3 Material und Methoden
3.2 Methoden
3.2.3 Validierung der HPLC für die untersuchten Testsubstanzen
3.2.3.3 Detektions- und Quantifizierungsgrenze
Die Detektionsgrenze (Limit of detection, LOD) ist definiert als die niedrigste Analytenkonzentration, die ein vom Leerwert unterscheidbares Instrumentensignal ergibt und somit qualitativ identifiziert werden kann. Ihre Bestimmung erfolgte mittels Kalibrationskurvenmethode nach DIN 32645 (1994).
Die Quantifizierungsgrenze (Limit of quantification, LOQ) ist definiert als die kleinste Analytenkonzentration, die mit gegebener Präzision und Richtigkeit detektiert werden kann (KROMIDAS 1999; DIN 32645 1994).
Die ermittelten Detektions- und Quantifizierungsgrenzen der im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Testsubstanzen sind in Tabelle 6 dargestellt.
Testsubstanz Detektionsgrenze Tabelle 6: Detektions- und Quantifzierungsgrenzen der Analyten
42 3.2.3.4 Richtigkeit
Die Richtigkeit einer Methode beschreibt die Übereinstimmung zwischen einem mittleren Messergebnis und dem erwarteten Referenzwert und wurde ermittelt, indem gespikte Leermatrixproben der höchsten (High quality control standard, HQS) sowie der niedrigsten (Low quality control standard, LQS) Kalibrationskonzentration an drei verschiedenen Tagen chromatographisch quantifiziert wurden. Als akzeptabel galten Abweichungen der HQS vom erwarteten Wert um bis zu 15 %, bei der LQS um bis zu 20 % (U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES 2001).
Zur Überprüfung der Richtigkeit sind die niedrigsten und höchsten Kalibrationskonzentrationen (LQS, HQS) jedes Analyten untersucht worden. Tabelle 7 und 8 zeigen die LQS und HQS der Analyten ebenso wie die Ergebnisse der Prüfung auf Richtigkeit durch Angabe der relativen Abweichung für jeden Testtag.
Testsubstanz Erwartete Tabelle 7: Relative Abweichung der niedrigsten Kalibrationskonzentrationen (LQS) der Testsubstanzen zur Überprüfung der Richtigkeit der Methode
43
Flufenaminsäure 10.000 1
2
Indomethacin 10.000 1
2
Tabelle 8: Relative Abweichung der höchsten Kalibrationskonzentrationen (HQS) der Testsubstanzen zur Überprüfung der Richtigkeit der Methode
Da gemäß U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES (2001) Schwankungen der LQS um 20 % und der HQS um 15 % vom Mittelwert akzeptabel sind, ist die Richtigkeit für die untersuchten Analytenkonzentrationen gegeben.
3.2.3.5 Präzision bzw. Reproduzierbarkeit
Bei der Präzision, das heißt der Übereinstimmung zwischen wiederholten Messungen identischer Proben, unterscheidet man zwischen der Wiederholpräzision (Tagespräzision, Intraday batch reproducibility) und der Zwischenpräzision (Interday batch reproducibility).
Ihre Überprüfung erfolgte durch chromatographische Quantifizierung der LQS und der HQS an mindestens drei unterschiedlichen Tagen. Die Präzision wurde nach HERBOLD und SCHMITT (2000) berechnet (siehe Formel 8 und 9).
44
Sw: Wiederholpräzision s: Standardabweichung
Sb: Zwischenpräzision f : Freiheitsgrade
X : Mittelwert
Dabei waren gemäß LINDNER und WAINER (1998) Abweichungen der HQS bis 10 % und der LQS bis 20 % vom gemessenen Mittelwert zulässig.
Die Ergebnisse der Überprüfung der Intra- und Interday-Präzision sind in Tabelle 9 Tabelle 9: Ergebnisse der Intra- und Interday-Präzision der HQS und LQS jedes Analyten
In Anlehnung an LINDNER und WAINER (1998) werden die vorgegebenen Richtwerte von 10 % bei den HQS und 20 % bei den LQS eingehalten, so dass die Präzision der Methoden bestätigt wird.
