Beta-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe und ihre Bedeutung im Hinblick auf das Hyperlipämie-Syndrom des Ponies

Aus dem Institut für Physiologische Chemie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Beta-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe

und ihre Bedeutung im Hinblick auf das Hyperlipämie-Syndrom des Ponies

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Sabine Wrage

aus Lübeck

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. H.-P. Sallmann

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. H.-P. Sallmann

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen

Tag der mündlichen Prüfung: 05. Juni 2002

M

E

MEINER

S

Ergebnisse dieser Doktorarbeit wurden auf folgenden Tagungen veröffentlicht:

Sympozjum Naukowe

(14. Dezember 2001 in Wroclaw (Breslau))

15. Tagung der Fachgruppe Physiologie und Biochemie der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft

(27. Februar bis 1. März 2002 in Wien)

I

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG

1

2 LITERATURÜBERSICHT 2

2.1 Das equine Hyperlipämie-Syndrom 2 2.2 Die adrenergen Rezeptoren 4

3 MATERIAL UND METHODEN 10

3.1 Versuchsaufbau 10 3.2 Auswahl der Versuchstiere 10 3.3 Gewinnung, Aufbereitung und Lagerung des Fettgewebes 11 3.4 Präparation der Adipocytenmembranen 11 3.5 Proteinbestimmung 13 3.6 Präparationskontrolle durch Bestimmung von Markerenzymen 14

3.6.1 5´Nucleotidase 14 3.6.2 Cytochrom-C-Oxidase 15 3.6.3 Cytochrom-C-Reduktase 15 3.7 Radioassays der ß-adrenergen Rezeptoren 17

3.7.1 Prinzip der Radioassays 17 3.7.2 Durchführung der Radioassays 18

3.7.2.1 Bindungskurven 18 3.7.2.1.1 ß₃-Adrenorezeptoren 19 3.7.2.1.2 ß₂-Adrenorezeptoren 19 3.7.2.1.3 ß1-Adrenorezeptoren 20 3.7.2.2 Bestimmung der Rezeptoranzahl 21

I

4 ERGEBNISSE 24

4.1 Ergebnisse der Membranaufarbeitung der Adipocyten 24 4.2 Reinheit der Membranfraktion 25

4.2.1 5´Nucleotidase 25 4.2.2 Cytochrom-C-Oxidase 26 4.2.3 Cytochrom-C-Reduktase 28 4.3 Rezeptorausstattung der Adipocytenmembran 29

4.3.1 ß3-Adrenorezeptoren 29 4.3.2 ß2-Adrenorezeptoren 36 4.3.3 ß₁-Adrenorezeptoren 42 4.4 Anzahl der Rezeptoren auf den Adipocyten 46

4.4.1 ß₃-Adrenorezeptoren 48 4.4.2 ß2-Adrenorezeptoren 49 4.5 Adipocytenmorphologie im Pferd-Pony-Vergleich 50

5 DISKUSSION 53

5.1 Methodik 53

5.1.1 Versuchsprinzip und Tiermaterial 53 5.1.2 Plasmamembranpräparation 54 5.1.3 Radioassays zur Bestimmung der ß-adrenergen Rezeptoren 56 5.1.4 Adipocytenmorphologie 57 5.2 Ergebnisse der Plasmamembranpräparation 58

5.2.1 Membranproteinerhalt nach der Isolierung 58 5.2.2 Enzymaktivitäten 59

5.2.2.1 5´Nucleotidase 59 5.2.2.2 Cytochrom-C-Oxidase 60 5.2.2.3 Cytochrom-C-Reduktase 60 5.3 Bindungskurven und Rezeptoranzahlbestimmungen 61 5.4 Adipocytenmorphologie 64 5.5 Interpretation im Hinblick auf die Hyperlipämie 66 5.6 Schlussfolgerung 71

I

6 ZUSAMMENFASSUNG 72

7 SUMMARY 74

8 ANHANG 76

8.1 Übersicht über die Tiergruppen 76

8.2 Bezugsquellen der Reagenzien 76

8.3 Verwendete Geräte 77

8.4 Pufferlösungen 77

8.5 Enzymaktivitäten 80

8.6 Pipettierschema 83

8.7 Messwerte der Bindungskurven 83

8.8 Messwerte der Rezeptoranzahlbestimmungen 90

8.9 Adipocytenmorphologie im Bindungsstellenvergleich 95

9 LITERATURVERZEICHNIS 96

A

α alpha

5´AMP 5´Adenosinmonophosphat A. Arteria Abb. Abbildung

AC Adenylatcyclase ANP atriales natriuretisches Peptid

AR adrenerge Rezeptoren ATP Adenosintriphosphat ß beta

ß-ARK beta-adrenerge-Rezeptor-Kinasen Bmax maximale Anzahl an Bindungsstellen

Bindg. Bindung

BNP brain nariuretic peptide BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise

ca. circa

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat cAMP-cGI-PDE cAMP-abhängige, durch cGMP zu hemmende (cGMP

inhibited) Phosphodiesterase CCO Cytochrom-C-Oxidase CCR Cytochrom-C-Reduktase

cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat CGP 12177 A (-)-4-(3-tert-butylamino-2-hydroxypropoxy)-

benzimidazol-2-one

CGP 20712 A 2-hydroxy-5-(2-[{hydroxy-3-(4-[1-methyl-4-

trifluoromethyl-2-imidazol] phenoxy) propyl} amino]

ethoxy) benzamide D Dichte

d.h. das heißt

dpm Zerfälle pro Minute (disintegrations per minute) Endkonz. Endkonzentration

ERK_1/2 extracellular signal-regulated kinase_1/2 et al. und andere (et alii)

Ext. Extinktion

FFS Freie Fettsäuren

γ gamma

g Erdbeschleunigung (9,81m^-2) ges gesamt

GDP Guanosin-5´-diphosphat

A

GPCR G-Protein gekoppelte Rezeptoren (G-Protein coupled receptors)

G-Protein Guanosin-sensitives Bindungsprotein G_i-Protein inhibierendes G-Protein

ggr. geringgradig G_s-Protein stimulierendes G-Protein GTP Guanosin-5´-triphosphat H Homogenat

3H Tritium

HSL Hormon-Sensitive-Lipase

ICI 118551 (±)-1-(2,3-[dihydro-7-methyl-1H-inden-4-yl] oxy)-3-([1- methylethyl]-amino)-2-butanol

IR Insulinrezeptor kg Kilogramm Koeff. Koeffizient

LPL Lipoproteinlipase LSC Liquid Szintilation Cocktail

Lsg. Lösung

M Median

MAPK mitogen-activated protein-kinase max. maximal

mgr. mittelgradig Mi Mitochondrien

min Minute

mmol Millimol

mRNA messenger Ribonucleinsäure MW Mittelwert

n Anzahl der Tiere

5´NT 5´Nucleotidase

p Irrtumswahrscheinlichkeit P Pellet

Pfd Pferd

PKA Proteinkinase A PKG Proteinkinase G PM Plasmamembran

Po. Pony

A

Tab. Tabelle TCA Trichloressigsäure

TG Triglycerid

U Units

unspez unspezifisch unterschiedl. unterschiedlich

Ü Überstand

V. Vena Vol. Volumen

Verd. Verdünnung

VLDL Lipoprotein sehr geringer Dichte (very low density lipoprotein)

z.T. zum Teil

1 E

1 E

Das equine Hyperlipämie-Syndrom ist eine Entgleisung des Fettstoffwechsels die insbesondere zu Zeiten eines Energiemangels und in Verbindung mit Sekundärerkrankungen wie Parasitosen und bakteriellen Infekten auftritt und durch eine stark erhöhte Lipolyse gekennzeichnet ist. Es kommt dadurch zu einer massiven Erhöhung von Triglyceriden, Freien Fettsäuren und Lipoproteinen sehr niedriger Dichte im Plasma. Eine besondere Anfälligkeit gegenüber dem Hyperlipämie-Syndrom zeigen kleine, sehr gut ernährte Ponies, während Großpferde dagegen nicht erkranken.

Die Ätiopathogenese dieser Stoffwechselentgleisung (Inzidenz: 2-3%) ist noch immer unklar und trotz Therapieversuchen liegt die Mortalität bei 60-80%.

Bisherige Studien hinsichtlich der Wirksamkeit des Insulins und der Aktivität verschiedener Schaltenzyme des Fettstoffwechsels konnten die Ursache des stark erhöhten Fettabbaus bei dieser Erkrankung nicht gut klären. Auffallend ist, dass durch eine ex vivo in vitro Stimulation von Adipocyten mit Noradrenalin bei Ponies im Gegensatz zu Pferden eine erhebliche Steigerung der Lipolyserate möglich ist. Das Catecholamin Noradrenalin aktiviert die Lipolyse über Catecholaminrezeptoren. Diese Rezeptoren, die auch als adrenerge Rezeptoren bezeichnet werden, stellen einen weiteren Ansatzpunkt für das Studium des Lipolysegeschehens dar. Es gibt verschiedene Rezeptorsubtypen (α1+2 und β1+2+3). Die ß-adrenergen Rezeptoren aktivieren und regulieren über Second- Messenger-Systeme das lipolytische Enzym Hormon-Sensitive-Lipase sowie weitere lipolyseregulierende Enzyme. Durch ein vermehrtes Vorkommen dieser Rezeptoren im Fettgewebe des Ponies ließe sich die unterschiedliche Reaktion bei der Aktivierung der Lipolyse durch Noradrenalin und das spezielle Vorkommen der Erkrankung bei Ponies erklären.

