oder gerichteten Reflexion (Spiegelung) sind die Unebenheiten auf der Grenzfläche klein gegenüber der Wellenlänge des auftreffenden Lichtes. Es gilt das Reflexionsgesetz, nach dem einfallender und reflektierter Strahl denselben Winkel mit dem in der Ebene liegenden Einfallslot bilden. Sind die Unebenheiten auf der Grenzfläche gegen die Wellenlänge des auftreffenden Lichtes hingegen groß, wird die Strahlung diffus in alle Rich- tungen des Halbraumes reflektiert. Beide Grenzfälle werden niemals erreicht; alle realen Grenzflächen besitzen also eine gemischte, als Glanz bezeichnete Reflexion (KORTÜM 1969). Der spektrale Reflexionsgrad ist abhängig vom Verhältnis der Brechungsindizes der aneinandergrenzenden Medien, vom Einfallswinkel und vom Absorptionskoeffizienten. Ist die daraus resultierende Wellenlängenabhängigkeit groß, so spricht man von selektiver Refle- xion.
Der Begriff Streuung bezeichnet Licht-Materie-Interaktionen, die zu einer Ablenkung der einfallenden Strahlung führen (KOTLARCHYK 1999). Streuung von ultravioletten Strahlen (UV) und sichtbarem Licht (VIS) ist eine quasi-simultane Aufnahme und Wiederabgabe von Photonen durch Atome oder Moleküle mit einer Zwischenzeit von etwa 10-15 s. Im Gegensatz zur Absorption und Emission treten keine Resonanzeffekte auf. Bei mit konventionellen Lichtquellen erreichten Lichtintensitäten handelt es sich um einen elastischen Prozeß, der die Energie weder des Photons noch des Atoms oder Moleküls verändert (WAGNIÈRE u.
WOZNIAK 1999).
Ähnlich wie bei der diffusen Reflexion ist die Intensität der Streustrahlung (IS) neben Teil- chenform, Brechungsindex und Absorptionseigenschaften hauptsächlich vom Größenverhält- nis des Teilchenradius zur Wellenlänge abhängig. Eine exakte theoretische Beschreibung existiert für die stark vereinfachten Systeme der Streuung an isotrop-kugelförmigen Teilchen beliebiger Größe (Mie-Streuung) und der Streuung einzelner Moleküle in Gasen, deren Moleküldurchmesser wesentlich kleiner als die Wellenlänge ist (Rayleigh-Streuung) (KORTÜM 1969). Die Streuung größerer Partikel, beispielsweise einer kolloidalen Lösung, wird als Tyndall-Streuung bezeichnet. Bei Messungen eines trüben Mediums treten im UV- VIS-Bereich Rayleigh- und Tyndall-Streuung auf (OWEN 1995). In komplexen Strukturen wie biologischen Geweben liegen kombinierte Streueffekte vor (BIGIO u. MOURANT 1997).
2.2.2 Grundsätzliche Vorgänge bei der Absorption
Moleküle existieren in diskreten Energieniveaus. Die Lage dieser Energieniveaus ist abhängig von der Anzahl und Konjugation der Elektronen sowie von der räumlichen Struktur des Mo- leküls. Beim Wechsel zwischen zwei Energieniveaus müssen Moleküle diejenige Energie aufnehmen oder abgeben, die der Energiedifferenz zwischen den jeweiligen Energiezuständen entspricht. Die Absorption von Strahlung durch ein Molekül ist mit der Aufnahme von Photo- nen verbunden. Die Energie elektromagnetischer Strahlung ist ihrer Frequenz proportional, wie durch die Bohr-Einstein-Relation definiert:
[1] E = h ⋅ ν
E Energie der elektromagnetischen Strahlung h Plancksche Konstante
ν Frequenz der elektromagnetischen Strahlung
Dies erklärt, warum jede Substanz nur bestimmte Frequenzen absorbiert, die den Eigenfre- quenzen der absorbierenden Substanz entsprechen. Gleichzeitig ist die Frequenz elektroma- gnetischer Wellen ihrer Wellenlänge umgekehrt proportional:
[2] c = λ⋅ν
c Lichtgeschwindigkeit
λ Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung ν Frequenz der elektromagnetischen Strahlung
Die absorbierten Wellenlängen sind somit ebenfalls stoffabhängig. Elektromagnetische Strahlen im UV-VIS Bereich interagieren mit π- und n-Elektronen. Die Energie von Strahlung dieser Frequenzen ist den Energiedifferenzen zwischen den äußeren Elektronenschalen äqui- valent, zwischen denen die zugehörigen Übergänge stattfinden (PERKAMPUS 1992, BÖCKER 1997).
2.2.3 Absorption durch Moleküle
Aus den obigen theoretischen Erwägungen ergibt sich, daß Spektren immer aus Absorptions- linien bestehen müßten, was in der Praxis jedoch nur bei Atomen beobachtet wird. Sind mehrere Atome in einem Molekül verbunden, so entstehen zur Schwingung und Rotation befähigte Gebilde. Aus Gründen der Resonanz ist die zur Anregung von Schwingungs- und Rotationsübergängen benötigte Energie ebenfalls stoffabhängig.
Elektronenübergänge in einem Molekül sind stets von einer Vielzahl verschiedener dicht beieinander liegender Schwingungs- und Rotationsübergänge begleitet, so daß Absorptions- spektren von Molekülen aus breiten Banden feiner Linienspektren bestehen. Dabei legen die Quantensprünge der Elektronenübergänge die Lage, die begleitenden Überlagerungen ener- gieärmerer Schwingungen und Rotationen die Form der Banden fest. Eine Auflösung der Feinstruktur ist nur in hochverdünnten Gasen, nicht jedoch an festen, flüssigen oder gelösten Stoffen möglich, da eine Verwischung durch intramolekulare Störungen hinzutritt (PERKAMPUS 1992, BÖCKER 1997).
2.2.4 Qualitative Spektroskopie
Aufgrund des unterschiedlichen atomaren und räumlichen Aufbaus von Molekülen sind die durch Elektronen-, Schwingungs- oder Rotationsanregung erzeugten Spektren stoffcharakte- ristisch. Absorptionsspektren liefern daher eine Aussage über die in der Probe enthaltenen Substanzen. Bei Substanzgemischen addieren sich die Extinktionsspektren der Einzelsubstan- zen zu einem Summenspektrum (BÖCKER 1997).
2.2.5 Quantitative Spektroskopie
2.2.5.1 Ermittlung von Spektren
Spektren werden ermittelt, indem Lichtintensitäten vor und nach der Interaktion mit einer absorbierenden Substanz gemessen werden. Aus diesen Intensitäten läßt sich der Anteil des durch die Probe hindurchtretenden (Transmission) und der des in der Probe absorbierten Lichtes errechnen (BÖCKER 1997):
[3]
I0
) I T(λ =
[4]
0 0
I I ) I
A(λ = −
T(λ) Transmission an der Wellenlänge λ A(λ) Absorptionsgrad an der Wellenlänge λ I0 eingestrahlte Strahlungsleistung I gemessene Strahlungsleistung
2.2.5.2 Das Lambert-Beersche Gesetz
Die nach Gleichung [3] und [4] errechnete Transmission beziehungsweise der Absorptions- grad hängt in seiner Größe von der Schichtdicke der Probe und der Konzentration des absor- bierenden Mediums ab. Zur Beschreibung dieser Zusammenhänge dient meist das empirisch ermittelte Lambert-Beersche Gesetz:
[5] c d
I log I )
E(λ = 10 0 = ⋅ ⋅
E(λ) Extinktion an der Wellenlänge λ I0 eingestrahlte Strahlungsleistung I gemessene Strahlungsleistung
ε Extinktionskonstante (stoffspezifisch) c Konzentration des absorbierenden Stoffes d Weglänge des Lichtes in der Probe
Das Lambert-Beersche Gesetz gilt jedoch nur unter bestimmten Voraussetzungen. So liegt bei sehr hohen Extinktionen kein linearer Zusammenhang mehr vor (RODGER u. SANDERS 1999). Weitere Voraussetzung ist eine homogen molekulardisperse Verteilung der absorbie- renden Substanzen ohne Streuung sowie ein definierter und konstanter Lichtweg (JUNGMANN 1998).
