2 Literaturübersicht
2.1 Haut
2.1.2 Hautlipide
2.1.2.2 Neutrale Lipide
2.1.2.2.3 Freie Fettsäuren und Triglyceride
Weitere neutrale Lipide der Epidermis stellen die freien Fettsäuren sowie die Triglyceride dar (siehe Abbildung 4). Die in den multilamellären Lipidschichten enthaltenen freien Fettsäuren enthalten Acylketten, die vorwiegend aus 14 bis 22 Kohlenstoffatomen bestehen, wobei der Anteil der C16:0- und C18:1-Ketten überwiegt (LAMPE et al. 1983a). Ihr Gehalt erhöht sich während der epidermalen Differenzierung, wobei unklar ist, ob dieser Anstieg im Stratum corneum durch Abbau von Membranlipiden (Phospholipide oder Acylglukosylceramide) oder durch Neusynthese bedingt ist (LAMPE et al. 1983a). Am Übergang vom Stratum
15
granulosum zum Stratum corneum und in den tieferen Schichten der Hornschicht kann die Phospholipid-aufspaltende Phospholipase-A2 nachgewiesen werden, deren Existenz darauf hinweist, dass freie Fettsäuren aus vorhandenen Lipiden synthetisiert werden (MAURO et al.
1998). Diese Vermutung kann durch die Ergebnisse weiterer Untersuchungen gestärkt werden, in denen eine Inhibition der Phospholipase-A2 einen verminderten Gehalt an freien Fettsäuren im Stratum corneum zur Folge hatte (MAO-QIANG et al. 1996).
Für den Aufbau und den Erhalt der Barriere sind die ungesättigten, vor allem die essentiellen Fettsäuren von Bedeutung, wobei besonders auf Linolsäure (C18:2) hingewiesen werden muss:
Durch Veresterung mit der endständigen ω-Hydroxyfettsäure der Ceramide entsteht das für den Zusammenhalt der Lipidlamellen wichtige Ceramid 1 (ZELLMER 2001).
Triglyceride findet man vorwiegend in den tieferen Schichten der Epidermis, wo sie der Energiegewinnung dienen (YARDLEY u. SUMMERLY 1981).
H3C
Abbildung 4: Strukturformeln epidermaler Neutrallipide nach MADISON (2003)
CH2
Freie Fettsäure (Ölsäure) Alkan (Dekan)
Triglycerid (Triolein) Squalen
16 2.1.2.3 Sphingolipide
Sphingolipide lassen sich anhand ihres chemischen Aufbaus in Sphingophospholipide, Ceramide und Glycosphingolipide unterteilen. Sie stellen amphiphile Moleküle dar, die sowohl hydrophile als auch hydrophobe Eigenschaften aufweisen. Der hydrophobe Teil besteht aus einer Fettsäure, welche über ihren Amidrest mit dem Carbonrest des Sphingoidgerüstes (v.a. Sphingosin, Sphinganin, Phytosphingosin) verknüpft ist (siehe Abbildung 5). Da es mindestens 5 verschiedene Sphingoidgrundgerüste gibt, die mit mehr als 20 Fettsäure-Arten und bei den Glycosphingolipiden zusätzlich mit etwa 500 verschiedenen Kohlenhydratresten kombiniert werden können, gibt es eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten (FUTERMAN u. HANNUN 2004). Neben Strukturelementen können Sphingolipide first und second messenger für intrazelluläre Signalkaskaden sein (z.B.
bei der Apoptose). Sie sind zudem beteiligt am Aufbau von Membran-Mikrodomänen, den so genannten Lipid rafts (OKAZAKI et al. 1990; PAGANO 1990; KIM et al. 1991;
ROSENWALD u. PAGANO 1993; FUTERMAN u. HANNUN 2004).