Über den Rezeptorbesatz von equinen Adipocyten liegen bislang keine Daten vor. In der vorliegenden Untersuchung sollte deshalb der ß-adrenerge Rezeptorbesatz von equinen Adipocyten bei Ponys und Pferden im Vergleich untersucht werden, um etwaige rassespezifischen Unterschiede im Rezeptor- subtypenbesatz sowie in der Rezeptoranzahl zu ermitteln.

Dazu wurde aus Fettgewebsproben die Adipocytenplasmamembran isoliert und mit Hilfe eines radioaktiven Bindungsassays die adrenergen Rezeptorsubtypen

2 L

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 DAS EQUINE HYPERLIPÄMIE-SYNDROM

Von dieser weltweit vorkommenden Erkrankung sind hauptsächlich Ponies und hier vor allem Shetlandponies betroffen (BARDIES u. BRAUN 1982), aber auch beim Esel ist sie beschrieben (WATSON u. LOVE 1994). Die erkrankten Tiere sind in der Regel adult, aber auch Fohlen können eine Hyperlipämie entwickeln. Stuten sind stärker gefährdet als Hengste oder Wallache, wobei ein adipöser Ernährungszustand ein wesentlicher prädisponierender Faktor ist (JEFFCOTT u. FIELD 1985 b; GILBERT 1986; LOVE 1990).

Die equine Hyperlipämie ist nach DIETZ (1999) keine selbständige Primärerkrankung, sondern die Folge einer solchen. Als Primärerkrankungen und Streßfaktoren, die über eine energetische Unterversorgung zu einer Hyperlipämie führen können, kommen Kolik, Enteritis, gastrointestinaler Parasitenbefall, Hufrehe, Nierenfunktionsstörungen, Metritis, fortgeschrittene Trächtigkeit, Hochlaktation, Hyperadrenocortizismus sowie Orts- und Besitzerwechsel in Frage (WATSON u. LOVE 1994; DIETZ, 1999). Nach WATSON und LOVE (1994) kann die Hyperlipämie auch idiopathisch auftreten und durch Nahrungskarenz provoziert werden (BAETZ u. PEARSON 1972;

BAUER 1983).

Klinisch zeigen die Tiere Apathie und völlige Inappetenz (DIETZ 1999).

Oftmals werden diese Symptome aber auch von einer bestehenden Primärerkrankung überlagert. In gravierenden Fällen kann es zur Hämo- konzentration kommen, die an eine metabolische Acidose gekoppelt ist (DIETZ 1999).

Unabhängig von der Ursache des Energiemangels kommt es bei allen betroffenen Tieren zu einer Lipolyse, die unkontrolliert und überschießend abläuft. Für den Lipidabbau ist die Hormon-Sensitive-Lipase (HSL) des Fettgewebes verantwortlich, es kommt zu massiven Erhöhungen der Plasmakonzentrationen an Triglyceriden, Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDL) und der nicht veresterten langkettigen Fettsäuren (WATSON et al.

1992 a). Das Plasma hyperlipämischer Ponies zeigt eine deutliche milchfarbene opaleszierende Trübung und kann Triglyceridkonzentrationen von bis zu 75mmol/l erreichen, wobei Konzentration von >5mmol/l als hyperlipämisch bezeichnet werden (NAYLOR 1982 b; WATSON et al. 1992 b; WATSON u.

LOVE 1994). Aufgrund dieser auffallenden Plasmafärbung läßt sich diese Lipidstoffwechselstörung schon makroskopisch diagnostizieren.

2 L

Die Lipolyse dient generell der Bereitstellung von Energie für den Organismus in Form von Freien Fettsäuren (FFS). Bei der Hyperlipämie erfolgt die Anflutung von FFS jedoch in so großen Mengen, dass diese nur begrenzt in den Organen oxidiert werden können. Es resultiert eine Verfettung zahlreicher Organe (v.a. Leber, Niere, Herzmuskulatur), die mit entsprechenden Symptomen einer fettigen Degeneration einhergeht (Naylor 1982 a; JEFFCOTT u. FIELD 1985 a). In der Leber kommt es zusätzlich zu einer Resynthese der FFS zu Triglyceriden, die in VLDLs eingebaut und ins Blut ausgeschleust werden.

Bei Vorliegen einer Primärerkrankung ist diese vorrangig und schnellstmöglich zu therapieren, da dies die ansonsten schlechte Prognose verbessert. Die Therapie der Hyperlipämie ist schwierig, da die Ätiopathogenese nur unzureichend bekannt ist. Bislang basiert die Therapie auf peroraler oder enteraler Glucose- bzw. Galaktoseapplikation zur Beseitigung der negativen Energiebilanz sowie zur Stimulation der endogenen Insulinausschüttung, der Applikation exogenen Insulins zur Hemmung der Lipolyse, der Beseitigung einer metabolischen Acidose mittels Natriumhydrogencarbonat, der intra- venösen Verabreichung von Heparin zur Aktivierung der Lipoprotein-Lipase (LPL) und damit zur Erhöhung der Triglyceridclearance (GAY et al. 1978;

NAYLOR 1982 a, 1983; FÜRLL et al. 1992; DIETZ 1999).

Diese Therapieversuche zeigen oft nur geringe Wirksamkeit und die Tiere erliegen einem multiplen Organversagen oder einer Leberruptur, die auch durch große Blutkavernen im Lebergewebe entstehen kann (WATSON u. LOVE 1994).

Strittig bei dieser Behandlung ist der Einsatz des Heparins, da dadurch die Blutungsneigung verstärkt wird, die bei hyperlipämischen Tieren aufgrund der Leberschädigung ohnehin besteht und die Aktivität der LPL bei den betroffenen Tieren schon stark erhöht ist (WATSON et al. 1992 b). Rassespezifische Unterschiede hinsichtlich der Aktivität der LPL konnten BREIDENBACH et al.

(1999) in seiner vergleichenden Studie nicht feststellen.

Insulin hemmt die Lipolyse durch Dephosphorylierung der HSL und ist damit ein direkter Antagonist der Catecholamine (BERGER u. BARNARD 1999).

Untersuchungen hinsichtlich der Wirksamkeit des Insulins bei Pferden und Ponies zeigten, dass Insulin in vitro bei den Ponies zu einer signifikant geringeren absoluten Inhibition der HSL führte. Die relative Inhibition war jedoch in beiden Gruppen vergleichbar. Ob und in welchem Grade beim Pony

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Zielzelle verändern können und der Glucosetransport sowie die Glucosenutzung durch die Catecholamine negativ beeinflusst werden (LAFONTAN et al. 1997).

2.2 DIE ADRENERGEN REZEPTOREN

Die adrenergen Rezeptoren (AR) werden aufgrund ihrer Aktivierung durch die Catecholamine Noradrenalin und Adrenalin auch als Catecholaminrezeptoren bezeichnet, die sich in zwei Untereinheiten (ß-AR und α-AR) unterteilen lassen (LAFONTAN et al. 1997). Bei beiden Rezeptoruntereinheiten unterscheidet man zusätzlich verschiedene Rezeptorsubtypen (α1,2 und ß_1,2,3). Neuere Untersuchungen weisen auf einen weiteren ß-adrenergen Rezeptorsubtyp (ß4) hin, dessen Existenz bislang jedoch nicht nachgewiesen werden konnte (GRANNEMAN 2001). Bei den Rezeptorsubtypen α1+2 differenziert man seit kurzem jeweils noch zwischen drei Variationen (α1A,1B,1D sowie α2A,2B,2C) (SMALL et al. 2002). Während der Subtyp α1 keinerlei Verbindung zur Lipolyse aufweist, sondern in die Glycogenolyse und die Lactatproduktion involviert ist, sind alle anderen Subtypen (α2 und ß1,2,3) in unterschiedlichem Maße an der Regulation der Lipolyse beteiligt (LAFONTAN et al. 1997) und sind an dieselbe Signalübertragungskaskade gekoppelt

Die Signalübertragungskaskade der AR beginnt mit der Aktivierung eines G- Proteins (Guanosin-sensitives Bindungsprotein), weshalb die AR mit anderen G- Protein interagierenden Rezeptoren zu einer Superfamilie zusammengefasst und als G-Protein coupled receptors (GPCR´s) bezeichnet werden (ROHRER u.

KOBILKA 1998; COLLINS 2000). Die G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten (α,β,γ). Die Bindung eines Agonisten an den Rezeptor verursacht eine Konformationsänderung des G-Proteins, welche die α- Untereinheit zum Austausch eines gebundenen Guanosin-5´-diphosphat- Moleküls (GDP) gegen ein Guanosin-5´-triphosphat-Molekül (GTP) und zur Dissoziation von den ßγ-Untereinheiten veranlasst.

Die GTP-gebundene Form der α-Untereinheit ist die Effektor-modulierende Untereinheit. Sie kann entweder stimulierend oder inhibierend wirken. Im Falle der AR des Fettgewebes sind die ß-AR an ein stimulierendes G-Protein (G_s) und der α2-AR an ein inhibierendes G-Protein (G_i) gekoppelt (LAFONTAN et al.

