Haarfollikeldurchmesser - Untersuchung der Haarfollikel

4 Ergebnisteil

4.3 Ergebnisse der histologischen Untersuchung

4.3.1.4 Untersuchung der Haarfollikel

4.3.1.4.2 Haarfollikeldurchmesser

Die Messergebnisse der Haarfollikeldurchmesser sind den Anhangstabellen 10 und 11 zu entnehmen. Abbildung 42 zeigt die graphische Darstellung der Haarfollikel-durchmessermessung der Primär- und Sekundärhaarfollikel der untersuchten Spezies.

Ratte Rind Hund Schwein

Abbildung 42: Ergebnisse der Durchmesser-Messung der Primär- (links) und Sekundärhaarfollikel (rechts) von vier Tierarten (pro Spezies n = 3) durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichung)

Die Primärhaarfollikel der Schweine weisen mit 98 µm den größten Durchmesser aller im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Tierarten auf; der mittlere Durchmesser der Sekundärhaarfollikel beträgt 18 µm. Der mittlere Durchmesser der Primärhaarfollikel der Ratten bemisst sich bei 89,3 µm, die Sekundärhaare sind 19,6 µm dick. Bei den Rindern beträgt die mittlere Dicke der analysierten Primärhaarfollikel 65,4 µm, während die Sekundärhaarfollikel einen Durchmesser von 16,2 µm aufweisen. Beim Hund sind die Primärhaarfollikel durchschnittlich 52,4 µm dick, die Sekundärhaarfollikel 17,5 µm. Während die Durchmesser der Primärhaarfollikel im Vergleich der untersuchten Tierarten großen Schwankungen unterliegen, sind die Sekundärhaarfollikeldurchmesser bei allen Spezies annähernd gleich.

84 4.3.1.4.3 Eindringtiefe der Haarfollikel

Die Versuchsergebnisse der Messung der Eindringtiefe der Haarfollikel sind den Anhangstabellen 10 und 11 zu entnehmen. Abbildung 43 zeigt die graphische Darstellung der Mittelwerte der untersuchten Spezies.

Ratte Rind Hund Schwein

0 200 400 600 800 1000 1200

Eindringtiefe der Haarfollikel [µm]

Abbildung 43: Ergebnisse der Messung der Haarfollikeleindringtiefe bei vier Spezies (pro Spezies n = 3) durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichung)

Aus Abbildung 43 wird deutlich, dass die Haarfollikel in der Haut der Hunde am Tiefsten verwurzelt sind (938,8 µm). Die Haarfollikel der Schweine und Rinder sind mit 820 µm bzw.

810,5 µm ungefähr gleich tief verankert. Dahingegen weist die Haut der Ratten mit 549,7 µm die geringste Eindringtiefe der Haarfollikel auf. Die Haare der untersuchten Tierarten zeigen bei der Messung der Haarfollikeleindringtiefe keine Unterschiede zwischen den Primär- und Sekundärhaarfollikeln wie es bei der Haarfollikeldichte sowie dem Haarfollikeldurchmesser möglich ist (siehe Kapitel 4.3.1.4.1 und 4.3.1.4.2).

4.4 Hierarchische Clusteranalyse

Durch die hierarchische Clusteranalyse kann sowohl das komplexe Bild der epidermalen Lipidprofile als auch der histologischen Untersuchung etwas vereinfacht dargestellt werden.

Abbildung 44 und 45 zeigen die graphische Darstellung der hierarchischen Clusteranalyse der epidermalen Lipidprofile bzw. der Histologie.

Abbildung 44: Darstellung der hierarchischen Clusteranalyse der mittels HPTLC untersuchten Tiere (mit Nummern) nach Mittelwertnormalisierung über die untersuchten Lipide (exklusive der Trigylceride); angewandt wurde die Clustermethode „centroid linking“; die Länge der horizontalen Balken beschreibt die Ähnlichkeit der epidermalen Lipidprofile

Wie aus Abbildung 44 ersichtlich ist, können die Tiere anhand ihrer epidermalen Lipidmuster in tierartspezifische Verwandtschaftsbeziehungen gesetzt werden. So bilden die untersuchten Hunde und Ratten einen Cluster, während sich die Rinder und die Schweine in mehrere, kleinere vermischte Gruppen einteilen lassen. Die zum Teil auftretenden überkreuzenden Linien entstehen durch Verwandtschaftsähnlichkeiten, die aufgrund der Mittelwertnormalisierung errechnet wurden.