3.2.3.6 Stabilität der Analyten
Die Stabilität jedes Analyten wurde über den gesamten Zeitraum der Versuchsdurchführung, Lagerung und Analytik durch einen Stabilitätstest überprüft (siehe Abbildung 14). Hierfür
Sw =
45
wurde die Akzeptorkammer der Diffusionszelle mit einer mittleren Testsubstanzkonzentration befüllt und bei den verschiedenen Tierhäuten über 30 Stunden inkubiert (die Versuchsbedingungen entsprachen denen der normal durchgeführten Versuche). Bei Versuchsbeginn wurden jeweils 18 Aliquots entnommen. Von diesen wurden 6 direkt in der HPLC auf ihre Konzentration hin untersucht, während jeweils 6 weitere Proben über 30 Stunden im Kühlschrank bei 4°C bzw. bei Zimmertemperatur gelagert und erst dann in der HPLC quantifiziert wurden. Nach 30 Stunden wurden aus jeder Franzzelle 6 weitere Proben entnommen und in der HPLC analysiert, nachdem sie dieselben Lagerungsbedingungen erfahren hatten wie die Proben der später durchgeführten Diffusionsversuche.
Abbildung 14: Schematische Darstellung der Stabilitätsprüfung der Testsubstanzen
Die Messwerte wurden auf Normalverteilung, Ausreißer, Trend und Varianzhomogenität (F-Test) untersucht. Zusätzlich erfolgte ein Vergleich der Mittelwerte der Messreihen mittels T-Test bei einseitiger Fragestellung. Die Stabilität war gewährleistet, wenn die T-Tests keine statistisch signifikanten Unterschiede ergaben, oder ein auftretender signifikanter Abfall der Messwerte innerhalb der Grenzen der Zwischenpräzision lag. Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchung sind in Tabelle 10 zusammengefasst.
6x
HPLC
direkt 30 Stunden
bei 4°C 30 Stunden bei
Zimmer-temperatur
6x 6x 6x
Lagerungsdauer und -bedingungen entsprechend der Proben im Hauptversuch 30 Stunden
0 Stunden
46 Flufenaminsäure 1.000 Ohne Haut
Hund
Ibuprofen 10.000 Ohne Haut
Hund
Indomethacin 3.500 Ohne Haut
Hund
Salicylsäure 50.000 Ohne Haut
Hund Tabelle 10: Ergebnisse der Stabilitätsprüfung jedes Analyten durch Angabe der Abweichungen vom erwarteten Messwert in %; *: p < 0,05
Anhand der Tabelle 10 wird deutlich, dass die Analytenkonzentrationen nach 30 Stunden Schwankungen unterliegen. Diese Schwankungen sind jedoch entweder nicht signifikant oder sie liegen wie im Fall von Ibuprofen (inkubiert mit Hunde- und Rinderhaut über 30 Stunden in der Franzzelle oder mit Rinderhaut über 30 Stunden bei Zimmertemperatur) unterhalb der Interday-Präzision von 3 bis 8 % (siehe Tabelle 9).
3.2.4 Lipidanalytik
Für die Untersuchung der epidermalen Lipidprofile wurden von jeder Tierart 6 bis 15 Individuen untersucht, wobei aufgrund der Materialbeschränkung nicht alle in den Diffusionsversuchen eingesetzten Tierhäute analysiert werden konnten.
47 3.2.4.1 Hitzeseparierung der Epidermis
Um die Epidermis zu isolieren, wurde die Haut nach einer modifizierten Methode nach KLIGMAN und CHRISTOPHERS (1963) hitzebehandelt: Nach vorsichtigem Entfernen des Haarkleides mit einer Schermaschine wurde die Haut mit der epidermalen Seite für 2 Minuten auf eine 60°C-heiße, entfettete Heizplatte gelegt. Nach dieser Zeit wurde die Epidermis mit einer entfetteten Pinzette vollständig abpräpariert.
3.2.4.2 Lipidextraktion
Um das Trockengewicht der verwendeten Häute zu erhalten, wurden sie über 3 bis 7 Tage im Exsikkator bei 30°C getrocknet, bis das Probengewicht Konstanz aufwies. Für die weitere Behandlung wurden 100 mg der gewonnenen Trockensubstanz in entfettete Reagenzgläser abgewogen und mittels Chloroform-Methanol-Gemisch (2/1 [V/V]) nach einer modifizierten Methode nach FOLCH et al. (1957) extrahiert, wobei auch der Gesamtlipidgehalt der Proben erfasst wurde (siehe Abbildung 15). Die Extrakte wurden bis zur weiteren Verwendung bei einer Temperatur von -20°C luftdicht verschlossen und lichtgeschützt gelagert.
48
Abbildung 15: Lipidextraktion nach FOLCH et al. (1957) (modifiziert)
Abwiegen von 100 mg Probentrockensubstanz in ein entfettetes Reagenzglas
Hydratation durch Zugabe von 500 µl NaCl-Lösung (300 mM) für 15 Min.
Delipidierung durch Zugabe von 5 ml Chloroform-Methanol-Gemisch (2/1 [V/V]) und 2 Std. rütteln bei 1000 U
Zugabe von 100 µl NaCl-Lösung (300 mM) und Inkubation für 10 Min.
Zentrifugation bei 2500 rpm für 10 Min. bei Raumtemperatur, dabei bilden sich 2 Phasen:
Abpipettieren (3,5 ml) und Filtration durch methanolgetränkte
Watte in entfettetes, gewogenes Reagenzglas
Evaporieren des Lösungsmittels unter Stickstoffbegasung
Wiederaufnahme der eingedampften Probe in 250 µl Chloroform-Methanol-Gemisch
(2/1 [V/V])
Überführung in Gewindeflaschen, luftdichter Verschluss und
Lagerung bei -20°C unter Lichtabschluss Wägen des Reagenzglases zur
Erfassung des Gesamtlipidgehaltes
Untere Phase: mit Lipiden im organischen Lösungsmittel Obere Phase:
wässrig
49 3.2.4.3 Hochleistungsdünnschichtchromatographie
Zur Auftrennung der einzelnen Lipidfraktionen im Lipidextrakt wurde die planare HPTLC (High-performance thin-layer chromatography) verwendet. Die HPTLC ist eine Flüssigkeitschromatographie, bei der die stationäre Phase auf einem ebenen Träger (Glasplatte mit Silicagel) fixiert ist. Eine Trennung der Testsubstanzen erfolgt ebenso wie bei der HPLC durch unterschiedliche Wechselwirkungen (Affinitäten) mit der mobilen und der stationären Phase. Eine Identifikation der entsprechenden Lipide kann aufgrund der Laufstrecken der Substanz relativ zur Laufstrecke der Lösungsmittelfront durchgeführt werden; die so ermittelte Größe bezeichnet man als Rf-Wert (Retarding-factor, Relate to front-factor bzw. Retentionsfaktor; siehe Abbildung 16).
Abbildung 16: Schematische Darstellung des Rf-Wertes
3.2.4.4 Versuchsdurchführung 3.2.4.4.1 Plattenvorbereitung
Auf den HPTLC-Silicagel-Platten (10 x 10 cm) wurden zunächst mit einem Bleistift auf zwei gegenüberliegenden Seiten auf einer Parallele 4 mm vom Plattenrand und im Abstand von 5 mm voneinander entfernt die späteren Auftragungspunkte der Proben markiert. Beim anschließenden “Precleaning” wurde die Platte zur Beseitigung von Schmutzpartikeln mittels
Auftragungspunkt Substanz
Fließmittelfront
a b
Laufrichtung des Fließmittels
Rf = b/a
a: Laufstrecke der Lösungsmittelfront b: Laufstrecke der Substanz
.
50
Methanol gereinigt, indem man dieses von den zwei markierten Seiten her über die Platte diffundieren ließ. Zur Entfernung des auf der Plattenoberfläche absorbierten Wassers wurde die HPTLC-Platte für 30 Minuten bei 120°C im Trockenschrank “aktiviert”. Nach dem Abkühlen der HPTLC-Platte auf Raumtemperatur wurden jeweils 1 µl der Lipidextrakte bzw.