2.2.5.3 Die Zweiflußtheorie von Kubelka und Munk
Analog zur Definition der Transmission wird die Reflexion (R) wie folgt definiert:
[6]
I0
) I R(λ =
R(λ) Reflexionsgrad an der Wellenlänge λ I0 eingestrahlte Strahlungsleistung I gemessene Strahlungsleistung
Da das Lambert-Beersche Gesetz Streuung von der Betrachtung ausnimmt, ist es zur Inter- pretation von Reflexionsspektren nicht geeignet. Die erste quantitative Beschreibung von Re- flexionsspektren stammt von KUBELKA u. MUNK (1931):
[7]
∞
∞
⋅
= − R 2
) R (1 S
K 2
K Absorptionsmodul
S Streumodul
R∞ Reflexion einer optisch halb unendlich dicken Probe
2.3 Spektroskopie an biologischen Geweben
In diesem Abschnitt soll nur auf allgemeine Prinzipen der Spektroskopie an biologischen Ge- weben eingegangen werden. Das später in dieser Arbeit entwickelte Modell zur Auswertung von Hautspektren ist in hohem Maße von einem Ausgleich der im Gewebe vorliegenden optischen Effekte abhängig. Die Grundlagen zur Korrektur dieser Effekte werden an entsprechender Stelle im Abschnitt 3 (Material und Methoden) mitbehandelt.
2.3.1 Einführung
Zahlreiche physiologisch wichtige Stoffe wie Hämoglobin, Cytochrome, Melanin, Caroti- noide, Fette, Adenosintriphosphat, aber auch Wasser, Glukose und Laktat sind spektrosko- pisch nachweisbar, so daß bereits Mitte des 19. Jahrhunderts Anstrengungen unternommen wurden, spektroskopische Methoden in der Medizin anzuwenden. Allerdings scheiterten diese Versuche bis Mitte des 20. Jahrhunderts am Fehlen eines geeigneten Modells zur Analyse von In-vivo-Spektren (JUNGMANN et al. 1996). Erst CHANCE (1954) sowie WODICK und LÜBBERS (1974) legten die Grundlagen einer erfolgreichen Anwendung der Spektroskopie in der Medizin.
Anfang der Achtziger Jahre wurde eine bessere Beschreibung des Verhaltens von Licht im Gewebe durch neue medizinische Anwendungen von Licht erforderlich. Dabei handelt es sich um Laseranwendungen sowie die sogenannte Photodynamische Therapie (PDT) von Tumoren, bei der injizierte Stoffe durch Licht angeregt werden, so daß sie eine lokale Gewebszerstörung bewirken (RIS et al. 1991). Diese Anwendungen benötigen für einen optimalen Therapieerfolg bei geringst möglicher Schädigung des umliegenden Gewebes eine genaue Beschreibung der lokalen Lichtdosis. Dazu wurden die optischen Eigenschaften des Gewebes zunächst mittels einfacher, ursprünglich für andere Anwendungen konzipierter Modelle wie oben beschriebener Zweiflußtheorie beschrieben (ANDERSON u. PARRISH 1982). Schon bald war jedoch offensichtlich, daß realistische Modelle neben dem Absorptionsmodul K und dem Streumodul S zusätzliche Parameter benötigen. Heutzutage werden die optischen Eigenschaften der Gewebe meist mittels komplizierterer Modelle beschrieben, die sich aus der Boltzmann-Transport-Gleichung herleiten (STAR 1997).
2.3.2 Optische Parameter biologischer Gewebe
Bei spektroskopischen Messungen in biologischen Geweben werden die eingestrahlten Pho- tonen an Oberflächen reflektiert, im Gewebe gestreut und absorbiert. Diese Effekte kombinie- ren sich zum resultierenden Gesamtspektrum. Für eine sinnvolle Interpretation solcher Spek- tren ist es notwendig, mathematische Modelle zur quantitativen Analyse der einzelnen Effekte anzuwenden. Die heute verwendeten Modelle leiten sich meist von der Boltzmann-Transport- Gleichung ab, welche genaue Beschreibungen der Ausbreitung von Licht im Gewebe durch Einbeziehung der statistischen Winkelverteilung von Streuereignissen ermöglicht
(ISHIMARU 1989). Für ein solches Modell werden vier Parameter benötigt: der Absorp- tionskoeffizient, der Streukoeffizient, die Streuphasenfunktion und der Brechungsindex.
Der Absorptionskoeffizient µa charakterisiert die Wahrscheinlichkeit der Absorption von Licht anhand der mittleren Häufigkeit von Absorptionsereignissen innerhalb der freien Weglänge eines Photons von 1 Millimeter (PROFIO 1989).
Der Absorptionskoeffizient eines Gewebes wird durch die in der Probe enthaltenen Farbstoffe bestimmt und läßt somit Rückschlüsse auf die Zusammensetzung des Probenmaterials zu (BIGIO u. MOURANT 1997). Der Absorptionskoeffizient menschlicher Haut nimmt im Be- reich von 300 nm bis 900 nm von etwa 1/mm auf etwa 0,05/mm ab (s. Abb. 2) (ROGGAN et al. 1999).
Entsprechend dem Absorptionskoeffizienten charakterisiert der Streukoeffizient µs die Wahrscheinlichkeit der Streuung anhand der mittleren Häufigkeit von Streuereignissen inner- halb der freien Photonenweglänge von 1 Millimeter (MOURANT et al. 1999).
Im Gegensatz zur Absorption werden die Streueigenschaften des Gewebes in erster Linie durch die Gewebsstruktur bestimmt (BIGIO u. MOURANT 1997). Eine Streuung elektro- magnetischer Wellen erfolgt dabei im Bereich der Dermis vor allem durch kollagene Fasern (SAIDI et al. 1995). Der Streukoeffizient humaner Haut zeigt einen Abfall von etwa 25/mm bei 300 nm auf etwa 18/mm bei 900 nm (s. Abb. 2) (ROGGAN et al. 1999).
Abb. 2: Absorptionskoeffizient und Streukoeffizient menschlicher Haut zwischen 300 und 900 nm (nach ROGGAN et al. 1999)
300 600 900
Wellenlänge (nm)
10
1
0,1
0,01
0,001
Absorptionskoeffizientµa (1/mm)
300 600 900 Wellenlänge (nm)
30
20
10
0 Streukoeffizientµs (1/mm)
In der Unterhaut liegen die absoluten Werte nur etwa halb so hoch und die Abnahme hin zu größeren Wellenlängen ist geringer als in darüber liegenden Schichten (SIMPSON et al.
1998). Darüber hinaus ist der Streukoeffizient menschlicher Haut in weiten Wellenlängenbereichen deutlich temperaturabhängig, und nimmt in der Epidermis und Dermis zwischen 25 °C und 40 °C zu, in der Unterhaut ab (LAUFER et al. 1998).
