3 Material und Methoden
3.3 Spektroskopische Methode und Ableitung des Auswert-Algorithmus
3.3.4 Optische Effekte bei Messung von Beta-Carotin im Gewebe
Verschiedene Einflüsse verändern die in Reflexion im Gewebe aufgenommenen Spektren gegenüber den in Transmission in einer Küvette aufgenommenen Reinspektren. So besitzen Reflexion und Streuung unterschiedliche Effekte auf Transmissions- und Reflexionsspektren.
Des weiteren müssen Inhomogenitäten des Lichtweges und der Farbstoffverteilung sowie Beta-Carotin-spezifische Lösungsmitteleffekte beachtet werden.
3.3.4.1 Wellenlängenabhängigkeit von Streueffekten
Die Intensität der Streuung von Licht ist in erster Linie vom Verhältnis der Größe des streu-enden Partikels zur Wellenlänge der auftreffstreu-enden Strahlung abhängig. Dies gilt sowohl für die ungerichtete Reflexion an der Oberfläche als auch für die Streuung in der Probe. Da auf-grund von Reflexion und Streuung ein Teil des Lichtes am Detektor vorbeigestreut wird ent-steht ein wellenlängenabhängiger Lichtverlust (HEDIGER 1985). Ein trübes Medium ist im UV-VIS-Bereich durch Rayleigh- und Tyndall-Streuung gekennzeichnet. Für die Intensität IS
der Streuung gilt:
[11] S p I = 1
IS Intensität der Streustrahlung λ Wellenlänge
p Von der Art der Streuung abhängiger Exponent
2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 -0 .2
0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 1 .2
Der Exponent p ist bei Rayleigh-Streuung 4 und bei Tyndall-Streuung 2. In trüben Lösungen liegt er - abhängig von der Größenverteilung der streuenden Teilchen und dem damit verbun-denen Anteil an Rayleigh und Tyndall-Streuung - zwischen diesen Werten (OWEN 1995). In einer komplexen Struktur wie biologischem Gewebe existieren unterschiedliche streuende Komponenten, deren Streuspektren sich zu Spektren aufaddieren, die sich durch Polynome höheren Grades beschreiben lassen (BIGIO u. MOURANT 1997). Deren Form ist im Gegen-satz zu Absorptionsspektren von der Meßanordnung abhängig. Wird in Transmission gemes-sen, so ergeben größere Streuungen größere Lichtverluste und folglich höhere Extinktionen (s. Abb. 6).
Abb. 6: Extinktionsspektren von Verdünnungen einer kolloidalen Lösung in Transmission.
Milch in Wasser, oberstes Spektrum: Verdünnung 1:50; untereinanderliegende Spektren sind jeweils 1:2 Verdünnungen der darüberliegenden Verdünnungsstufe (eigener Vorversuch).
In Reflexion hingegen ergeben größere Streuungen geringere Eindringtiefen des Lichtes in die Probe und damit geringere Lichtverluste, folglich geringere Extinktionen (s. Abb. 7).
Wellenlänge (nm)
Extinktion (OE)
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 0
0.5 1 1.5 2 2.5 3
Wellenlänge (nm)
Extinktion (OE)
Abb. 7: Extinktionsspektren kolloidaler Lösungen in Reflexion, gemessen in optisch unendli-cher Probe. () 100% Milch, (⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅) 10% Milch, (⋅⋅⋅) 1% Milch (eigener Vorversuch) 3.3.4.2 Effekt wellenlängenabhängig unterschiedlicher Eindringtiefe des Lichtes Infolge der Wellenlängenabhängigkeit der Streuung dringt Licht kurzer Wellenlängen weni-ger tief in die Probe ein als Licht länweni-gerer Wellenlängen (GRAAF et al. 1993). Dies bedeutet, daß an derselben Meßstelle langwelliges Licht eine größere Wegstrecke in der Probe durch-läuft als kurzwelliges, und damit nach Gleichung [5] an langen Wellenlängen eine höhere Extinktion meßbar ist. Spektren, die mit wellenlängenabhängig unterschiedlicher Eindring-tiefe des Lichtes aufgenommen wurden, erscheinen daher verglichen mit den Reinspektren verzerrt (JUNGMANN 1998).
3.3.4.3 Effekt unterschiedlicher Oberflächenreflexion
Absorption und Streuung sind unabhängige Prozesse. Bei den mit oben beschriebener re-flexionsspektroskopischer Meßapparatur erzeugten Hautspektren fiel dennoch eine Abhän-gigkeit der Amplitude der Absorptionsbanden von der Größe des überlagerten Streuspektrums auf (s. Abb. 9b). Das im folgenden beschriebene Modell wurde in dieser Arbeit entwickelt, um diesen Zusammenhang zu erklären.
Fällt Licht auf eine Probe, so bewirken bereits geringe Veränderungen des Einstrahlwinkels große Unterschiede in der Intensität der Oberflächenreflexion (KORTÜM 1969). Entspre-chend ändert sich der Anteil des in die Probe eindringenden Lichtes. Bei Messungen in Transmission gelangen an der Probenoberfläche reflektierte Strahlen im allgemeinen nicht in den Detektor. In der Probe geht ein weiterer Teil des Lichtes durch Absorption verloren, so daß für die Intensität I des in den Detektor gelangenden Lichtes gilt:
[12] I = I0 ⋅ (1 – R) ⋅ (1 – A)
I Intensität des gemessenen Lichtes I0 Intensität des eingestrahlten Lichtes
R Reflexion
A Absorptionsgrad
Diese Gleichung zeigt, daß sich die Reflexion in Transmissionsspektren an Bereichen des Spektrums bestimmen läßt, in denen der Absorptionsgrad gleich Null ist. Unterschiedliche Intensitäten der Reflexion führen zu multiplikativen Veränderungen der Lichtintensität, die sich in Extinktionsspektren aufgrund ihrer logarithmischen Natur in einer linearen Verschie-bung entlang der Ordinate äußern.
Bei Messungen in Reflexion hingegen gelangen - von der Meßanordnung abhängig - unter-schiedlich große Anteile der reflektierten Strahlung in den Detektor. Diese addieren sich mit dem in die Probe eingedrungenen und von dort zurück gestreuten Licht zur Gesamtintensität:
[13] I = IR + IS
I Intensität des gemessenen Lichtes
IR Intensität des an der Oberfläche reflektierten Lichtes IS Intensität des Streulichtes
Die Intensität der Oberflächenreflexion ist:
[14] IR = I0Â5⋅ α
IR Intensität des an der Oberfläche reflektierten Lichtes I0 Intensität des eingestrahlten Lichtes
R Reflexion
α Anteil der detektierten Reflexion
Dabei ist R vom Reflexionsvermögen des Stoffes und α von der während der Messung vor-liegenden Geometrie abhängig. Für die weitere Betrachtung wird für α zunächst ein Wert von 1 angenommen. Die Intensität des in die Probe gelangenden Lichtes ist um die Oberflächen-reflexion vermindert:
[15] IP = I0±5
IP Intensität des in die Probe gelangenden Lichtes IR Intensität des an der Oberfläche reflektierten Lichtes
R Reflexion
Ein Anteil dieses Lichtes wird in der Probe absorbiert, der Rest in den Detektor zurück ge-streut:
[16] IS = IP±$
IS Intensität des Streulichtes
IP Intensität des in die Probe gelangenden Lichtes A Absorptionsgrad
Aus der Kombination der Gleichungen [15] und [16] ergibt sich für die Intensität des Streu-lichtes IS:
[17] IS = I0 ⋅ (1 – R) ⋅ (1 – A)
Durch Einsetzten der Gleichungen [14] und [17] in die Ursprungsgleichung [13] ergibt sich:
[18] I = I0Â5⋅ α + I0±5±$
Es wird deutlich, daß sich der Anteil der Oberflächenreflexion nicht an absorptionsfreien Be-reichen des Spektrums bestimmen läßt. Vielmehr bewirkt eine Zunahme von R im Extink-tionsspektrum eine Verminderung der Höhe von Absorptionsmaxima (s. Abb. 8).
Abb. 8: Schematische Darstellung von Extinktionsspektren bei unterschiedlichen Intensitäten der Oberflächenreflexion (α = 1). a: Transmissionsmessung (nach [12]), b: Reflexionsmes-sung (nach [18]). An den Wellenlängen 1, 2, 4 und 5 ist die A = 0, an der Wellenlänge 3 = 0,5 In der Realität ist der in den Detektor gelangende Anteil der Reflexion α immer kleiner als 1.
Dies bedeutet, daß ein Teil der Reflexion am Detektor vorbei gestreut wird, so daß sich Kom-binationen der in Abb. 8 dargestellten Effekte ergeben. Bei Messungen an der Haut kann aufgrund des einheitlichen Brechungsindexes n der Haut (BOLIN et al. 1989) von geringen Schwankungen des Reflexionsvermögens ausgegangen werden. Aufgrund der lokal stark va-riierenden Oberflächenstruktur der Haut ist jedoch mit großen Schwankungen der detektierten Oberflächenreflexion zu rechnen. Abb. 9 zeigt die Eignung des entwickelten Modells zur Er-klärung des an den Hautspektren beobachteten Zusammenhangs zwischen der Höhe des Streu- und Absorptionsspektrums.
Der Effekt einer unterschiedlichen Oberflächenreflexion läßt sich auf mathematischem Wege nicht ausgleichen, da es sich um eine Gleichung mit zwei Unbekannten (R und α) handelt.
Eine Vermeidung dieses Effektes ist nur auf meßtechnischem Wege mit Verfahren möglich, die α entweder bestimmen oder gleich Null setzten.
1 2 3 4 5
400 450 500 550 600 650 700 750 -0.2
-0.1 0 0.1 0.2
1 2 3 4 5
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
α=0,1 α=0,5 α=0,9 a
Wellenlänge (nm)
Abb. 9: a: Schematische Darstellung von Extinktionsspektren (nach [18]) bei unterschiedli-cher Detektion einer Reflexion von 0,5. An den Wellenlängen 1, 2, 4 und 5 ist A = 0, an der Wellenlänge 3 ist A = 0,5. b: drei Hautspektren von Rindereuterhaut nach minimaler Verset-zung des Sensors.
3.3.4.4 Effekt additiver Farbmischung durch inhomogenen Lichtweg
Nimmt man Reflexions- und Streulichteffekte von der Betrachtung aus, so legen bei Trans-missionsmessungen in einer Küvette alle durch die Probe gelangenden Lichtstrahlen densel-ben Weg zurück; das heißt, die Weglänge c des Lichtes ist definiert und konstant. Durchläuft ein Lichtstrahl nacheinander mehrere Küvetten, so ist die Gesamttransmission das Produkt der Transmissionen durch jede der Küvetten:
[19] Tges =T1⋅T2⋅...⋅Tn
Tges Gesamttransmission
T1...Tn Teiltransmission der Küvetten 1 bis n
Dieses wird als multiplikative Farbmischung bezeichnet; bei Messungen von Reflexionsspek-tren hingegen liegt additive Farbmischung vor, da das Licht über unterschiedlich lange Licht-wege zum Detektor gelangt (s. Abb. 10). Durchlaufen Lichtstrahlen mehrere Küvetten neben-einander, ist die Gesamttransmission die Summe der Teiltransmissionen jeder der Küvetten:
[20] Tges =1⋅T1+2⋅T2+...+nTn
Tges Gesamttransmission
T1...Tn Teiltransmission der Küvetten 1 bis n
Ψ1...ψn In die Küvetten 1 bis n einfallende Fraktion des Gesamtlichtes
Dabei gilt:
[21]
∑
= n 1 i
ψi = 1
Das Lambert-Beersche Gesetz [5] ist nicht auf additive Farbmischung anwendbar, da es von einer konstanten Weglänge c ausgeht. Diese kann nur dann errechnet werden, wenn die ge-nauen geometrischen Verhältnisse ermittelt werden können. Die Extremwerte der Spektren bleiben durch den Effekt des inhomogenen Lichtweges in ihrer Lage unbeeinflußt (WODICK u. LÜBBERS 1973a). Zum besseren Verständnis des Effektes eines inhomogenen Lichtweges haben WODICK und LÜBBERS (1973a) das Konzept der Treppenküvette vorgeschlagen, die aus nebeneinander angeordneten Teilküvetten unterschiedlicher Schichtdicken besteht. Mit diesem Konzept läßt sich der Effekt inhomogener Lichtwege in Transmission nachbilden (s.
Abb. 10).
Abb. 10: Schematische Darstellung des Lichtweges bei der Entstehung von Reflexionsspek-tren (links) und Konzept der Treppenküvette zur Nachahmung des inhomogenen Lichtweges an einem Modell mit durchfallendem Licht (rechts) (nach WODICK u. LÜBBERS 1973a)
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 0
0.2 0.4 0.6 0.8 1
Wellenlänge (nm)
Extinktion (OE)
Abb. 11 zeigt den Effekt unterschiedlich inhomogener Lichtwege auf das Extinktionsspek-trum von Oxy-Hämoglobin. Dabei wurde eine Treppenküvette mit unterschiedlich vielen Stu-fen mathematisch simuliert und die Transmission der einzelnen StuStu-fen gemäß Gleichung [19]
aus dem Extinktionsspektrum von Oxy-Hämoglobin errechnet. Die Gesamttransmission Tges
ist nach Gleichung [20] die Summe der Einzeltransmissionen, wobei der Einfachheit halber davon ausgegangen wurde, daß das Licht gleichmäßig auf alle Teilküvetten scheint, also der Faktor ψi für alle Treppenstufen konstant ist. Die Extinktion ergibt sich als:
[22]
ges 10 T log 1 E=
Abb. 11: Extinktionsspektren von Oxy-Hämoglobin bei unterschiedlich inhomogenen Licht-wegen, errechnet mit dem Konzept der Stufenküvette. Das oberste Spektrum stellt einen ho-mogenen Lichtweg dar, in den darunter liegenden Spektren wurde die Anzahl der Stufen der Treppenküvette jeweils vervierfacht (unterstes Spektrum: 1024 Stufen). Der verzerrende Ef-fekt wird von Schritt zu Schritt geringer (Eigene Berechnung)
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 0
0.2 0.4 0.6 0.8 1
Wellenlänge (nm)
Extinktion (OE)
3.3.4.5 Effekt additiver Farbmischung durch inhomogene Farbstoffverteilung
Substanzen sind im Gewebe im allgemeinen nicht homogen verteilt. So findet sich das Hä-moglobin als häufigster und in höchsten Konzentrationen vorkommender Farbstoff nur intra-vaskulär. Die durch inhomogene Farbstoffverteilung verursachten Verformungen des Spek-trums beruhen wiederum auf additiver Farbmischung (WODICK u. LÜBBERS 1973b). Dies erklärt sich durch die Tatsache, daß das Licht flächenförmig ins Gewebe eingestrahlt wird, parallele Lichtstrahlen also Bereiche unterschiedlicher Farbstoffkonzentration gleichzeitig durchlaufen. Die dadurch erzeugten Auswirkungen auf das Spektrum sind nicht-linear (WODICK u. LÜBBERS 1974). Auch in diesem Fall ist das Lambert-Beersche Gesetz [5]
nicht anwendbar, da es von einer homogenen Farbstoffverteilung ausgeht. Abb. 12 zeigt den Effekt einer inhomogenen Farbstoffverteilung auf Extinktionsspektren.
Abb. 12: Extinktionsspektren von Oxy-Hämoglobin, errechnet für unterschiedlich inhomo-gene Verteilung in fünfkammeriger Küvette. Hämoglobinspektrum in homoinhomo-gener Verteilung (oben) und Effekt zunehmend inhomogener Verteilung (von oben nach unten: Verteilung auf 80%, 60%, 40% und 20% des Gesamtvolumens) (Eigene Berechnung)
Dabei wurde folgendes Experiment mathematisch simuliert. Eine Küvette unterteile sich in fünf aneinanderliegende Kammern gleicher Größe und das zur Messung benutzte Licht falle gleichmäßig durch alle fünf Kammern. Zunächst enthalte eine der Kammern Oxy-Hämoglo-bin, die vier anderen Kammern ein absorptionsfreies Lösungsmittel. Man messe die Ge-samttransmission und entferne die Wand zwischen der hämoglobinhaltigen und einer benach-barten Kammer. Nach gleichmäßiger Verteilung des Farbstoffes messe man erneut und wie-derhole den Vorgang, bis das Hämoglobin homogen in allen fünf Kammern verteilt ist. Für die Berechnung wurde dasselbe Oxy-Hämoglobinspektrum wie in Abb. 11 verwendet und die additive Gesamttransmission nach Gleichung [20], die Extinktion nach Gleichung [22]
errechnet.
3.3.4.6 Ausgleich von Inhomogenitäten
Eine additive Farbmischung erzeugt Signale, die sich in einer nicht-lineare Verzerrung in Richtung der Ordinate äußern (MARTENS u. NAES 1993). Das heißt, die Verzerrung ist al-lein von der Höhe der Extinktion abhängig. Hohe Werte werden nicht-linear stärker verzerrt als Werte niedriger Extinktion. Dies wird deutlich, wenn man die Extinktionswerte eines ho-mogenen gegen die eines inhoho-mogenen Spektrums aufträgt (s. Abb. 13).
Ist die Abweichung der Spektren nur auf diesen Effekt zurückzuführen, so ergibt sich eine eindeutige Transformation. Dabei handelt es sich um ein Polynom niedrigen Grades, welches benutzt werden kann, um homogene und inhomogene Spektren ineinander zu überführen (WODICK u. LÜBBERS 1973a).
Ergibt sich bei diesem auch als „multiplicative signal correction“ (MSC) bezeichneten Ver-fahren eine aus mehreren Ästen bestehende Kurve, so ist die Transformation nicht eindeutig.
Das heißt, gleiche Extinktionswerte werden unterschiedlich verformt. Eine solche Mehrdeu-tigkeit der Transformation kann durch eine Wellenlängenabhängigkeit des Lichtweges oder dem inhomogenen Spektrum überlagerte Störkomponenten verursacht werden (WODICK u.
LÜBBERS 1973b, MARTENS u. NAES 1993).
Abb. 13: Transformation der Extinktionsspektren homogen und inhomogen verteilter Farb-stoffe. a: Spektrum homogen verteilten Hämoglobins. b: Transformation, gewonnen indem die Extinktionswerte inhomogen verteilten Hämoglobins als Abszisse und die homogen ver-teilten Hämoglobins als Ordinate aufgetragen wurden. c: Spektrum auf 60% des Gesamtvo-lumens verteilten Hämoglobins aus Abb. 12
3.3.4.7 Lösungsmitteleffekte
Die Polarität des während der Messung verwendeten Lösungsmittels hat einen starken Einfluß auf das Spektrum. Die Ursache hierfür liegt darin, daß ein durch Absorption der π- oder n-Elektronen angeregtes Molekül gegenüber dem Grundzustand eine gesteigerte Polarität be-sitzt. Aufgrund von Dipol-Dipol-Interaktionen zwischen Molekül und Lösungsmittel wird für
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 400 500 600 700 800
0
den Übergang zum angeregten Zustand mit zunehmender Polarität des Lösungsmittels weni-ger Energie benötigt. Daher ergibt sich eine bathochrome Verschiebung (Rotverschiebung) des Spektrums (WILLIAMS u. FLEMMING 1987).
Beim Beta-Carotin zeigten sich deutliche Lösungsmitteleffekte (s. Abb. 14). Auffällig ist eine deutliche bathochrome Verschiebung des Spektrums und Verbreiterung der Absorptionsbande mit zunehmender Polarität des Lösungsmittels. Weiterhin ist das Auftreten einer Basislinie und die unterschiedliche Höhe der Absorptionsmaxima trotz Verwendung gleicher Beta-Ca-rotin-Konzentrationen anzumerken. Diese sind die Folge eines zunehmendem Streulichtef-fektes, der durch den Übergang einer echten zu einer kolloidalen Lösung ausgelöst wird.
Abb. 14: Extinktionsspektren von Beta-Carotin in unterschiedlichen Lösungsmitteln (Ethanol (99%), Ethanol (50%), Wasser, wäßrige NaCl-Lösung (1%) (Eigener Vorversuch)
Zur genaueren Untersuchung solcher Effekte bieten sich Ableitungen an (s. Abb. 15), die ex-akt die Lage von Extremwerten, Wendepunkten und Punkten maximaler Krümmung aufzu-zeigen vermögen. Die Maxima sind in 1%iger NaCl-Lösung gegenüber Ethanol von 339 nm auf 346 nm und von 447 nm auf 469 nm verschoben. Des weiteren erscheinen die Spektren deutlich verzerrt, was im Auftreten eines dritten Maximums bei 499 nm in Wasser und bei 516 nm in NaCl-Lösung Ausdruck findet. Eine Auflistung der kurvenrelavanten Punke findet sich in Anhangstabelle 1.
300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Wellenlänge (nm)
Extinktion (OE)
Ethanol (99%) Ethanol (50%) Wasser
wäßrige NaCl-Lösung (1%)
Abb. 15: Extinktionsspektren von Beta-Carotin in unterschiedlichen Lösungsmitteln (Ethanol (99%), Ethanol (50%), Wasser, wäßrige NaCl-Lösung (1%)), erste Ableitung. (Eigener Vorversuch)
3.3.5 Spektrenaufnahme
Die später vorgestellte Datenanalyse von Reflexionsspektren der Rindereuterhaut ist von einer Kenntnis der hauptsächlich zur Absorption beitragenden Stoffe abhängig. Reflexionsspektren durchbluteter Organe sind im UV-VIS-Bereich in hohem Maße durch das Absorptionsspek-trum von Hämoglobin bestimmt (WODICK u. LÜBBERS 1974). Das typische Absorptions-spektrum von Hämoglobin war in den eigenen Versuchen trotz Perfusion des Rindereuters mit hämoglobinfreier Lösung in allen Spektren deutlich zu erkennen. Neben Beta-Carotin mußte dieser Stoff daher in die Datenanalyse mit einbezogen werden. Reinspektren von Beta-Carotin und Hämoglobin wurden zur Eichung in vitro gemessen.
3.3.5.1 Beta-Carotin Reinspektrum
Eine grundsätzliche Frage bei der Messung im Gewebe ist die Vergleichbarkeit von in vitro mit in vivo aufgenommenen Spektren (DOORNBOS et al. 1999). Beim Beta-Carotin war bei der Aufnahme eines Reinspektrums besonders die Wahl eines Lösungsmittels schwierig, da zunächst unklar war, welches die Lösungsverhältnisse im Gewebe widerspiegelt.
Bei Perfusion des Rindereuters mit Tyrodelösung wurde beobachtet, daß sich die Hautspektren nur wenig verändern. Unter ansonsten konstanten Bedingungen sind
Wellenlänge (nm)
300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
Ethanol (99%) Ethanol (50%) Wasser wäßrige NaCl-Lösung (1%)
Veränderungen der Spektren unter Perfusion mit einer Beta-Carotin haltigen Lösung folglich auf diesen Stoff zurückzuführen. Das Beta-Carotin-Spektrum im Gewebe läßt sich zumindest näherungsweise als Differenzspektrum der Spektren nach und vor der Perfusion errechnen.
Diese Differenzspektren besitzen ein Maximum bei etwa 460 nm. Daher wurde als erste Näherung ein Transmissionsspektrum von Beta-Carotin in Paraffinöl mit einem Maximum bei 457 nm verwendet. Die Konzentration von Beta-Carotin im verwendeten Reinspektrum wurde anhand der Extinktion beim Maximum mit Hilfe einer Kalibrationsreihe bestimmt.
3.3.5.2 Reinspektren von Oxy- und Desoxy-Hämoglobin
Hämoglobin wurde aus Rinderblut gewonnen, indem diesem eisgekühltes, destilliertes Wasser zugesetzt, für 10 Minuten bei 2000g und 4 °C zentrifugiert und der Überstand abpipetiert wurde. Ein Teil der gewonnenen Hämoglobinlösung wurde mit reinem Sauerstoff oxygeniert, ein Teil durch Zugabe von Natrium-Dithianit desoxygeniert und die Lösungen in Transmission gemessen. Die Konzentrationen der so ermittelten Reinspektren wurden mittels der von PRAHL (1999) für den Menschen veröffentlichten Hämoglobin-Extinktionskoeffizienten ermittelt. Zu diesen Daten zeigen die verwendeten Reinspektren nur minimale Unterschiede (s. Abb. 16).
Abb. 16: Vergleich der im Versuch verwendeten HämoglobinReinspektren () mit den Daten von PRAHL (1999) (---). a: Oxy-Hämoglobin, b: Desoxy-Hämoglobin
400 450 500 550 600 650 700 750 0
400 450 500 550 600 650 700 750 0
Wellenlänge (nm) Wellenlänge (nm)
Extinktionskoeffizient ( ⋅ cm-1⋅ mol-1) Extinktionskoeffizient ( ⋅ cm-1⋅ mol-1)
350 400 450 500 550 600 650 700 750 -0.05
0 0.05
0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
W ellenlänge(nm)
Extinktion (OE)
3.3.5.3 Hautspektren
Die Abb. 17 gibt ein typisches Hautspektrum wieder, an dem die angewendete Datenanalyse erklärt werden soll.
Abb. 17: Typisches Reflexionsspektrum von Rindereuterhaut zwischen 380 nm und 750 nm Zur Sicherstellung eines günstigen Signal-Rausch-Verhältnisses wurde die Integrationszeit zu Beginn für alle weiteren Messungen des Versuches auf hohe Signale des Hautspektrums eingestellt. Um Überblendungen zu vermeiden, mußte die Lichtintensität bei Aufnahme des Referenzspektrums vermindert werden. Durch dieses Verfahren sind die Extinktionsspektren linear gegen die Ordinate verschoben, was bei der späteren Basislinienkorrektur ausgeglichen wurde. Zur Verminderung des Rauschens wurde bei allen Messungen der arithmetische Mittelwert aus mindestens 75 Einzelmessungen gebildet.