Hund 5 Hund 7 Hund 6

Ratte 2 Ratte 3 Ratte 1

Schwein 1 Schwein 11 Schwein 10

Rind 7 Rind 9 Rind 8

Abbildung 45: Darstellung der hierarchischen Clusteranalyse der untersuchten morphologischen Parameter von vier Spezies mit jeweils drei Individuen (mit Nummern) nach Mittelwertnormalisierung über einzelne histologische Parameter; angewandt wurde die Clustermethode „centroid linking“; die Länge der horizontalen Balken beschreibt die Ähnlichkeit der epidermalen Lipidprofile

Aus Abbildung 45 wird deutlich, dass jede Spezies aufgrund der untersuchten morphologischen Parameter zunächst eine eindeutige Gruppe bildet (mit Ausnahme einer Ratte). Zudem bilden die Rinder und Schweine ebenso wie die Ratten und Hunde Verwandtschaftsgruppen.

87 5 Diskussion

Ziel dieser Arbeit war es, einen Erklärungsansatz zu schaffen für die in In-vitro-Permeationsversuchen auftretenden Schwankungen zwischen unterschiedlichen Spezies und zwischen verschiedenen Individuen einer Spezies. Für die Untersuchungen wurde die Haut von verschiedenen Lokalisationen von vier Spezies (Ratte: laterale Bauch- und Rückenhaut, Rind: Euterhaut, Hund und Schwein: laterale Bauchhaut) herangezogen. Zum einen wurden In-vitro-Diffusionsversuche mit vier Testsubstanzen (Flufenaminsäure, Ibuprofen, Indomethacin, Salicylsäure) an Spalthaut der genannten Tierarten durchgeführt. Darüber hinaus wurde das epidermale Lipidmuster jeder Spezies analysiert sowie histologische Parameter der Haut untersucht, die mögliche Einflussfaktoren auf die transdermale Permeation darstellen.

Im Folgenden wird zunächst darauf eingegangen, wie die Auswahl der eingesetzten Tierhäute getroffen wurde. Anschließend werden die Versuchsergebnisse der Diffusionsversuche sowie die Bedeutung des morphologischen Hautaufbaus und der epidermalen Lipidkomposition für die percutane Substanzaufnahme diskutiert.

5.1 Auswahl der Tierhäute

Im Rahmen dieser Arbeit wurde wie bereits beschrieben das Diffusionsverhalten von vier nichtsteroidalen Antiphlogistika an verschiedenen Tierhäuten untersucht. Es ist bekannt, dass verschiedenste Hauteigenschaften einen Einfluss auf die dermale Permeation haben können.

Da auf diese in Kapitel 5.3 näher eingegangen wird, sei an dieser Stelle nur kurz darauf hingewiesen, dass durch die Auswahl der verwendeten Tierhäute eine große Variabilität bei der transdermalen Permeation provoziert wurde. Um Unterschiede zwischen Individuen einer Spezies minimal zu halten, stammten die Tiere einer Tierart mit Ausnahme der Rinder und zweier Hunde aus homogenen Gruppen bezüglich des Alters, der Fütterung sowie der Haltung. Darüber hinaus wiesen die Tierhäute keine makroskopisch erkennbaren Anzeichen für Hauterkrankungen und Verletzungen auf.

5.2 Permeationsverhalten der Analyten bei vier verschiedenen Spezies

Der Einfluss physikochemischer Substanzeigenschaften auf den transdermalen Stofftransport wurde bereits durch verschiedene Untersuchungen näher charakterisiert (KASTING et al.

1987; CORDERO et al. 1997; MAGNUSSON et al. 2004). Die Auswahl der vier verwendeten Analyten wurde daher so getroffen, dass sie ein breites Spektrum der in der einschlägigen Literatur beschriebenen permeationsbeeinflussenden Parameter Molekulargewicht, Lipophilie und Schmelzpunkt abdeckten. Alle Testsubstanzen wurden unter den gleichen standardisierten Bedingungen eingesetzt (siehe Kapitel 3.2.2). Zur Beurteilung der Permeationsverhalten der Testsubstanzen wurden aus den in der Franz-Diffusionszelle durchgeführten Permeationsversuchen die ermittelten Papp-Werte, die Lag-Zeiten, sowie die nach 30 Stunden durch die Haut permeierte Testsubstanzmenge berechnet.