Die Streuphasenfunktion P (θ) wird zur Beschreibung der statistischen Winkelverteilung der Streuereignisse benötigt (PROFIO 1989). In biologischen Geweben dominiert die Streuung deutlich über die Absorption. Unter dieser Voraussetzung ist es möglich, mit der sogenannten Diffusionsapproximation zu arbeiten, bei welcher die Streuphasenfunktion auf den Anisotropiefaktor g reduziert wird. Dieser ist wie folgt definiert:
[8] g = cos (θ)
g Anisotropiefaktor θ mittlerer Streuwinkel
Der Anisotropiefaktor g umfaßt Werte zwischen –1 (totale Rückstreuung) und +1 (totale Vorwärtsstreuung). Ein Wert von 0 steht für isotrope (richtungsunabhängige) Streuung (ROGGAN et al. 1999).
Die meisten Gewebe sind durch starke Vorwärtsstreuung mit einem Anisotropiefaktor g grö- ßer als 0,85 charakterisiert (FLOCK et al. 1987). Er beträgt in der Haut für den Wellenlän- genbereich von 600 nm bis 1200 nm etwa 0,9 (CHEONG et al. 1990). Bei kürzeren Wellen- längen zeigt sich in menschlicher Haut ein deutlicher Abfall dieses Wertes bis auf etwa 0,5 bei 300 nm (ROGGAN et al. 1999).
Des weiteren beschreiben NICKELL et al. (2000) für humane Haut eine hohe Abhängigkeit des Anisotropiefaktors von der Fortbewegungsrichtung des Lichtes, welche auf die Ausrich- tung der kollagenen Fasern in der Dermis mit damit verbundener unterschiedlicher Streuung des Lichtes zurückgeführt wird.
Der Brechungsindex n besitzt entscheidenden Einfluß auf die Flußrate von Licht an der Ge- websoberfläche (STAR et al. 1992). Unterschiedliche Brechungsindizes des Gewebes und des darüberliegenden Mediums führen je nach Meßanordnung zu Lichtverlusten oder Überlage- rungen von Oberflächenreflexionen. Die meisten Säugetiergewebe haben im Bereich sichtba-
ren Lichtes speziesunabhängig einen Brechungsindex n zwischen 1,38 und 1,41. Dieser zeigt zu höheren Wellenlängen einen abnehmenden Trend (BOLIN et al. 1989).
2.3.3 Photonenweglänge
Nach dem Lambert-Beerschen-Gesetz (Gleichung 5), hängt die Extinktion linear von der Photonenweglänge d ab. Die Kenntnis der Weglänge ist somit die Voraussetzung für quanti- tative spektroskopische Messungen. Die im Gewebe zurückgelegte Weglänge des Lichtes ist jedoch unbekannt und läßt sich nicht ohne weiteres bestimmen (JUNGMANN 1998).
Die Entwicklung von Methoden, diese Größe direkt für jede Meßsituation zu ermitteln, stellt einen Schwerpunkt aktueller spektroskopischer Forschung dar. Dabei existieren unterschiedli- che Ansätze, die Weglänge d zumindest näherungsweise zu bestimmen. So ist es möglich, die Flugzeit von Photonen im Gewebe zur Berechnung des Lichtweges zu benutzen. Die Auflö- sung dieser kostenintensiven Methode liegt jedoch derzeit bei etwa 2 mm, was für Messungen in biologischen Geweben bei weitem nicht ausreicht (DELPY et al. 1988, TSUCHIYA et al.
1995).
In einem anderen Ansatz wird versucht, die optischen Eigenschaften eines Gewebes während der Messung mit Hilfe geeigneter Sensoren zu bestimmen und diese Information zur Ermitt- lung der mittleren Photonenweglänge zu benutzen. FARREL et al. (1992) beschreiben die Möglichkeit, mittels eines Sensors, der die Reflexion in unterschiedlichen Abständen von der Einstrahlung aufnimmt, die optischen Eigenschaften anhand der Diffusionsapproximation zu errechnen. WEERSINK et al. (1997) benutzen eine gleichartige Methode zur spektroskopi- schen Bestimmung der Konzentration von Photosensitizern in Kaninchenhaut. MOURANT et al. (1999) ermitteln die mittlere Photonenweglänge in Mäusehaut mittels Monte-Carlo-Simu- lationen (s. 3.3.7.4, S. 60f) und messen spektroskopisch die Konzentration der Chemothera- peutika Doxorubicin und Mitoxantron.
2.4 Beta-Carotin
2.4.1 Physikalisch-chemische Eigenschaften
Beta-Carotin gehört zur Gruppe der Carotinoide, die von Photosynthese betreibenden Orga- nismen gebildet werden. Von diesen farbigen Verbindungen sind mehr als 600 bekannt (THURNHAM 1994). Carotinoide werden in die apolaren Carotine und die mehr polaren Xantophylle (z. B. Lutein, Zeaxanthin) eingeteilt. Beta-Carotin ist ein Polypren mit einer symmetrischen Strukturformel, das aus zwei, über eine Isoprenoidkette verbundenen Beta- Ionenringen besteht (s. Abb. 3). Das Molekül enthält 11 konjugierte Doppelbindungen, ist in Wasser unlöslich und in apolaren Lösungsmitteln löslich (BIESALSKI 1997). Das Moleku- largewicht beträgt 536,9 g/mol.
Die Verbindung tritt in zahlreichen geometrischen Konfigurationen auf, von denen all-trans-, 9-cis-, 13-cis- und 15-cis-Isomere bevorzugt formiert werden. Diese können durch Licht, thermische Energie oder chemische Reaktionen ineinander umgewandelt werden (ZECHMEISTER 1962).
Abb. 3: Strukturformel von Beta-Carotin
2.4.2 Beta-Carotin-Stoffwechsel
Säugetiere unterscheiden sich von anderen Tierklassen durch ihre Unfähigkeit, Carotinoide de novo oder durch oxidative Metabolisierung anderer Carotinoide herzustellen. Sie sind somit auf eine Zufuhr mit der Nahrung angewiesen. Bezüglich des Carotinoid-Stoffwechsels unter- scheiden sich die verschiedenen Säugetiere erheblich. Da Carotinoide in unveränderter Form nur von einigen Spezies resorbiert werden, unterteilt man die Säugetiere in sogenannte Caro- tin-Akkumulierer und -Nichtakkumulierer. Innerhalb der ersten Gruppe unterscheidet man
wiederum selektive und unselektive Akkumulierer, je nachdem, ob sie nur einzelne oder unterschiedliche Carotinoide resorbieren (GOODWIN 1984).
Der Mensch und andere Primaten zählen zu den unselektiven, Rinder und Pferde dagegen zu den selektiven Akkumulierern, da in ihrem Gewebe lediglich Beta-Carotin in höheren Konzentrationen auftritt. Sichtbares Zeichen ist die Gelbfärbung gewisser Fettgewebsanteile, die auf die Einlagerung von Beta-Carotin zurückzuführen ist. Andere Haussäugetiere (Hund, Katze, Schwein, Schaf) und die meisten Labortiere (Ratte, Meerschweinchen und Kaninchen) zählen zu den durch geringe oder fehlende Carotinoidkonzentrationen in Plasma und Gewebe gekennzeichneten Nichtakkumulierern (GOODWIN 1984, KRINSKY et al. 1990, SLIFKA et al.1999). Meßbare Carotinoid-Konzentrationen findet man bei diesen Tieren nur nach lang- wöchiger Fütterung mit hohen Dosen (MATHEWS-ROTH et al. 1977, RIBAYA-MERCADO et al. 1989).
2.4.2.1 Resorption aus dem Dünndarm
Beta-Carotin wird im Dünndarm zusammen mit andern Lipiden durch Gallensalze emulgiert, in Mizellen aufgenommen und von der Intestinalmukosazelle resorbiert (EL-GORAB et al.