1997). Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, das die ß₃₊₂-AR sowohl an G_s- als auch an G_i-Proteine gekoppelt sein können. Nach bisherigem Kenntnisstand soll die Aktivierung eines Gi-Proteins durch ß2+3-AR zu einer

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Abschwächung der Adenylatcyclase (AC)-Stimulation und zu einer Aktivierung eines cAMP und PKA unabhängigen Kinaseweges führen (extracellular signal- regulated kinase1/2 (ERK1/2) und mitogen-activated protein-kinase (MAPK)).

Bislang fehlen allerdings der Beweis und die vollständige Konsequenz einer solchen Bindung (SOEDER et al. 1999; COLLINS 2000).

Die Aktivierung der ß-AR erfolgt über eine Phosphorylierung durch zwei Kinasen (Proteinkinase A (PKA) und ß-AR-Kinasen (ß-ARK)), die nach der Rezeptoraktivierung mit Hilfe der dissozierten ßγ-Untereinheit des G-Proteins wieder vom Rezeptor abgespalten werden (MARULLO et al. 1995;

FREEDMAN u. LEFKOWITZ 1996; COLLINS 2000). Die stimulierende α- Untereinheit aktiviert die Adenylatcyclase (AC), die das intrazelluläre Hauptsignalprotein, das cyclische Adenosin-3´-5´-monophosphat (cAMP) produziert. Der second-messenger cAMP ist verantwortlich für die Aktivierung einer cAMP-abhängigen-Proteinkinase A (cAMP-PKA), deren katalytische Untereinheit phosphoryliert und aktiviert damit die HSL.

Die HSL hydrolysiert intrazelluläre Triglyceride (TGL) des Fettgewebes zu Freien Fettsäuren (FFS) und Glycerin. Außerdem kommt es zur Phosphorylierung weiterer verschiedener intrazelluläre Proteine (MERSMANN 1998). Die HSL ist das limitierende Enzym der Lipolyse, sie wird über die cAMP-PKA und die wiederum durch die intrazellulären cAMP-Konzentration reguliert. Damit steht die HSL nur indirekt unter hormonaler Kontrolle (LAFONTAN et al. 1997). Bei der Ratte und dem Menschen existiert eine positive Korrelation zwischen Adipocytengröße und Aktivität der HSL (BERGER u. BARNARD 1999).

Eine Signalverstärkung resultiert aus der Fähigkeit eines einzelnen Rezeptors, mehrere G-Protein-Moleküle zu aktivieren (DOHLMANN et al. 1991).

Der Rezeptorsubtyb α2 ist an ein G_i-Protein gekoppelt und veranlasst auf vergleichbare Weise die Inhibierung der AC und senkt dadurch den intrazellulären cAMP-Spiegel. Dies zieht letztendlich einen Aktivitätsverlust durch eine verminderte Phosphorylierung der HSL nach sich. Es kommt zur Hemmung der Lipolyse.

2 L

Abb. 3.1 Regulierung der Lipolyse über die adrenergen Rezeptoren (AR)

Durch die Bindung von Agonisten an die ß-adrenergen Rezeptoren (ß-AR) kommt es über gekoppelte, stimulierende G-Proteine (G_s) zur Aktivierung einer Adenylatcyclase (AC). Die AC erhöht den intrazellulären cAMP- Spiegel und dieser aktiviert die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA). Die cAMP-PKA phosphoryliert und aktiviert damit die Hormon-Sensitive-Lipase (HSL) sowie weitere Zielproteine. Der α2-AR wirkt in gleicher Weise wie die ß-AR, nur ist er an ein inhibierendes G-Protein (Gi) gekoppelt und wirkt damit direkt antagonistisch zu den ß-AR.

Insulin wirkt über die Aktivierung der Phosphodiesterase (cAMP-cGI-PDE) antilipolytisch. Die Senkung des cAMP-Spiegels und der cAMP-PKA Aktivität führt zu einer Hemmung der HSL-Aktivierung.

IR= Insulinrezeptor

(modifiziert nach LAFONTAN et al. 1997 und HOLM et al. 2000)

Die Regulation der Lipolyse wird zu einem großen Teil durch die Balance der antagonistisch wirkenden α- und ß-AR sichergestellt (α2-ß-functional-balance).

Adipocyten- plasmamembran

+

_

ATP

cAMP

-PKA

5´AMP

HSL-P

= LIPOLYSE

HSL

ß1+2-AR P div. Proteine Genaktivierung cAMP-cGI-PDE-P

Gi

Gs Gs Gs

α2- AR

cAMP-cGI-PDE IR ß₁ ß₂ ß₃- AR

+ +

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Diese Balance nimmt eine Schlüsselrolle bei der Erhöhung der cAMP Konzentration in der Zelle ein, wobei es hierbei große Speziesunterschiede gibt (CARPENE et al. 1998).

Zusätzlich zu der Rezeptorsubtypenbalance existiert ein wichtiges regulatorisches Enzym innerhalb der Rezeptor-Signalkaskade. Die cAMP abhängige, durch cGMP zu hemmende Phosphodiesterase Typ 3_B (cAMP-cGI- PDE) ist in der Lage, den intrazellulären cAMP Gehalt sowie die Aktivität der cAMP-PKA zu senken und limitiert dadurch die Dauer der Zellsignalgebung (MARULLO et al. 1995). Hierdurch kommt es über eine geringere Aktivierung der HSL ebenso zu einer verminderten Lipolyse. Phosphoryliert und damit aktiviert wird die cAMP-cGI-PDE durch cAMP- und insulinabhängige Serinkinasen oder direkt über die cAMP-PKA. Einzigartig ist die Regulierung dieses Enzyms, denn die cAMP-cGI-PDE aktiviert sich nicht nur cAMP- abhängig über die cAMP-PKA, sondern sie reguliert über einen feed-back- Mechanismus auch ihren eigenen Abbau über cAMP (cAMP reguliert die Expression des Abbauenzyms) (LAFONTAN et al. 1997). Auch Insulin übt seinen antilipolystischen Effekt über dieses Enzym aus. Durch Aktivierung der Insulinrezeptoren (IR) kommt es auch zu einer Second-Messenger-Kaskade, die in einer Aktivierung einer Proteinkinase B (PKB) endet. Diese PKB aktiviert die cAMP-cGI-PDE und der cAMP-Spiegel sinkt (HOLM et al. 2000).

Des weiteren ist die cAMP-cGI-PDE an der Desensibilisierung der Rezeptoren beteiligt (BOUSQUET-MELOU 1995).

Hinsichtlich des Vorkommens der ß-AR und ihrer Funktion bei der Aktivierung der Lipolyse im Fettgewebe lassen sich tierarten- und rassenspezifische Unterschiede der einzelnen ß-AR-Subtypen feststellen (VAN LIEFDE et al.

1994).

Bei fast allen bislang untersuchten Tierarten und beim Menschen konnten alle drei ß-AR Subtypen in unterschiedlicher Dichte und Verteilung im Fettgewebe nachgewiesen werden. Ausnahmen bilden das Schwein und das Kalb. Beim Schwein konnten bislang nur die Subtypen ß₁₊₂ eindeutig durch Bindungsstudien nachgewiesen werden. Molekularbiologische Untersuchungen der mRNA des Subtyp ß₃ und auch Lipolysestudien weisen aber auf sein Vorhandensein hin (MERSMANN 1996; MILLS 2000). Auch beim Kalb fehlt bisher der Nachweis

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BERLAN (1993) schematisiert wurden. Die Autoren untersuchten die ß₃ vermittelte Lipolyse durch den Einsatz selektiver ß3-Agonisten bei verschiedenen Spezies und stellten dabei drei unterschiedliche Reaktionen der lipolytischen Antworten fest.

Die erste Gruppe zeigte eine hohe Sensitivität gegenüber den ß₃-Agonisten und beantwortete diese Stimulation mit einer hohen Lipolyserate. Zu dieser als responders oder auch hyperresponders bezeichneten Gruppe gehören Ratte, Maus und Hamster. Der Rezeptorsubtyp ß3 ist in dieser Gruppe hauptverantwortlich für die Aktivierung der Lipolyse.

Die zweite Gruppe, der Kaninchen und Hund zugeordnet werden, reagierte mit einer geringeren Sensitivität auf die ß₃-Agonisten-Stimulation. Zur Aktivierung einer mit der ersten Gruppe vergleichbaren Lipolyserate wurde eine höhere Konzentration der ß₃-Agonisten benötigt. Aus diesem Grund bezeichneten die Autoren diese Gruppe als hyporesponders. Die Lipolyse verläuft in dieser Gruppe hauptsächlich über den Subtyp ß1.

Die dritte und letzte Gruppe sind die nonresponders. Zu ihr gehören Mensch und Meerschwein. Auf die Stimulation der Lipolyse mit ß3-Agonisten folgte bei den nonresponders eine sehr schwache bis keine Lipolyse. Für die Aktivierung der Lipolyse dieser Spezies sind die Subtypen ß₁₊₂ verantwortlich, wobei der Subtyp ß₁ der wichtigere zu sein scheint.

Die Ergebnisse von LAFONTAN und BERLAN (1993) bezüglich der Subtypenfunktion bei der Aktivierung der Lipolyse decken sich mit den Feststellungen anderer Autoren (MAURIEGE et al. 1988; VAN LIEFDE et al.

1992; TAVERNIER et al. 1996). Welche Rezeptorsubtypen bei der Spezies Pferd hauptsächlich in die Lipolyseaktivierung involviert sind, ist nicht bekannt.

Andere Autoren stellten fest, dass die Catecholamine zwar alle ß-AR aktivieren, aber ihre differenzierte Aktivierung durch verschiedene Affinitäten reguliert wird. Noradrenalin besitzt eine hohe Affinität für α2-AR und eine geringe für ß₃- AR (α2> ß1≥ ß2> ß3), ähnliche Affinitäten sind auch für Adrenalin ermittelt worden (α2> ß2> ß1> ß3). Diese Affinitätsunterschiede ermöglichen die unterschiedliche Aktivierung der einzelnen Rezeptorsubtypen. Bei einer geringen Catecholaminkonzentration werden zunächst die Subtypen ß₁₊₂ aktiviert und erst bei einer hohen Konzentration der Subtyp ß₃ (D´ALLAIRE et al. 1995; GALITZKY et al. 1995; LAFONTAN et al. 1995, 1997). Alle drei Subtypen führen zur Stimulierung derselben AC (GRANNEMAN 1992).

Beim Schwein wird die Lipolyse hauptsächlich über den ß1-AR gesteuert, während der ß2-AR keine lipolytische Funktion übernimmt (MILLS 2000).

2 L

Über eine im Vergleich zum Pferd erhöhte Anzahl an ß-AR könnte die erhöhte Lipolyserate der Ponies nach Stimulation mit dem Catecholamin Noradrenalin erklärt werden. Da beim Pferd noch nicht bekannt ist, welcher der drei ß-AR hauptsächlich an der Aktivierung beteiligt ist, wurden in der vorliegenden Studie alle Subtypen untersucht.

Bei trächtigen Kaninchen wurde von BOUSQUET-MELOU et.al. (1999) ein Anstieg der ß-AR vermittelten Lipolyse durch eine Erhöhung der Rezeptoranzahl festgestellt. Ob dies auch bei der Ponystute der Fall sein kann ist fraglich, aber es würde die Häufung der Erkrankung bei trächtigen Tieren erklären können.

Einen neuen Aspekt in der Regulation der Lipolyse außerhalb der ß-AR- Signalkaskade stellt das atriale natriuretische Peptid (ANP) dar. Es wird im Vorhof des Herzens synthetisiert, gespeichert und durch Muskeldehnung freigesetzt. Das ANP wurde auf Rattenadipocyten nachgewiesen und auch beim Menschen konnte mRNA dieses Peptidhormons im Adipocyten ermittelt werden. In isolierten Fettzellen stimuliert das ANP und ein weiteres natriuretisches Peptid (brain natriuretic peptide, BNP) die Lipolyse in gleichem Maße, wie der ß-AR-Agonist Isoproterenol. Es kommt zu einer cyclischen Guanosin-monophosphat (cGMP) Produktion in der Zelle und dies führt über eine Proteinkinase G (PKG) ebenfalls zur Phosphorylierung und damit Aktivierung der HSL. Dass die HSL auch durch cGMP-abhängige PKG phosphoryliert werden kann, zeigten STRALFORS und BELFRAGE (1985).

Diese HSL-Aktivierung ist von der cAMP-Produktion der Zelle unabhängig und lässt sich nicht durch die cAMP-cGI-PDE beeinflussen. Auch eine Hemmung der AC verändert die ANP-induzierte Lipolyse nicht (LAFONTAN et al. 2000;

SENGENES et al. 2000). Ob dieser Weg der Aktivierung der Lipolyse bei der Spezies Pferd auch möglich ist, ist nicht bekannt. Bei der weiteren Erforschung der Ätiopathogenese des equinen Hyperlipämie-Syndrom kann diese alternative Lipolysestimulation jedoch einen weiteren Ansatzpunkt darstellen.

3 M

M

3 M

M

In den Versuchen dieser Arbeit sollte herausgefunden werden, ob es einen Unterschied in den ß-adrenergen Rezeptoren (ß-AR) des Fettgewebes bei Pferden und Ponies bezüglich der Subtypenklassifizierung und der Rezeptorgesamtmenge gibt. Für diesen Tiergruppenvergleich (Pferde und Ponies) wurde die Adipocytenplasmamembran aus dem Fettgewebe der Versuchstiere isoliert und die beta-adrenergen Rezeptoren mit einem Radioassay bestimmt.

Zunächst mußte eine Methode gefunden werden, die ß-adrenergen Rezeptoren zu isolieren. Zur Anwendung kam ein Verfahren nach BELSHAM et al. (1980), das von NICOLAS et al. (1990) modifiziert wurde.

Hierbei handelt es sich um eine Abfolge verschiedener Homogenisierungs- und Zentrifugationsschritte, an deren Ende man eine Plasmamembranfraktion erhält, die die Rezeptoren als membrangebundene Proteinmoleküle beinhaltet.

Nach einer Proteinbestimmung sowie einer Präparationskontrolle durch Messung verschiedener Markerenzyme wurden zu diesen Plasmamembran- fraktionen hochspezifische ß-adrenerge Liganden, einer davon radioaktiv markiert, hinzugefügt und mittels ß-Counter die gebundene Radioaktivität gemessen. Diese Versuchansätze erfolgten nach einer Methode von RE et al.

(1997), die anhand dieser Vorgehensweise die ß-adrenergen Rezeptoren an der glatten Muskulatur des Ileums beim Pferd charakterisierten.

3.2 AUSWAHL DER VERSUCHSTIERE

Das in dieser Arbeit untersuchte Fettgewebe stammt von Tieren, die zum Zwecke der Lebensmittelgewinnung getötet worden sind. Die Probenentnahme fand dazu direkt vor Ort auf einem auf Pferdeschlachtung spezialisierten Schlachthof statt. Um eine Zyklusabhängigkeit auszuschließen, wurden lediglich adulte Wallache selektiert.

Das Durchschnittsalter der Pferde lag bei 11 Jahren (±6,0), das der Ponies bei 12,2 Jahren (±4,5). Das Stockmaß der Pferdegruppe lag durchschnittlich bei 1,67 m (±0,04), das der Ponygruppe bei 1,10 m (±0,07).

3 M

M

Eine Übersicht über die Tiere beider Gruppen befindet sich im Anhang auf Seite 76.

3.3 GEWINNUNG UND LAGERUNG DES FETTGEWEBES

Alle Tiere sind an verschiedenen Tagen im Laufe des Vormittages in die Schlachtung gegangen. Sie wurden mittels eines Bolzenschusses betäubt, die Ausblutung erfolgte durch Eröffnung der großen Blutgefäße am Kaudalende der Drosselrinne (V. jugularis externa, Aa. carotides communes), mit einem Einstich in Richtung Herz (A. und V. cervicales superficialis).

Das Fettgewebe wurde sofort nach der Ausweidung der Tiere schlachtwarm entnommen und in verschließbare, mit 37°C warmer 0,9% Kochsalzlösung gefüllte Gefäße verbracht. Verwendet wurde Bauchhöhlenfett, direkt rechts und links neben der Linea alba gelegen. Es wurde bei allen Tieren aus demselben Bereich (zwei Handbreit hinter dem Sternum bis eine Handbreit hinter der Nabelnarbe, bei einer Probenbreite von ca. 4cm je Seite (je nach Ernährungszustand des Tieres)) entnommen. Die gut verschlossenen Probengefäße wurden in einer mit 37°C warmen Leitungswasser gefüllten Isolierbox ins Labor transportiert. Dort wurde das Fettgewebe in einer handwarmen 0,9% Kochsalzlösung gewaschen und große Blutgefäße entfernt.

Danach wurde das Fettgewebe in Szintillationsgefässen bei –80°C tiefgefroren und ebenso gelagert.

3.4 PRÄPARATION DER ADIPOCYTENPLASMAMEMBRAN

Alle im folgenden genannten Puffer und Lösungen, sind im Anhang mit ihren Inhaltsstoffen, Konzentrationen und pH-Werten aufgelistet.

Da die Methode nach BELSHAM (1980) einerseits von NICOLAS (1990) und andererseits von der Verfasserin für die vorliegende Arbeit in einzelnen Punkten modifiziert wurde, ist die Beschreibung der gesamten Präparation hier erforderlich.

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40ml ) gebracht, die 8ml eiskalten Puffer (Saccharoseextraktionsmedium, siehe Anhang auf Seite 77) enthielten. Insgesamt lag die eingewogene Fettgewebsmenge je nach Präparationsansatzgröße zwischen 70-120 g. Alle weiteren Bearbeitungsschritte erfolgten bei 0-4°C. Mittels eines Ultra-Turrax wurde das Fett 3 sec homogenisiert und das Puffer-Fett-Gemisch in Reagenzgläser gefüllt. Nun erfolgte durch eine kurze Zentrifugation (40 sec, Varifuge) bei 1000g die Entfettung, wobei sich das Fett über einer Zwischenschicht, die maßgeblich die Adipocytenzellmembran enthält, ablagerte.

Die untere der drei Phasen enthält im Puffer gelöste Blutkörperchen, sowie geringe Mengen Zellbestandteile.

Mit Hilfe je einer 2- und 5ml Spritze mit aufgesetzter Kanüle (0,90x70 mm) wurde die Zwischenschicht sowie die untere Pufferphase vorsichtig aufgenommen, die Gesamtmenge dabei festgestellt und in Polypropylen- reagenzgläser (Volumen 12ml) überführt. Von diesem entfetteten Homogenat wurde aus jedem Röhrchen 50µl zur Protein- sowie Enzymbestimmung entnommen, dieses in einem Eppendorfcup gepoolt und bis zur weiteren Untersuchung auf Eis gelagert.

Anschließend wurde die Reagenzgläser 30 min bei 30000g (RC 5B) zentrifugiert. Hierdurch erhält man ein Pellet, bestehend aus den Adipocytenplasmamembranen und den Adipocytenmitochondrien, sowie einen Überstand, in dem sich letzte Anteile des Fettes oben absetzen.

Das abgeschiedene Fett wurde entfernt, der Überstand nach Mengenbestimmung und Abnahme von 1ml für die obengenannten Präparationskontrollen verworfen und das Pellet in 400µl Saccharoseextraktionsmedium langsam resuspendiert.

Von dieser Pelletsuspension wurden ebenfalls 10µl je Röhrchen zur Präparationskontrolle abgenommen und gepoolt.

Mittels eines nun folgenden Percollgradienten (Dichte 1,05) können die Plasmamembranen von den Mitochondrienmembranen isoliert werden. Dazu wurden der Pelletsuspension 8ml einer isoosmotischen Percolllösung (Percoll, Saccharoselösung und Saccharoseextraktionsmedium im Verhältnis 7:1:32) hinzugefügt. Da die Plasmamembranen eine geringere Dichte (1,04) als die Mitochondrien (1,08) besitzen, setzen sich diese durch eine Zentrifugation bei 10000g für 15 min. im oberen Bereich des Flüssigkeitsspiegels ab, während sich die Mitochondrien am Röhrchenboden sammeln.

Nach beendeter Zentrifugation wurde die obere Phase der Percolllösung mit den flotierten Plasmamembranen mit Hilfe einer Pipette abgenommen und in die größeren Polypropylenreagenzgläser (Volumen 40ml) überführt. Ebenso wurden die sedimentierten Mitochondrien gewonnen und in Reagenzgläser gleicher Größe gefüllt.

Es folgte eine Waschung der Plasmamembranen mit einer Kochsalzlösung im Verhältnis 1:7 und anschließende Zentrifugation bei 30000g über 20 min. Das

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dadurch erhaltene Pellet wurde nach Absaugen des Überstandes mit einer Wasserstrahlpumpe erneut in der Kochsalzlösung resuspendiert und ein zweites Mal wie oben beschrieben gewaschen und zentrifugiert. Die Mitochondrien wurden in gleicher Weise, jedoch nur einmalig, gewaschen und zentrifugiert.

Sodann erfolgte eine Resuspension der entstandenen Pellets mit der Kochsalzlösung, wobei die Plasmamembranen in 3-5ml und die Mitochondrien in 0,6-1ml resuspendiert und in Eppendorfcups gefüllt wurden.

Von der Plasmamembranlösung wurde ein Aliquot von 200µl für die enzymatische Präparationkontrolle abgenommen und der Rest sofort nach Präparationsende bei –80°C eingefroren.

Während der Präparation wurde das Volumen der fünf Präparationsstufen (entfettetes Homogenat, Überstand, Pelletresuspension, Mitochondrienfraktion und Plasmamembranlösung) festgehalten, um anhand des Proteingehaltes die Ergiebigkeit der Aufarbeitung zu errechnen.

Die Darstellung der Aufarbeitungsergiebigkeit erfolgte prozentual, indem der Gesamtproteingehalt des entfetteten Homogenats zu 100% angenommen wurde und die anderen Präparationsstufen in Relation dazu gesetzt wurden.

3.5 PROTEINBESTIMMUNG

Die Proteinkonzentration der fünf Präparationsstufen (entfettetes Homogenat (H), Überstand (Ü), erste Pelletlösung (P), Mitochondrienlösung (Mi) und Plasmamembranlösung (PM)) wurde anhand der Mikromethode nach Lowry (1951) gemessen.

Die fünf Proben wurden in einer Verdünnung von 1:10 jeweils als Dreifachansatz gemessen. 10µl Probe wurden in ein Eppendorfcup vorgelegt und 1ml kalte 10% TCE hinzugegeben. In einer Eppendorftischzentrifuge folgte eine Zentrifugation über 5 Minuten bei 14000g. Nach der Zentrifugation wurden die Proben dekantiert und kräftig ausgeschlagen, mit 100µl 1M NaOH versetzt und gemischt. Es folgte eine zehnminütige Inkubation bei 37°C, während der die Proben 2-3 Mal gemixt wurden. Danach wurden 1ml der Lowry-Lösung 1 und 100µl der Lowry-Lösung 2 hinzugegeben, die Gefäße verschlossen, und 2 min

3 M

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3.6 PRÄPARATIONSKONTROLLE DURCH BESTIMMUNG VON MARKERENZYMEN

3.6.1 5`NUCLEOTIDASE

Zur Präparationskontrolle der Plasmamembran wurde das Enzym 5´Nucleotidase (5´NT) als membranspezifisches Markerenzym ausgewählt. Es spaltet Phosphat von Nucleotiden und somit kann nach Zugabe von Adenosinmomophosphat (AMP) zur Plasmamembran das frei gewordene Phosphat spectralphotometrisch gemessen werden.

Direkt nach der Präparation wurde je Präparationsstufe ein Ansatz sowie ein dazugehöriger Blindwert pipettiert.

In jeden Ansatz kamen : 100µl 0,5M Tris-HCl-Lösung

100µl 1,8mM MgCl₂x 6H₂O-Lösung 90µl Aqua bidest.

10µl Probe

100µl 10mM 5´-AMP in jeden Probenansatz 100µl Aqua bidest. in den probenspezifischen Blindwert (anstelle des 5´AMP) Nach kurzem Schütteln wurden die Ansätze 30 min bei 37°C inkubiert und danach durch Zugabe von 100µl 1 M HCl abgestoppt.

Das abgespaltene Phosphat in den Ansätzen wurde nun entweder sofort bestimmt oder die Ansätze bei 4°C gelagert und am folgenden Tag gemessen.

Zur Messung wurden die Ansätze 1:5 mit Aqua bidest. verdünnt.

Die Bestimmung erfolgte in Mikrotiterplatten, die folgendermaßen bestückt wurden:

In jede Vertiefung wurde 50µl Aqua bidest vorgelegt und 20µl verdünnte Probe hinzugefügt, wobei jeder Ansatz als Dreifachmessung pipettiert wurde.

Kurz vor der Messung wurde eine Na-Molybdat/2,5 N HCl/Malachitgrünlösung (10ml/10ml/0,570ml) frisch angesetzt und jeweils 180µl zu jedem Ansatz hinzugefügt.

Nach 2 min Reaktionszeit erfolgte die Messung bei 620nm in einem Photometer.

Zur Auswertung wurde die eingesetzte Proteinmenge in der Berechnung berücksichtigt und die Werte des entfetteten Homogenats mit denen der Plasmamembran verglichen, indem die Homogenatwerte als Bezugsgröße herangezogen wurden (Homogenatwerte wurden gleich eins gesetzt) und die Werte der Plasmamembranfraktion dazu in Bezug gestellt wurden.

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Die Cytochrom-C-Oxidase (CCO) ist eines der Markerenzyme der Mitochondrien und wurde nach einer Methode von STORRIE (1990) gemessen.

Die Messung erfolgte in Halbmikroküvetten, wobei jeweils zwei Durchgänge mit einem Einzelansatz jeder Probe durchgeführt wurden. Die Zusammensetzungen und die Konzentrationen der Puffer sind im Anhang auf Seite 78 aufgeführt.

In jeden Küvettenansatz wurden pipettiert : 900µl KPO4-Puffer pH 6,2

100µl 0,55mM Cytochrom C

100µl Probe in einer Verdünnung von 1:10

Die Extinktionsänderung wurde nach Durchmischung der Lösungen über 6 min bei einer Temperatur von 25°C in einem Pharmacia Biochrom 4060 Photometer bei einer Wellenlänge von 550 nm verfolgt.

Die Auswertung erfolgte unter Verwendung folgender Formel:

∆E / min x 1,1 (V) x Verdünnungsfaktor

21,1 (Ext.-Koeff.) x 1 (D) x 0,1 (V_Probe) = ∆E / min x 0,5213= U/ml

V= Volumen des Assayansatzes [ml]

D= Schichtdicke der Küvette [cm]

V_Probe= Volumen der Probe [ml]

21,1= Ext.-Koeff. des Cytochrom-C [ε^λmol]

Unter Einbeziehung des Proteingehaltes der Probe (mg/ml) erhält man ein Ergebnis in U/mg Protein als Aktivitätsangabe der CCO.

3.6.3 CYTOCHROM-C-REDUKTASE

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Auch hier wurden die fünf Proben zweimalig hintereinander im Einzelansatz gemessen.

