Abschätzung der mittleren Photonenweglänge

Die mittels der CLS-Methode errechneten Farbstoffkonzentrationen beziehen sich alle auf die Weglänge des Lichtes von 1 cm, da diese bei der Aufnahme der Reinspektren verwendet wurde. Die tatsächliche Konzentration errechnet sich durch Division mit der tatsächlich in der Haut zurückgelegten Weglänge des Lichtes. Diese läßt sich nach dem Stand der Technik nicht direkt bestimmen, sondern nur indirekt ableiten (s. 2.3.3, S. 14).

In Anlehnung an andere Studien (WEERSINK et al. 1997, DOORNBOS et al. 1999 MOURANT et al. 1999) wurde die mittlere Photonenweglänge in Rindereuterhaut mittels der optischen Eigenschaften dieses Gewebes bestimmt. Diese lassen sich anhand der mit ihnen in eindeutiger Weise verknüpften Größen diffuse Reflexion und totale Transmission indirekt be-stimmen. Die Methode der Wahl ist dabei die inverse Monte-Carlo-Simulation (s. 3.3.7.4, S.

55f) (ROGGAN et al. 1999).

Die Extraktion der optischen Parameter aus den Messungen mittels der inversen Monte-Carlo-Simulation ist rechnerisch sehr aufwendig (KIENLE u. PATTERSON 1996). Die optischen Parameter von Rindereuterhaut wurden daher in dieser Studie für sechs Proben an

den Wellenlängen 420 nm, 465 nm und 490 nm ermittelt, die im Bereich der Beta-Carotin-Absorption liegen. So war es möglich, eine Vorstellung über die Weglängen des Lichtes dieser Wellenlängen in Rindereuterhaut zu bekommen.

Die optischen Parameter der Rindereuterhaut wurden dabei in Anlehnung an MARCHESINI et al. (1989) mit einer Ulbrichtkugel in vitro bestimmt. Diese zeigen gegenüber In-vivo-Verhältnissen unveränderte Weglängen des Lichtes (DELPY et al. 1988).

3.3.7.1 Probengewinnung und -vorbereitung

Sechs etwa handtellergroße Euterhautproben wurden von verschiedenen Schlachttieren ent-nommenen. Diese wurden gekühlt zum Institut transportiert, dort gründlich gereinigt und ra-siert und bis zur Messung bei –20°C eingefroren. Die Zeit bis zur Messung betrug maximal 10 Tage.

Für die Messungen wurden die Proben aufgetaut und bis auf Raumtemperatur erwärmt. An-schließend wurde das Reflexionsspektrum der Hautstücke ermittelt und von jedem Hautstück drei etwa 3 x 3cm große Proben entnommen. Zwei Hautstücke wurden im Gefriermikrotom in zehn 100 µm dicke Schichten parallel zur Oberfläche geschnitten, eines zur Kontrolle in zwei 500 µm dicke Schichten. Die Schnitte wurden bis zur anschließenden Messung des Transmis-sionsspektrums in Tyrodelösung aufbewahrt. Dies ist notwendig, um eine Austrocknung der Schnitte zu vermeiden und einen standardisierten Grad der Hydration der Proben zu erreichen (TREWEEK u. BARBENEL 1996). Die Zeit bis zur Messung betrug maximal zwei Stunden.

Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

3.3.7.2 Messungen

Alle Messungen wurden im Bereich von 400 nm bis 600 nm mittels Halogenlampe mit einem Blaufilter durchgeführt und achtfach wiederholt. Das diffuse Reflexionsspektrum wurde mit der Ulbrichtkugel ermittelt.

Die Transmission wurde an 100 µm dicken Hautschnitten gemessen, da bei dieser Schicht-dicke keine Mehrfachstreuung zu erwarten ist (FLOCK et al. 1987). Zur Messung wurden die Hautschnitte der Öffnung der Ulbrichtkugel direkt aufgelegt und Licht mittels eines Stiftsen-sors eingestrahlt. Bei der gewählten Meßgeometrie gelangt bei Anisotropiefaktoren von grö-ßer als 0,25 alles gestreute Licht in den Detektor. Da Haut durch starke Vorwärtsstreuung

gekennzeichnet ist (CHEONG et al. 1990), waren Lichtverluste also nur auf Absorption und Oberflächenreflexionen zurückzuführen. Letztere sind aufgrund der glatten Schnittflächen bei senkrechter Einstrahlung jedoch nur gering und wurden von der weiteren Betrachtung ausge-nommen. Die genaue Meßanordnung ist aus Abb. 24 ersichtlich.

Abb. 24: Schematische Darstellung der Meßanordnung zur Ermittlung der totalen Transmis-sion der 100 µm dicken Hautschnitte

3.3.7.3 Errechnung der Reflexion und Transmission

Die Reflexion und Transmission der Proben wurde nach Gleichung [10] errechnet. Für die weitere Bearbeitung wurde der Median der acht Einzelmessungen benutzt. Um Ungenauigkei-ten der Schichtdicke durch Präparation mit dem Gefriermikrotom zu minimieren, wurde von jedem Hautstück das Mittelwertspektrum der zehn Schnitte gebildet. Zur zusätzlichen

Kon-Stiftsensor

Öffnung: 100µm ∅ Numerische Apertur: 0,22

5 mm

Ulbrichtkugel Durchmesser: 5 cm Öffnung: 8mm ∅ zum CCD-Array

Hautschnitt

trolle wurde jeweils das additive Spektrum der oberen und unteren fünf Schichten mit der Transmission der zugehörigen 500 µm dicken Schichten verglichen. Diese stimmten sehr gut miteinander überein. Die dickeren Proben besaßen aufgrund von Mehrfachstreuungen zu er-wartende leicht höhere Extinktionen.

3.3.7.4 Monte-Carlo-Simulation

Zur Extraktion optischer Parameter aus spektroskopischen Messungen wird ein Modell des Lichttransportes im Gewebe benötigt. Alle mathematischen Modelle, wie die Zweiflußtheorie, die Diffusionsapproximation oder andere numerische Lösungen der Transport-Gleichung, sind von simplifizierenden Annahmen abhängig und daher in ihrer Aussagekraft beschränkt.

Diese Beschränkungen gelten nicht für die Technik der inversen Monte-Carlo-Simulation, die verwendet wurde, die optischen Eigenschaften von Euterhautgewebe zu ermitteln (FLOCK et al. 1987).

Bei dieser Technik wird der Weg von Photonen unter Berücksichtigung der geometrischen Verhältnisse der jeweilig benutzten Meßanordnung auf der Grundlage vorgegebener optischer Eigenschaften einer Probe nachverfolgt. Für jedes Photon wird erfaßt, ob es an der Oberfläche reflektiert wird, in der Probe absorbiert wird oder die Probe wieder verläßt (GROENHUIS et al. 1983, WILSON u. ADAM 1983).

Wird die Anzahl der benutzten Photonen als eingestrahlte Lichtintensität und die Anzahl der detektierten Photonen als gemessene Lichtintensität aufgefaßt, läßt sich bei Verwendung einer genügend großen Anzahl von Photonen die Transmission bzw. Reflexion mit Hilfe der Glei-chungen [3] und [6] an einer Wellenlänge statistisch vorhersagen. Diese Größen lassen sich nun durch iterative Veränderung der in der Simulation benutzten optischen Parameter den an der Probe gemessenen Größen Transmission und Reflexion annähern.

Die inverse Monte-Carlo-Simulation wurde mit dem Programm MontCarl 2001 (Version 20.01, University of Twente, Department of Applied Physics, Biophysical Technology Chair, Biomedical Optics Group, DE MUL et al. 1995) durchgeführt.

Dabei wurde die Haut in Anlehnung an andere Autoren als optisch homogenes Medium auf-gefaßt (PATTERSON et al. 1989, SIMPSON et al. 1998). Für den Brechungsindex der Haut wurde der von BOLIN et al. (1989) für alle weichen Gewebe genannte Wert von 1,4 ange-nommen. Der Anisotropiefaktor g wurde mit einem Wert von 0,7 auf von ROGGAN et al.

(1999) für menschliche Haut veröffentlichte Werte angepaßt. Reflexion und Transmission der Simulation wurden durch iterative Veränderungen des Absorptions- und Streukoeffizienten mit anschließender Simulation von 100000 Photonen den in den Proben gemessenen Werten angenähert. Der Absorptionskoeffizient wurde dabei bis auf 0,01/mm und der Streukoeffizient bis auf 0,1/mm berechnet. Die Abweichungen von Reflexion und Transmission zu den bei den Proben gemessenen Werten betrug in allen Fällen weniger als 1%.

Mittels der so bestimmten optischen Koeffizienten konnte anschließend die Weglänge des Lichtes in Rindereuterhaut mittels einer Monte-Carlo-Simulation ermittelt werden. Für die Berechnung der Farbstoffkonzentrationen in Rindereuterhaut wurde der Median der Weglängen dieser Proben beim Absorptionsmaximum von Beta-Carotin (465 nm) benutzt.

3.4 Vergleich reflexionsspektroskopisch ermittelter