1975, CANFIELD et al. 1990). HOLLANDER u. RUBLE (1978) sind der Meinung, daß die Carotinoide durch passive Diffusion von der Mizelle in die Mukosazellen gelangen, wobei diese Untersuchung an der zu den Nichtakkumulierern zählenden Ratte durchgeführt wurde.
Die Absorptionsrate aus dem Dünndarm wird durch zahlreiche Faktoren wie Effektivität der Freisetzung der Carotinoide aus der natürlichen Matrix, Rohfaseranteil der Nahrung sowie Anteil nichtverdauter Lipide im Darmlumen beeinflußt (ROCK u. SWENDSEID 1992, WESTRATE u. VAN HET HOF 1995, PARKER 1996). Besonders ein erhöhter Fettanteil der Nahrung führt zu einer stark gesteigerten Absorptionsrate von Beta-Carotin (DIMITROV et al. 1988). BOREL et al. (1996) erklären dies dadurch, daß Fettsäuren als Produkte der Lipolyse von Triglyceriden der limitierende Faktor für die Bildung von Mizellen sind. Des weiteren sind Interaktionen zwischen verschiedenen Carotinoiden beschrieben (WHITE et al.
1994, KOSTIC et al. 1995).
Darüber hinaus wird Beta-Carotin bei Mensch und Rind als all-trans-Isomer gegenüber dem 9-cis-Isomer bevorzugt resorbiert (JENSEN et al. 1987, STAHL et al. 1993, GAZIANO et al.
1995). Ursache hierfür scheint eine cis-trans-Isomerisierung von Beta-Carotin in den Darmmukosazellen zu sein (STAHL et al. 1995, YOU et al. 1996).
Die Höhe der erreichten Plasmaspiegel von Beta-Carotin nach einmaliger oraler Gabe ist stark unterschiedlich. Ein Anstieg bleibt sowohl beim Menschen als auch beim noch nicht ruminie- renden Kalb bei einigen Individuen völlig aus (JOHNSON u. RUSSEL 1992, POOR et al.
1992, STAHL et al. 1993). Erklärungsversuche für dieses Verhalten umfassen eine ineffi- ziente Aufnahme von Beta-Carotin durch die Mukosazellen, ungenügenden Transfer in die Lipoproteine oder einen extensiven Umsatz zu Retinylestern (PARKER 1996). Solche so ge- nannten „non-responder“ treten jedoch bei beiden Spezies unter chronischer Supplementie- rung nicht auf (MICOZZI et al. 1992, HOPPE et al. 1996).
2.4.2.2 Metabolisierung in der Intestinalzelle
In der Intestinalmukosazelle wird ein Teil des Beta-Carotins durch Spaltung in Retinyl-Ester umgesetzt. Diese erfolgt entweder durch das Enzym 15,15-Dioxygenase an der zentralen Doppelbindung unter Bildung von zwei Molekülen Retinal oder an exzentrischen Doppelbin- dungen, wobei verschiedene Apocarotinale entstehen (OLSON 1988). Die Konversionsrate von Beta-Carotin zu Vitamin A ist stark speziesabhängig und führt zur Unterscheidung zwischen Akkumulierern und Nichtakkumulierern (BEESON 1965, BONDI u. SKLAN 1984, ROCK et al. 1996).
2.4.2.3 Transport in der Intestinalzelle und Sekretion in die Lymphe
Nicht metabolisierte Carotinoide werden zumindest teilweise von der Mukosazelle über Chylomikronen in den Intrazellularraum sezerniert, von wo sie mit der Lymphe in den Blut- strom gelangen. Es ist unklar, wie Carotinoide innerhalb der Zelle transportiert werden, sowie wann und wo sie in den Lipoproteinbildungsprozeß gelangen (ERDMAN et al. 1993, PARKER 1996).
Andere Lipide werden innerhalb der Intestinalzelle zum endoplasmatischen Retikulum trans- portiert und nach Kombination mit Apolipoprotein B in Chylomikronen inkorporiert. Diese gelangen über den Golgi-Apparat in Form von Vesikeln zur Plasmamembran, wo sie durch Verschmelzung der Vesikel mit der Membran freigesetzt werden (VANCE u. VANCE 1990).
Im Gegensatz zu verschiedenen dieser Lipide, wie auch zum Carotin-Metaboliten Retinol sind
spezifisch bindende und für den intrazellulären Transport verantwortliche cytosolische Pro- teine für Carotinoide bislang nicht nachgewiesen. Das schnelle Erscheinen von Carotinoiden in neu synthetisierten Chylomikronen nach oraler Aufnahme spricht jedoch gegen eine rein passive Diffusion und für das Vorhandensein zusätzlicher Transportmechanismen. In Frage kommen beispielsweise membrangebundene Transportproteine oder ein vesikulärer Trans- port, wie er auch für den intrazellulären Transport von Cholesterol beschrieben ist (LISCUM u. DAHL 1992, GUGGER u. ERDMAN 1996).
2.4.2.4 Transport im Blut
Carotinoide werden im Blut bei oraler Aufnahme in Lipoproteinen transportiert; nach intra- muskulärer Injektion sind jedoch 30% des Gesamt-Beta-Carotins im Plasma nicht an Lipo- proteine gebunden (SCHWEIGERT u. EISELE 1990). Bei Lipoproteinen handelt es sich um sphäroide Partikel, die aus einem apolaren Triglyceridkern und einer monomolekularen, hauptsächlich aus Phospholipiden bestehenden amphipolaren Schale bestehen. Beta-Carotin befindet sich aufgrund seiner Apolarität ausschließlich im Triglyceridkern (BOREL et al.
1996), was den Befund erklärt, daß in-vitro ein spontaner Transfer von Beta-Carotin zwischen unterschiedlichen Lipoproteinen auch bei 18stündiger Inkubation nicht beobachtet werden kann (MASSEY 1984).
Im Darm wird Beta-Carotin zunächst in Chylomikronen inkorporiert, die im Blutkreislauf zu Chylomikronen-Restkörpern metabolisiert und von der Leber aufgenommen werden. Hier wird Beta-Carotin entweder zu Vitamin-A umgesetzt oder wieder in den Blutkreislauf abge- geben. Dies geschieht über Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL), die im Blutkreislauf weiter zu Lipoproteinen geringer (LDL) und hoher Dichte (HDL) umgesetzt werden (ERDMAN et al. 1993).
Beim Menschen tragen vor allem LDL, zu einem geringeren Anteil auch VLDL und HDL zum Transport bei (MATHEWS-ROTH u. GULBRANDSEN 1974, CLEVIDENCE u. BIERI 1993). Beim Rind findet der Transport hauptsächlich in der HDL-, zu geringem Anteil auch in der LDL- und VLDL-Fraktion sowie in Chylomikronen statt (SCHWEIGERT et al. 1987, CHEW et al. 1993, BIERER et al. 1995).
Des weiteren ist Beta-Carotin in der Erythrozytenmembran von Mensch und Rind nachweis- bar (NILSSON 1971, MATHEWS-ROTH 1975). Ein geringer Anteil findet sich beim Men-
schen auch in den Zellmembranen von Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten (MATHEWS-ROTH 1978). Beim Rind hingegen ist Beta-Carotin nur in Lymphozyten, nicht jedoch in anderen weißen Blutzellen nachweisbar (CHEW et al. 1993), was CHEW et al.
(1991a) nach gleichen Befunden an porcinen Lymphozyten auf das Vorhandensein eines spe- zifischen Beta-Carotin bindenden Proteins und einer spezifischen Funktion von Beta-Carotin in diesen Zellen zurückführen.