Ceramide, die die größte Fraktion der Hornschichtlipide darstellen, wurden anfangs anhand ihres dünnschichtchromatographischen Trennverhaltens in 6 Gruppen eingeteilt (1, 2, 3, 4/5, 6I und 6II) (WERTZ et al. 1985; WERTZ 2000): je höher die Nummer ist, desto polarer ist das Ceramid und desto weiter läuft das Lipid bei der Dünnschichtchromatographie. Aufgrund ihrer Komplexizität und ständig neu entdeckter Ceramid-Varianten wurde eine neue Nomenklatur vorgeschlagen, die sich an der molekularen Struktur der Ceramide orientiert (MOTTA et al. 1993; ROBSON et al. 1994). Man unterscheidet danach zwischen Derivaten des Phytosphingosins, des Sphingosins und des 6-Hydroxy-Sphingosins (siehe Tabelle 1).
Zusätzliche Kriterien sind es, ob die ω-Hydroxygruppe der amidartig gebundenen Fettsäure verestert ist, und ob die Ceramide in α-Stellung hydroxyliert sind (ZELLMER 2001).
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Abkürzung Aufbau
H Sphingoidbase: 6-Hydroxy-Sphingosin S Sphingoidbase: Sphingosin
P Sphingoidbase: Phytosphingosin
A Amidartig gebundene Fettsäure ist in α-Stellung hydroxyliert N Amidartig gebundene Fettsäure ist in α-Stellung nicht hydroxyliert O Amidartig gebundene Fettsäure ist in ω-Stellung hydroxyliert
E Amidartig gebundene Fettsäure ist in ω-Stellung mit einer anderen Fettsäure verestert
Tabelle 1: Nomenklatur der Ceramide nach MOTTA et al. (1993) und ROBSON et al. (1994)
Mittels dünnschichtchromatographischer Untersuchungen war es möglich, 7 Ceramidklassen zu identifizieren: Cer [EOS], Cer [NS], Cer [NP], Cer [EOH], Cer [AS], Cer [AP] und Cer [AH] (ROBSON et al. 1994). Allerdings überlappen sich dabei zwei Banden (Cer [NH]
und Cer [AS]). Da diese Ceramide die gleiche Polarität aufweisen, sind sie erst nach Acetylierung trennbar, wobei Cer [NH] den größeren Teil der Bande ausmacht (STEWART u. DOWNING 1999). PONEC et al. (2003) konnten durch Untersuchungen mittels Kernspinresonanz-Spektroskopie, Hochleistungsdünnschichtchromatographie und Gaschromatographie darüber hinaus das Ceramid 9 [EOP] nachweisen.
Der bekannteste Vertreter der Ceramide ist das Ceramid 1 [EOS], das das einfachste Sphingolipid darstellt. Es hat eine amidgebundene langkettige ω-Hydroxyfettsäure, die über ihre ω-Hydroxylgruppe mit einer kürzeren Nichthydroxyfettsäure verestert ist (im Stratum corneum zu 41% Linolsäure). Aufgrund seiner Moleküllänge kann es benachbarte Lipiddoppelschichten der interkorneozytären Lipidlamellen durch asymmetrische Anordnung miteinander verzahnen, wodurch ihm eine wichtige Bedeutung hinsichtlich der Hornschichtstabilisierung, der Struktur der Lipidlamellen sowie der Barrierefunktion zukommt (MELNIK 1990; BOUWSTRA et al. 1998; MCINTOSH 2003).
18
Abbildung 5: Strukturformeln epidermaler Sphingolipide nach MADISON (2003)
Bei den Glycosphingolipiden handelt es sich um Moleküle, bei denen die terminale Hydroxylgruppe des Sphingosins bzw. des Phytosphingosins glykosidisch an einen Zuckerrest gebunden ist. Zu dieser Gruppe zählen auch die Cerebroside, die in Abhängigkeit vom konjugierten Zuckerrest in Galactocerebroside und Glucocerebroside unterteilt werden.
Hauptanreicherungsort der Glycosphingolipide sind die Keratinosomen (Lamellar bodies), wo
H3C
19
sie sich vorwiegend in den dicht gepackten, inneren Lipidlamellen befinden (WERTZ et al.