Kalibrationsstandards auf die Markierungen aufgetragen. Somit konnten pro Seite der HPTLC-Platte vier Lipidstandardgemische (Konzentrationen: 1,875 µg/µl; 1,250 µg/µl;
0,625 µg/µl; 0,125 µg/µl) gemeinsam mit 7 Proben (in Doppelbestimmung) aufgetragen werden. Das Lipidstandardgemisch bestand dabei aus folgenden Einzelkomponenten:
Phosphatidylcholin (Phospholipid), Cholesterolsulfat, Galactocerebroside, Ceramid 4 [EOH], Ceramid 3 [NP], Cholesterol, Ölsäure (freie Fettsäure), Triolein (Triglycerid) und Cholesterolester.
3.2.4.4.2 Kammervorbereitung
Um eine Kontamination der HPTLC-Platte mit Schmutzpartikeln zu minimieren, wurde die Entwicklungskammer vollständig mit Methanol gereinigt. Zur Erzeugung eines optimalen Milieus in der Entwicklungskammer befand sich auf deren Boden ein saugfähiges Labortuch, was mit dem entsprechenden Fließmittel vollständig durchtränkt war. Die Kammer wurde mittels Wasserwaage horizontal ausgerichtet.
Vor dem eigentlichen Trennvorgang wurde (zur Erzeugung des gewünschten Milieus in der Kammer) der Kammerdeckel nach dem Einsetzen der HPTLC-Platte für eine Minute geschlossen.
3.2.4.4.3 Trennvorgang
Für eine adäquate Auftrennung der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Lipide wurde ein Fließmittelsystem aus drei Fließmitteln verwendet (siehe Tabelle 11). Jedes Fließmittel diffundierte entsprechend den Auftragungspunkten von zwei Seiten über die HPTLC-Platte.
Zwischen den einzelnen Trennvorgängen lag jeweils eine 5-minütige Trocknungszeit der HPTLC-Platte bei Raumtemperatur.
51
Reihenfolge der Fließmittel Bestandteile Anteil [%] Laufstrecke [cm]
1
Tabelle 11: Ermitteltes Fließmittelsystem für die HPTLC epidermaler Lipide
3.2.4.4.4 Nachbearbeitung und Auswertung
Nach dem Lauf des letzten Fließmittels wurde die HPTLC-Platte für 15 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurde sie über 30 Sekunden in einem Tauchbad mit Derivatisierungsreagenz behandelt. Dieses bestand aus 10 g Kupfersulfatpentahydrat, 10 g Phosphorsäure (85 %) und 80 g Aqua bidestillata. Durch ein 30-minütiges Erhitzen auf einer 180°C heißen Heizplatte wurden die Lipidbanden durch Veraschung visualisiert und detektiert. Für die densitometrische Auswertung wurden die HPTLC-Platten nach dem Abkühlen auf dem Flachbettscanner “Highscan” eingescannt. Die Lipidbanden wurden mit Hilfe der Computer Software Scion-Image® sowohl qualitativ als auch quantitativ gegen die mit auf die HPTLC-Platte aufgetragenen Lipidstandards analysiert. Für eine optimale Auswertung der Lipidbanden, wurde zunächst eine Hintergrundsubtraktion durchgeführt.
Dafür wurde in der Systemeinstellung “Process” die Funktion “Subtract Background”
ausgewählt, in der wiederum die Einstellungen “Rolling ball” (Radius 130) und “1 D Horizontal” nacheinander angewandt wurden, um Störbanden zu entfernen. Die Graustufen der Lipidbanden einer Probe wurden densitometrisch analysiert und mittels Microsoft Excel® graphisch in Form der Fläche unter der Kurve (AUC; area under the curve) dargestellt (siehe Abbildung 17). Überstieg die Konzentration einzelner Lipidbanden die höchste Kalibrationskonzentration, so wurden die entsprechenden Lipidextrakte verdünnt und erneut auf der HPTLC-Platte analysiert.
Die ermittelten Lipidmengen in 1 µl aufgetragenem Lipidextrakt wurden auf 100 mg Trockensubstanz umgerechnet, um einen Vergleich zwischen den Untersuchungsergebnissen
52
zu ermöglichen. Zusätzlich wurde der Anteil der quantifizierbaren Lipide am Gesamtlipidgehalt der Epidermis berechnet.