Die Beta-Carotin-Konzentration im Plasma schwankt beim Menschen zwischen 0,2 µg/ml und 2 µg/ml (FORTH u. RUMMEL 1992). Beim adulten Rind liegt sie mit stark saisonalen Schwankungen zwischen 1,5 µ g/ml und 15 µg/ml (STÖBER 1994). Während der Trächtigkeit fällt die Konzentration ab und normalisiert sich post partum wieder innerhalb von drei Wochen (GOODWIN 1984).
2.4.2.5 Aufnahme aus dem Blut und intrazellulärer Transport
Der Mechanismus der Aufnahme von Beta-Carotin aus den Lipoproteinen in die Zellen der unterschiedlichen Gewebe ist unklar. Ein Zusammenhang zum Vorhandensein von Lipopro- tein-Rezeptoren im Zielgewebe ist wahrscheinlich, jedoch bislang nicht nachgewiesen (PARKER 1996). ASHES et al. (1984) beobachten bei Rindern eine negative Korrelation des in der HDL-Fraktion transportierten Anteils zur Sekretion von Beta-Carotin in die Milch. Sie vermuten daher, daß der Transfer von Beta-Carotin in die Milch über nicht-HDL-Lipopro- teine erfolgt. Da Beta-Carotin im Lipoproteinkern transportiert wird, vermuten BOREL et al.
(1996), daß Beta-Carotin erst nach Lipolyse der Kerntriglyceride auf Zellmembranen oder andere Lipoproteine transferiert werden kann.
Die subzelluläre Verteilung von Beta-Carotin wurde an verschiedenen Zellen unterschiedli- cher Spezies untersucht. In allen untersuchten Zellen findet man Beta-Carotin in sämtlichen subzellulären Fraktionen. Im Cytosol boviner Zellen des Corpus luteum liegt es an nicht näher bestimmte hochmolekulare Proteine gebunden vor. In mitochondralen und nukleären Frak- tionen ist es lediglich schwach, in Mikrosomen fester gebunden, was darauf hinweist, daß es ein integraler Bestandteil der Mikrosomenmembran ist (O´FALLON u. CHEW 1984). Die subzelluläre Verteilung ist in der bovinen Milchdrüse vom Laktationsstatus abhängig (PATTON u. KELLY 1980). Sie verändert sich in porcinen Lymphozyten nach einmaliger Supplementierung im Laufe der Zeit (CHEW et al. 1991b). In bovinen Lymphozyten ist der
Peak in allen Fraktionen gegenüber dem Plasmapeak um etwa vier Tage verzögert (CHEW et al. 1993).
2.4.2.6 Speicherung
Hauptspeicher für Beta-Carotin ist beim Menschen das Fettgewebe, beim Rind die Leber, wo es auch im Fettgewebe und diversen inneren Organen, der Muskulatur und Haut nachgewie- sen werden kann (GOODWIN 1984, PARKER 1989, POOR et al. 1992). Auffällig sind die hohen Schwankungen der Carotinoidgehalte in den Speichergeweben von Rind und Mensch.
Die Normalkonzentration von Beta-Carotin in der Leber des Rindes liegt zwischen 4000 und 50000 ng/g Gewebe (STÖBER 1994). In menschlichem Fettgewebe findet PARKER (1988) Carotinoidkonzentrationen zwischen 340 ng und 1351 ng pro g Gewebe. In menschlicher Leber liegen die Werte pro g Gewebe zwischen 1 ng und 100 ng (BIESALSKI 1997).
Im Auge von Primaten einschließlich des Menschen ist eine offensichtlich durch selektive Mechanismen regulierte Ablagerung der Carotinoide Lutein und Zeaxanthin beschrieben (HANDELMAN et al. 1988, HANDELMAN et al. 1991).
2.4.2.7 Eliminierung
Nicht aus dem Dünndarm resorbiertes Beta-Carotin wird mit den Fäzes ausgeschieden; im Urin können Apocarotinale und nicht näher identifizierte Bruchstücke nachgewiesen werden.
Rinder sezernieren Beta-Carotin mit der Milch und dem Sekret der Ohrdrüsen (GOODWIN 1984). Das Ausmaß der Sekretion in die Milch ist rasseabhängig und folgt einer Michaelis- Menten-Kinetik (THOMSON et al. 1964, JENSEN et al. 1999).
Der Serum-Beta-Carotinspiegel fällt nach Absetzen einer oralen Supplementierung beim Menschen dosisunabhängig mit einer Halbwertszeit von 10 Tagen, gehorcht jedoch nicht einer einfachen Kinetik erster Ordnung. Dies wird auf eine auch nach dem Absetzen anhaltende Freisetzung von Beta-Carotin aus dem Dünndarm zurückgeführt (PRINCE u.
FRISOLI 1993). Beim Kalb beträgt die Halbwertszeit im Plasma 5,5 Tage (CHEW et al.
1993).
2.4.3 Pharmakokinetik von Beta-Carotin in der Haut
2.4.3.1 Beta-Carotin-Konzentration in der Haut
Beim Menschen hat Beta-Carotin die höchsten Konzentrationen in der Epidermis und in der Unterhaut, deutlich geringere Konzentrationen in der dazwischen liegenden Dermis (s. Abb.
4) (VAHLQUIST et al. 1982). Darüber hinaus sind die Beta-Carotin-Konzentrationen in der Haut in verschiedenen Körperregionen stark unterschiedlich mit höchsten Werten an Stirn und Händen, geringeren Konzentrationen am Rücken sowie der Innenseite des Unterarms (STAHL et al. 1998). Im Flotzmaul des Rindes liegt die höchste Beta-Carotin-Konzentration mit 1000 ng/g Gewebe in basalen Epidermisschichten vor. Höhere epidermale Schichten und die Dermis weisen geringere Beta-Carotin-Konzentrationen auf (VAHLQUIST et al. 1987).
Abb. 4: Schematische Darstellung der mittleren Beta-Carotin-Konzentrationen der verschie- denen Hautschichten inklusive der Blutgefäße (menschliche Brust). Der obere schraffierte Teil der Dermis stellt das Stratum papillare, der untere nicht schraffierte das Stratum reticu- lare dar (nach VAHLQUIST et al. 1982)
2.4.3.2 Akkumulation in der Haut
Zur Pharmakokinetik von Beta-Carotin in der Haut existieren nur wenige Studien. Die Akku- mulation in der Haut ist beim Menschen unter oraler Supplementierung gegenüber der Serum-
2220 ng/g
700 ng/g
775 ng/g
1885 ng/g
1100 ng/ml
Epidermis
Dermis
Unterhaut
Blut (Serum)
akkumulation um bis zu zwei Wochen verschoben, folgt dieser jedoch bei einzelnen Indivi- duen auch ohne zeitliche Verzögerung (PRINCE u. FRISOLI 1993). RIBAYA-MERCADO et al. (1995) beobachten nach einmaliger oraler Gabe von 120 mg Beta-Carotin bei gesunden Frauen einen Anstieg der dermalen Beta-Carotin-Konzentration um 23% nach 6 Tagen.
STAHL et al. (1998 u. 2000) berichten, daß ein steady-state in der Haut auch nach 12 wöchi- ger oraler Supplementierung nicht erreicht wird. In dieser Zeit findet eine Akkumulation in allen Körperregionen statt. Es bestehen jedoch starke interindividuelle Unterschiede.
2.4.3.3 Verteilung in der Haut
JUNGMANN et al. (1996) beobachten Veränderungen der Verteilung innerhalb der Haut bei chronisch oraler Aufnahme. Beta-Carotin ist nach 4 Wochen erheblich inhomogener verteilt als nach 6 Wochen, was darauf zurückgeführt wird, daß es sich zunächst im Kapillarbereich ablagert wird und erst anschließend weiter ins Gewebe diffundiert.
2.4.3.4 Einfluß von Lichtexposition auf die dermale Beta-Carotin-Konzentration BIESALSKI et al. (1996) beschreiben nach 12tägiger Sonnenlichtexposition einen signifi- kanten Abfall der dermalen Beta-Carotin-Konzentration bei supplementierten und nicht sup- plementierten Probanden. Überdies nehmen nach Beendigung einer oralen Supplementierung die dermalen Beta-Carotin-Konzentrationen an lichtexponierten Stellen am stärksten ab (STAHL et al. 1998). Hingegen beobachten RIBAYA-MERCADO et al. (1995) nach UV- Exposition mit der dreifachen minimalen Erythemdosis (individuell ermittelte UV-Dosis, die gerade zur Ausbildung eines Erythems ausreicht) keinen signifikanten Abfall der dermalen Beta-Carotin-Konzentration.
2.4.3.5 Korrelation zwischen Beta-Carotin-Plasma- und Hautkonzentrationen
PENG et al. (1995) finden beim Menschen eine signifikante Korrelation der Beta-Carotin Konzentrationen von Plasma und Haut. Eine lineare Korrelation liegt jedoch beim Menschen nach BIESALSKI et al. (1996) nur unter oraler Supplementierung vor. Das Ausmaß der Kor- relation ist nach STAHL et al. (1998) an Handinnenflächen und der Stirn besonders groß, am Handrücken und der Innenseite des Arms geringer.
In der Haut der Ratte sind die Beta-Carotin-Konzentrationen in Plasma und Haut von der zu- geführten Menge abhängig. Bei dieser Spezies unterscheidet sich die Pharmakokinetik von Beta-Carotin in allen Geweben hinsichtlich akkumulierter Menge, Geschwindigkeit und Halbwertszeit (SHAPIRO et al. 1984). PARKER (1989) geht von zahlreichen Einflußfaktoren auf die Korrelation von Plasma- und Gewebsspiegeln aus. Eine Interaktion zwischen ver- schiedenen Carotinoiden ist bei der Ratte nachgewiesen. So verringert Lycopin die Verteilung von Beta-Carotin in die Gewebe (GLISE et al. 1998).
2.4.4 Wirkungen von Beta-Carotin
2.4.4.1 Provitamin-A-Wirkung
Beta-Carotin ist das wichtigste und wirksamste Provitamin-A. Der Umsatz zu Retinal erfolgt zu einem großen Anteil in den Enterozyten, ist aber auch in peripheren Geweben beschrieben.
Beispielhaft seien menschliches Fettgewebe, Leber und Lunge von Primaten sowie bovine Milchdrüse und Corpus luteum genannt (SCHWEIGERT et al. 1988, SCHWEIGERT u.
EISELE 1990, WANG et al. 1993).
2.4.4.2 Antioxidative Wirkung
Beta-Carotin ist in der Lage, hochreaktive Radikale und Singulett-Sauerstoff zu desaktivieren, und so die Zellen und Gewebe des Organismus vor einer oxidativen Schädigung zu schützen (BIESALSKI 1997).
Freie Radikale entstehen als Nebenprodukte des normalen Sauerstoff-Metabolismus und bei Lichtabsorption. Sie vermögen in einer Kettenreaktion verschiedene Lipide wie ungesättigte Fettsäuren und Cholesterin, aber auch Proteine, Nukleinsäuren und Kohlenhydrate zu schädi- gen (SIES 1986, DARR u. FRIDOVICH 1994). Beta-Carotin vermag freie Radikale zu in- aktivieren und somit solche Kettenreaktion zu unterbrechen, indem es selbst stark resonanz- stabilisierte Radikale bildet, die miteinander oder mit anderen Radikalen unter Bildung in- aktiver Produkte reagieren (BURTON 1989, BIESALSKI 1997).
Singulett-Sauerstoff entsteht durch Lichtabsorption. Carotinoide können Sauerstoff in den Grundzustand zurückführen, indem sie die Anregungsenergie unter Bildung eines angeregten Triplettzustandes selbst aufnehmen und als Wärme abgeben (THURNHAM 1994).
2.4.4.3 Photoprotektive Eigenschaften
Die während der UV-Einstrahlung entstehenden Radikale und Singulett-Sauerstoff stehen im Verdacht, an der Genese von Hautschäden (Hautkrebs, Photodermatosen, Sonnenbrand und Hautalterung) beteiligt zu sein (TAYLOR et al. 1990). Aus den oben beschriebenen antioxi- dativen Eigenschaften der Carotinoide werden photoprotektive Eigenschaften abgeleitet, wo- bei die Befunde der verschiedenen Untersuchungen jedoch kein einheitliches Bild ergeben.
Beim Menschen erhöht Beta-Carotin bei längerfristiger oraler Supplementierung die UV- induizierte mittlere Erythemdosis signifikant (GOLLNICK et al. 1996, STAHL et al. 2000).
Hingegen halten MATHEWS-ROTH et al. (1972) die hautprotektive Wirkung von Beta-Ca- rotin für gering. GARMYN et al. (1995) beobachten auf die Induktion von Apoptosezellen durch UV-Einstrahlung und WOLF et al. (1988) auf die Entwicklung UV-induzierter DNA- Schäden und des Hauterythems keinen Effekt von Beta-Carotin. Auch konnte in Langzeitstu- dien beim Menschen kein positiver Effekt von Beta-Carotin auf die Neuentwicklung von Hautkarzinomen beobachtet werden (GREENBERG et al. 1990, GREEN et al. 1999). Eine hautprotektive Wirkung allein durch die optische Filterfunktion von Beta-Carotin wird von BIESALSKI (1997) vermutet, was jedoch von SAYRE u. BLACK (1992) bestritten wird.
HEINRICH et al. (1996) führen die photoprotektiven Eigenschaften von Beta-Carotin vor allem auf wellenlängenunabhängig erhöhte Lichtreflexion zurück.
2.4.4.4 Wirkungen auf das Immunsystem
BENDICH (1989) und CHEW (1993) diskutieren Wirkungen von Beta-Carotin auf das Im- munsystem. Sie unterscheiden Wirkungen auf das spezifische Immunsystem (gesteigerte Lymphozyten-Proliferation mit Steigerung der Zahl zirkulierender CD4-T-Zellen, vermehrte Aktivität zytotoxischer T-Zellen und natürlicher Killerzellen) und Wirkungen auf die unspezi- fische Abwehr (verstärkte makrophagozytäre Bakterienabwehr, Phagozytose und Produktion des Tumor-Nekrosefaktors-α in Tumormodellen, Verhinderung des Verlustes antigenpräsen- tierender Makrophagenrezeptoren). Des weiteren wird von einer verstärkten Abstoßung von Allotransplantaten und Verhinderung der streß- und strahlungsbedingten Thymusinvolution berichtet.
2.5 Das isoliert perfundierte Rindereuter
2.5.1 Anatomie des Rindereuters
2.5.1.1 Allgemeiner Aufbau
Die Milchdrüse des Rindes ist ein bilateral symmetrisches, aus zwei Mammarkomplexen be- stehendes Organ. Beide Euterhälften sind durch das von der Fascia trunci externa profunda gebildete Aufhängeband des Euters (Ligamentum suspensorium uberis) nahezu vollständig getrennt. Jeder Mammarkomplex besteht aus dem Drüsenkörper, welcher das Drüsenparen- chym und die dazugehörigen bindegewebig eingebetteten Leitungsbahnen aufnimmt, sowie der daraus hervorgehenden Zitze. An der Zitzenspitze findet das aus drei Abschnitten (Strich- kanal, Milchzisterne und Milchgänge) bestehende Hohlraumsystem des Euters Verbindung zur Außenwelt. Äußerlich ist das Organ komplett von Haut überzogen, die bei hochgezüchte- ten Rinderrassen nur dünn und fein behaart ist (HABERMEHL 1984).
2.5.1.2 Gefäßversorgung
Die Hauptarterie des Euters ist die Arteria pudenda externa, ein Zweig des Truncus puden- doepigastricus. Sie verläßt die Bauhöhle durch den Leistenkanal und zieht in den Drüsenkör- per des Euters. Hier teilt sie sich in eine stärkere, die Bauchviertel vaskularisierende vordere (Arteria mammaria cranialis) und eine schwächere hintere Euterarterie (Arteria mammaria caudalis), die der Versorgung der Schenkelviertel dient. Teils noch vor dieser Aufzweigung, zum Teil aber auch aus der hinteren Euterarterie zweigt der Ramus basalis caudalis ab, der an kaudodorsale Anteile der Schenkelviertel sowie an den Euterlymphknoten herantritt. Eine Arteria mammaria media entspringt mit erheblichen interindividuellen Unterschieden der vorderen oder hinteren Euterarterie oder dem Teilungswinkel der Arteria pudenda externa.
Sie versorgt die medialen Abschnitte der Bauch- und Schenkelviertel. Neben diesen Haupt- arterien existieren kleinere Zuflüsse aus der Arteria pudenda interna. Anastomosen existieren zwischen den großen Arterien einer Seite, aber auch zwischen beiden Euterhälften. Die Zitze wird von jeweils nur einer Arteria papillaris versorgt, die aus verschiedenen Arterien ent- springt (LE ROUX u. WILKENS 1959).
Der venöse Abfluß des Blutes erfolgt in der Zitze durch zwischen Haut und Zisternen- schleimhaut verlaufende Venen, die nicht von entsprechenden Arterien begleitet werden.
Diese formieren an der Zitzenbasis den Fürstenbergschen Venenring (Circulus venosus pa- pillae). Von diesem ziehen oberflächliche und im Drüsenparenchym mit den Arterien ge- meinsam verlaufende tiefe Venen zur Euterbasis (KOCH u. BERG 1993). Diese treten entwe- der in die vordere (Vena mammaria cranialis) oder die hintere Eutervene (Vena mammaria caudalis), die über Queranastomosen mit der Gegenseite verbunden sind und so den Circulus venosus mammae bilden. Aus diesem wird das Blut über die Vena pudenda externa, die Vena pudenda interna oder die voluminöse Milchader (Vena epigastrica cranialis superficialis) kranial abgeführt. Die Lymphe des Euters sammelt sich in einem subkutan gelegenen diffusen Lymphgefäßnetz, welches größere Gefäße zum kaudal gelegenen Euterlymphknoten (Lym- phonodus mamarii) entläßt (HABERMEHL 1984).
2.5.1.3 Innervation
Die sensible Innervation des Euters erfolgt über die drei ersten Lendennerven und den Nervus pudendus. Der Hauptnerv ist der Nervus genitofemoralis, der große Teile der Haut und des Drüsenparenchyms der Bauch- und Schenkelviertel versorgt. Die Rami cutanei ventrales des Nervus iliohypogastricus und des Nervus ilioinguinalis versorgen die kranialen, der Ramus mammarius des Nervus pudendus die kaudalen Haut- und Drüsenanteile des Euters. Die ve- getative Innervation erfolgt durch symphatische Fasern des Ganglion mesentericum caudale, die zusammen mit den Fasern des Nervus genitofemoralis laufen (HABERMEHL 1984).
2.5.2 Untersuchungen an isoliert perfundierten Rindereutern
PETERSEN et al. (1939, 1941) und HARDWICK et al. (1963) nutzen bereits isoliert mit he- parinisiertem Vollblut perfundierte Euter zur Untersuchung der Physiologie der Milchbildung.
Bei einer Versuchsdauer von bis zu 360 Minuten wird venöses Blut aufgefangen, gefiltert und nach Anreicherung mit Sauerstoff dem arteriellen Reservoir zurückgeführt. BRÄUNIG (1979) weist in einer Studie zur Pharmakokinetik von Sulfonamiden die Resorption intrazi- sternal applizierten und die Sekretion arteriell zugeführten Arzneistoffes mit der Milch nach.
Dazu wird nur eine, mit einer Tyrode-Erythrozyten-Suspension perfundierte Euterhälfte be- nutzt. Die andere Hälfte wird vorher abgesetzt und Anastomosen ligiert.
KIETZMANN et al. (1993) weisen am isoliert perfundierten Rindereuter die dermale Pene- tration topisch applizierter Stoffe und die In-vitro-Metabolisierung von Wirkstoffen nach.
MAASS (1993) überprüft die Eignung des isoliert perfundierten Rindereuters als Hautirrita- tionsmodell. Zur Darstellung der Vitalität des Organs werden Glukosekonzentration, Laktat- bildung und LDH-Freisetzung im Perfusat erfaßt und euterspezifische Grenzwerte festgesetzt.
Diese werden auch bei Perfusion mit reiner Tyrode über einen Versuchszeitraum von 360 Minuten nicht überschritten.
EHINGER u. KIETZMANN (2000) ermitteln unter Perfusion beider Euterhälften die Vertei- lung intrazisternal applizierter Antibiotika im Drüsengewebe in Abhängigkeit von der galeni- schen Formulierung und finden in Perfusat und Gewebe In-vivo-Ergebnissen vergleichbare Konzentrationen. BÄUMER u. KIETZMANN (2000) prüfen die Eignung des Modells zur Untersuchung des Entzündungsgeschehens in der Haut. Dabei ist die In-vitro-Produktion von Prostaglandinen und Leukotrienen sowie die pharmakologische Beeinflussung der Prosta- glandin E2-Synthese nach topischer Arachidonsäureapplikation nachweisbar.
3 Material und Methoden
3.1 Geräte und Reagentien
3.1.1 Spektroskopische Apparatur
Halogenlichtquelle: Halogen Light Source HL-2000, Top Sensor Systems, Eerbeek, Nieder- lande
Deuteriumlichtquelle: Deuterium-Halogen Light Source DH-2000, Top Sensor Systems, Eer- beek, Niederlande
Pencilsensor, Top Sensor Systems, Eerbeek, Niederlande
Ulbrichtkugel mit 5 cm Durchmesser, Top Sensor Systems, Eerbeek, Niederlande CCD-Array mit 2048 aktiven Zellen: Song IL X5M
Blaufilter, ausgebaut aus Photometer M4 QIII, Zeiss, Oberkochen IBM-kompatibler PC mit Pentium-Prozessor
3.1.2 Geräte für die Euterperfusion
Thermostatbad: Mod. W 12, Medingen, Dresden
Peristaltik-Schlauchpumpe: Mod. 7553-75, Cole-Parmer, Chicago, USA Thermometer (HI 93530) mit Oberflächensensor (HI 766B2):
Hanna Instruments, Kehl am Rhein
Schermaschine: Type 1849, Moser, Unterkirchnach
3.1.3 Sonstige Geräte
Photometer: DM 4, Zeiss, Oberkochen
Kühlzentrifuge: Centrifuge 5403, Eppendorf, Hamburg Gefriermikrotom: 1325 CM, Leica, Nußloch
3.1.4 Chemikalien
Perfusionsmedium für das isoliert perfundierte Rindereuter:
136 mmol/l NaCl 11,9 mmol/l NaHCO3
5,5 mmol/l D(+)-Glukose x 1 H2O 2,7 mmol/l KCl
1,8 mmol/l CaCl2 x 2 H2O 1,05 mmol/l MgCl2 x 6 H2O 0,416 mmol/l NaH2PO4
Alle Chemikalien wurden von Merck, Darmstadt bezogen.