1984). Die ω-Hydroxyacylketten der Linoleylglukosylceramide durchdringen vollständig eine Lipiddoppelschicht, während Linoleylgruppen in benachbarte Lipiddoppelschichten hineinreichen. Durch eine Verzahnung der übereinander liegenden Lipiddoppelschichten wird die Bildung und Integrität der Lipidlamellen gewährleistet (WERTZ u. DOWNING 1982;
WERTZ et al. 1984, 1987; MCINTOSH 2003). Unter den Glycosphingolipiden ist das Acylglukosylceramid am bedeutendsten, da es etwa die Hälfte aller Glycosphingolipide ausmacht. Es ist ein nicht extrahierbares Ceramid und ermöglicht die Bildung des so genannten Lipid envelope, indem über seine ω-Hydroxygruppe eine kovalente Bindung mit den Hüllproteinen der Korneozyten (Involukrin, Lorikrin und SPRP) eingegangen wird (CHANG et al. 1993; STEINERT u. MAREKOV 1995).
Während der Differenzierung steigt der Anteil der Ceramide mit fortschreitender Verhornung proportional an, während der Glykosphingolipidanteil im Stratum corneum abnimmt.
Physiologischer Weise sind Glykosphingolipide nur in den lebenden Epidermisschichten vorhanden, so dass ihr Vorkommen in den äußeren Schichten der Hornschicht lediglich bei Verhornungsstörungen beobachtet werden kann (YARDLEY u. SUMMERLY 1981). Zu diesen zählt unter anderem die Parakeratose, die auch bei Haussäugetieren anzutreffen ist (CHRISTOPHERS u. BRAUN-FALCO 1970).
Aufgrund der unterschiedlichen Syntheseorte lässt sich ein Verteilungsprofil der epidermalen Lipide erstellen, das für den Menschen in Abbildung 6 dargestellt ist.
20
Abbildung 6: Epidermale Lipidverteilung nach FRITSCH (1998) und LAMPE (1983b)
2.1.3 Transdermaler Stofftransport
Für topisch applizierte Substanzen stellt die Hornschicht die erste und bedeutendste Barriereschicht dar (SCHEUPLEIN 1965). Gelangt eine Substanz in und durch diese hindurch, bezeichnet man dies als Penetration (STÜTTGEN u. SCHAEFER 1974). Dabei können Substanzen das Stratum corneum auf verschiedenen Wegen durchdringen: zum einen transdermal und zum anderen über so genannte „Shunt-Wege“ (siehe Abbildung 7).
Bei der transdermalen Route unterscheidet man zwischen dem Transport durch die Zellen (transzellulär) und dem Transport durch interzelluläre Kanäle (interzellulär) (KARZEL u.
LIEDTKE 1989). Beim transzellulären Weg müssen die Stoffe sowohl durch die Lipidlamellen als auch durch die Keratinozyten hindurch gelangen. Obwohl dieses der
„direkte“ Weg ist, ist es für Stoffe nicht leicht, ihn zu bewältigen, da sowohl hydrophile als auch lipophile Strukturen durchquert werden müssen. Der häufigste Weg durch die Haut ist daher der Interzelluläre zwischen den Korneozyten hindurch (HADGRAFT 2004).
Beim „Shunt-Weg“ gelangt die penetrierende Substanz über die Haarfollikel inklusive der Talg- und/oder ekkrinen Schweißdrüsen in den Körper (LADEMANN et al. 2003). Zudem bestehen die Möglichkeiten, dass Mikroläsionen der Hornschicht Eintrittspforten darstellen oder dass durch Auflösung der desmosomalen Zellkontakte wasserdurchlässige Poren entstehen (MENON u. ELIAS 1997; SCHAEFER u. LADEMANN 2001).
Keratohyalingranula
Odland bodies
Hemidesmosom Desmosom
Stratum corneum Stratum granulosum
Stratum spinosum
Stratum basale
Cholesterolsulfat Phospholipide Neutrale Lipide
Sphingolipide
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Abbildung 7: Wege des transdermalen Stofftransportes nach HADGRAFT (2001)
Durchdringt die Substanz neben der Hornschicht auch die darunter liegende Cutis, so bezeichnet man diesen Vorgang als Permeation. Bei der Resorption kommt es zusätzlich zu einer Substanzaufnahme in die Lymph- und Blutgefäße (STÜTTGEN u. SCHAEFER 1974).
Der percutane Stofftransport verläuft direkt proportional zum Konzentrationsgradienten der Stoffverteilung (BLANK u. SCHEUPLEIN 1969). Daraus schlossen POTTS et al. (1992), dass der transdermale Fluss vorwiegend durch passive Diffusion erfolgt und den Gesetzmäßigkeiten der Membrandiffusion unterliegt. Ungerichtete Bewegungen der Teilchen führen zu einem Teilchenfluss mit einem Konzentrationsgradienten. Aktive Transport-vorgänge spielen im Stratum corneum nach SCHEUPLEIN (1978) und BARRY (1983) keine Rolle. Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften lässt sich der percutane Fluss durch das 1. Fick´sche Diffusionsgesetz beschreiben:
Diese Form des 1. Fick´schen Diffusionsgesetzes gilt nur für Experimente unter Infinite-Dose-Bedingungen. Von diesen spricht man, wenn die Testsubstanz in so hoher
x
c K D A t
J m ⋅ ⋅∆
=
⋅
∆
= ∆ [mol · s-1 · cm-2] (1)
J: Flux D: Diffusionskoeffizient m: Masse K: Verteilungskoeffizient
t: Zeit c: Konzentration
A: Fläche x: Diffusionsstrecke
transzellulär interzellulär follikulär glandulär
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Konzentration auf die Haut aufgetragen wird, dass die maximale Absorptionsrate über die gesamte Versuchsdauer aufrechterhalten wird.
Handelt es sich dagegen um Finite-Dose-Bedingungen (d.h. die maximale Absorptionsrate ist nur für kurze Zeit vorhanden), ändert sich der maximale Flux (Jmax) entsprechend der folgenden Gleichung nach (BARRY 2002):
x auf der Membranoberfläche K: Verteilungskoeffizient
J: Flux c: Konzentration
x: Diffusionsstrecke
Da die interzelluläre Route für die meisten Substanzen den Hauptweg der Permeation darstellt, ist der tatsächlich zurückgelegte Weg mit geschätzten 500 µm länger als die Dicke des Stratum corneum (ca. 20 µm) (HADGRAFT 2004). Die tatsächliche Diffusionsstrecke
„x“ ist unbekannt, weswegen (SCHEUPLEIN 1976) den so genannten Papp-Wert verwendet:
Papp : scheinbarer Permationskoeffizient D: Diffusionskoeffizient K: Verteilungskoeffizient x: Diffusionsstrecke
Damit ergibt sich aus dem 1. Fick´schen Diffusionsgesetz:
J =
c: Konzentration Papp : scheinbarer Permeationskoeffizient Papp =
x K D⋅
[cm · s-1] (3)
23
Der Papp-Wert einer Substanz am Übergang von einer wässrigen Donorphase in eine lipophile Akzeptorphase kann auf empirischer Basis geschätzt werden (POTTS u. GUY 1992):
K MW
Dadurch ergibt sich, dass Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht langsamer durch die Haut diffundieren, während Substanzen mit einer guten Löslichkeit in Wasser und Öl sehr gut durch die Haut gelangen. Letztere sind Substanzen mit einem niedrigen Schmelzpunkt (HADGRAFT 2004). Obwohl das 1. Fick´sche Diffusionsgesetz sowie die Schätzung des Papp-Wertes nach POTTS und GUY (1992) den Anschein erwecken, dass ein hoher Verteilungskoeffizient einen hohen transdermalen Stofftransport bedingt, ist dies nicht der Fall, denn große Verteilungskoeffizienten bringen Moleküle mit sich, die eine relativ geringe Löslichkeit haben. Ein optimales Verteilungsverhalten legen dagegen die Moleküle an den Tag, die einen log KOW von 1 bis 3 aufweisen (HADGRAFT 2004).
Das 1. Fick´sche Diffusionsgesetz beschreibt den Diffusionsstrom bei einer gegebenen Konzentrationsverteilung eines diffusionsfähigen Moleküls mit bekanntem Diffusions-koeffizienten. Da sich die Konzentrationen durch die stattfindenden Diffusionsströme verändern, kann das 1. Fick´sche Diffusionsgesetz in das 2. Fick´sche Diffusionsgesetz umgewandelt werden. Durch diese partielle Differentialgleichung 2. Ordnung wird die zeitabhängige Veränderung der Molekülkonzentration in der Membran bei gegebenem Diffusionskoeffizienten beschrieben (TANG et al. 2002):
2
Papp : scheinbarer Permeationskoeffizient MW: Molekulargewicht KOW: Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient x: Diffusionsstrecke
24
2.1.4 Einfluss der Haut auf den transdermalen Stofftransport
Wie bereits beschrieben stellt nicht die lebende Epidermis, sondern das intakte Stratum corneum mit seiner lipidreichen Interzellularsubstanz die wichtigste Permeabilitätsbarriere der Haut dar (SCHEUPLEIN 1965; GRAY u. YARDLEY 1975a, b; STÜTTGEN 1990;
WESTER u. MAIBACH 1992). Von SCHEUPLEIN (1966) konnte gezeigt werden, dass Wasser die Hornschicht 1000-mal schlechter durchdringt als die Epidermis und Dermis.
Das Stratum corneum stellt keine einseitige Barriere für Substanzen aus der Umwelt dar, sondern verhindert gleichzeitig einen Verlust körpereigener Substanzen. Bereits 1927 konnte von BENEDICT und BENEDICT (1927) festgestellt werden, dass der Körper Wasser über die Haut kontinuierlich abgibt. Der transepidermale Wasserverlust ist abhängig von Umgebungstemperaturen, der umgebenden Luftfeuchtigkeit sowie von Luftbewegungen auf der Hautoberfläche (SCHWINDT et al. 1998):
x D c
TEWL ∆
⋅
−
= [g · s-1 · cm-2] (7)
TEWL: transepidermaler Wasserverlust D: Diffusionskoeffizient
c: Konzentration x: Diffusionsstrecke
Ohne die lebensnotwendigen Lipide der Hornschicht würde der Wasserverlust eines Körpers um das 2500-fache und bei Fehlen der Hornschicht sogar um das 4-Millionenfache zunehmen (LANDMANN 1988). Daher dient der TEWL als ein Parameter für die Beurteilung der Hautintegrität (GRUBAUER et al. 1989). Durch Lipidextraktionsversuche konnte gezeigt werden, dass eine Lipidreduktion der Epidermis zu einem dramatischen Permeabilitätsanstieg führt (BERENSON u. BURCH 1951; ONKEN u. MOYER 1963; MATOLTSY et al. 1968;
SCHEUPLEIN u. ROSS 1970; SWEENEY u. DOWNING 1970; BRONAUGH u. FRANZ 1986). ELIAS et al. (1981) konnten durch Penetrationsversuche mit Salicylsäure zeigen, dass bereits der Gesamtlipidgehalt ein kritischer Faktor der dermalen Permeabilität ist; je höher das Lipidgewicht war, desto weniger Salicylsäure durchdrang die Haut.
Der für die Barrierefunktion wichtige Aufbau der Hornschicht lässt sich durch das Brick-and-Mortar-Model beschreiben: die ziegelsteinartigen, lipidarmen Korneozyten sind in einem interzellulären, hydrophoben Lipidmörtel eingebettet, der sich hauptsächlich aus Ceramiden
25
(45-50 %), Cholesterol (25 %) und freien Fettsäuren (10-15 %) zusammensetzt (ELIAS 1981b, 1983; WILLIAMS u. ELIAS 1987; MCINTOSH et al. 1996). Durch die Korneozyten erlangt die Hornschicht ihre physikalische Stabilität, während die interzellulären Lipide eine Barriere für Wasser und gelöste Stoffe bilden. LAW et al. (1995), WERTZ (2000) sowie MADISON (2003) stellten fest, dass die Lipidkomposition neben dem Gesamtlipidgehalt von entscheidender Bedeutung ist: Hauptverantwortlich für die Barrierefunktion sind demnach die bereits beschriebenen Hauptbestandteile des Lipidmörtels: Ceramide, Cholesterol und freie Fettsäuren (MAO-QIANG et al. 1993). Die Barriereeigenschaft des Stratum corneum wird durch die folgenden Faktoren unterstützt (LANDMANN 1988):
• Stabilisierung der Lipidlamellen durch den strukturellen Aufbau von Sphingolipiden und Cholesterol
• Hohe molekulare Ordnung der Interzellularsubstanz durch langkettige gesättigte Fettsäuren
• Verhinderung der Phasentransition der festkristallinen Lipidschicht durch die gegenüber dem Körperinneren verminderte Hautoberflächentemperatur.
Mittels Elektronenmikroskopie und Röntgenbeugungsanalyse konnte gezeigt werden, dass interzelluläre Lipidlamellen in der gesamten Hornschicht verbreitet sind (ELIAS u. FRIEND 1975; WERTZ et al. 1987; WHITE et al. 1988; BOUWSTRA et al. 1991). Sie bilden eine Vielzahl lamellärer Blätter mit einer glatten Oberfläche (ELIAS et al. 1977a, b). Neuesten Untersuchungen zu Folge geht man davon aus, dass die Lipide zwei kristalline, lamelläre Phasen mit einer Periodizität von 6,4 nm und 13,4 nm Dicke ausbilden, die durch eine flüssige Phase voneinander getrennt werden. Dabei tragen Cholesterol und Ceramid 1 [EOS]
entscheidend zur Bildung dieser Formation bei (BOUWSTRA et al. 2001).
Entgegen früherer Annahmen von (STRAUSS et al. 1985) wird aufgrund der Untersuchungen von FLUHR et al. (2003) davon ausgegangen, dass Sebumlipide die epidermale Barrierefunktion unbeeinflusst lassen.
Durch genaue Betrachtung des 1. Fick´schen Diffusionsgesetzes wird schnell klar, dass die Dicke der Haut bzw. der Hornschicht eine große Rolle bei der transdermalen Barrierefunktion spielt. MARZULLI et al. (1969) und BRONAUGH et al. (1982a) führten bereits die in
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Penetrationsversuchen mit verschiedenen Spezies beobachteten Penetrationsunterschiede auf die unterschiedliche Stärke der Hornschicht zurück. Dies konnte an Ratten- und Mäusehaut durch diverse Untersuchungen belegt werden (HORHOTA u. FUNG 1978; BEHL et al. 1985;
SCOTT et al. 1991). Einen Hinweis auf den Einfluss der Dicke der permeierten Schicht auf die Permeation liefert auch die in Diffusionsversuchen messbare Lag-Zeit, die als Zeitverzögerung zwischen der Stoffapplikation auf die Haut und dem Auftreten dieses Stoffes unterhalb der Haut definiert ist.
Die Kontinuität der Hornschicht wird wie bereits erwähnt durch Hautanhangsgebilde unterbrochen. So ist bekannt, dass die Epithelauskleidung der sezernierenden Drüsen sowie der Haarschaft einen Einfluss auf die Permeation ausüben (PITMAN u. ROSTAS 1982;
STÜTTGEN 1990; GENINA et al. 2002; HUEBNER et al. 2002; FISCHER et al. 2004).
Obwohl Hautanhangsgebilde nur rund 1 % der gesamten Hautoberfläche beim Menschen ausmachen, stellen sie einen bedeutenden Penetrationsweg für topisch applizierte Substanzen dar (SCHAEFER u. REDELMEIER 1996).
OTBERG (2003) konnte an Humanhaut zeigen, dass der Anteil der Follikelostien, die Fläche der follikulären Epithelauskleidung sowie das follikuläre Volumen in Abhängigkeit von den Körperregionen erheblich variieren. Je nach Körperregion besteht dadurch ein follikuläres Reservoir, das in manchen Körperregionen so groß ist wie das Reservoir des Stratum corneum (SCOTT et al. 1991; SCHAEFER u. LADEMANN 2001; OTBERG et al. 2004b;
TEICHMANN et al. 2005; LADEMANN et al. 2006). Durch vergleichende Resorptionsversuche an „normaler“ Haut und Narbenhaut konnten die Bedeutungen des transfollikulären und des transepidermalen Weges gezeigt werden: Lipophile Testsubstanzen durchdrangen Narbenhaut, die weder Haarfollikel noch Talgdrüsen als mögliche Penetrationswege aufweist, wesentlich langsamer als „normale“ Haut (HUEBNER et al.
1994; TENJARLA et al. 1999; LADEMANN et al. 2001). Auch Untersuchungen an Ratten konnten dies belegen, denn im Vergleich von neugeborenen und 5-Tage-alten Ratten konnte festgestellt werden, dass die follikelfreie Haut der Neugeborenen weniger durchlässig war (BEHL et al. 1985; ILLEL et al. 1991). Daher sind sowohl Haarfollikel als auch Talgdrüsen als wichtige Penetrationswege weitläufig anerkannt, wobei vermutet wird, dass die tieferen Regionen der Haarfollikel für die Aufnahme von lipophilen Substanzen prädestiniert sind,
27
während in den oberen Abschnitten vor allem die Aufnahme von wasserlöslichen Stoffen im Vordergrund steht (PITMAN u. ROSTAS 1982; STÜTTGEN 1990; ILLEL et al. 1991;
LAUER et al. 1995;).
Mit zunehmendem Alter eines Individuums ändern sich die Barriereeigenschaften der Haut.
Die möglichen Ursachen hierfür werden auch heute noch diskutiert, wobei Untersuchungen darauf hinweisen, dass eine veränderte Blutversorgung der Haut, eine Änderung der Zusammensetzung der Hornschichtlipide sowie eine TEWL-Veränderung dafür verantwortlich sein könnten (KLIGMAN 1979; ROSKOS et al. 1986, 1989; WILHELM et al.
1991). Zudem spielt die Jahreszeit eine wesentliche Rolle beim transdermalen Stofftransport, wie aus Untersuchungen von PITMAN et al. (1983) hervorgeht. In diesen Studien durchdrang Levamisol in einem Pour-on-Präparat die Haut verschiedener Rinderrassen im Frühjahr und Sommer in höheren Konzentrationen als im Herbst und Winter.
2.1.5 Einfluss der Testsubstanzen und deren Vehikel auf den transdermalen Stofftransport
Durch verschiedene Untersuchungen konnte belegt werden, dass physikochemische Eigenschaften der topisch applizierten Substanzen großen Einfluss auf die Penetration haben.
Resorptionsversuche an Humanhaut zeigten, dass das Molekulargewicht der Testsubstanz den transdermalen Fluss stark beeinflusst: je größer dieses ist, desto kleiner ist der maximale Flux Jmax (KASTING et al. 1987; MAGNUSSON et al. 2004; NIELSEN et al. 2004). Auch der Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient (ein Maß für die Lipophilie eines Stoffes) und der Schmelzpunkt konnten als weitere wichtige Einflussfaktoren auf den Flux nachgewiesen werden (ANDERSON u. RAYKAR 1989; POTTS u. FRANCOEUR 1992; POTTS u. GUY 1992; HAGEDORN-LEWEKE u. LIPPOLD 1995; ROBERTS et al. 2002). Der Ionisationsgrad der penetrierenden Substanz ist bei der transdermalen Substanzaufnahme ebenfalls zu beachten. Elektrolyte durchdringen das Stratum corneum nur in geringem Maße, da die Zellmembranen für diese undurchlässig sind. Es wird angenommen, dass sie auf interzellulärem Wege durch die Hornschicht gelangen (MIDDLETON 1969; OAKLEY u.
SWARBRICK 1987). Da nur ungeladene lipophile Stoffe die Lipidmembranen durchdringen
28
können, gelangen hydrophile Stoffe (ebenso wie höhermolekulare Substanzen) nur in minimalen Konzentrationen in die Hornschicht (SCHAEFER et al. 1982).