Abbildung 17: Beispielhafte Auswertung der Lipidbanden eines Lipidstandardgemisches. Die Punkte markieren jeweils den Anfang sowie das Ende der ausgewerteten AUC (1: Phospholipide, 2: Cholesterolsulfat, 3 und 4:
Galactocerebroside, 5: Ceramid 4 [EOH], 6: Ceramid 3 [NP], 7: Cholesterol, 8: freie Fettsäuren, 9: Triglyceride, 10: Cholesterolester)
3.2.5 Histologische Untersuchung
Zur Erfassung histologischer Parameter wurden aus den Häuten Horizontal- und Vertikalschnitte hergestellt, die mittels Hämatoxilin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) angefärbt wurden. Somit standen sowohl Längs- als auch Querschnitte der Haut für die weiteren Untersuchungen zur Verfügung. Pro Tierart wurde dabei die Haut von drei Individuen für die Histologie herangezogen.
3.2.5.1 Versuchsdurchführung
Aus jeder Haut wurde mittels Skalpell eine Probe von 7 mm Durchmesser heraus präpariert und in Tissue freezing Medium eingebettet. Nach einem kurzen Tauchbad in flüssigem Stickstoff (30 Sekunden) erfolgte bis zum Schneideprozess die Lagerung bei -80°C. Die im Kryostatschneider gewonnenen 8 µm dicken Horizontal- und Vertikalschnitte wurden angefärbt (siehe Abbildung 18) und lichtmikroskopisch auf folgende Parameter untersucht:
0
53
Dicke der lebenden Epidermis (ohne Stratum corneum), Dicke des Stratum corneum, Haarfollikelanzahl, -durchmesser und –eindringtiefe (Tabelle 12). Zusätzlich wurde die Anordnung der Haarfollikel in den untersuchten Hautquerschnitten beurteilt. Die Dickenmessungen der Epidermis und der Hornschicht ebenso wie das Erfassen der Eindringtiefe der Haarfollikel erfolgten, indem senkrecht zur Hautoberfläche (bzw. im Fall der lebenden Epidermis zur Oberfläche des Stratum granulosum) in die Tiefe gemessen wurden. Da die Haarfollikeldurchmesser vom Haarfollikelursprung bis zum Austrittsort Größenänderungen unterworfen sind, wurden die Haarfollikel auf ihrer halben Länge vermessen. Die Auswertung, d.h. Messung oder Auszählung einzelner Parameter erfolgte entsprechend dem Standardraster der Zeiss®-Software KS400.
Aufgrund der Messergebnisse der lebenden Epidermis sowie des Stratum corneum ist durch Addition beider Werte die Berechnung der Gesamtdicke der Epidermis möglich. Aus dem so erhaltenen Wert kann wiederum die relative Dicke der Hornschicht (in % der Gesamtdicke der Epidermis einschließlich der Hornschicht) abgeleitet werden.
Untersuchter Parameter Art des Hautschnittes
Anzahl der Hautschnitte
Stichproben-anzahl Dicke des Stratum corneum/der
Epidermis
Querschnitt 10 100
Anzahl der Haarfollikel auf 1 cm2
Querschnitt 5 ---
Durchmesser der Haarfollikel Querschnitt 5 75
Eindringtiefe der Haarfollikel Längsschnitt 5 75
Tabelle 12: Übersicht der untersuchten histologischen Parameter
54
Abbildung 18: Schematische Darstellung der Hämatoxilin-Eosin-Färbung
3.2.6 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte unter Verwendung der Software GraphPad Prism 4.01®.
Absteigende Alkoholreihe (100 %, 96 %, 90 %, 80 %, 70 %)
Jeweils 2 Minuten
Destilliertes Wasser 3 Minuten
Hämalaun (frisch filtriert) 5-12 Minuten
Salzsaurer Alkohol 20 Sekunden
Fließendes Leitungswasser 15 Minuten
Eosin (1 %-ig in Aqua dest. frisch angesetzt und Eisessig: 1 Tr./100 ml)
0,5-2 Minuten
Deckgläschen mittels Entellam auf dem Objektträger fixieren Aufsteigende Alkoholreihe (70 %, 80 %, 90 %, 96 %, 100 %)
20 Sekunden Tauchbad
Bläuen
Eindecken Tauchbad
55 3.2.6.1 Diffusionsversuche
Aus den in den Diffusionsversuchen ermittelten Ergebnissen wurden Graphiken erstellt, in der die Mittelwerte der permeierten Substanzmengen pro cm² gegen die Zeit aufgetragen wurden, so dass die Ermittlung der Lag-Zeit und der Papp-Werte möglich war.
Aus den so ermittelten Ergebnissen wurden für jedes Tier der Mittelwert sowie die Standardabweichung berechnet. Diese wurden mittels One-way-ANOVA-Test statistisch analysiert, wobei ein Konfidenzintervall von 95 % angenommen wurde. Bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) kleiner als 5 %, wurde als Post-Hoc-Test der Tukey´s-Multiple-Comparison-Test angewandt, der die Mittelwerte aller Spezies einzeln gegeneinander verglich.
3.2.6.2 Epidermale Lipidanalytik
Eine statistische Untersuchung der Versuchsergebnisse der Lipidanalytik erfolgte, indem alle Lipidmittelwerte der Einzelindividuen einer Spezies mittels One-way-ANOVA-Test bei einem Konfidenzintervall von 95 % analysiert wurden. Bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) kleiner als 5 %, wurde als Post-Hoc-Test der Tukey´s-Multiple-Comparison-Test angewandt, der die Mittelwerte aller Spezies einzeln gegeneinander verglich.
3.2.7 Hierarchische Clusteranalyse
Um herauszufinden, ob sich innerhalb der untersuchten Versuchsergebnisse (Histolologie und epidermale Lipidanalytik) Gruppen bilden lassen, wurde jeweils eine hierarchische Clusteranalyse durchgeführt. Diese teilt die einzelnen Individuen in Gruppen ein, die sich hinsichtlich der untersuchten Faktoren ähneln.
Die hierarchische Clusteranalyse der epidermalen Lipidgehalte und der histologischen Parameter wurde durchgeführt, indem zunächst eine Mittelwertnormalisierung der einzelnen Parameter durchgeführt wurde. Im Anschluss daran wurde die Clustermethode „centroid linking“ angewandt.
Bei der Lipidanalytik wurde die Fraktion der Triglyceride von der Clusteranalyse ausgeschlossen, da angenommen wird, dass sie größtenteils eine exogene Kontamination ohne Einfluss auf die Permeation darstellen (HEDBERG et al. 1988a, b).
56 4 Ergebnisteil
4.1 In-vitro-Diffusionsversuche 4.1.1 Flufenaminsäure-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Flufenaminsäure sind in Anhangstabelle 1 und 2 dargestellt. Abbildung 19 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Flufenaminsäure-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 20 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 19). In Tabelle 13 sind die in den Diffusionsversuchen mit Flufenaminsäure ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahme [Stunden]
Permeierte Menge an Flufenaminsäure [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 19: Interspeziesvergleich der Flufenaminsäure-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 1,4 mg Flufenaminsäure;
Ratte (n = 4), Rind (n = 8), Hund (n = 4), Schwein (n = 7)
Von den 1,4 mg der topisch applizierten Flufenaminsäure sind nach 30 Stunden bei der Ratte 8,2 %, beim Rind 4,3 %, beim Hund 3,9 % und beim Schwein 3 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
57
Abbildung 20: Auszug aus Abbildung 19; Interspeziesvergleich der Flufenaminsäure-Permeation über die Dauer von 8 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 1,4 mg intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Flufenaminsäure-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation von 1,4 mg Flufenaminsäure ermittelt;
Ratte (n = 4), Rind (n = 8), Hund (n = 4), Schwein (n = 7)
58 4.1.2 Ibuprofen-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Ibuprofen sind in Anhangstabelle 3 und 4 dargestellt. Abbildung 21 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Ibuprofen-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 22 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 21). In Tabelle 14 sind die in den Diffusionsversuchen mit Ibuprofen ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahme [Stunden]
Permeierte Menge an Ibuprofen [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 21: Interspeziesvergleich der Ibuprofen-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 48,6 mg Ibuprofen; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
Von den 48,6 mg des topisch applizierten Ibuprofens sind nach 30 Stunden bei der Ratte 5,8 %, beim Rind 2,8 %, beim Hund 1,9 % und beim Schwein 0,4 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
59
Abbildung 22: Auszug aus Abbildung 21; Interspeziesvergleich der Ibuprofen-Permeation über die Dauer von 8 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 48,6 mg Ibuprofen;
Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4) intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Ibuprofen-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation von 48,6 mg Ibuprofen ermittelt; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