Testsätze für die Vitalität des isoliert perfundierten Rindereuters:
Glukose: Nr. 166391, Boehringer, Mannheim Laktat: Nr. 149993, Boehringer, Mannheim LDH: Nr. 1087592, Boehringer, Mannheim
3.2 Aufgabenstellung
Diese Arbeit diente der Entwicklung eines reflexionsspektroskopischen Verfahrens zur nicht- invasiven Stoffbestimmung in der Haut. Die Schwierigkeit lag dabei in erster Linie in der Formulierung eines verläßlichen mathematischen Modells mit der Programmierung und Eta- blierung von Algorithmen zur automatisierten Extraktion quantitativer Informationen aus Reflexionsspektren. Die entwickelte Datenanalyse gleicht zahlreiche der in biologischem Gewebe auftretenden Effekte aus. Sie kann somit als Grundlage einer In-vivo-Spektroskopie für alle im UV-VIS-Bereich zugänglichen Substanzen dienen.
Zur Evaluation der Methode auf der Grundlage umfangreichen Datenmaterials wurde eine Studie zum pharmakokinetischen Verhalten von Beta-Carotin in der Haut angeschlossen.
Dazu wurde das isoliert perfundierte Rindereuter verwendet, welches ein realistisches Modell für die optischen Effekte bei In-vivo-Messungen darstellt. Besonders die Möglichkeit einer Perfusion mit definierten und konstanten Farbstoff-Konzentrationen macht das Modell gut standardisierbar. Erleichtert wurden die Messungen durch eine Perfusion des Organs mit hämoglobinfreier Nährlösung, was aufgrund deutlich geringerer Lichtabsorption und -streu- ung zu größeren Eindringtiefen des Lichtes ins Gewebe führt, und letztlich die Detektierbar- keit anderer Stoffe erleichtert (WODICK u. LÜBBERS 1974). Daneben bietet die Anwen- dung eines In-vitro-Modells die Möglichkeit einer unproblematischen Probenentnahme zum Vergleich der Ergebnisse mit denen etablierter Meßmethoden.
Für die Wahl von Beta-Carotin als Testsubstanz sprach neben der Detektierbarkeit im UV- VIS-Bereich vor allem die klinische Bedeutung von Beta-Carotin. Trotz der zunehmenden Anwendung dieses Stoffes für den Lichtschutz sind pharmakokinetische Parameter in der Haut nur wenig untersucht (GOLLNICK et al. 1996). Auch hier sprechen neben geringerem Aufwand und Kosten gegenüber einer klinischen Studie wesentlich besser standardisierbare Bedingungen für Untersuchungen an einem In-vitro-System. Von Vorteil ist dabei die Tatsa- che, daß Rind und Mensch zu den Beta-Carotin-Akkumulierern zählen, wodurch gewonnene Ergebnisse problemloser zwischen diesen Spezies übertragbar sind als bei Verwendung von Nicht-Akkumulierern.
3.3 Spektroskopische Methode und Ableitung des Auswert-Algorithmus
Die in der Arbeit entwickelte Datenanalyse basiert auf dem Prinzip, Reflexionsspektren von Haut auf Reinspektren bekannter Referenzsubstanzen zurückzuführen. Die in der biologi- schen Matrix gemessenen Spektren werden gegenüber den Reinspektren durch zahlreiche optische Effekte verzerrt. Eine sinnvolle Analyse von Stoffkonzentrationen ist folglich nur nach Korrektur dieser Effekte möglich. Die dazu angewendeten Auswertschritte sollen im Folgenden unter Bezug auf die Literatur beschrieben werden. Sie stellen trotz ihrer Zuord- nung zum Teil „Material und Methoden“ ein wesentliches Ergebnis der Arbeit dar.
3.3.1 Reflexionsspektroskopische Meßapparatur
Die Meßapparatur ist in Abb. 5 schematisch dargestellt.
Abb. 5: Reflexionsspektroskopische Meßapparatur. a: Komponenten b: Sensor: Anordnung der Quarzfasern zur Einstrahlung und Detektion
Als Lichtquelle dient eine hochstabile Halogenlampe, die ein kontinuierliches Emissions- spektrum von etwa 350 nm bis 2000 nm besitzt und über Quarzlichtleiter mit einem Stiftsen-
Computer
Lichtquelle Holographisches Gitter
CCD-Array A/D- Wandler
Sensor
Gewebe
a
200 µm
Quarzfaser zur Einstrahlung in die Probe
Quarzfaser zur Aufnahme reflektierten Lichtes b
sor von der Größe eines Kugelschreibers verbunden ist. Dieser strahlt das Licht über sieben kreisförmig um das zentrale Detektionsfeld angeordnete Quarzfasern (s. Abb. 5b) in die Probe, wo es gestreut und durch enthaltene Stoffe absorbiert wird. Ein Teil des Lichtes ge- langt infolge mehrfacher Streuung und Reflexion zum Detektionsfeld des Sensors und über einen zweiten Lichtleiter zum Dispersionsgitter, in dem die spektrale Zerlegung des Lichtes erfolgt. Dabei handelt es sich um ein holographisches Gitter mit 600 Linien pro Millimeter.
Die Umwandlung der Lichtenergie in elektrische Energie erfolgt gleichzeitig über einen Be- reich von 170 nm bis 880 nm durch ein CCD-Array. Die erzeugten elektrischen Signale wer- den durch einen 12 Bit Analog-Digital (A/D)-Wandler digitalisiert und zur weiteren Analyse einem PC zugeleitet, welcher das Spektroskop über das Programm Spektroskopie 2.3 (MBR Meßtechnik, Herdecke) steuert.
3.3.2 Transmissionsspektroskopische Meßapparatur
Für die Aufnahme von Spektren in Transmission wurde ein Lichtweg aus zwei Stiftsensoren mit dazwischen liegendem Küvettenhalter konstruiert. Als Lichtquelle wurde entweder oben beschriebene Halogenlampe oder eine Deuteriumlampe verwendet, die Messungen im UV- VIS-Bereich von 200 nm bis 800 nm erlaubt.
3.3.3 Errechnung der Spektren
Die Berechnung von Extinktions-, Reflexions- und Transmissionsspektren erfolgte bei der verwendeten Meßapparatur anhand von drei Komponenten (Referenzspektrum, Meßspektrum und Dunkelspektrum). Für die Aufnahme des Referenzspektrums (Ref) wurde bei Mes- sungen in Reflexion weißes Spektralon benutzt, welches einen hohen spektralen Reflexions- grad über den gesamten eingestrahlten Wellenlängenbereich besitzt. Bei Transmissionsmes- sungen wurde eine das Lösungsmittel enthaltene Vergleichsküvette verwendet. Das Meß- spektrum (M) wurde durch Einstrahlen des Lichtes auf bzw. durch die zu messende Probe erzeugt. Schließlich wurde ein Dunkelspektrum (D) aufgenommen, welches der Eliminie- rung einer durch die Dunkelspannung des CCD-Arrays erzeugten Basislinie dient. Die Er- rechnung von Extinktion, Reflexion und Transmission erfolgte mittels Erweiterungen der Gleichungen [3] und [4]:
