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Einfluss des Lipidmusters und der Morphologie der Epidermis auf transdermale Permeationsraten im In-vitro-Versuch
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Jessica Stahl Aus Cagliari, Italien
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H.Y. Naim
Tag der mündlichen Prüfung: 12. November 2007
Die vorliegende Arbeit wurde durch ein Promotionsstipendium der Akademie für Tiergesundheit e.V. gefördert.
Für meine Familie
und Falko
in Liebe und Dankbarkeit
I. Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung...1
2 Literaturübersicht...2
2.1 Haut...2
2.1.1 Aufbau und Funktion...2
2.1.1.1 Epidermis ...3
2.1.1.2 Dermis...8
2.1.1.3 Hypodermis ...8
2.1.1.4 Hautgefäße ...8
2.1.1.5 Hautnerven ...9
2.1.1.6 Hautanhangsgebilde...9
2.1.2 Hautlipide ...10
2.1.2.1 Polare Lipide ...12
2.1.2.1.1 Cholesterolsulfat...12
2.1.2.1.2 Phospholipide ...12
2.1.2.2 Neutrale Lipide...13
2.1.2.2.1 Sterole ...13
2.1.2.2.2 n-Alkane...14
2.1.2.2.3 Freie Fettsäuren und Triglyceride...14
2.1.2.3 Sphingolipide...16
2.1.3 Transdermaler Stofftransport ...20
2.1.4 Einfluss der Haut auf den transdermalen Stofftransport ...24
2.1.5 Einfluss der Testsubstanzen und deren Vehikel auf den transdermalen Stofftransport...27
2.1.6 Topisch applizierte Testsubstanzen...28
3 Material und Methoden...30
3.1 Materialien...30
3.1.1 Chemikalien und Lösungsmittel ...30
3.1.2 Hergestellte Puffer...31
3.1.3 Sonstige Materialien...31
3.1.4 Verwendete Geräte...32
3.1.5 Datenverarbeitung ...33
3.2 Methoden...33
3.2.1 Hautgewinnung ...33
3.2.2 Franzzell-Diffusionsversuch ...34
3.2.2.1 Präparation der Haut ...34
3.2.2.2 Herstellung der Testsubstanzlösungen...35
3.2.2.3 Diffusionsversuch...35
3.2.2.4 Versuchsdurchführung...36
3.2.2.5 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ...37
3.2.3 Validierung der HPLC für die untersuchten Testsubstanzen ...38
3.2.3.1 Selektivität...38
3.2.3.2 Linearität ...40
3.2.3.3 Detektions- und Quantifizierungsgrenze ...41
3.2.3.4 Richtigkeit ...42
3.2.3.5 Präzision bzw. Reproduzierbarkeit...43
3.2.3.6 Stabilität der Analyten ...44
3.2.4 Lipidanalytik ...46
3.2.4.1 Hitzeseparierung der Epidermis ...47
3.2.4.2 Lipidextraktion ...47
3.2.4.3 Hochleistungsdünnschichtchromatographie ...49
3.2.4.4 Versuchsdurchführung...49
3.2.4.4.1 Plattenvorbereitung...49
3.2.4.4.2 Kammervorbereitung ...50
3.2.4.4.3 Trennvorgang ...50
3.2.4.4.4 Nachbearbeitung und Auswertung ...51
3.2.5 Histologische Untersuchung ...52
3.2.5.1 Versuchsdurchführung...52
3.2.6 Statistische Auswertung ...54
3.2.6.1 Diffusionsversuche ...55
3.2.6.2 Epidermale Lipidanalytik...55
3.2.7 Hierarchische Clusteranalyse...55
4 Ergebnisteil...56
4.1 In-vitro-Diffusionsversuche ...56
4.1.1 Flufenaminsäure-Permeation ...56
4.1.2 Ibuprofen-Permeation...58
4.1.3 Indomethacin-Permeation...60
4.1.4 Salicylsäure-Permeation ...62
4.1.5 Vergleichende Darstellung der Versuchsergebnisse ...64
4.1.5.1 Papp-Werte...64
4.1.5.1.1 Vergleich der verwendeten Tierhäute...64
4.1.5.1.2 Vergleich der verwendeten Testsubstanzen ...65
4.1.5.1.3 Korrelation zwischen den Analyteneigenschaften und den in den Diffusionsversuchen ermittelten Parametern ...66
4.1.5.1.4 Korrelation zwischen der Lipophilie der Analyten und der Permeabilität ...66
4.1.5.1.5 Korrelation zwischen dem Schmelzpunkt der Analyten und der Permeabilität...67
4.1.5.2 Lag-Zeit...68
4.1.5.2.1 Vergleich der verwendeten Tierhäute...68
4.1.5.2.2 Vergleich der verwendeten Testsubstanzen ...69
4.2 Ergebnisse der epidermalen Lipidanalytik ...70
4.2.1 Anteil der untersuchten Lipide am Gesamtlipidgehalt der Epidermis ...75
4.3 Ergebnisse der histologischen Untersuchung...75
4.3.1.1 Dicke der vitalen Epidermis...80
4.3.1.2 Dicke des Stratum corneum...80
4.3.1.3 Gesamtdicke der Epidermis und relative Dicke des Stratum corneum..81
4.3.1.4 Untersuchung der Haarfollikel ...82
4.3.1.4.1 Haarfollikeldichte ...82
4.3.1.4.2 Haarfollikeldurchmesser ...83
4.3.1.4.3 Eindringtiefe der Haarfollikel ...84
4.4 Hierarchische Clusteranalyse ...84
5 Diskussion...87
5.1 Auswahl der Tierhäute ...87
5.2 Permeationsverhalten der Analyten bei vier verschiedenen Spezies...88
5.2.1 Permeabilität und Lag-Zeit von vier verschiedenen Spezies im Vergleich...88
5.2.2 Korrelation zwischen der Permeabilität und den physikochemischen Eigenschaften der Testsubstanzen ...89
5.2.3 Korrelation zwischen der Lag-Zeit und den physikochemischen Eigenschaften der Testsubstanzen...90
5.3 Einflussfaktoren auf die transdermale Permeation/Interindividuelle Schwankungen...91
5.3.1 pH-Wert der Hautoberfläche ...92
5.4 Epidermales Lipidmuster verschiedener Spezies ...92
5.4.1 Analytik des epidermalen Gesamtlipidgehalts verschiedener Spezies ...92
5.4.2 Analytik der Zusammensetzung epidermaler Lipide verschiedener Spezies ...93
5.4.2.1 Tierartliche Besonderheiten ...93
5.4.2.2 Lipidzusammensetzung der Epidermis...95
5.4.2.2.1 Problematik der Triglyceride ...96
5.4.2.3 Anteil der untersuchten Lipide am Gesamtlipidgehalt ...98
5.4.2.4 Problematische Aspekte der Beurteilung des epidermalen Lipidgehaltes ...98
5.4.2.4.1 Methodik ...98
5.4.2.4.2 Einflussfaktoren auf das epidermale Lipidmuster/Interindividuelle Schwankungen...100
5.4.2.4.2.1 Lipide der Haare ...102
5.4.3 Korrelation zwischen den epidermalen Lipiden und der Permeation ...103
5.4.4 Beurteilung der durchgeführten Lipidanalytik...104
5.5 Untersuchung morphologischer Parameter bei verschiedenen Spezies...105
5.5.1 Dickenmessung der vitalen Epidermis, des Stratum corneum sowie der
gesamten Epidermis...105
5.5.2 Anordnungsmuster, Dichte und Eindringtiefe der Haarfollikel bei verschiedenen Spezies ...106
5.5.3 Problematik der Beurteilung morphologischer Parameter bei verschiedenen Spezies ...110
5.5.3.1 Methodik ...110
5.5.3.2 Einflussfaktoren auf morphologische Hautparameter/Interindividuelle Unterschiede...111
5.5.4 Korrelation zwischen der Permeabilität und den morphologischen Parametern...111
5.5.4.1 Dicke der permeierten Hautschichten...111
5.5.4.2 Haarfollikel...112
5.5.4.2.1 Problematik der Haarfollikel...114
5.5.4.3 Hautdrüsen ...114
5.5.5 Korrelation zwischen der Lag-Zeit und den morphologischen Parametern ...115
5.5.5.1 Dicke der permeierten Hautschichten...115
5.5.5.2 Haarfollikel...115
5.6 Hierarchische Clusteranalyse ...115
5.7 Einsatz der untersuchten Tierhäute in In-vitro-Permeationsstudien...116
5.8 Schlussfolgerung...118
6 Zusammenfassung...120
7 Summary...122
8 Anhang...124
9 Literaturverzeichnis...131
10 Veröffentlichungen...181
11 Danksagung...182
II. Abkürzungsverzeichnis
< kleiner als
°C Grad Celsius
δ Differential
δ Dicke eines dünnen Substanzvorrates auf der Membranoberfläche
® Marke, Warenzeichen
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
% Prozent
A Fläche
ad zu
ANOVA Analysis of variance
Aqua bidest. Aqua bidestillata
AUC Area under the curve
bzw. beziehungsweise
c Konzentration
C Cholesterol
C3 Ceramid 3 [NP]
C4 Ceramid 4 [EOH]
ca. circa
Ca2+ Calcium
CE Cholesterolester
Cer Ceramid
cm Centimeter
cm² Quadratcentimeter
CS Cholesterolsulfat
D Diffusionskoeffizient
d.h. has heißt
DNA Desoxyribonukleinsäure
eGL epidermaler Gesamtlipidgehalt
et al. et alii
f Freiheitsgrade der linearen Kalibration
FFA freie Fettsäuren
Flu Flufenaminsäure
g Gramm
GC Galactocerebroside
HE-Färbung Hämatoxilin-Eosin-Färbung
HCl Salzsäure
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HPTLC Hochleistungsdünnschichtchromatographie
HQS High quality control standard
Ibu Ibuprofen
IL(-α , -β, -1α) Interleukin (α , β, -1α)
Ind Indomethacin
inkl. inklusive
J Flux
K+ Kalium
K Kelvin
K Verteilungskoeffizient
K1-20 Keratin1-20
l Liter
lat. lateinisch
Kow Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient
LDL Low density lipoprotein
LOD Limit of detection, Detektionsgrenze
log Logarithmus
LOQ Limit of quantification, Quantifizierungsgrenze
LQS Low quality control standard
m Masse
m² Quadratmeter
mg Milligramm
ml Milliliter
mm Millimeter
mM Millimol
mPa Millipascal
MW Molekulargewicht
n Anzahl der Proben
NaCl Natriumchlorid
NaOH Natronlauge/Natriumhydroxid
ng Nanogramm
NHR Nuclear hormon receptors
nm Nanometer
Nr. Nummer
p Irrtumswahrscheinlichkeit
Papp scheinbarer Permeationskoeffizient PAPS 3´-Phosphoadenosin-5´-Phosphosulfat
pH pH-Wert
PL Phospholipide
rpm Revolutions per minute
Rf-Wert Retentionsfaktor, Relate to front-factor, Retarding-factor
RNA Ribonukleinsäure
s Sekunde
s Standardabweichung
S Schwein
Sal Salicylsäure
Sb Zwischenpräzision
SREBP Sterol regulatory element binding proteins SPRP Small proline rich proteins
SCCE Stratum corneum Chymotrypsin
SCTE Stratum corneum Trypsin
Std. Stunde
Sw Wiederholpräzision
t Zeit
t Lag-Zeit
TEWL Transepidermaler Wasserverlust
TGL Triglyceride
TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-α
Tr. Tropfen
u. und
U Umdrehungen
u.a. unter anderem
UV ultraviolett
UV-VIS Ultraviolet and visible spectroscopy
USA United States of America
V Volumen
v.a. vor allem
x betrachtete Stelle in der Membran
x Diffusionsstrecke
X Mittelwert
z.B. zum Beispiel
1 1 Einleitung
Die Erforschung des transdermalen Stofftransportes von topisch applizierten Substanzen stellt ein wichtiges Gebiet der pharmakologischen, der toxikologischen sowie der kosmetischen Forschung dar. Sowohl in der Tier- als auch in der Humanmedizin werden In-vitro- Permeationsversuche zur Entwicklung und Erprobung von Arzneimitteln (z.B. Spot-on- Präparate, transdermale Pflaster) genutzt. Bei rein äußerlich wirkenden Substanzen ist es notwendig zu wissen, welche Substanz- und Hauteigenschaften eine transdermale Stoffaufnahme verhindern. Andererseits gibt es eine Vielzahl von Arzneimitteln, die transdermal in den Körper gelangen sollen, da diese Art der Applikation viele Vorteile mit sich bringt (RIVIERE et al. 1986; ROBERTS et al. 1998). Durch die Umgehung des Gastointestinaltraktes wird beispielsweise ein First-Pass-Metabolismus in der Leber verhindert und Nebenwirkungen können verringert werden (z.B. Vermeidung der gefürchteten Ulkusneigung bei nichtsteroidalen Antiphlogistika durch Umgehung der Magen-Darm-Trakt- Passage). Zusätzlich ergibt sich für die transdermale Applikation von Arzneimitteln aufgrund der guten Praktikabilität ein breites Anwendungsgebiet in der Human- und Tiermedizin.
In-vivo-Studien an Menschen und Tieren sind aus ethischen Gründen und zum Schutz der Tiere zu vermeiden (PERSHING u. KRUEGER 1987), so dass vermehrt In-vitro-Versuche durchgeführt werden. Die Versuchsergebnisse verschiedener Spezies und unterschiedlicher Individuen einer Spezies unterliegen jedoch großen Schwankungen, wobei die Gründe dieser Schwankungen bisher nicht ausreichend präzisiert werden konnten. Der heutige Stand der Forschung weist auf Unterschiede im morphologischen und biochemischen Aufbau der Haut hin, wobei sich der Vergleich von Literaturergebnissen aufgrund unterschiedlich angewandter Untersuchungsmethoden als schwierig erweist.
Ziel dieser Arbeit war es daher, einen Erklärungsansatz für die in dermalen In-vitro- Permeationsversuchen auftretenden Ergebnisstreuungen sowohl zwischen verschiedenen Spezies als auch zwischen den Individuen derselben Spezies zu schaffen und Einflussursachen zu konkretisieren. Der Vergleich der erhaltenen Versuchsergebnisse mit Daten vom Menschen sollte zudem die Möglichkeit bieten, die Eignung der untersuchten In- vitro-Modelle als Ersatzmethode zur Humanhaut näher zu charakterisieren.
2 2 Literaturübersicht
2.1 Haut
2.1.1 Aufbau und Funktion
Die Haut (lat.: Cutis) stellt eines der größten und vielseitigsten Organsysteme des Körpers dar und bedeckt beim erwachsenen Menschen eine Fläche von etwa 2 m² (HADGRAFT 2001).
Funktionell und histologisch lässt sich die Haut, die aus 70 % Wasser, 25 % Proteinen sowie 3 % Lipiden besteht, in drei Schichten einteilen (LIEBICH et al. 1999): die Epidermis (Oberhaut), die Dermis (Lederhaut) und die Hypodermis (Unterhaut) (siehe Abbildung 1).
Abbildung 1: Schematischer Querschnitt durch die Haut (COGNIS DEUTSCHLAND GMBH & CO. KG 2003)
Sie ist das schützende Grenz- und Kontaktorgan jedes Organismus zur Außenwelt und übernimmt als Beteiligte des Abwehrgeschehens wichtige Immunüberwachungsfunktionen des Körpers (WOLFF 1991; SCHAEFER u. REDELMEIER 1996; LIEBICH et al. 1999;
NEUBERT et al. 2001). Mit der Fähigkeit, Wasserdampf, Talg und Schweiß abzusondern, Epidermis
Dermis
Hypodermis
Stratum corneum Stratum granulosum
Stratum spinosum Stratum basale Talgdrüse Haarpapille
Schweißdrüse
Blutgefäß
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nimmt sie Teil an der Regulation des Wasserhaushaltes sowie der Körpertemperatur (WOHLFARTH 1987; WOLFF 1991). Zudem können über die Haut mechanische, thermische sowie Schmerzreize wahrgenommen werden (LEONHARD 1990).
2.1.1.1 Epidermis
Die äußere Schicht der Haut ist die Epidermis, die ein geschichtetes, verhornendes Plattenepithel darstellt. Sie dient als erste Schutzbarriere beim Eindringen von Fremdstoffen in den Körper und unterliegt permanenten Erneuerungsprozessen (FRITSCH 1988). Ihre Dicke variiert in Abhängigkeit von der Körperregion, dem Alter, dem Geschlecht sowie der mechanischen Beanspruchung (STEIGLEDER 1991). Hauptbestandteil der Epidermis sind Keratinozyten (etwa 90 % der Trockenmasse); des Weiteren enthält sie Langerhans-Zellen mit Makrophagenfunktion, Lymphozyten zur Immunabwehr, Melanozyten, die Melanin synthetisieren und somit ultraviolette Strahlungen absorbieren und Merkelzellen, die sensorisch Berührungsreize wahrnehmen.
Wegen des ständigen Abschilferns der verhornten Zellen nach außen, befindet sie sich in einem Fließgleichgewicht, da in den basalen Schichten kontinuierlich Zellproliferationen stattfinden. Abhängig vom Grad der Keratinozytendifferenzierung lässt sich die Epidermis in die folgenden vier Schichten unterteilen (von innen nach außen), die jeweils durch ihre Morphologie und Funktion charakterisiert sind (SCHWARZ et al. 1981; FRITSCH 1988):
Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulosum und Stratum corneum (siehe Abbildung 1).
Im Stratum basale befindet sich das Stammzellsystem, das aus teilungsfähigen Keratinoblasten besteht. Alle Keratinozyten entstammen diesem System. Untereinander haben sie durch Desmosomen und zur darunter liegenden Basalmembran durch Hemidesmosomen Kontakt und bilden so eine einschichtige, säulenförmige Zelllage (NEUBERT et al. 2001).
Eine exakte Charakterisierung der Keratinoblasten ist anhand der Expression von Keratinen (K1-K20) und spezieller Integrine möglich. Bei den Keratinen unterscheidet man den sauren Typ 1 (K9-K20) und den neutral bis basischen Typ 2 (K1-K8), die immer paarweise auftreten.
Integrine stellen Heterodimere dar, die sowohl aus einer α- als auch aus einer β-Untereinheit aufgebaut sind (FRITSCH 1988; ELIAS 2005). Die im Stratum basale noch undifferenzierten
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Zellen exprimieren vorwiegend Integrine mit einer β1-Untereinheit. Mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper sind 6 Kombinationen nachweisbar (α2β1-, α3β1-, α5β1-, α8β1-, α9β1- und α6β4-Integrin), wobei das α6β4-Integrin nur im Bereich der basalen Zellmembran vorzufinden ist, wo es mit den hemidesmosomalen Proteinen der Basalmembran wechselwirkt (SONNENBERG et al. 1991; ZELLMER 2001).
Während der Differenzierung der Zellen wandern die Zellen von den basalen Schichten in apikale Richtung. Eingeleitet wird dieser Prozess durch die mitotische Teilung der Keratinozyten. Wenn die entstehenden Tochterzellen die Fähigkeit, α6β4-Integrin zu bilden, verlieren, löst sich der Kontakt zur Basalmembran und die Zellwanderung in Richtung Stratum spinosum beginnt (FRITSCH 1988; SONNENBERG et al. 1991; WATT 1998).
Der Transit durch das Stratum spinosum dauert etwa 14 Tage, wobei sich das Zellbild aufgrund intrazellulärer Umbauprozesse während dieser Zeit erheblich verändert, so dass die typische Stachelzellform entsteht, der diese Schicht ihren Namen verdankt (ZELLMER 2001).
Am Übergang zum Stratum granulosum werden basische Keratohyalingranula synthetisiert, in denen sich Profilaggrin und Keratinfilamente anreichern. Während der weiteren Differenzierung werden aus Profilaggrin Filaggrin sowie Involukrin gebildet. Letzteres lagert sich an die Zellmembraninnenseite an, wird dort durch das Ca2+-abhängige Enzym Transglutaminase quervernetzt und stabilisiert die Zelle von nun an in Form des Cornified envelope. Dadurch erlangt diese eine gewisse Resistenz gegenüber chemischen Einwirkungen und wird zudem versteift (Rigidität) (FRITSCH 1988). Filaggrin stabilisiert darüber hinaus durch Vernetzung der Keratinfilamente über Disulfidbrücken das Innere der Zelle (LIEBICH et al. 1999). Gleichzeitig kommt es zur Ausbildung von Keratinosomen (Lamellar bodies), die essentiell für die Barrierefunktion sind. Sie stammen aus dem Golgi-Apparat und sind reich an polaren Lipiden (v.a. Phospholipiden) sowie katabolen Enzymen, die für die Lipidbildung entscheidend sind (GRAYSON et al. 1985; MENON u. GHADIALLY 1997).
Am Übergang zum Stratum corneum entleeren die Keratinosomen ihren Inhalt in den Interzellularraum der Hornschicht (FRITSCH 1988; MELNIK 1990). Dabei werden Lipidhydrolasen freigesetzt, die aus Lipiden (Cholesterolsulfat, Phospholipide, Sphingomyelin und Glykosylceramide) apolare Metabolisierungsprodukte synthetisieren
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(ELIAS u. MENON 1991). Zudem gehen die Keratinozyten durch den Vorgang der Apoptose zu Grunde: die lebende Zelle wird in eine kernlose Hornzelle ohne Zellorganellen umgewandelt, wobei Proteasen und Nucleasen den größten Teil der Zellorganellen, die DNA und die RNA der Keratinozyten abbauen (ELIAS et al. 1998; MELNIK 1990).
Innerhalb der Hornschicht bleibt der Zusammenhalt der Hornzellen über Desmosomen (Korneosomen) bestehen (CHAPMAN et al. 1991). Diese unterscheiden sich jedoch in ihrer Proteinzusammensetzung von den Desmosomen in den darunter liegenden Schichten der Epidermis: Während einige Proteine fehlen, werden Desmoglein-1, Desmocollin-1 und Corneodesmosin als zusätzliche Proteine ausgebildet. Durch Untersuchungen von LUNDSTROM et al. (1994) wurde gezeigt, dass vorwiegend Corneodesmosin für den Zusammenhalt der Korneozyten verantwortlich ist. Bei der fortschreitenden epidermalen Differenzierung kann es der massiven Proteaseneinwirkung ebenso wie das Desmoglein-1 und das Desmocollin-1 nicht standhalten, wodurch sich die interzellulären Kontakte auflösen (EGELRUD u. LUNDSTROM 1991; LUNDSTROM u. EGELRUD 1991; EKHOLM et al.
2000). Das Stratum corneum lässt sich aufgrund unterschiedlicher Zellkontakte in zwei Schichten unterteilen: das Stratum corneum compactum, das beim Schwein aus den unteren 4 bis 6 Zellschichten besteht, sowie das Stratum corneum disjunctum, das ungefähr 14 Korneozytenschichten umfasst. Während im Stratum corneum compactum ein enger Zellkontakt durch eine Vielzahl an Korneosomen auf den Korneozyten gewährleistet wird, finden sich im peripher gelegenen Stratum corneum disjunctum nur vereinzelt Korneosomen, wodurch die Korneozyten nur wenig miteinander vernetzt sind (CHAPMAN u. WALSH 1990).
Das Stratum corneum stellt keine „tote“ Schicht dar, sondern ist aufgrund zahlreicher metabolischer Vorgänge (sowohl in den Korneozyten als auch in den extrazellulären Domänen) ein lebendiges Körperelement. Neben kontinuierlich ablaufenden Umwandlungsprozessen bewirken verschiedene Umwelteinwirkungen Reaktionen in der Cutis. So verursacht ein Einwirken von schädlichen Noxen ebenso wie eine Änderung des Wasserhaushaltes auf der Hornschicht eine Signalweiterleitung in die tieferen epidermalen Schichten (DENDA et al. 1998b; ELIAS 2004). Durch komplexe Signalkaskaden, die ihren
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Ursprung sowohl extra- als auch intrazellulär haben, wird die überlebenswichtige Barrierefunktion der Haut aufrechterhalten und die epidermale Differenzierung gewährleistet (ELIAS u. FEINGOLD 2001).
Zu den bekannten extrazellulären Signalmolekülen der Epidermis zählen Cytokine sowie Ca2+- und K+-Ionen. Am besten untersucht sind die Cytokine IL-α, IL-β und der Tumor- Nekrose-Faktor-α (TNF-α). Allesamt stammen sie aus den Keratinozyten. Im Falle einer Hornschichtschädigung werden sie massiv ausgeschüttet, was zu einem Anstieg der Keratinozytenproliferation und zu einer gesteigerten Lipidsynthese führt (IL-1α) (ELIAS et al. 1999; WOOD et al. 1992, 1996, 1997). Daneben spielt die extrazelluläre Ca2+- Konzentration eine entscheidende Rolle bei der epidermalen Differenzierung. Am höchsten ist sie im Stratum granulosum, die niedrigsten Werte finden sich in den basalen Zellschichten (MENON et al. 1985b). Bei Schädigung der epidermalen Schichten kommt es zum Abfall der Ca2+- aber auch der K+-Konzentration, was eine Keratinosomen-Ausschüttung bewirkt, so dass eine schnelle Reaktion des Gewebes auf die Schädigung gewährleistet wird (MENON et al. 1992a; LEE et al. 1994). Intrazellulär existieren zudem verschiedene Transkriptionsfaktoren, die bei der epidermalen Differenzierung regulierend eingreifen können; hierzu zählen die sterolbindenden Proteine (SREBP = Sterol regulatory element binding proteins), die nach Sterolbindung eine Cholesterol- und Fettsäuresynthese bewirken, und die so genannten Nuclear hormon receptors (NHR), die durch Bindung ihrer Liganden (z.B. Glucocorticoide, Östrogene, Androgene) durch fortlaufende Signalkaskaden die epidermale Differenzierung und Proliferation stimulieren (ELIAS u. FEINGOLD 2001;
ELIAS 2005).
Während der fortschreitenden Differenzierung findet auch in der lipidhaltigen Interzellularsubstanz eine Umwandlung statt: Die aus den Keratinosomen freigesetzten Lipide lagern sich zu vielschichtigen Lipidlamellen um, die parallel zur Längsachse der Hornzellen verlaufen und die Korneozyten umschließen (MELNIK 1990). Phospholipide werden abgebaut und Glykolipide werden zu Ceramiden synthetisiert (ELIAS 1981a, 1983).
Außerdem steigt der Gehalt an freien Fettsäuren an. Durch diese Umwandlungsprozesse kommt es zur Anreicherung der für die Barrierefunktion entscheidenden Neutrallipide und Ceramide (ELIAS u. FRIEND 1975; ELIAS u. BROWN 1978; YARDLEY u.
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SUMMERLY 1981; MENON et al. 1985a; ELIAS et al. 1987). In die lipidreiche Interzellulärsubstanz finden sich eingebettet die Korneozyten, die aufgrund der ihnen widerfahrenen Umwandlungsprozesse eine hexagonale Struktur besitzen und mit einem Netzwerk aus Keratinfilamenten gefüllt sind (PLEWIG u. MARPLES 1970; MACKENZIE u.
LINDER 1973). Ihre äußere Abgrenzung wird vom Cornified envelope übernommen (DOWNING 1992). Dieser stellt eine ca. 10 bis 15 nm dicke verhornte Hülle aus verschiedenen quervernetzten Proteinen (v.a. Involucrin, Loricrin sowie SPRP (Small proline rich proteins)) dar, die bereits während der Keratinisierungsphase synthetisiert worden sind (HOHL 1990; HOHL et al. 1991; KALININ et al. 2000, 2001). Vorwiegend ω- Hydroxyceramide sind es, die an seiner äußeren Seite kovalent gebunden sind (SWARTZENDRUBER et al. 1987; WERTZ u. DOWNING 1987). Diese Lipidhülle gewährleistet gemeinsam mit dem Cornified envelope sowie den interzellulären Lipiden die Barrierefunktion des Stratum corneum (STEINERT u. MAREKOV 1999; BEHNE et al.
2000; MEGURO et al. 2000; STEINERT 2000).
Die verhornten Zellen der Hornschicht schilfern nach einem 28 bis 30 Tage dauernden Entwicklungszyklus, ausgehend vom Stratum basale, kontinuierlich ab (MARZULLI 1962;
VINSON et al. 1965; FRITSCH 1988). Neusten Untersuchungen zu Folge geht man davon aus, dass die treibende Kraft der Desquamation pH-Wert-Veränderungen innerhalb der Hornschicht sind. Während in den tieferen Schichten ein neutraler pH-Wert vorherrscht, wird er zu den äußeren Schichten hin immer geringer (ELIAS 2004). Beim Menschen erreicht er somit einen Wert von 5, während Untersuchungen von MEYER und NEURAND (1991) zeigten, dass bei den Haussäugetieren in Abhängigkeit von der Hautlokalisation und der Tierart ein leicht saurer bis neutraler pH-Wert an der Hautoberfläche vorherrscht. Durch diese pH-Wert-Veränderung kommt es zur Aktivierung verschiedener extrazellulären Proteasen, die ihren Ursprung in den Keratinosomen haben (z.B. Stratum corneum Chymotrypsin (SCCE) und Stratum corneum Trypsin (SCTE)). Als Folge dessen lösen sich die bereits beschriebenen interzellulären Zellverbindungen und die Zellen verlieren den Kontakt zu einander (SUZUKI et al. 1993, 1994; EKHOLM et al. 2000).
8 2.1.1.2 Dermis
Die Dermis (Lederhaut) ist der bindegewebige Anteil der Körperdecke, der zwischen der Epidermis und der Unterhaut gelegen ist. Ihre Dicke ist abhängig von der Tierart, dem Alter und der Körpergegend (HABERMEHL 1996). Sie stellt den größten Anteil der Haut dar, zeichnet sich durch eine hohe Elastizität sowie Reißfestigkeit aus und wird von Blutgefäßen, Nerven und Lymphbahnen durchdrungen (FRITSCH 1988; ECKERT 1992; NEUBERT et al.
2001). An der Lederhaut lassen sich histologisch zwei Schichten unterscheiden: ein dünnes, gefäß- und zellreiches, subepidermales Stratum papillare und ein dickes, faserreiches Stratum reticulare. Während Ersteres mit seinen Zellen und der Matrix die Nährstoffversorgung der epidermalen Basalzellen ermöglicht, ist Letzteres für die Zugfestigkeit und Elastizität der Haut verantwortlich (SMOLLE 1998).
2.1.1.3 Hypodermis
Das Bindeglied zwischen der Dermis und den darunter liegenden Faszien, Muskeln und Knochen bildet die innere Schicht der Haut, die Hypodermis, die auch als Unterhaut oder Subcutis bezeichnet wird. Sie stellt ein lockeres Gewebe dar, das läppchenartig aufgebaut ist und von bindegewebigen Septen unterteilt wird. Durch ihre Zusammensetzung aus lockerem Bindegewebe, elastischen Fasern und Fettgewebe gewährleistet sie die Verschieblichkeit der Haut (NEURAND u. SCHWARZ 1969; SCHWARZ et al. 1979; ECKERT 1992). Je stärker sie ausgebildet ist, desto besser ist die Haut gegenüber dem darunter liegenden Gewebe beweglich (HABERMEHL 1996). Ihre Funktion liegt in der Körperisolation gegen thermische Veränderungen, dem Schutz vor mechanischen Noxen sowie der Wasser- und Nährstoffspeicherung. Zudem stellt sie den Ursprungsort für Schweißdrüsen und Haarfollikel dar.
2.1.1.4 Hautgefäße
Die Haut beinhaltet ein tiefes, ein oberflächliches und ein subepitheliales Gefäßnetz, die über vertikal verlaufende Gefäße miteinander verbunden sind. Dadurch wird sowohl die Thermoregulation des Körpers als auch eine Versorgung der einzelnen Hautschichten gewährleistet (FRITSCH 1988; LIEBICH et al. 1999).
9 2.1.1.5 Hautnerven
Die in der Haut befindlichen Nerven lassen sich in Nervenfasergeflechte um Hautanhangsgebilde, mit Nervenfasern versorgte Sinnesrezeptoren sowie freie Nervenendigungen unterteilen. Letztere dienen der Wahrnehmung von Sinnesreizen. Alle in der Haut vorhandenen Nerven sind autonomer oder sensibler Natur (FRITSCH 1988).
2.1.1.6 Hautanhangsgebilde
In der Haut befindet sich eine Reihe von Hautanhangsgebilden, zu denen die Hautdrüsen und die Haare zählen, was beim Menschen rund 1% der Gesamtoberfläche der Haut ausmacht (SCHAEFER u. REDELMEIER 1996).
Die Hautdrüsen unterteilt man bei den Haussäugetieren in die holokrin sezernierenden Talgdrüsen sowie in die apokrin sezernierenden Schweiß- und Duftdrüsen in Form so genannter Knäueldrüsen (MEYER et al. 1978b, c). Im Gegensatz zum Menschen existieren in der Haut der Haussäugetiere keine ekkrinen Schweißdrüsen. Funktionell gibt es zwischen den Schweißdrüsen des Pferdes und des Menschen Parallelen, wobei Equide im Gegensatz zum Menschen große Mengen an Proteinen mit dem Schweiß abgeben (JUNKELMANN 1976).
Aufgrund der gemeinsamen epidermalen Anlage der Hautanhangsgebilde spricht man auch von der epidermalen Trias. Die Sekrete der Hautdrüsen verleihen der Haut einen dünnen Säure- und Fettmantel (LIEBICH et al. 1999). Das Sebum der Talgdrüsen, das vorwiegend aus Wachsestern, Squalen und Triglyceriden besteht, wird in die Haarfollikel abgegeben und über diese auf die Hautoberfläche transportiert (FRITSCH 1988; STEWART u. DOWNING 1991). Bei stark behaarten Tierarten beschränkt sich die Funktion des Sebums vor allem auf die vor Wasser schützende Imprägnierung des Haarkleides (MEYER et al. 1978a). Die Zusammensetzung des Sebums variiert dabei in Abhängigkeit von der Körperregion sowie des Alters, denn mit dem Alter variiert die auf die Talgdrüsen wirkende Hormonproduktion (z.B. die auf die Talgproduktion stimulierend wirkenden Thyreotropin releasing-Hormone und Androgene) (FRITSCH 1988). Mit der Sebumabgabe werden gleichzeitig Vitamin E (Antioxidanz), Androgene und antimikrobielle Stoffe (gegen grampositive Bakterien) an die Hautoberfläche transportiert (BURTENSHAW 1942; CHAI u. CHAI 1980; THIELE et al.
10
1999; ZOUBOULIS et al. 2000; PILGRAM et al. 2001; FLUHR et al. 2003; WILLE u.
KYDONIEUS 2003). Obwohl schon länger bekannt ist, dass die antimikrobielle Wirkung des Sebums auf freie Fettsäuren zurückzuführen ist, konnte kürzlich festgestellt werden, dass es sich dabei vorwiegend um Palmitoleinsäure-Isomere (C16:1) handelt (STONE u. FULGUM 1984; LEYDEN et al. 1987; WILLE u. KYDONIEUS 2003).
Haare findet man über den gesamten Körper verteilt mit Ausnahme der Ballen, wobei sie beim Menschen nur ca. 0,1 – 1 % der Gesamtkörperoberfläche ausmachen (SCHAEFER u.
REDELMEIER 1996). Sie bestehen aus dem peripher gelegenen Haarschaft, dem sichtbaren Teil des Haares, der über den bindegewebigen Haarbulbus (Haarzwiebel) im Haarfollikel steckt und den Haarfollikel wie eine Haube umschließt. Je nach Spezies, Haartyp und Körperregion haben die Haare der Säugetiere einen speziellen Insertionswinkel und eine bestimmte Tiefe, in die sie reichen, um eine effektive Verankerung zu gewährleisten (MEYER et al. 2002). Im Haarfollikel findet das zyklisch stattfindende Haarwachstum statt (EBLING et al. 1991; RANDALL et al. 1991). Es untergliedert sich in die folgenden Phasen:
Anagen- (Wachstums-), Telogen- (Ruhe-) Phase und die kurze zwischengeschaltete Katagen- (Rückbildungs-) Phase. Während der Telogenphase fällt das Haar aus, da sich die Verankerung im Haarfollikel löst (FRITSCH 1988). Dieser Haarwechsel kann im Gegensatz zum Menschen topographisch diffus oder bilateral symmetrisch ablaufen (MEYER et al.
1978a). Die Steuerung des Haarzyklus geschieht durch eine Reihe an endogenen (z.B.
Geschlecht und Alter) und exogenen Faktoren (z.B. Licht und Temperatur). Man unterscheidet bei den Säugetieren anhand einer Vielzahl von morphologischen Parametern (z.B. Länge und Form) Primärhaare von Sekundärhaaren, die eine Vielzahl an Funktionen übernehmen. Unter anderem zählen dazu der mechanische Schutz, die Wärmeisolation sowie der Schutz vor ultravioletten Strahlen. Am Bedeutendsten ist allerdings die Fähigkeit der Hautsensibilität, die bewerkstelligt wird durch ein dichtes Netz an sensorischen Nervenfasern um den Haarfollikel herum (LIEBICH et al. 1999; MEYER et al. 2002).
2.1.2 Hautlipide
Der Gehalt der für die Hautpermeabilität wichtigen Lipide der Epidermis ist unabhängig vom extra-epidermalen Lipidgehalt des Körpers (ANDERSEN u. DIETSCHY 1977; GRUBAUER
11
et al. 1987; MONGER et al. 1988). Von LOWE (1977), MELTON et al. (1987), WERTZ et al. (1987) und FRITSCH (1998), konnte jedoch gezeigt werden, dass ein Defizit an essentiellen Fettsäuren eine Ausnahme darstellt, da durch morphologische Umwandlungsprozesse innerhalb der Epidermis herabgesetzte Barriereeigenschaften der Haut resultieren. Anhand ihrer chemisch-physikalischen Eigenschaften lassen sich die epidermalen Lipide in drei Gruppen einteilen (siehe Abbildung 2).
Abbildung 2: Einteilung der epidermalen Lipide nach LAMPE et al. (1983a)
Hautlipide spielen neben der Permeabilitätsbeeinflussung eine wichtige Rolle bei der Desquamation, dem Zusammenhalt der Hornschicht (Kohäsion) sowie den mechanischen Eigenschaften der Haut (ELIAS et al. 1984). Daher können Störungen der Lipidbiosynthese schwerwiegende Auswirkungen auf den betroffenen Organismus haben, die sich ebenso wie beim Menschen auch bei den Haussäugetieren in Hauterkrankungen wie der Psoriasis, der Xerosis oder der Ichthyosis äußern können (SAINT-LEGER et al. 1989; MOTTA et al. 1994;
FARTASCH 1997).
Epidermale Lipide
Polare Lipide Neutrale Lipide Sphingolipide
Cholesterolsulfat Phospholipide
Sterole n-Alkane
Squalen
Ceramide Glycosphingolipide
Triglyceride freie Fettsäuren
12 2.1.2.1 Polare Lipide
2.1.2.1.1 Cholesterolsulfat
Cholesterolsulfat stellt ein hydrophiles Sterol dar, das im Stratum granulosum am höchsten konzentriert ist (siehe Abbildung 3). Zum Stratum corneum hin fällt es kontinuierlich ab und ist in abschilfernden Hornzellen nur noch in Spuren nachweisbar. Es entsteht durch Sulfatierung von Cholesterol mit 3´-Phosphoadenosin-5´-Phosphosulfat (PAPS) und trägt zur Integration der Lipidlamellen bei.
Durch seine amphiphile Struktur kann es Disulfidbrücken bilden und mittels seiner negativen Ladung ist es in der Lage, mit extrazellulären Ca2+-Ionen die Stabilität der Lipidlamellen zu erhöhen (WILLIAMS 1983; WILLIAMS u. ELIAS 1986). Im Stratum corneum katalysiert die Steroidsulfatase die Hydrolyse von Cholesterolsulfat. Diese Reaktion wird als ein möglicher Mechanismus der Desquamation angesehen, da die interkorneozytären Lipidlamellen destabilisiert und die Korneozytenkohäsion gemindert werden (LAMPE et al.
1983b; ELIAS et al. 1984; LONG et al. 1985; BOUWSTRA et al. 1999b). Daher wird das Verhältnis von Cholesterol zu Cholesterolsulfat, das beim Menschen etwa 10:1 ist, als ein wichtiger Parameter zur Beurteilung der Stratum corneum – Integrität herangezogen (HARATAKE et al. 2006). SERIZAWA et al. (1992) konnten durch vergleichende Untersuchungen zwischen der Haut vom Unter- und Oberarm allerdings zeigen, dass trotz massiver Unterschiede in der Kohäsion an diesen Körperlokalisationen keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Cholesterolsulfatkonzentration bestanden. Durch diese und weitere Untersuchungen von LUNDSTROM und EGELRUD (1988), SERIZAWA et al.
(1992), WILLIAMS et al. (1992b) sowie ZETTERSTEN et al. (1998) wird daher der angenommene Zusammenhang zwischen Cholesterolsulfat und der Stabilität des Stratum corneum in Frage gestellt.
2.1.2.1.2 Phospholipide
Zu den polaren Lipiden zählt neben dem Cholesterolsulfat auch die Gruppe der Phospholipide (siehe Abbildung 3). Hierzu gehören das Phosphatidylethanolamin, -cholin, -serin, das Sphingomyelin sowie das Lysolecithin. Während diese im Stratum granulosum noch zu über 60 % vertreten sind, nimmt ihr Gehalt während der Differenzierung der Zellen zur
13
Hornschicht stetig ab, da eine Aufspaltung in Glycerol und freie Fettsäuren stattfindet. Im Stratum corneum sind sie kaum noch nachweisbar (< 5 % der Lipide) (LAMPE et al. 1983b;
ELIAS u. FEINGOLD 1988; WERTZ u. DOWNING 1991).
Abbildung 3: Strukturformeln polarer, epidermaler Lipide nach MADISON (2003)
2.1.2.2 Neutrale Lipide 2.1.2.2.1 Sterole
Weitere Hauptkomponenten der Hornschicht sind die Sterole (siehe Abbildung 4), zu denen Cholesterol, -ester, Squalen, sowie das bereits beschriebene Cholesterolsulfat gehören. Den größten Anteil daran bildet beim Menschen das freie Cholesterol, das ein Bestandteil aller Zellmembranen ist und für die Membranfluidität verantwortlich ist. In der menschlichen Epidermis finden 21 % der gesamten Cholesterolbiosynthesereaktionen statt, die zudem unabhängig ist von der hepatischen Synthese, da Keratinozyten keine LDL-Rezeptoren (Low density lipoprotein) ausbilden (FEINGOLD 1991). Änderungen der Cholesterolkonzentrationen im Blut haben daher auch keinen Einfluss auf die Cholesterolbiosynthese in der Epidermis. Nachdem Cholesterol in den lebenden Epidermisschichten gebildet wurde, gelangt es durch Exozytose der Keratinosomen in die Hornschicht (ELIAS 1983; HEDBERG et al. 1988a). Es verhindert dort durch Einlagerung zwischen die Fettsäureacylketten in der Membran zum einen eine kristalline Anordnung durch Unterbrechung der hydrophoben Kräfte und zum anderen größere Molekularbewegungen durch sterische Blockierung. Dadurch wird einem Phasenübergang entgegengewirkt; die Membranfluidität wird vermindert (SINGER u. NICOLSON 1972;
BRETSCHER u. RAFF 1975). Cholesterol ist somit an der epidermalen Barrierefunktion und der Desquamation beteiligt. Zudem spielt es eine initiale Rolle im Vitamin D3-Stoffwechsel,
CH3
CH3
O S
CH3 CH3
H3C
O- O O
CH3 O
O O P
CH 3
N+ CH3
CH 3 CH
3 O HO
Cholesterolsulfat Phospholipid (Phosphatidylcholin)
14
da Cholesterol in der Haut durch eine photochemische Reaktion unter UV-Licht-Einfluss in Vitamin D3 umgewandelt werden kann (LEHNINGER et al. 2001).
Sterolester sind im Stratum corneum stärker vertreten als in der lebenden Epidermis, wobei es sich bei den veresterten Fettsäuren vor allem um Ölsäure (C18:1), Palmitoleinsäure (C16:1) und Palmitinsäure (C16:0) handelt (LAMPE et al. 1983a).
Squalen (siehe Abbildung 4) lässt sich sowohl in physiologischer als auch in pathologisch veränderter Humanhaut nachweisen. Seine Herkunft ist allerdings umstritten: Während einerseits angenommen wird, dass es sich dabei um eine Sebumkontamination handelt, wird von LAMPE et al. (1983b) aufgrund seines Vorhandenseins in allen epidermalen Schichten davon ausgegangen, dass es keine Kontamination darstellen kann (MELNIK 1990).
2.1.2.2.2 n-Alkane
Bei den n-Alkanen (siehe Abbildung 4) handelt es sich um eine homologe Reihe lipophiler Stoffe mit unterschiedlicher Kettenlänge von C15-C35 (Maximum bei C25/26) (WILLIAMS u.
ELIAS 1982; BORTZ et al. 1989). N-Alkane stellen keine hauteigenen Lipide dar, sondern sind exogenen Ursprungs (BORTZ et al. 1989). Durch Untersuchungen von FITZGERALD et al. (1975), PETERS und WHITE (1978), SCOTT (1986) sowie LUBACH und KIETZMANN (1991) konnte gezeigt werden, dass eine Applikation von Hexadekan auf die Hautoberfläche neben einer Hautirritation eine epidermale Hyperplasie induziert.
2.1.2.2.3 Freie Fettsäuren und Triglyceride
Weitere neutrale Lipide der Epidermis stellen die freien Fettsäuren sowie die Triglyceride dar (siehe Abbildung 4). Die in den multilamellären Lipidschichten enthaltenen freien Fettsäuren enthalten Acylketten, die vorwiegend aus 14 bis 22 Kohlenstoffatomen bestehen, wobei der Anteil der C16:0- und C18:1-Ketten überwiegt (LAMPE et al. 1983a). Ihr Gehalt erhöht sich während der epidermalen Differenzierung, wobei unklar ist, ob dieser Anstieg im Stratum corneum durch Abbau von Membranlipiden (Phospholipide oder Acylglukosylceramide) oder durch Neusynthese bedingt ist (LAMPE et al. 1983a). Am Übergang vom Stratum
15
granulosum zum Stratum corneum und in den tieferen Schichten der Hornschicht kann die Phospholipid-aufspaltende Phospholipase-A2 nachgewiesen werden, deren Existenz darauf hinweist, dass freie Fettsäuren aus vorhandenen Lipiden synthetisiert werden (MAURO et al.
1998). Diese Vermutung kann durch die Ergebnisse weiterer Untersuchungen gestärkt werden, in denen eine Inhibition der Phospholipase-A2 einen verminderten Gehalt an freien Fettsäuren im Stratum corneum zur Folge hatte (MAO-QIANG et al. 1996).
Für den Aufbau und den Erhalt der Barriere sind die ungesättigten, vor allem die essentiellen Fettsäuren von Bedeutung, wobei besonders auf Linolsäure (C18:2) hingewiesen werden muss:
Durch Veresterung mit der endständigen ω-Hydroxyfettsäure der Ceramide entsteht das für den Zusammenhalt der Lipidlamellen wichtige Ceramid 1 (ZELLMER 2001).
Triglyceride findet man vorwiegend in den tieferen Schichten der Epidermis, wo sie der Energiegewinnung dienen (YARDLEY u. SUMMERLY 1981).
H3C
CH3
H3C CH
3
CH3
CH3 CH3 CH3 CH
3 CH3
Abbildung 4: Strukturformeln epidermaler Neutrallipide nach MADISON (2003)
CH2 O
O
CH3
CH2 O
O
CH3 CH O
O
CH3 O
OH H3C
CH3
CH3
O S
CH3 CH3
H3C
O- O O H
3C CH
3 CH
3
HO CH3
CH 3
H3C
CH3 CH
3
O CH3
CH3
H3C
O
Cholesterolester
Cholesterol Cholesterolsulfat
Freie Fettsäure (Ölsäure) Alkan (Dekan)
Triglycerid (Triolein) Squalen
16 2.1.2.3 Sphingolipide
Sphingolipide lassen sich anhand ihres chemischen Aufbaus in Sphingophospholipide, Ceramide und Glycosphingolipide unterteilen. Sie stellen amphiphile Moleküle dar, die sowohl hydrophile als auch hydrophobe Eigenschaften aufweisen. Der hydrophobe Teil besteht aus einer Fettsäure, welche über ihren Amidrest mit dem Carbonrest des Sphingoidgerüstes (v.a. Sphingosin, Sphinganin, Phytosphingosin) verknüpft ist (siehe Abbildung 5). Da es mindestens 5 verschiedene Sphingoidgrundgerüste gibt, die mit mehr als 20 Fettsäure-Arten und bei den Glycosphingolipiden zusätzlich mit etwa 500 verschiedenen Kohlenhydratresten kombiniert werden können, gibt es eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten (FUTERMAN u. HANNUN 2004). Neben Strukturelementen können Sphingolipide first und second messenger für intrazelluläre Signalkaskaden sein (z.B.
bei der Apoptose). Sie sind zudem beteiligt am Aufbau von Membran-Mikrodomänen, den so genannten Lipid rafts (OKAZAKI et al. 1990; PAGANO 1990; KIM et al. 1991;
ROSENWALD u. PAGANO 1993; FUTERMAN u. HANNUN 2004).
Ceramide, die die größte Fraktion der Hornschichtlipide darstellen, wurden anfangs anhand ihres dünnschichtchromatographischen Trennverhaltens in 6 Gruppen eingeteilt (1, 2, 3, 4/5, 6I und 6II) (WERTZ et al. 1985; WERTZ 2000): je höher die Nummer ist, desto polarer ist das Ceramid und desto weiter läuft das Lipid bei der Dünnschichtchromatographie. Aufgrund ihrer Komplexizität und ständig neu entdeckter Ceramid-Varianten wurde eine neue Nomenklatur vorgeschlagen, die sich an der molekularen Struktur der Ceramide orientiert (MOTTA et al. 1993; ROBSON et al. 1994). Man unterscheidet danach zwischen Derivaten des Phytosphingosins, des Sphingosins und des 6-Hydroxy-Sphingosins (siehe Tabelle 1).
Zusätzliche Kriterien sind es, ob die ω-Hydroxygruppe der amidartig gebundenen Fettsäure verestert ist, und ob die Ceramide in α-Stellung hydroxyliert sind (ZELLMER 2001).
17
Abkürzung Aufbau
H Sphingoidbase: 6-Hydroxy-Sphingosin S Sphingoidbase: Sphingosin
P Sphingoidbase: Phytosphingosin
A Amidartig gebundene Fettsäure ist in α-Stellung hydroxyliert N Amidartig gebundene Fettsäure ist in α-Stellung nicht hydroxyliert O Amidartig gebundene Fettsäure ist in ω-Stellung hydroxyliert
E Amidartig gebundene Fettsäure ist in ω-Stellung mit einer anderen Fettsäure verestert
Tabelle 1: Nomenklatur der Ceramide nach MOTTA et al. (1993) und ROBSON et al. (1994)
Mittels dünnschichtchromatographischer Untersuchungen war es möglich, 7 Ceramidklassen zu identifizieren: Cer [EOS], Cer [NS], Cer [NP], Cer [EOH], Cer [AS], Cer [AP] und Cer [AH] (ROBSON et al. 1994). Allerdings überlappen sich dabei zwei Banden (Cer [NH]
und Cer [AS]). Da diese Ceramide die gleiche Polarität aufweisen, sind sie erst nach Acetylierung trennbar, wobei Cer [NH] den größeren Teil der Bande ausmacht (STEWART u. DOWNING 1999). PONEC et al. (2003) konnten durch Untersuchungen mittels Kernspinresonanz-Spektroskopie, Hochleistungsdünnschichtchromatographie und Gaschromatographie darüber hinaus das Ceramid 9 [EOP] nachweisen.
Der bekannteste Vertreter der Ceramide ist das Ceramid 1 [EOS], das das einfachste Sphingolipid darstellt. Es hat eine amidgebundene langkettige ω-Hydroxyfettsäure, die über ihre ω-Hydroxylgruppe mit einer kürzeren Nichthydroxyfettsäure verestert ist (im Stratum corneum zu 41% Linolsäure). Aufgrund seiner Moleküllänge kann es benachbarte Lipiddoppelschichten der interkorneozytären Lipidlamellen durch asymmetrische Anordnung miteinander verzahnen, wodurch ihm eine wichtige Bedeutung hinsichtlich der Hornschichtstabilisierung, der Struktur der Lipidlamellen sowie der Barrierefunktion zukommt (MELNIK 1990; BOUWSTRA et al. 1998; MCINTOSH 2003).
18
O O
NH O OH O
H3C
O OH
OH
OH OH H3C
Abbildung 5: Strukturformeln epidermaler Sphingolipide nach MADISON (2003)
Bei den Glycosphingolipiden handelt es sich um Moleküle, bei denen die terminale Hydroxylgruppe des Sphingosins bzw. des Phytosphingosins glykosidisch an einen Zuckerrest gebunden ist. Zu dieser Gruppe zählen auch die Cerebroside, die in Abhängigkeit vom konjugierten Zuckerrest in Galactocerebroside und Glucocerebroside unterteilt werden.
Hauptanreicherungsort der Glycosphingolipide sind die Keratinosomen (Lamellar bodies), wo
H3C
O
OH OH NH
O O
H3C
OH
H3C O
NH OH OH H3C
OH OH
H3C O
NH OH OH OH
H3C
OH
H3C O
NH OH OH H3C
OH
H3C O
NH OH OH H3C
OH H3C
OH H3C
O
OH OH NH
O O
H3C O
NH OH OH H3C
OH
H3C O
NH OH OH H3C
H3C
O
H3C OH
OH NH
O O
Ceramid 1 [EOS]
Ceramid 2 [NS] Ceramid 3 [NP]
Ceramid 4 [EOH]
Ceramid 5 [AS] Ceramid 6 [NH]
Ceramid 7 [AP] Ceramid 8 [AH]
Ceramid 9 [EOP]
Acylglycosylceramid
19
sie sich vorwiegend in den dicht gepackten, inneren Lipidlamellen befinden (WERTZ et al.
1984). Die ω-Hydroxyacylketten der Linoleylglukosylceramide durchdringen vollständig eine Lipiddoppelschicht, während Linoleylgruppen in benachbarte Lipiddoppelschichten hineinreichen. Durch eine Verzahnung der übereinander liegenden Lipiddoppelschichten wird die Bildung und Integrität der Lipidlamellen gewährleistet (WERTZ u. DOWNING 1982;
WERTZ et al. 1984, 1987; MCINTOSH 2003). Unter den Glycosphingolipiden ist das Acylglukosylceramid am bedeutendsten, da es etwa die Hälfte aller Glycosphingolipide ausmacht. Es ist ein nicht extrahierbares Ceramid und ermöglicht die Bildung des so genannten Lipid envelope, indem über seine ω-Hydroxygruppe eine kovalente Bindung mit den Hüllproteinen der Korneozyten (Involukrin, Lorikrin und SPRP) eingegangen wird (CHANG et al. 1993; STEINERT u. MAREKOV 1995).
Während der Differenzierung steigt der Anteil der Ceramide mit fortschreitender Verhornung proportional an, während der Glykosphingolipidanteil im Stratum corneum abnimmt.
Physiologischer Weise sind Glykosphingolipide nur in den lebenden Epidermisschichten vorhanden, so dass ihr Vorkommen in den äußeren Schichten der Hornschicht lediglich bei Verhornungsstörungen beobachtet werden kann (YARDLEY u. SUMMERLY 1981). Zu diesen zählt unter anderem die Parakeratose, die auch bei Haussäugetieren anzutreffen ist (CHRISTOPHERS u. BRAUN-FALCO 1970).
Aufgrund der unterschiedlichen Syntheseorte lässt sich ein Verteilungsprofil der epidermalen Lipide erstellen, das für den Menschen in Abbildung 6 dargestellt ist.
20
Abbildung 6: Epidermale Lipidverteilung nach FRITSCH (1998) und LAMPE (1983b)
2.1.3 Transdermaler Stofftransport
Für topisch applizierte Substanzen stellt die Hornschicht die erste und bedeutendste Barriereschicht dar (SCHEUPLEIN 1965). Gelangt eine Substanz in und durch diese hindurch, bezeichnet man dies als Penetration (STÜTTGEN u. SCHAEFER 1974). Dabei können Substanzen das Stratum corneum auf verschiedenen Wegen durchdringen: zum einen transdermal und zum anderen über so genannte „Shunt-Wege“ (siehe Abbildung 7).
Bei der transdermalen Route unterscheidet man zwischen dem Transport durch die Zellen (transzellulär) und dem Transport durch interzelluläre Kanäle (interzellulär) (KARZEL u.
LIEDTKE 1989). Beim transzellulären Weg müssen die Stoffe sowohl durch die Lipidlamellen als auch durch die Keratinozyten hindurch gelangen. Obwohl dieses der
„direkte“ Weg ist, ist es für Stoffe nicht leicht, ihn zu bewältigen, da sowohl hydrophile als auch lipophile Strukturen durchquert werden müssen. Der häufigste Weg durch die Haut ist daher der Interzelluläre zwischen den Korneozyten hindurch (HADGRAFT 2004).
Beim „Shunt-Weg“ gelangt die penetrierende Substanz über die Haarfollikel inklusive der Talg- und/oder ekkrinen Schweißdrüsen in den Körper (LADEMANN et al. 2003). Zudem bestehen die Möglichkeiten, dass Mikroläsionen der Hornschicht Eintrittspforten darstellen oder dass durch Auflösung der desmosomalen Zellkontakte wasserdurchlässige Poren entstehen (MENON u. ELIAS 1997; SCHAEFER u. LADEMANN 2001).
Keratohyalingranula
Odland bodies
Hemidesmosom Desmosom
Stratum corneum Stratum granulosum
Stratum spinosum
Stratum basale
Cholesterolsulfat Phospholipide Neutrale Lipide
Sphingolipide
21
Abbildung 7: Wege des transdermalen Stofftransportes nach HADGRAFT (2001)
Durchdringt die Substanz neben der Hornschicht auch die darunter liegende Cutis, so bezeichnet man diesen Vorgang als Permeation. Bei der Resorption kommt es zusätzlich zu einer Substanzaufnahme in die Lymph- und Blutgefäße (STÜTTGEN u. SCHAEFER 1974).
Der percutane Stofftransport verläuft direkt proportional zum Konzentrationsgradienten der Stoffverteilung (BLANK u. SCHEUPLEIN 1969). Daraus schlossen POTTS et al. (1992), dass der transdermale Fluss vorwiegend durch passive Diffusion erfolgt und den Gesetzmäßigkeiten der Membrandiffusion unterliegt. Ungerichtete Bewegungen der Teilchen führen zu einem Teilchenfluss mit einem Konzentrationsgradienten. Aktive Transport- vorgänge spielen im Stratum corneum nach SCHEUPLEIN (1978) und BARRY (1983) keine Rolle. Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften lässt sich der percutane Fluss durch das 1. Fick´sche Diffusionsgesetz beschreiben:
Diese Form des 1. Fick´schen Diffusionsgesetzes gilt nur für Experimente unter Infinite- Dose-Bedingungen. Von diesen spricht man, wenn die Testsubstanz in so hoher
x
c K D A t
J m ⋅ ⋅∆
=
⋅
∆
= ∆ [mol · s-1 · cm-2] (1)
J: Flux D: Diffusionskoeffizient m: Masse K: Verteilungskoeffizient
t: Zeit c: Konzentration
A: Fläche x: Diffusionsstrecke
transzellulär interzellulär follikulär glandulär
22
Konzentration auf die Haut aufgetragen wird, dass die maximale Absorptionsrate über die gesamte Versuchsdauer aufrechterhalten wird.
Handelt es sich dagegen um Finite-Dose-Bedingungen (d.h. die maximale Absorptionsrate ist nur für kurze Zeit vorhanden), ändert sich der maximale Flux (Jmax) entsprechend der folgenden Gleichung nach (BARRY 2002):
x
c K
J D⋅ ⋅∆
=1,85* *
max δ
[mol · s-1 · cm-2] (2)
δ : Dicke eines dünnen Substanzvorrates D: Diffusionskoeffizient auf der Membranoberfläche K: Verteilungskoeffizient
J: Flux c: Konzentration
x: Diffusionsstrecke
Da die interzelluläre Route für die meisten Substanzen den Hauptweg der Permeation darstellt, ist der tatsächlich zurückgelegte Weg mit geschätzten 500 µm länger als die Dicke des Stratum corneum (ca. 20 µm) (HADGRAFT 2004). Die tatsächliche Diffusionsstrecke
„x“ ist unbekannt, weswegen (SCHEUPLEIN 1976) den so genannten Papp-Wert verwendet:
Papp : scheinbarer Permationskoeffizient D: Diffusionskoeffizient K: Verteilungskoeffizient x: Diffusionsstrecke
Damit ergibt sich aus dem 1. Fick´schen Diffusionsgesetz:
J = A t
m
⋅
∆
∆ = Papp · ∆c [mol · s-1 · cm-2] (4)
J: Flux t: Zeit
m: Masse A: Fläche
c: Konzentration Papp : scheinbarer Permeationskoeffizient Papp =
x K D⋅
[cm · s-1] (3)
23
Der Papp-Wert einer Substanz am Übergang von einer wässrigen Donorphase in eine lipophile Akzeptorphase kann auf empirischer Basis geschätzt werden (POTTS u. GUY 1992):
K MW
x cm
P
OW
app 2,3 0,71log 0,0061
log 1 =− + −
⋅ − (5)
Dadurch ergibt sich, dass Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht langsamer durch die Haut diffundieren, während Substanzen mit einer guten Löslichkeit in Wasser und Öl sehr gut durch die Haut gelangen. Letztere sind Substanzen mit einem niedrigen Schmelzpunkt (HADGRAFT 2004). Obwohl das 1. Fick´sche Diffusionsgesetz sowie die Schätzung des Papp-Wertes nach POTTS und GUY (1992) den Anschein erwecken, dass ein hoher Verteilungskoeffizient einen hohen transdermalen Stofftransport bedingt, ist dies nicht der Fall, denn große Verteilungskoeffizienten bringen Moleküle mit sich, die eine relativ geringe Löslichkeit haben. Ein optimales Verteilungsverhalten legen dagegen die Moleküle an den Tag, die einen log KOW von 1 bis 3 aufweisen (HADGRAFT 2004).
Das 1. Fick´sche Diffusionsgesetz beschreibt den Diffusionsstrom bei einer gegebenen Konzentrationsverteilung eines diffusionsfähigen Moleküls mit bekanntem Diffusions- koeffizienten. Da sich die Konzentrationen durch die stattfindenden Diffusionsströme verändern, kann das 1. Fick´sche Diffusionsgesetz in das 2. Fick´sche Diffusionsgesetz umgewandelt werden. Durch diese partielle Differentialgleichung 2. Ordnung wird die zeitabhängige Veränderung der Molekülkonzentration in der Membran bei gegebenem Diffusionskoeffizienten beschrieben (TANG et al. 2002):
2
2
x D c t c
∂
⋅∂
=
∂
∂ (6)
c: Konzentration D: Diffusionskoeffizient
t: Zeit x: betrachtete Stelle in der Membran
Papp : scheinbarer Permeationskoeffizient MW: Molekulargewicht KOW: Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient x: Diffusionsstrecke
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2.1.4 Einfluss der Haut auf den transdermalen Stofftransport
Wie bereits beschrieben stellt nicht die lebende Epidermis, sondern das intakte Stratum corneum mit seiner lipidreichen Interzellularsubstanz die wichtigste Permeabilitätsbarriere der Haut dar (SCHEUPLEIN 1965; GRAY u. YARDLEY 1975a, b; STÜTTGEN 1990;
WESTER u. MAIBACH 1992). Von SCHEUPLEIN (1966) konnte gezeigt werden, dass Wasser die Hornschicht 1000-mal schlechter durchdringt als die Epidermis und Dermis.
Das Stratum corneum stellt keine einseitige Barriere für Substanzen aus der Umwelt dar, sondern verhindert gleichzeitig einen Verlust körpereigener Substanzen. Bereits 1927 konnte von BENEDICT und BENEDICT (1927) festgestellt werden, dass der Körper Wasser über die Haut kontinuierlich abgibt. Der transepidermale Wasserverlust ist abhängig von Umgebungstemperaturen, der umgebenden Luftfeuchtigkeit sowie von Luftbewegungen auf der Hautoberfläche (SCHWINDT et al. 1998):
x D c
TEWL ∆
⋅
−
= [g · s-1 · cm-2] (7)
TEWL: transepidermaler Wasserverlust D: Diffusionskoeffizient
c: Konzentration x: Diffusionsstrecke
Ohne die lebensnotwendigen Lipide der Hornschicht würde der Wasserverlust eines Körpers um das 2500-fache und bei Fehlen der Hornschicht sogar um das 4-Millionenfache zunehmen (LANDMANN 1988). Daher dient der TEWL als ein Parameter für die Beurteilung der Hautintegrität (GRUBAUER et al. 1989). Durch Lipidextraktionsversuche konnte gezeigt werden, dass eine Lipidreduktion der Epidermis zu einem dramatischen Permeabilitätsanstieg führt (BERENSON u. BURCH 1951; ONKEN u. MOYER 1963; MATOLTSY et al. 1968;
SCHEUPLEIN u. ROSS 1970; SWEENEY u. DOWNING 1970; BRONAUGH u. FRANZ 1986). ELIAS et al. (1981) konnten durch Penetrationsversuche mit Salicylsäure zeigen, dass bereits der Gesamtlipidgehalt ein kritischer Faktor der dermalen Permeabilität ist; je höher das Lipidgewicht war, desto weniger Salicylsäure durchdrang die Haut.
Der für die Barrierefunktion wichtige Aufbau der Hornschicht lässt sich durch das Brick-and- Mortar-Model beschreiben: die ziegelsteinartigen, lipidarmen Korneozyten sind in einem interzellulären, hydrophoben Lipidmörtel eingebettet, der sich hauptsächlich aus Ceramiden
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(45-50 %), Cholesterol (25 %) und freien Fettsäuren (10-15 %) zusammensetzt (ELIAS 1981b, 1983; WILLIAMS u. ELIAS 1987; MCINTOSH et al. 1996). Durch die Korneozyten erlangt die Hornschicht ihre physikalische Stabilität, während die interzellulären Lipide eine Barriere für Wasser und gelöste Stoffe bilden. LAW et al. (1995), WERTZ (2000) sowie MADISON (2003) stellten fest, dass die Lipidkomposition neben dem Gesamtlipidgehalt von entscheidender Bedeutung ist: Hauptverantwortlich für die Barrierefunktion sind demnach die bereits beschriebenen Hauptbestandteile des Lipidmörtels: Ceramide, Cholesterol und freie Fettsäuren (MAO-QIANG et al. 1993). Die Barriereeigenschaft des Stratum corneum wird durch die folgenden Faktoren unterstützt (LANDMANN 1988):
• Stabilisierung der Lipidlamellen durch den strukturellen Aufbau von Sphingolipiden und Cholesterol
• Hohe molekulare Ordnung der Interzellularsubstanz durch langkettige gesättigte Fettsäuren
• Verhinderung der Phasentransition der festkristallinen Lipidschicht durch die gegenüber dem Körperinneren verminderte Hautoberflächentemperatur.
Mittels Elektronenmikroskopie und Röntgenbeugungsanalyse konnte gezeigt werden, dass interzelluläre Lipidlamellen in der gesamten Hornschicht verbreitet sind (ELIAS u. FRIEND 1975; WERTZ et al. 1987; WHITE et al. 1988; BOUWSTRA et al. 1991). Sie bilden eine Vielzahl lamellärer Blätter mit einer glatten Oberfläche (ELIAS et al. 1977a, b). Neuesten Untersuchungen zu Folge geht man davon aus, dass die Lipide zwei kristalline, lamelläre Phasen mit einer Periodizität von 6,4 nm und 13,4 nm Dicke ausbilden, die durch eine flüssige Phase voneinander getrennt werden. Dabei tragen Cholesterol und Ceramid 1 [EOS]
entscheidend zur Bildung dieser Formation bei (BOUWSTRA et al. 2001).
Entgegen früherer Annahmen von (STRAUSS et al. 1985) wird aufgrund der Untersuchungen von FLUHR et al. (2003) davon ausgegangen, dass Sebumlipide die epidermale Barrierefunktion unbeeinflusst lassen.
Durch genaue Betrachtung des 1. Fick´schen Diffusionsgesetzes wird schnell klar, dass die Dicke der Haut bzw. der Hornschicht eine große Rolle bei der transdermalen Barrierefunktion spielt. MARZULLI et al. (1969) und BRONAUGH et al. (1982a) führten bereits die in