60 4.1.3 Indomethacin-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Indomethacin sind in Anhangstabelle 5 und 6 dargestellt. Abbildung 23 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Indomethacin-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 24 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 23). In Tabelle 15 sind die in den Diffusionsversuchen mit Indomethacin ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 50 100 150 200 250
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahme [Stunden]
Permierte Menge an Indomethacin [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 23: Interspeziesvergleich der Indomethacin-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 3,5 mg Indomethacin; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
Von den 3,5 mg des topisch applizierten Indomethacins sind nach 30 Stunden bei der Ratte 3,8 %, beim Rind 2,5 %, beim Hund 1,4 % und beim Schwein 0,5 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
61
Abbildung 24: Auszug aus Abbildung 23; Interspeziesvergleich der Indomethacin-Permeation über die Dauer von 8 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 3,5 mg intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Indomethacin-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation 3,5 mg Indomethacin ermittelt;
Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
62 4.1.4 Salicylsäure-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Salicylsäure sind in Anhangstabelle 7 und 8 dargestellt. Abbildung 25 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Salicylsäure-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 26 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 25). In Tabelle 16 sind die in den Diffusionsversuchen mit Salicylsäure ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahmen [Stunden]
Permierte Menge an Salicylsäure [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 25: Interspeziesvergleich der Salicylsäure-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 14,7 mg Salicylsäure; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
Von den 14,7 mg der topisch applizierten Salicylsäure sind nach 30 Stunden bei der Rattenhaut 3,8 %, bei der Rinderhaut 2,1 %, bei der Hundehaut 1 % und bei der Schweinehaut 0,6 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
63
Abbildung 26: Auszug aus Abbildung 25; Interspeziesvergleich der Salicylsäure-Permeation über die Dauer von 8 Stunden bei Rind und Schwein und 4 Stunden bei Hund und Ratte (die Stundenwerte 5 bis 8 sind aufgrund eines Defektes der HPLC-Anlage nicht verfügbar) durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 14,7 mg Salicylsäure; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4) intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Salicylsäure-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation von 14,7 mg Salicylsäure ermittelt; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
64
4.1.5 Vergleichende Darstellung der Versuchsergebnisse 4.1.5.1 Papp-Werte
4.1.5.1.1 Vergleich der verwendeten Tierhäute
Die in den Diffusionsversuchen ermittelten Papp-Werte (siehe Tabelle 13 bis 16) der Substanzpermeation sind für jede Spezies gesondert graphisch dargestellt, um die Permeation der verschiedenen Analyten bei den verwendeten vier Spezies miteinander vergleichen zu können. Die Versuchsergebnisse, die für die Abbildung 27 grundlegend sind, sind den Anhangstabellen 1 bis 8 zu entnehmen.
Abbildung 27: Vergleich der in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden ermittelten Papp-Werte der einzelnen Testsubstanzen bei der jeweiligen Spezies durch Angabe des Mittelwertes sowie der Standardabweichung; je Tierart wurden 4 bis 8 Individuen untersucht; *: p < 0,05 (One-way ANOVA); Flu = Flufenaminsäure, Ibu = Ibuprofen, Ind = Indomethacin, Sal = Salicylsäure
Bei allen Spezies ist ein Trend der Papp-Werte erkennbar. Den höchsten Papp-Wert zeigt immer Flufenaminsäure, gefolgt von Ibuprofen. Indomethacin weist einen geringeren Papp-Wert auf
5,0 x 10-7
65
als Ibuprofen; Salicylsäure hat bei allen untersuchten Tierhäuten den geringsten Papp-Wert.
Signifikante Unterschiede sind bei Hund und Schwein zwischen Flufenaminsäure und Salicylsäure vorhanden, sowie zusätzlich beim Schwein zwischen Flufenaminsäure und Ibuprofen bzw. Indomethacin.
4.1.5.1.2 Vergleich der verwendeten Testsubstanzen
Die in den Diffusionsversuchen ermittelten Papp-Werte (siehe Tabelle 13 bis 16) sind für jeden
Die in den Diffusionsversuchen ermittelten Papp-Werte (siehe Tabelle 13 bis 16) sind für jeden