5.2.1 Permeabilität und Lag-Zeit von vier verschiedenen Spezies im Vergleich

In den In-vitro-Diffusionsversuchen zeigte sich, dass für jeden Analyten die gleiche Permeabilitätsreihenfolge der vier Spezies vorlag. Die Rattenhaut stellte die geringste Barriere für die eingesetzten Analyten dar, gefolgt von der Rinder- und der Hundehaut. Die porcine Bauchhaut bot allen Analyten die größte Permeationsbarriere. Diese Ergebnisse stimmen überein mit Untersuchungen von SATO et al. (1991) und SCOTT et al. (1991), die zeigen konnten, dass Labortiere (wie z.B. die Ratte) im Verhältnis zu anderen Säugetieren höhere Permeationsraten aufweisen. Vergleicht man Rindereuterhaut mit porciner Bauchhaut hinsichtlich der Permeation von Koffein, Benzoe-, Flufenaminsäure und Testosteron, so bietet die bovine Haut den untersuchten Testsubstanzen eine geringere Barriere (NETZLAFF et al.

2006). Die im Rahmen dieser Studie festgestellte Permeabilitätsreihenfolge der verschiedenen Spezies wird zudem bestätigt durch Untersuchungen von MARZULLI (1962) und MCCREESH (1965), die beschrieben haben, dass Labornager eine durchlässigere Haut aufweisen als Hunde. Deren Haut wiederum zeigt eine höhere Durchlässigkeit als Schweinehaut.

Die umgekehrte Reihenfolge der vier Spezies wurde bei Betrachtung der Lag-Zeiten ermittelt.

Hier wies das Schwein die höchste Lag-Zeit auf, gefolgt von der Hunde-, der Rinder- und der Rattenhaut. Damit zeigte die Spezies mit der größten Permeation die kürzeste Lag-Zeit und umgekehrt.

5.2.2 Korrelation zwischen der Permeabilität und den physikochemischen Eigenschaften der Testsubstanzen

In den Diffusionsversuchen wurde beim Vergleich der Häute der unterschiedlichen Spezies die gleiche Abfolge der Testsubstanzpermeation festgestellt. Die höchste Permeabilität wies Flufenaminsäure auf, gefolgt von Ibuprofen und Indomethacin. Salicylsäure permeierte durch alle Tierhäute im Vergleich zu den anderen topisch applizierten Substanzen am Geringsten.

Lipophilie: Sortiert man die untersuchten nichtsteroidalen Antiphologistika nach ihrem Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten, einem Maß für die Lipophilie einer Substanz, so zeigt sich folgende Abfolge (begonnen mit der geringsten Lipophilie): Salicylsäure <

Indomethacin < Ibuprofen < Flufenaminsäure. Diese Reihenfolge entspricht der bereits beschriebenen Permeabilitätsabfolge der Testsubstanzen (siehe 5.2.2). Demnach permeieren Testsubstanzen mit einer höheren Lipophilie besser durch die Haut als Hydrophile. Dieser Zusammenhang bestätigt bereits beschriebene Versuchsergebnisse von KASTING et al.

(1987) und CORDERO et al. (1997).

Schmelzpunkt: Ein weiterer physikochemischer Parameter, der nach KASTING et al. (1987) als potentieller Einflussfaktor auf die transdermale Stoffaufnahme postuliert wurde, ist der Schmelzpunkt einer Substanz. Eigene Untersuchungen bestätigten dies, da eine Korrelation zwischen der Permeabilität und dem Schmelzpunkt der Testsubstanzen auftrat. Substanzen mit geringem Schmelzpunkt zeigten eine hohe Permeabilität, während eine Abnahme des transdermalen Stofftransportes mit erhöhtem Schmelzpunkt einherging.

Molekulargewicht und Molekularvolumen: Haupteinflusskomponente auf den transdermalen Stofftransport seitens der topisch applizierten Testsubstanz ist nach MAGNUSSON et al. (2004) das Molekulargewicht. Untersuchungen des Permeations-verhaltens diverser Substanzen durch NIELSEN et al. (2004) bestätigten einen Zusammenhang zwischen dem Molekulargewicht und der Permeationsrate. Je größer das Molekulargewicht einer Testsubstanz war, desto geringer war der maximale Flux. Diese Korrelation konnte durch eigene Untersuchungen jedoch nicht bestätigt werden, ebenso wenig

wie die von KASTING et al. (1987) beschriebene inverse Relation zwischen dem Molekularvolumen und der Permeation.

5.2.3 Korrelation zwischen der Lag-Zeit und den physikochemischen Eigenschaften der Testsubstanzen

Lipophilie: Die Lag-Zeit ist ein Resultat der Wechselwirkung einer Substanz sowohl mit der permeierten Schicht als auch mit der Donor- und der Akzeptorphase. Topisch applizierte Substanzen zeigen daher in Abhängigkeit von der Affinität zu den unterschiedlichen Kompartimenten unterschiedlich lange Lag-Zeiten (NIELSEN et al. 2004). Ist die Haut lipophiler als die Donorflüssigkeit, verbleiben hydrophile Stoffe in der Donorphase, während lipophile Stoffe gemäß ihrer Affinität in die Haut gelangen. Steigt der Substanzgradient zur Haut hin an, werden hydrophile Stoffe in die Haut gedrängt, von wo aus sie bei einer hydrophilen Akzeptorflüssigkeit sehr schnell in diese übergehen. Dahingegen verbleiben lipophile Stoffe bei hydrophiler Akzeptorflüssigkeit in der Haut, wo sie erst durch entsprechend hohe Substanzgradienten in die Akzeptorphase diffundieren. NIELSEN et al.

(2004) erklärten so die längeren Lag-Zeiten hydrophiler Stoffe gegenüber lipophilen Substanzen. Diese These wurde durch Untersuchungen von BARBERO und FRASCH (2006) bestätigt. Je höher die Lipophilie der Analyten war, desto länger war die in den Diffusionsversuchen beobachtete Lag-Zeit. Bei den im Rahmen dieser Studie durchgeführten Diffusionsversuchen hätte entsprechend der Lipophilie der Testsubstanzen eine Zunahme der Lag-Zeit von Salicylsäure über Indomethacin, Ibuprofen zu Flufenaminsäure beobachtet werden können, was jedoch nicht der Fall war. Vielmehr zeigte sich für jede Spezies eine unterschiedliche Abfolge der Testsubstanzen hinsichtlich ihrer Permeabilität.

Molekulargewicht, Schmelzpunkt und Molekularvolumen: Da Moleküle mit steigendem Molekulargewicht durch sterische Hinderung am Transport durch die Haut gehindert werden, wurde untersucht, ob mit steigendem Molekulargewicht eine Verlängerung der Lag-Zeit auftrat. NIELSEN et al. (2004) zeigten, dass bei der Untersuchung des Permeationsverhalten von fünf Pestiziden unterschiedlichen Molekulargewichtes an Humanhaut keine Korrelation zwischen dem Molekulargewicht der Testsubstanzen und der Lag-Zeit vorlag. Eigene Untersuchungen stehen ebenso wie Untersuchungen von CORDERO et al. (1997),

SARTORELLI et al. (1999) sowie von VAN RAVENZWAAY und LEIBOLD (2004) mit diesen Beobachtungen in Einklang. Darüber hinaus wurden weder der Schmelzpunkt noch das Molekularvolumen als Einflussfaktoren auf die Lag-Zeit ermittelt.

5.3 Einflussfaktoren auf die transdermale Permeation/Interindividuelle Schwankungen

Wie bereits beschrieben zeigen unterschiedliche Spezies voneinander abweichende Permeationsraten (SATO et al. 1991; SCOTT et al. 1991; PANCHAGNULA et al. 1997;

JEWELL et al. 2000; VAN DE SANDT et al. 2000; NGAWHIRUNPAT et al. 2004; VAN RAVENZWAAY u. LEIBOLD 2004). Im Rahmen dieser Studie waren speziesbedingte Unterschiede der transdermalen Permeation erwünscht, so dass verschiedene Tierarten für die Untersuchungen herangezogen wurden. Unterschiedliche anatomische Regionen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Barriereeigenschaft. SCOTT et al. (1991) untersuchten die Ethanol-Permeation am Unterarm und Oberschenkel beim Affen und beschrieben unterschiedliche Permeationsraten. Um einen Einfluss verschiedener anatomischer Lokalisationen zu umgehen, wurde bei jedem Individuum einer Spezies die gleiche Hautregion für die Untersuchung herangezogen.

Analog zu HOSTYNEK (2003) wurden im Rahmen dieser Arbeit trotz homogener Tiergruppen innerhalb der Spezies Schwankungen der Permeationsraten beobachtet, was in Anbetracht der Vielzahl von Einflussfaktoren auf die Permeabilität nicht verwundert.

DENDA et al. (1998a), LOWE u. STOUGHTON (1977), DE PAEPE et al. (2004), ELIAS et al. (2004) und NIELSEN et al. (2004) postulierten, dass Hauterkrankungen, Umwelteinflüsse, die Jahreszeit, die Ernährung sowie individuelle Besonderheiten Veränderungen der Hautbarriere hervorrufen. CHOI et al. (2005) wiesen darüber hinaus nach, dass Stress die Haut in ihrer Funktion als schützende Schicht schädigt.

Letztendlich resultieren die beschriebenen Faktoren in einer Änderung der Hautmorphologie sowie in Abweichungen der epidermalen Lipidkomposition (MEYER et al. 1978c; LAMPE et al. 1983a; SATO et al. 1991; SCOTT et al. 1991; DICK u. SCOTT 1992). Dies zu untersuchen, war Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Daher wird in Kapitel 5.4 und Kapitel 5.5 darauf näher eingegangen.

92 5.3.1 pH-Wert der Hautoberfläche

Auch der pH-Wert der Hautoberfläche ist entscheidend für den transdermalen Stofftransport, wobei das Ausmaß seines Einflusses unklar ist (MATOUSEK u. CAMPBELL 2002).

Unterschiedliche pH-Werte bedingen in Abhängigkeit vom pka-Wert unterschiedliche Verhältnisse von ionisierten zu unionisierten Formen des topisch applizierten Stoffes. Bereits HADGRAFT (2001) wies darauf hin, dass der pka-Wert einer topisch applizierten Substanz den transdermalen Stofftransport beeinflusst. Das Verhältnis der ionisierten zu den unionisierten Formen einer Testsubstanz ist neben dem pka-Wert der Testsubstanz auch vom pH-Wert des Lösungsmittels bzw. der Haut abhängig (KAMAL et al. 2005). MEYER und NEURAND (1991) untersuchten den pH-Wert bei diversen Säugetierarten und zeigten, dass sich der pH-Wert der Haussäugetiere zwischen verschiedenen Spezies unterscheidet und in der Regel etwas höher liegt als bei humaner Haut (siehe Tabelle 21). Zudem unterscheiden sich die Geschlechter einiger Spezies (z.B. Rinder) in ihrem pH-Wert der Hautoberfläche, wobei Stresssituationen binnen einer Minute zu einer pH-Wert-Änderung führen können (z.B.

beim Hund).

Spezies Ratte Rind Hund Schwein Mensch

pH-Wert 6,7 - 6,9 6,8 6,0 6,4 5,4 - 5,9

Tabelle 21: pH-Werte der untersuchten Spezies entsprechend der verwendeten Lokalisationen nach MEYER und NEURAND (1991) sowie BRAUN-FALCO und KORTING (1986)

5.4 Epidermales Lipidmuster verschiedener Spezies

5.4.1 Analytik des epidermalen Gesamtlipidgehalts verschiedener Spezies

Die Untersuchung der epidermalen Lipide zeigte signifikante Unterschiede des Gesamtlipidgehaltes bei den untersuchten Tierarten. Die Rattenhaut besaß im Verhältnis zu den anderen untersuchten Spezies den höchsten Gehalt an epidermalen Lipiden. Darüber hinaus konnte ein Abfall der epidermalen Gesamtlipidmenge über die Rinder- und Hundehaut zur Schweinehaut beobachtet werden.

GRAY und YARDLEY (1975b) führten vergleichende Untersuchungen des Lipidgehaltes von epidermalen Zellen ohne Hornschicht beim Menschen, Schwein und der Ratte durch.

Dabei wurde für die Ratte mit 20 % Gesamtlipiden in der Trockensubstanz ein doppelt so hoher Wert wie für humane epidermale Zellen festgestellt. Durch eigene Untersuchungen konnte dagegen ein etwas geringerer Lipidgehalt von 16 % detektiert werden, der allerdings auf der Untersuchung der gesamten Epidermis der Ratten basiert. Rindereuterhaut weist nach NETZLAFF et al. (2006) einen Gesamtlipidgehalt von 6,5 % auf. Eigene Untersuchungen der Oberhaut des bovinen Euters stellten einen Lipidgehalt von 13,7 % in der Trockensubstanz fest. Die Epidermis der Hundebauchhaut wies 13,4 % Lipide in der Trockensubstanz auf.

Vergleichbare Literaturangaben zum Gesamtlipidgehalt der caninen Epidermis sind jedoch nicht erhältlich. Dahingegen wurde analog zu den Untersuchungen von GRAY et al. (1978), GRAY und WHITE (1978) sowie von WERTZ und DOWNING (1983a) ein Gesamtlipidgehalt der porcinen Epidermis von 7,8 % festgestellt.

5.4.2 Analytik der Zusammensetzung epidermaler Lipide verschiedener Spezies 5.4.2.1 Tierartliche Besonderheiten

Trotz der Vielzahl eingesetzter Lipidstandards war bei jeder untersuchten Spezies eine Reihe von Lipidbanden auf der HPTLC-Platte vorhanden, die keinem kommerziell erhältlichen Lipidstandard entsprach. Bei Hunden und Rindern trat dies vorwiegend im Umgebungsbereich der Ceramidstandards auf. Weitere unbekannte Lipidbanden wurden bei Ratten, Rindern und Schweinen in unmittelbarer Nähe der Cholesterolester auf der HPTLC-Platte sichtbar (siehe Abbildung 46).

Abbildung 46: Beispiel eines Chromatogrammes der Lipidextrakte von vier Spezies und dem Lipidstandardgemisch; die Kästen markieren unbekannte Lipide (ausgenommen sind die Lipidbanden von Ceramid 3 [NP] und 4 [EOH])

Aufgrund des Fließverhaltens der unterschiedlichen Lipidfraktionen kann davon ausgegangen werden, dass die unbekannten Banden im Bereich der Ceramidstandards ebenfalls Ceramide darstellen. Die in der Literatur vorhandenen Angaben zur Zahl verschiedener Ceramide schwanken in Abhängigkeit von der Untersuchungsmethode und der Tierart zwischen 6 und 9 (WERTZ u. DOWNING 1983b, c; WERTZ et al. 1984, 1985; BOUWSTRA et al. 1998;

UCHIDA et al. 2000; WEERHEIM u. PONEC 2001; DE JAGER et al. 2004; FARWANAH et al. 2005), was durch eigene Beobachtungen bestätigt werden konnte.

Das Problem der Quantifizierung überzähliger Ceramidbanden (bezogen auf die Lipidstandards) wurde in anderen Studien gelöst, indem käufliche Ceramidstandards für die unbekannten Ceramide als quantifizierbare Standards verwendet wurden. In den Untersuchungen von FARWANAH et al. (2005) beispielsweise wurde das kommerziell erhältliche Ceramid 3 [NP] als quantitative Referenz für alle Ceramidfraktionen herangezogen. Im Rahmen der in dieser Arbeit durchgeführten Analysen zeigte sich, dass eine Quantifizierung aller vorhandener Ceramidbanden bezogen auf die beiden eingesetzten Standards (Ceramid 3 [EOH] und Ceramid 4 [NP]) nicht möglich war, da gleiche

Cholesterolester

Triglyceride freie Fettsäuren Cholesterol Ceramid 3 [NP]

Ceramid 4 [EOH]

Galactocerebroside Cholesterolsulfat

Phospholipide

Schwein Ratte Rind Hund Standard

Konzentrationen dieser Standards unterschiedliche Flächen unter dem Peak bei der Analytik hervorriefen. Folglich konnten nicht alle Ceramidfraktionen quantitativ bestimmt werden.

Weitere Möglichkeiten, alle Ceramidbanden quantitativ zu bestimmen, sind die Aufarbeitung der Ceramide aus den HPTLC-Platten und die Neusynthese der entsprechenden Lipidstandards (BOUWSTRA et al. 1998; DE JAGER et al. 2004). Beide Methoden sind sehr aufwendig und bisher im hiesigen Institut nicht etabliert.

5.4.2.2 Lipidzusammensetzung der Epidermis

Freie Ceramide, Sterole sowie freie Fettsäuren stellen die Hauptanteile der epidermalen Lipide dar (MAO-QIANG et al. 1993; BOUWSTRA et al. 1999b; DE JAGER et al. 2004).

Die Fraktion der Ceramide konnte im Rahmen dieser Arbeit aufgrund der oben beschriebenen Problematik nicht in ihrer Gesamtheit quantitativ erfasst werden. Die Tatsache, dass in Abhängigkeit von der Tierart bis zu 9 Ceramidbanden visuell bestätigt werden konnten, lässt jedoch vermuten, dass die Ceramide bei den untersuchten Spezies zu den Hauptlipidfraktionen zählen.

Der Vergleich des quantitativen Gehaltes aller untersuchten Lipidfraktionen zeigte, dass zwischen den Tierarten erhebliche Unterschiede bestehen. Beim Schwein und Rind waren vorwiegend Cholesterol und freie Fettsäuren zu finden, welche beim Hund durch Cholesterolester ergänzt wurden. Bei der Ratte kam darüber hinaus ein hoher Gehalt an Triglyceriden in der Epidermis vor. Abbildung 47 zeigt das Verhältnis der Anteile der einzelnen Lipidfraktionen am epidermalen Gesamtlipidgehalt sowie der Epidermis bei den untersuchten Tierarten.

Anteil der analysierten Lipide am Gesamtlipidgehalt [%]

Ratte Rind Hund Schwein

Anteil der analysierten Lipide an der Epidermis [%]

Abbildung 47: Anteil der mittels HPTLC analysierten epidermalen Lipide von vier Spezies am epidermalen Gesamtlipidgehalt und der Epidermis; Ratte ( n = 6), Rind (n = 15), Hund (n = 8), Schwein (n = 13)

In Analogie zu MAO-QIANG et al. (1993), BOUWSTRA et al. (1999b) sowie DE JAGER et al. (2004) kann zusammenfassend festgestellt werden, dass freie Fettsäuren, Cholesterol, Triglyceride sowie Cholesterolester zu den Hauptlipidfraktionen der untersuchten Oberhäute zählen.

5.4.2.2.1 Problematik der Triglyceride

Das Vorkommen von Triglyceriden in der Epidermis wird in der Literatur kontrovers diskutiert. HEDBERG et al. (1988a) konnten zeigen, dass Schweine in Abhängigkeit von der Hygiene in der Haltung mehr oder weniger hohe Gehalte an Triglyceriden in ihren Hautlipidextrakten aufwiesen. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass Triglyceride exogene Kontaminationen sind. Zudem zeigten Untersuchungen epidermaler Lipide beim Menschen große Schwankungen in den Triglyceridgehalten zwischen verschiedenen Individuen (LAMPE et al. 1983a). Als Ursache hierfür wurde eine Kontamination des Extraktionsmaterials durch subkutanes Fettgewebe diskutiert. Diese Vermutung wird bestätigt durch Untersuchungen des Triglyceridgehaltes der Schweineepidermis durch HEDBERG et al. (1988a, b), die zeigen konnten, dass durch eine Präparation der Epidermis ohne Inzision ins subkutane Fettgewebe ein Abfall des Triglyceridgehaltes zu beobachten ist. Allerdings

sind Triglyceride auch in den tieferen Schichten der Epidermis nachweisbar, so dass sie nicht ausnahmslos exogenen Ursprungs sind (LAMPE et al. 1983b). Im Rahmen dieser Studie war die Fraktion der Triglyceride diejenige Lipidklasse mit der größten Streuung. Folglich wird angenommen, dass in Abhängigkeit vom jeweiligen Individuum eine unterschiedlich starke Kontamination der Epidermis bestand.

Im Vergleich zu Untersuchungen von GRAY und YARDLEY (1975b) bezüglich des Gehaltes einzelner Lipidfraktionen zeigte die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Epidermis der Ratten verringerte Lipidgehalte. Statt beschriebener 64,2 % neutraler Lipide und 34,7 % polarer Lipide im Gesamtlipidgehalt wurden durch eigene Untersuchungen 86,3 % Neutrallipide und 13,8 % polare Lipide ermittelt. Die Untersuchungen zum epidermalen Lipidgehalt der Euterepidermis des Rindes zeigten hinsichtlich einiger Lipidfraktionen Abweichungen zu Versuchsergebnissen aus der Literatur. Während höhere Anteile an Cholesterol, freien Fettsäuren sowie Triglyceriden detektiert wurden, entsprach der Gehalt an Cholesterolester den Untersuchungen von NETZLAFF et al. (2006). Ein Vergleich der übrigen Lipidfraktionen ist aufgrund des Fehlens verlässlicher Angaben in der einschlägigen Literatur nicht möglich. Untersuchungen zum epidermalen Lipidgehalt beim Hund sind bisher nicht durchgeführt worden. Allerdings wurde durch SHARAF et al. (1977) das

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