Jede Halbmicroküvette wurde folgendermaßen bestückt:

200µl KPO4-Puffer pH 7,0

100µl 0,4mM Cytochrom C

10µl 0,05mM KCN

4µl 3,6µM Antimycin A 120µl Probe in einer Verdünnung von 1:10

Nach gründlicher Durchmischung erfolgte eine erste Messung über 6 Minuten.

Dann wurden

100µl 4,2µM NADH

hinzugefügt, gemischt und abermals 6 Minuten gemessen. Die Messung der Extinktion erfolgte wie bei der CCO in demselben Photometer, bei 25°C und 550nm Wellenlänge.

Die Auswertung erfolgte durch folgende Formel:

∆E / min x 0,534 ( V ) x Verdünnungsfaktor

21,1 ( Ext.-Koeff.) x 1 (D ) x 00,12 ( V_Probe ) = ∆E / min x 0,2109 = U/ml

V= Volumen des Assayansatzes [ml]

D= Schichtdicke der Küvette [cm]

V_Probe= Volumen der Probe [ml]

21,1= Ext.-Koeff. des Cytochrom-C [ε^λmol]

Von der Extinktionsänderung der zweiten Messung werden jeweils die Extinktionsänderungen der ersten Messung subtrahiert und der erhaltene Wert in die Formel eingesetzt, sodann durch den Proteingehalt der Probe (mg/ml) dividiert, um die Enzymaktivität in U/mg zu erhalten.

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3.7.1 PRINZIP DER RADIOASSAYS

Die in dieser Studie verwendeten Bindungsassays orientierten sich an den von RE et al. (1997) durchgeführten Untersuchungen zur Bestimmung der ß-AR der glatten Ileummuskulatur des Pferdes. In dieser Arbeit kamen zur Rezeptorbestimmung und Subtypenunterscheidung zwei verschiedene Konzentrationsbereiche sowie hochspezifische selektive Liganden zum Einsatz.

Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über den Assayaufbau.

ß3 ß2 ß1

Hohe

Ligandenkonzentration

3H-CGP12177A (0,6-10nM) Propranolol (0,5mM)

Niedrige

Ligandenkonzentration

3H-CGP12177A (0,06-3nM) Propranolol (1µM) OHNE spezif.

Ligandenzusatz

MIT ß₁-selektivem Ligandenzusatz

(CGP20712A)

MIT ß₂-selektivem Ligandenzusatz

(ICI118551)

Tabelle 3.1 Überblick über den Assayaufbau

Wenn der Radioligand ³H-CGP12177A in einer hohen Konzentration eingesetzt wird, erfasst er nur den ß-AR-Subtyp ß3. In einer niedrigeren Konzentration lassen sich mit ihm die ß-AR-Subtypen ß₁₊₂ ermitteln. Um nun diese beiden Rezeptorsubtypen differenzieren zu können, kommen hochselektive Liganden zum Einsatz. Zur Bestimmung des Subtyps ß₂ ist dies ein ß₁-selektiver Ligand (CGP20712A) und für den Subtyp ß₁ ein ß₂-selektiver Ligand (ICI118551).

Durch den Besatz dieser hochselektiven Liganden der jeweiligen Subtypenbindungsstellen, verbleiben für den Radioliganden nur die freien Bindungstellen des anderen Subtyps.

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Zu Beginn eines jeden Rezeptorversuches wurden die eingefrorenen Plasmamembranen des jeweiligen Tieres auf Eis aufgetaut, in ein Kunststoffreagenzglas überführt, mit der Adipocytenpräparationslösung 4 ca.

1:2 verdünnt und 20 Minuten bei 10000g zentrifugiert.

Der Überstand wurde nach der Zentrifugation verworfen und das Pellet in einem Tris-Mg-Puffer langsam resuspendiert, wobei gleichzeitig ein Proteingehalt von 2,3 mg/ml eingestellt wurde. Die resuspendierten Plasmamembranen wurden direkt vor deren Verwendung einmal per Hand in einem Homogenisierungsgefäß mit Stempel vorsichtig homogenisiert. Von der erhaltenen Plasmamembranlösung wurde erneut eine Proteinbestimmung nach Lowry gemacht, um den aktuellen Proteingehalt zu messen. Diese doppelte Proteinbestimmung war nötig, da durch die Homogenisierung mittels Homogenisierungsgefäß ein geringer Proteinverlust nicht ausgeschlossen werden konnte. Der Proteingehalt war jedoch von großer Bedeutung, da er als Bezugsgrundlage diente.

3.7.2.1 BINDUNGSKURVEN

Zur Bestimmung der Rezeptorsubtypen und deren Bindungsaffinitäten wurden jeweils drei Versuchsansätze unter Zugabe von verschiedenen spezifischen Liganden und einer ansteigenden Konzentration durchgeführt.

Von den Liganden (Propranolol, CGP20712A, ICI118551) wurden vor Versuchsbeginn Stammlösungen erstellt, die in Aliquots aufgeteilt und bei

–20°C für max. 6 Wochen gelagert und genutzt wurden.

Es wurden sowohl bei den Pferden als auch bei den Ponies von drei Tieren die Bindungskurven bestimmt.

Zur Auswertung der Messdaten (Berechnung der Gleichgewichts- dissoziationskonstanten (K_D) und des Korrelationskoeffizienten (r²) durch eine nichtlineare Regression) wurde das Computerprogramm Sigma Plot 4.0

herangezogen.

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Zur Bestimmung der ß3-AR erfolgte ein Ansatz in einem hohen Konzentrationsbereich (0,6-10nM) des spezifischen, tritiummarkierten ß-AR- Liganden CGP-12177A und Propranolol (Endkonzentration 0,5mM), wobei nach RE et al. (1997) in diesem Konzentrationsbereich lediglich die ß₃-AR erfasst werden.

Insgesamt wurden für jede Kurve sechs Punkte im Doppelansatz gemessen.

Für jeden gemessenen Gesamtbindungspunkt wurde ein dazugehöriger Punkt ermittelt, bei dem die unspezifische Bindung durch die Zugabe von Propranolol im sonst identischen Ansatz bestimmt und bei der Auswertung von der Gesamtbindung abgezogen wurde.

Das Assayvolumen betrug insgesamt 230µl und setzte sich je Eppendorfcup folgendermaßen zusammen:

100µl Konz. Tris-Mg-Puffer

100µl Membranfraktion (1,9µg (±0,4µg) Proteingehalt)

H³-CGP-12177A von 3-10µl (45,6-230nM), welches 0,6-10nM Endkonz.

im Ansatz entsprach Aqua dest. in unterschiedl. Volumina zum Auffüllung auf 230µl

sowie 10µl Propranolollösung (11,5mM, Endkonz. 0,5mM) in den Cups zur Bestimmung der unspezifischen Bindung.

Ein Pipettierschema ist zur Verdeutlichung im Anhang auf Seite 83 dargestellt.

3.7.2.1.2 ß₂-ADRENOREZEPTOREN (ß₂-AR)

Um die ß₂-AR zu bestimmen, erfolgte ein Versuchsansatz unter Zugabe von 15µM CGP20712A in der Endkonz., einem hochspezifischen selektiven ß1-AR Antagonisten.

Die ³H-CGP12177A Konzentration war in diesen Ansatz niedriger, sie bewegte sich zwischen 0,06 bis 3nM Endkonzentration.

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Die unspezifische Bindung wurde wie bei der ß₃-AR Messung durch die Zugabe von Propranolol (auch in einer niedrigeren Konzentration, 1µM Endkonzentration) bestimmt.

Für diese Kurven wurden jeweils sieben Punkte im Doppelansatz bestimmt.

Das Assayvolumen betrug ebenfalls 230µl : 100µl Konz. Tris-Mg-Puffer

100µl Membranfraktion

10µl 15µM Endkonz. Lsg CGP20712A

H³-CGP-12177 A von 2-10µl (6,87-69nM), welches 0,06-3nM Endkonz.

im Ansatz entsprach Aqua dest. in unterschiedichen Volumina zum Auffüllen auf 230µl

sowie 10µl 1µM Endkonz. Lsg. Propranolol in den Cups zur Bestimmung der unspezifischen Bindung.

3.7.2.1.3 ß₁-ADRENOREZEPTOREN (ß₁-AR)

Die Messung der ß₁-AR erfolgte in gleicher Weise wie die der ß₂-AR.

Der hier eingesetzte Ligand ICI118551 ist ein selektiver Antagonist der ß₂-AR und besetzt diese, so dass in diesem Ansatz nur die ß₁-AR radioaktiv markiert und erfasst werden. Sowohl die Konzentration von ICI118551 als auch die von Propranolol lag auch in einem niedrigen Bereich (5µM und 1µM Endkonzentration).

Auch hier wurden sieben Punkte als Doppelprobe gemessen, die folgendermaßen pipettiert wurden:

100µl Konz. Tris-Mg-Puffer 100µl Membranfraktion

10µl 5µM Endkonz. Lsg ICI118551

H³-CGP12177A von 2-10µl (6,87-69nM), welches 0,06-3nM

Endkonz.Lösung entsprach Aqua dest. in unterschiedl. Volumina zur Aufrundung auf 230µl

sowie 10µl 1µM Endkonz. Lsg. Propranolol in den Cups zur Bestimmung der unspezifischen Bindung.

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In den Eppendorfcups wurden für alle Ansätze die eiskalten Lösungen und Puffer vorgelegt und dann im Abstand von 60 sec die jeweilige Membranfraktion hinzugefügt. Die Inkubationszeit betrug 60 min bei 37°C. Zur Abstoppung der Bindungsreaktion wurden den Eppendorfcups jeweils 200µl entnommen und in Reagenzgläser gefüllt, in denen 2ml eiskalter Stop-Puffer vorgelegt war. Die Reagenzgläser wurden auf Eis gehalten, bis alle Proben abgestoppt waren.

Dann erfolgte die Filtration der Proben in einem Filtersauggerät durch Whatman Mikrofilter (GF\C, Durchmesser 25mm). Jede Probe wurde dreimalig mit 4ml eiskaltem Stop-Puffer gewaschen. Die Filter wurden danach in 5ml Szintillationsgefäße überführt und 4ml Szintillationsflüssigkeit (LSC) hinzugegeben.

Nach Abkühlung bei 4°C über Nacht wurde im gekühlten ß-Counter die gebundene Radioaktivität gemessen. In 2 Zählläufen nacheinander wurde jede Probe zweimal zehn Minuten gezählt.

3.7.2.2. BESTIMMUNG DER REZEPTORANZAHL

Die weitere Untersuchung der Anzahl der Bindungsstellen zum Vergleich der Pferde und der Ponies erfolgte durch Ein-Punkt-Messungen.

Dazu wurde jeweils der Meßpunkt ausgewählt, der im Sättigungsbereich der Bindungskurve lag. Dies waren bei den ß₃- und den ß₂-AR die Punkte mit der höchsten Konzentration an ³H-CGP12177A (10nM und 3nM).

Aufgrund der Ergebnisse der Bindungskurven wurde auf eine weitere Untersuchung der ß₁-AR verzichtet.

Die Durchführung der Assays erfolgte im Fünffach-Ansatz, d.h. für den Meßpunkt sowie für die dazugehörige unspezifische Bindung wurden jeweils fünf Eppendorfcups pipettiert. Die Meßmethode gleicht der der Bindungskurven.

Die Daten wurden bei drei Pferden und drei Ponies erhoben, so dass für den Punktevergleich sechs Tiere je Gruppe zur Verfügung standen (drei Tiere jeweils zusätzlich aus den Bindungskurven).

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Der Nachweis des an die der ß-AR gebundenen Liganden ³H-CGP12177A erfolgte mittels Detektion der Tritium-Strahlung im ß-Counter.

Zur Auswertung der Meßwerte fand folgende Formel Verwendung:

RL= B/(VxSAx2220) [nM]

RL= Konzentration des gebundenen Liganden in nM B= gemessene dpm

V= Assayvolumen (0,23ml)

SA= spezifische Aktivität des Radioliganden (46 Ci/mmol)

Gemäß dieser Formel wurde die Gesamtbindung (RL_ges) und die unspezifische Bindung (RLunspezif) berechnet.

Die spezifische Bindung (RLspez) wurde indirekt durch Subtraktion ermittelt:

RL_spez = RL_ges - RL_unspez

Die Ergebnisse der spezifischen Bindung (RL_spez [nM]) wurden durch den gemessenen Proteingehalt dividiert, so dass als Endergebnis eine Angabe der Bindungstellen (fmol) pro mg Protein möglich war.

3.8 ADIPOCYTENHISTOLOGIE UND MORPHOMETRIE

Zur Feststellung der Adipocytengröße der Tiere wurden mit einem Kryotom Gefrierschnitte angefertigt, die nativ mikroskopisch untersucht und zur Auswertung fotografiert wurden.

Aus dem gefrorenen Fettgewebe wurden mit einem Skalpell kleine Blöcke von 0,5x0,5x0,5cm herausgeschnitten, mittels einer Gefrierhilfslösung (Cryo-M- Bed) auf die kalten metallenen Gewebehalterungen aufgefroren und dann mit der Lösung ummantelt.

Das Kryotom wurde vor Versuchsbeginn auf –20°C heruntergefroren und während des Schneidens weiter bei dieser Temperatur gehalten. Von dem Fettgewebe wurden 75µm dicke Schnitte angefertigt und mit Hilfe Poly-L- Lysin-beschichteter Objektträger mit Raumtemperatur von dem Schneidemesser

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aufgenommen, wobei der Schnitt aufgrund der Temperatur sowie der Beschichtung am Objektträger haften blieb. Jeder Objektträger wurde mit vier Schnitten bestückt und dann unmittelbar mikroskopiert und fotografiert. Die Vergrößerung der Adipocyten auf den Fotos liegt bei 102,5.

Um Unterschiede in der Fettzellgröße der einzelnen Tiere zu bestimmen, wurden anhand zweier Fotos 200-250 Zellen je Tier ausgezählt, die eingenommene Fläche ermittelt, diese für 100 Zellen anteilig berechnet und anhand dieses Kriteriums wurden die Tiere miteinander verglichen.

3.9 STATISTISCHE AUSWERTUNG

Die statistische Auswertung wurde nach Beratung durch das Institut für Biometrie und Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Zum Tiergruppenvergleich der Bindungsstellenanzahlen der ß-AR (Gesamtanzahl an ß-AR sowie der beiden nachgewiesenen Subtypen) und der Adipocytenfläche wurden die Ergebnisse zunächst auf ihre Normalverteilung getestet. Da keine Normalverteilung vorlag, wurden die Ergebnisse logarithmiert und der Wilcoxon-Test angewandt.

4 E

4 E

4.1 ERGEBNISSE DER MEMBRANAUFARBEITUNG DER ADIPOCYTEN

Von dem Gesamtproteingehalt des jeweiligen entfetteten Homogenats ausgehend, ergibt sich eine prozentuale, durchschnittliche Aufarbeitungs- ergiebigkeit der Plasmamembranen von 2,31% (±0,69), wobei für die Pferde dieser Wert bei 2,75% (±0,67) und für die Ponies bei 1,88% (±0,38) liegt. Die Einzelwerte der Tiere und Präparationsstufen sind aus Tabelle (4.1) zu entnehmen.

Homogenat H

Überstand Ü

Pellet P

Mito- chondrien

Mi

Plasma- membran

PM

Pferd 1 100 63,68 9,94 0,16 3,00

Pferd 2 100 64,40 8,70 0,23 2,73

Pferd 3 100 56,20 13,90 0,26 3,78

Pferd 4 100 63,00 8,80 0,20 2,90

Pferd 5 100 74,60 6,60 0,20 2,30

Pferd 6 100 72,50 6,00 0,20 1,80

MW Pfd 65,73 8,99 0,21 2,75

±SD 6,76 2,82 0,03 0,67

Pony 1 100 54,01 8,37 0,19 1,97

Pony 2 100 65,93 8,10 0,17 2,47

Pony 3 100 63,86 8,32 0,32 1,72

Pony 4 100 94,80 7,10 0,30 1,50

Pony 5 100 89,00 9,60 0,40 2,10

Pony 6 100 68,70 5,50 0,50 1,50

MW Po. 72,72 7,83 0,31 1,88

±SD 15,77 1,39 0,13 0,38 MW alle 69,22 8,41 0,26 2,31

±SD 12,13 2,21 0,10 0,69 Tabelle 4.1 Übersicht über die prozentuale Aufarbeitungsergiebigkeit der Adipocytenplasmamembranen. Der Gesamtproteingehalt des entfetteten Homogenats entsprach 100%; die Gesamtproteingehalte der einzelnen Präparationsstufenvolumina wurden anteilig berechnet.

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4.2.1 5´NUCLEOTIDASE

Das Markerenzym der Plasmamembran, die 5´Nucleotidase, weist in den Plasmamembranfraktionen eine Aktivität von durchschnittlich 0,157 U/mg Protein (±0,047) auf. Im entfetteten Homogenat liegt die spezifische Aktivität bei 0,072 U/mg Protein (±0,028). Die Werte aller Aktivitätsmessungen sind im Anhang auf Seite 80 aufgeführt.

Um nun die Anreicherung dieses Enzyms und damit die Plasmamembrangewinnung darzustellen, wurde für jede Aufarbeitung die Enzymaktivität des entfetteten Homogenats als jeweiliger Bezugswert herangezogen (=1) und die Werte der anderen Präparationsstufen damit verglichen. Bei mehreren Aufarbeitungen je Tier wurde davon der Mittelwert ermittelt und dieser in der Berechnung verwendet.

In der Plasmamembranfraktion kann gegenüber dem entfetteten Homogenat die 5´Nucleotidase durchschnittlich 2,33-fach (±0,59) angereichert werden.

Für die Pferdegruppe ergibt sich ein Wert von 2,23-fach (±0,44) und für die Ponygruppe eine Anreicherung von 2,43 (±0,73).

In der Tabelle 4.2 ist eine Übersicht über die berechneten Daten für alle 5 Präparationsfraktionen der untersuchten Tiere wiedergegeben.

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Homogenat H

Überstand Ü

Pellet P

Mito- chondrien

Mi

Plasma- membran

PM

Pferd 1 1 0,49 3,62 0,92 2,06

Pferd 2 1 0,66 4,01 1,00 2,58

Pferd 3 1 1,68 2,33 0,83 1,59

Pferd 4 1 0,79 3,50 1,02 2,58

Pferd 5 1 0,68 3,68 1,53 2,66

Pferd 6 1 0,29 1,88 0,61 1,89

MW Pfd 0,77 3,17 0,98 2,23

±SD 0,48 0,85 0,31 0,44

Pony 1 1 0,73 3,56 0,89 1,83

Pony 2 1 0,74 3,62 0,77 1,82

Pony 3 1 0,71 3,33 1,29 1,87

Pony 4 1 0,55 4,71 1,31 2,71

Pony 5 1 0,88 3,65 1,75 3,65

Pony 6 1 0,79 4,66 1,13 2,68

MW Po. 0,73 3,92 1,19 2,43

±SD 0,11 0,60 0,35 0,73 MW alle 0,75 3,55 1,09 2,33

±SD 0,33 0,81 0,33 0,59 Tabelle 4.2 Darstellung der Anreicherung des Enzyms 5´Nucleotidase in den einzelnen Präparationsstufen. Die Enzymaktivität des entfetteten Homogenats bildet die Bezugsgröße (=1). Die anderen Aktivitätswerte wurden nach Berücksichtigung des Proteingehaltes damit verglichen, so dass man eine Zahl erhält, die die Anreicherung gegenüber dem Homogenat direkt beschreibt.

4.2.2 CYTOCHROM-C-OXIDASE

Die Cytochrom-C-Oxidase weist als das Markerenzym der Mitochondrien in dieser Aufarbeitungsfraktion die höchste Enzymaktivität auf.

Sie liegt durchschnittlich bei 0,327 U/mg Protein (±0,117) in der mitochondrienhaltigen Präparation.

4 E

Im entfetteten Homogenat hat sie eine Aktivität von 0,044 U/mg Protein (±0,019) und in der Plasmamembranfraktion liegt sie bei 0,101 U/mg Protein (±0,042).

Um auch hier die Aufarbeitung zu überprüfen, wurde ebenso wie bei der 5´Nucleotidase die Aktivität der CCO im entfetteten Homogenat als Bezugsgröße gewählt (=1) und die Werte der anderen Präparationsstufen damit verglichen (s. Tab. 4.3).

Homogenat H

Überstand Ü

Pellet P

Mito- chondrien

Mi

Plasma- membran

PM

Pferd 1 1 0,61 3,27 7,28 2,14

Pferd 2 1 0,48 2,94 8,01 1,67

Pferd 3 1 0,63 1,78 5,93 1,41

Pferd 4 1 0,37 3,15 7,72 1,48

Pferd 5 1 0,39 4,09 9,87 2,87

Pferd 6 1 0,09 1,25 4,63 2,09

MW Pfd 1 0,43 2,75 7,24 1,94

±SD 0,20 1,04 1,80 0,55

Pony 1 1 0,61 3,65 8,69 2,87

Pony 2 1 0,90 4,16 9,98 2,06

Pony 3 1 0,83 4,96 8,05 2,99

Pony 4 1 0,24 2,78 8,38 4,78

Pony 5 1 0,28 0,60 6,12 3,72

Pony 6 1 0,59 2,63 9,04 1,67

MW Po. 1 0,58 3,13 8,37 3,02

±SD 0,27 1,51 1,29 1,13 MW alle 1 0,50 2,94 7,81 2,48

±SD 0,24 1,26 1,61 1,01 Tabelle 4.3 Darstellung der Anreicherung des Enzyms Cytochrom-C-Oxidase in den einzelnen Präparationsstufen. Die Enzymaktivität des entfetteten Homogenats bildet wie bei der 5´Nucleotidase die Bezugsgröße (=1) und die anderen Aktivitätswerte wurden nach Berücksichtigung des Proteingehaltes

4 E

Die Cytochrom-C-Reduktase wurde zu Kontrollzwecken gemessen, um etwaige Verunreinigungen in der Präparation zu überprüfen, da in der angewandten Plasmamembranpräparation nach BELSHAM et. al (1980) keine spezielle Mikrosomenphase gewonnen wird. Die Enzymaktivität liegt im Homogenat bei 0,053U/mg (±0,06) und in der Plasmamembranfraktion bei 0,052U/mg (±0,019) (s. Tab. 4.4).

Homogenat H

Überstand Ü

Pellet P

Mito- chondrien

Mi

Plasma- membran

PM

Pferd 1 1 0,95 2,76 1,07 1,27

Pferd 2 1 0,67 2,07 0,64 1,41

Pferd 3 1 0,96 1,29 0,45 0,73

Pferd 4 1 0,22 1,85 0,52 1,15

Pferd 5 1 0,46 3,65 1,05 1,22

Pferd 6 1 0,51 0,21 0,11 0,66

MW Pfd 1 0,63 1,97 0,64 1,07

±SD 0,29 1,19 0,37 0,30

Pony 1 1 1,00 1,93 1,14 1,23

Pony 2 1 0,91 3,03 0,55 0,87

Pony 3 1 0,81 2,03 0,64 1,38

Pony 4 1 0,46 2,15 0,92 1,46

Pony 5 1 0,61 0,11 1,94 2,17

Pony 6 1 0,72 1,44 0,77 0,67

MW Po. 1 0,75 1,78 1,00 1,30

±SD 0,20 0,97 0,51 0,52 MW alle 1 0,69 1,88 0,82 1,18

±SD 0,25 1,04 0,46 0,43 Tabelle 4.4 Darstellung der Anreicherung des Enzyms Cytochrom-C-Reduktase in den einzelnen Präparationsstufen. Die Enzymaktivität des entfetteten Homogenats bildet die Bezugsgröße (=1) und die anderen Aktivitätswerte wurden nach Berücksichtigung des Proteingehaltes damit verglichen. Die Werte zeigen die Höhe der Anreicherung in den Fraktionen.

4 E

4.3 REZEPTORAUSSTATTUNG DER ADIPOCYTENMEMBRAN

Um die Rezeptorausstattung sowie das Bindungsverhalten der drei ß-AR für beide Tiergruppen darzustellen, wurden für jeweils drei Tiere der Gruppen die Bindungskurven ermittelt.

Anhand der Kurven sollten durch die Bestimmungen der Gleichgewichts- dissoziationskonstanten (K_D) die Bindungsaffinitäten der ß-AR beider Tiergruppen überprüft und ein Punkt im Sättigungsbereich für die anschließende Bestimmung der maximalen Anzahl an Bindungsstellen (Bmax) ermittelt werden.

Für die Untersuchung der B_max wurden Ein-Punkt-Messungen mit definiertem und überprüftem Proteingehalt sowie mit den jeweiligen Liganden durchgeführt.

Sie erfolgten durch Ein-Punkt-Messungen, um mehr Tiere untersuchen zu können.

4.3.1 ß₃-ADRENOREZEPTOREN

Für den ß₃-Rezeptor des Pferdes 1 ergeben sich folgende unten abgebildete Bindungskurven. Während der Kurvenverlauf der spezifischen Bindung durch eine nichtlineare Regression den Messpunkten angepasst wurde, wurden die ermittelten Punkte der Gesamt- und der unspezifischen Bindung miteinander verbunden. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K_D) ist 0,48 molar.

Zur visuellen Überprüfung wurden die Messpunkte der spezifischen Bindung mittels eines Scatchard Plots dargestellt. Der Regressionskoeffizient (r²) beträgt 0,88. Für die weitere Ergebnisauswertung fand der Scatchard Plot keine Verwendung.

4 E

Bound (nM)

0,12 0,16 0,20 0,24 0,28

Bound/Free

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35

Free (nM)

0 2 4 6 8 10

Bound (nM)

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40

Regression spezif.Bindg.

Spezif.Bindg.

Unspezif.Bindg.

Gesamtbindg.

Abb. 4.1 Graphische Darstellung der Bindungskurven für den ß₃-Rezeptor des Pferdes 1. Der Kurvenverlauf zwischen den Messpunkten der spezifischen Bindung wurde durch eine nichtlineare Regression angepasst, während bei der Gesamt- und der unspezifischen Bindung die Messpunkte miteinander verbunden wurden. Die rechte Graphik stellt einen Scatchard Plot der spezifischen Bindung dar.

4 E

Für das Pferd 2 sind die Bindungskurven in gleicher Weise unten dargestellt.

Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante hat bei diesem Tier einen Wert von 0,53 molar; im Scatchard Plot zeigt sich eine sehr hohe Korrelation von 0,96.

Free (nM)

0 2 4 6 8 10

Bound (nM)

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40

Regression spezif.Bindg.

Spezif.Bindg.

Unspezif.Bindg.

Gesamtbindg.

Bound (nM)

0,16 0,24 0,32 0,40

Bound/Free

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Abb. 4.2 Graphische Darstellung der Bindungskurven für den ß3-Rezeptor des Pferdes 2. Der Kurvenverlauf zwischen den Messpunkten der spezifischen Bindung wurde durch eine nichtlineare Regression angepasst, während bei der Gesamt- und der unspezifischen Bindung die Messpunkte miteinander verbunden wurden. Die rechte Graphik stellt einen Scatchard Plot der spezifischen Bindung dar.