Aber auch die Eigenschaften des Vehikels beeinflussen die Stoffaufnahme durch die Haut:
Von HADGRAFT et al. (2003) konnte gezeigt werden, dass Ibuprofen in Abhängigkeit von der galenischen Formulierung mehr oder weniger gut in die Haut gelangt. ROUGIER et al.
(1989) fanden heraus, dass die Benzoesäure-Resorption vehikelabhängig ist, und auch Salicylsäure penetrierte in Versuchen von SCHWARB et al. (1999) aus verschiedenen galenischen Formulierungen unterschiedlich gut in die Haut der Probanden. Diese Erscheinungen lassen sich durch Wechselwirkungen des Vehikels mit der Testsubstanz aber auch mit der Haut erklären. Daher überrascht es nicht, dass die Lipophilie des Vehikels die Resorption der topisch applizierten Substanzen beeinflusst (BRONAUGH u. FRANZ 1986;
TWIST u. ZATZ 1989; GLOOR 2004).
2.1.6 Topisch applizierte Testsubstanzen
Die im Rahmen dieser Arbeit transdermal angewendeten Testsubstanzen stammen aus der Wirkstoffgruppe der nichtsteroidalen Antiphlogistika (siehe Abbildung 8). Dabei handelt es sich um schwache, aromatische Säuren ohne Steroidgerüst, die schmerzlindernd, entzündungshemmend und fiebersenkend wirken. In der Humanmedizin werden bereits einige Vertreter dieser Stoffklasse erfolgreich transdermal eingesetzt (z.B. Diclofenac, Ketoprofen), um den bei systemischer Applikation auftretenden Nebenwirkungen zu entgehen.
Die Auswahl der Testsubstanzen für diese Arbeit erfolgte anhand der physikochemischen Parameter, die den größten Einfluss auf die transdermale Permeation ausüben sollen. Wie bereits erwähnt sind dies der Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient sowie das Molekulargewicht (siehe Tabelle 2).
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Abbildung 8: Strukturformeln der verwendeten nichtsteroidalen Antiphlogistika
Substanz
Tabelle 2: Nichtsteroidale Antiphlogistika und ihre permeationsbeeinflussenden physikochemischen Parameter nach KASTING et al. (1987), MORIMOTO et al. (1992), SINGH und ROBERTS (1994) sowie WENKERS und LIPPOLD (1999)
Salicylsäure Indomethacin Flufenaminsäure
Ibuprofen
30 3 Material und Methoden
Im Folgenden werden die verwendeten Materialien sowie die Versuchsmethoden, die im Rahmen dieser Arbeit eingesetzt wurden, näher beschrieben. Vorgehensweise war es, das Permeationsverhalten von vier Testsubstanzen an den Häuten von vier verschiedenen Spezies zu untersuchen. Darüber hinaus wurden von den eingesetzten Tierarten epidermale Lipidmuster analysiert sowie histologische Untersuchungen der Haut auf mögliche permeationsbeeinflussende Parameter durchgeführt.
3.1 Materialien
3.1.1 Chemikalien und Lösungsmittel
Acetonitril Labscan, Dublin, Irland
Ceramid 3 [NP] Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Ceramid 4 [EOH] Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Chloroform Labscan, Dublin, Irland
Cholesterol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Cholesterolester Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Cholesterolsulfat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Diethylether Merck, Darmstadt
Dinatriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt
Eosin G (gelblich) Merck, Darmstadt
Essigsäure 100 % zur Analyse AppliChem, Darmstadt
Ethanol Labscan, Dublin, Irland
Flufenaminsäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Galactocerebroside Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Ibuprofen Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Indomethacin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Isotonische Kochsalz-Lösung Braun, Melsungen Kaliumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt
Kupfersulfatpentahydrat Merck, Darmstadt
Mayers Hämalaun-Lösung für die Mikroskopie Merck, Darmstadt
31
Methanol Labscan, Dublin, Irland
Dinatriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt
Natriumchlorid Merck, Darmstadt
Natriumhydroxid-Plätzchen Merck, Darmstadt
n-Hexan Labscan, Dublin, Irland
Ortho-Phosphorsäure (85 %) Merck, Darmstadt
Ölsäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Phosphatidylcholin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Salicylsäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Salicylsäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim