3 Material und Methoden
3.2 Methoden
3.2.4 Lipidanalytik
3.2.4.2 Lipidextraktion
Um das Trockengewicht der verwendeten Häute zu erhalten, wurden sie über 3 bis 7 Tage im Exsikkator bei 30°C getrocknet, bis das Probengewicht Konstanz aufwies. Für die weitere Behandlung wurden 100 mg der gewonnenen Trockensubstanz in entfettete Reagenzgläser abgewogen und mittels Chloroform-Methanol-Gemisch (2/1 [V/V]) nach einer modifizierten Methode nach FOLCH et al. (1957) extrahiert, wobei auch der Gesamtlipidgehalt der Proben erfasst wurde (siehe Abbildung 15). Die Extrakte wurden bis zur weiteren Verwendung bei einer Temperatur von -20°C luftdicht verschlossen und lichtgeschützt gelagert.
48
Abbildung 15: Lipidextraktion nach FOLCH et al. (1957) (modifiziert)
Abwiegen von 100 mg Probentrockensubstanz in ein entfettetes Reagenzglas
Hydratation durch Zugabe von 500 µl NaCl-Lösung (300 mM) für 15 Min.
Delipidierung durch Zugabe von 5 ml Chloroform-Methanol-Gemisch (2/1 [V/V]) und 2 Std. rütteln bei 1000 U
Zugabe von 100 µl NaCl-Lösung (300 mM) und Inkubation für 10 Min.
Zentrifugation bei 2500 rpm für 10 Min. bei Raumtemperatur, dabei bilden sich 2 Phasen:
Abpipettieren (3,5 ml) und Filtration durch methanolgetränkte
Watte in entfettetes, gewogenes Reagenzglas
Evaporieren des Lösungsmittels unter Stickstoffbegasung
Wiederaufnahme der eingedampften Probe in 250 µl Chloroform-Methanol-Gemisch
(2/1 [V/V])
Überführung in Gewindeflaschen, luftdichter Verschluss und
Lagerung bei -20°C unter Lichtabschluss Wägen des Reagenzglases zur
Erfassung des Gesamtlipidgehaltes
Untere Phase: mit Lipiden im organischen Lösungsmittel Obere Phase:
wässrig
49 3.2.4.3 Hochleistungsdünnschichtchromatographie
Zur Auftrennung der einzelnen Lipidfraktionen im Lipidextrakt wurde die planare HPTLC (High-performance thin-layer chromatography) verwendet. Die HPTLC ist eine Flüssigkeitschromatographie, bei der die stationäre Phase auf einem ebenen Träger (Glasplatte mit Silicagel) fixiert ist. Eine Trennung der Testsubstanzen erfolgt ebenso wie bei der HPLC durch unterschiedliche Wechselwirkungen (Affinitäten) mit der mobilen und der stationären Phase. Eine Identifikation der entsprechenden Lipide kann aufgrund der Laufstrecken der Substanz relativ zur Laufstrecke der Lösungsmittelfront durchgeführt werden; die so ermittelte Größe bezeichnet man als Rf-Wert (Retarding-factor, Relate to front-factor bzw. Retentionsfaktor; siehe Abbildung 16).
Abbildung 16: Schematische Darstellung des Rf-Wertes
3.2.4.4 Versuchsdurchführung 3.2.4.4.1 Plattenvorbereitung
Auf den HPTLC-Silicagel-Platten (10 x 10 cm) wurden zunächst mit einem Bleistift auf zwei gegenüberliegenden Seiten auf einer Parallele 4 mm vom Plattenrand und im Abstand von 5 mm voneinander entfernt die späteren Auftragungspunkte der Proben markiert. Beim anschließenden “Precleaning” wurde die Platte zur Beseitigung von Schmutzpartikeln mittels
Auftragungspunkt Substanz
Fließmittelfront
a b
Laufrichtung des Fließmittels
Rf = b/a
a: Laufstrecke der Lösungsmittelfront b: Laufstrecke der Substanz
.
50
Methanol gereinigt, indem man dieses von den zwei markierten Seiten her über die Platte diffundieren ließ. Zur Entfernung des auf der Plattenoberfläche absorbierten Wassers wurde die HPTLC-Platte für 30 Minuten bei 120°C im Trockenschrank “aktiviert”. Nach dem Abkühlen der HPTLC-Platte auf Raumtemperatur wurden jeweils 1 µl der Lipidextrakte bzw.
Kalibrationsstandards auf die Markierungen aufgetragen. Somit konnten pro Seite der HPTLC-Platte vier Lipidstandardgemische (Konzentrationen: 1,875 µg/µl; 1,250 µg/µl;
0,625 µg/µl; 0,125 µg/µl) gemeinsam mit 7 Proben (in Doppelbestimmung) aufgetragen werden. Das Lipidstandardgemisch bestand dabei aus folgenden Einzelkomponenten:
Phosphatidylcholin (Phospholipid), Cholesterolsulfat, Galactocerebroside, Ceramid 4 [EOH], Ceramid 3 [NP], Cholesterol, Ölsäure (freie Fettsäure), Triolein (Triglycerid) und Cholesterolester.
3.2.4.4.2 Kammervorbereitung
Um eine Kontamination der HPTLC-Platte mit Schmutzpartikeln zu minimieren, wurde die Entwicklungskammer vollständig mit Methanol gereinigt. Zur Erzeugung eines optimalen Milieus in der Entwicklungskammer befand sich auf deren Boden ein saugfähiges Labortuch, was mit dem entsprechenden Fließmittel vollständig durchtränkt war. Die Kammer wurde mittels Wasserwaage horizontal ausgerichtet.
Vor dem eigentlichen Trennvorgang wurde (zur Erzeugung des gewünschten Milieus in der Kammer) der Kammerdeckel nach dem Einsetzen der HPTLC-Platte für eine Minute geschlossen.
3.2.4.4.3 Trennvorgang
Für eine adäquate Auftrennung der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Lipide wurde ein Fließmittelsystem aus drei Fließmitteln verwendet (siehe Tabelle 11). Jedes Fließmittel diffundierte entsprechend den Auftragungspunkten von zwei Seiten über die HPTLC-Platte.
Zwischen den einzelnen Trennvorgängen lag jeweils eine 5-minütige Trocknungszeit der HPTLC-Platte bei Raumtemperatur.
51
Reihenfolge der Fließmittel Bestandteile Anteil [%] Laufstrecke [cm]
1
Tabelle 11: Ermitteltes Fließmittelsystem für die HPTLC epidermaler Lipide
3.2.4.4.4 Nachbearbeitung und Auswertung
Nach dem Lauf des letzten Fließmittels wurde die HPTLC-Platte für 15 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurde sie über 30 Sekunden in einem Tauchbad mit Derivatisierungsreagenz behandelt. Dieses bestand aus 10 g Kupfersulfatpentahydrat, 10 g Phosphorsäure (85 %) und 80 g Aqua bidestillata. Durch ein 30-minütiges Erhitzen auf einer 180°C heißen Heizplatte wurden die Lipidbanden durch Veraschung visualisiert und detektiert. Für die densitometrische Auswertung wurden die HPTLC-Platten nach dem Abkühlen auf dem Flachbettscanner “Highscan” eingescannt. Die Lipidbanden wurden mit Hilfe der Computer Software Scion-Image® sowohl qualitativ als auch quantitativ gegen die mit auf die HPTLC-Platte aufgetragenen Lipidstandards analysiert. Für eine optimale Auswertung der Lipidbanden, wurde zunächst eine Hintergrundsubtraktion durchgeführt.
Dafür wurde in der Systemeinstellung “Process” die Funktion “Subtract Background”
ausgewählt, in der wiederum die Einstellungen “Rolling ball” (Radius 130) und “1 D Horizontal” nacheinander angewandt wurden, um Störbanden zu entfernen. Die Graustufen der Lipidbanden einer Probe wurden densitometrisch analysiert und mittels Microsoft Excel® graphisch in Form der Fläche unter der Kurve (AUC; area under the curve) dargestellt (siehe Abbildung 17). Überstieg die Konzentration einzelner Lipidbanden die höchste Kalibrationskonzentration, so wurden die entsprechenden Lipidextrakte verdünnt und erneut auf der HPTLC-Platte analysiert.
Die ermittelten Lipidmengen in 1 µl aufgetragenem Lipidextrakt wurden auf 100 mg Trockensubstanz umgerechnet, um einen Vergleich zwischen den Untersuchungsergebnissen
52
zu ermöglichen. Zusätzlich wurde der Anteil der quantifizierbaren Lipide am Gesamtlipidgehalt der Epidermis berechnet.
Abbildung 17: Beispielhafte Auswertung der Lipidbanden eines Lipidstandardgemisches. Die Punkte markieren jeweils den Anfang sowie das Ende der ausgewerteten AUC (1: Phospholipide, 2: Cholesterolsulfat, 3 und 4:
Galactocerebroside, 5: Ceramid 4 [EOH], 6: Ceramid 3 [NP], 7: Cholesterol, 8: freie Fettsäuren, 9: Triglyceride, 10: Cholesterolester)
3.2.5 Histologische Untersuchung
Zur Erfassung histologischer Parameter wurden aus den Häuten Horizontal- und Vertikalschnitte hergestellt, die mittels Hämatoxilin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) angefärbt wurden. Somit standen sowohl Längs- als auch Querschnitte der Haut für die weiteren Untersuchungen zur Verfügung. Pro Tierart wurde dabei die Haut von drei Individuen für die Histologie herangezogen.
3.2.5.1 Versuchsdurchführung
Aus jeder Haut wurde mittels Skalpell eine Probe von 7 mm Durchmesser heraus präpariert und in Tissue freezing Medium eingebettet. Nach einem kurzen Tauchbad in flüssigem Stickstoff (30 Sekunden) erfolgte bis zum Schneideprozess die Lagerung bei -80°C. Die im Kryostatschneider gewonnenen 8 µm dicken Horizontal- und Vertikalschnitte wurden angefärbt (siehe Abbildung 18) und lichtmikroskopisch auf folgende Parameter untersucht:
0
53
Dicke der lebenden Epidermis (ohne Stratum corneum), Dicke des Stratum corneum, Haarfollikelanzahl, -durchmesser und –eindringtiefe (Tabelle 12). Zusätzlich wurde die Anordnung der Haarfollikel in den untersuchten Hautquerschnitten beurteilt. Die Dickenmessungen der Epidermis und der Hornschicht ebenso wie das Erfassen der Eindringtiefe der Haarfollikel erfolgten, indem senkrecht zur Hautoberfläche (bzw. im Fall der lebenden Epidermis zur Oberfläche des Stratum granulosum) in die Tiefe gemessen wurden. Da die Haarfollikeldurchmesser vom Haarfollikelursprung bis zum Austrittsort Größenänderungen unterworfen sind, wurden die Haarfollikel auf ihrer halben Länge vermessen. Die Auswertung, d.h. Messung oder Auszählung einzelner Parameter erfolgte entsprechend dem Standardraster der Zeiss®-Software KS400.
Aufgrund der Messergebnisse der lebenden Epidermis sowie des Stratum corneum ist durch Addition beider Werte die Berechnung der Gesamtdicke der Epidermis möglich. Aus dem so erhaltenen Wert kann wiederum die relative Dicke der Hornschicht (in % der Gesamtdicke der Epidermis einschließlich der Hornschicht) abgeleitet werden.
Untersuchter Parameter Art des Hautschnittes
Anzahl der Hautschnitte
Stichproben-anzahl Dicke des Stratum corneum/der
Epidermis
Querschnitt 10 100
Anzahl der Haarfollikel auf 1 cm2
Querschnitt 5 ---
Durchmesser der Haarfollikel Querschnitt 5 75
Eindringtiefe der Haarfollikel Längsschnitt 5 75
Tabelle 12: Übersicht der untersuchten histologischen Parameter
54
Abbildung 18: Schematische Darstellung der Hämatoxilin-Eosin-Färbung
3.2.6 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte unter Verwendung der Software GraphPad Prism 4.01®.
Absteigende Alkoholreihe (100 %, 96 %, 90 %, 80 %, 70 %)
Jeweils 2 Minuten
Destilliertes Wasser 3 Minuten
Hämalaun (frisch filtriert) 5-12 Minuten
Salzsaurer Alkohol 20 Sekunden
Fließendes Leitungswasser 15 Minuten
Eosin (1 %-ig in Aqua dest. frisch angesetzt und Eisessig: 1 Tr./100 ml)
0,5-2 Minuten
Deckgläschen mittels Entellam auf dem Objektträger fixieren Aufsteigende Alkoholreihe (70 %, 80 %, 90 %, 96 %, 100 %)
20 Sekunden Tauchbad
Bläuen
Eindecken Tauchbad
55 3.2.6.1 Diffusionsversuche
Aus den in den Diffusionsversuchen ermittelten Ergebnissen wurden Graphiken erstellt, in der die Mittelwerte der permeierten Substanzmengen pro cm² gegen die Zeit aufgetragen wurden, so dass die Ermittlung der Lag-Zeit und der Papp-Werte möglich war.
Aus den so ermittelten Ergebnissen wurden für jedes Tier der Mittelwert sowie die Standardabweichung berechnet. Diese wurden mittels One-way-ANOVA-Test statistisch analysiert, wobei ein Konfidenzintervall von 95 % angenommen wurde. Bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) kleiner als 5 %, wurde als Post-Hoc-Test der Tukey´s-Multiple-Comparison-Test angewandt, der die Mittelwerte aller Spezies einzeln gegeneinander verglich.
3.2.6.2 Epidermale Lipidanalytik
Eine statistische Untersuchung der Versuchsergebnisse der Lipidanalytik erfolgte, indem alle Lipidmittelwerte der Einzelindividuen einer Spezies mittels One-way-ANOVA-Test bei einem Konfidenzintervall von 95 % analysiert wurden. Bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) kleiner als 5 %, wurde als Post-Hoc-Test der Tukey´s-Multiple-Comparison-Test angewandt, der die Mittelwerte aller Spezies einzeln gegeneinander verglich.
3.2.7 Hierarchische Clusteranalyse
Um herauszufinden, ob sich innerhalb der untersuchten Versuchsergebnisse (Histolologie und epidermale Lipidanalytik) Gruppen bilden lassen, wurde jeweils eine hierarchische Clusteranalyse durchgeführt. Diese teilt die einzelnen Individuen in Gruppen ein, die sich hinsichtlich der untersuchten Faktoren ähneln.
Die hierarchische Clusteranalyse der epidermalen Lipidgehalte und der histologischen Parameter wurde durchgeführt, indem zunächst eine Mittelwertnormalisierung der einzelnen Parameter durchgeführt wurde. Im Anschluss daran wurde die Clustermethode „centroid linking“ angewandt.
Bei der Lipidanalytik wurde die Fraktion der Triglyceride von der Clusteranalyse ausgeschlossen, da angenommen wird, dass sie größtenteils eine exogene Kontamination ohne Einfluss auf die Permeation darstellen (HEDBERG et al. 1988a, b).
56 4 Ergebnisteil
4.1 In-vitro-Diffusionsversuche 4.1.1 Flufenaminsäure-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Flufenaminsäure sind in Anhangstabelle 1 und 2 dargestellt. Abbildung 19 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Flufenaminsäure-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 20 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 19). In Tabelle 13 sind die in den Diffusionsversuchen mit Flufenaminsäure ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahme [Stunden]
Permeierte Menge an Flufenaminsäure [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 19: Interspeziesvergleich der Flufenaminsäure-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 1,4 mg Flufenaminsäure;
Ratte (n = 4), Rind (n = 8), Hund (n = 4), Schwein (n = 7)
Von den 1,4 mg der topisch applizierten Flufenaminsäure sind nach 30 Stunden bei der Ratte 8,2 %, beim Rind 4,3 %, beim Hund 3,9 % und beim Schwein 3 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
57
Abbildung 20: Auszug aus Abbildung 19; Interspeziesvergleich der Flufenaminsäure-Permeation über die Dauer von 8 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 1,4 mg intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Flufenaminsäure-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation von 1,4 mg Flufenaminsäure ermittelt;
Ratte (n = 4), Rind (n = 8), Hund (n = 4), Schwein (n = 7)
58 4.1.2 Ibuprofen-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Ibuprofen sind in Anhangstabelle 3 und 4 dargestellt. Abbildung 21 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Ibuprofen-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 22 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 21). In Tabelle 14 sind die in den Diffusionsversuchen mit Ibuprofen ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahme [Stunden]
Permeierte Menge an Ibuprofen [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 21: Interspeziesvergleich der Ibuprofen-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 48,6 mg Ibuprofen; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
Von den 48,6 mg des topisch applizierten Ibuprofens sind nach 30 Stunden bei der Ratte 5,8 %, beim Rind 2,8 %, beim Hund 1,9 % und beim Schwein 0,4 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
59
Abbildung 22: Auszug aus Abbildung 21; Interspeziesvergleich der Ibuprofen-Permeation über die Dauer von 8 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 48,6 mg Ibuprofen;
Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4) intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Ibuprofen-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation von 48,6 mg Ibuprofen ermittelt; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
60 4.1.3 Indomethacin-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Indomethacin sind in Anhangstabelle 5 und 6 dargestellt. Abbildung 23 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Indomethacin-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 24 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 23). In Tabelle 15 sind die in den Diffusionsversuchen mit Indomethacin ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 50 100 150 200 250
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahme [Stunden]
Permierte Menge an Indomethacin [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 23: Interspeziesvergleich der Indomethacin-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 3,5 mg Indomethacin; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
Von den 3,5 mg des topisch applizierten Indomethacins sind nach 30 Stunden bei der Ratte 3,8 %, beim Rind 2,5 %, beim Hund 1,4 % und beim Schwein 0,5 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
61
Abbildung 24: Auszug aus Abbildung 23; Interspeziesvergleich der Indomethacin-Permeation über die Dauer von 8 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 3,5 mg intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Indomethacin-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation 3,5 mg Indomethacin ermittelt;
Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
62 4.1.4 Salicylsäure-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Salicylsäure sind in Anhangstabelle 7 und 8 dargestellt. Abbildung 25 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Salicylsäure-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 26 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 25). In Tabelle 16 sind die in den Diffusionsversuchen mit Salicylsäure ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahmen [Stunden]
Permierte Menge an Salicylsäure [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 25: Interspeziesvergleich der Salicylsäure-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 14,7 mg Salicylsäure; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
Von den 14,7 mg der topisch applizierten Salicylsäure sind nach 30 Stunden bei der Rattenhaut 3,8 %, bei der Rinderhaut 2,1 %, bei der Hundehaut 1 % und bei der Schweinehaut 0,6 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
63
Abbildung 26: Auszug aus Abbildung 25; Interspeziesvergleich der Salicylsäure-Permeation über die Dauer von 8 Stunden bei Rind und Schwein und 4 Stunden bei Hund und Ratte (die Stundenwerte 5 bis 8 sind aufgrund eines Defektes der HPLC-Anlage nicht verfügbar) durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 14,7 mg Salicylsäure; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4) intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Salicylsäure-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation von 14,7 mg Salicylsäure ermittelt; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
64
4.1.5 Vergleichende Darstellung der Versuchsergebnisse 4.1.5.1 Papp-Werte
4.1.5.1.1 Vergleich der verwendeten Tierhäute
Die in den Diffusionsversuchen ermittelten Papp-Werte (siehe Tabelle 13 bis 16) der Substanzpermeation sind für jede Spezies gesondert graphisch dargestellt, um die Permeation der verschiedenen Analyten bei den verwendeten vier Spezies miteinander vergleichen zu können. Die Versuchsergebnisse, die für die Abbildung 27 grundlegend sind, sind den Anhangstabellen 1 bis 8 zu entnehmen.
Abbildung 27: Vergleich der in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden ermittelten Papp-Werte der einzelnen Testsubstanzen bei der jeweiligen Spezies durch Angabe des Mittelwertes sowie der Standardabweichung; je Tierart wurden 4 bis 8 Individuen untersucht; *: p < 0,05 (One-way ANOVA); Flu = Flufenaminsäure, Ibu = Ibuprofen, Ind = Indomethacin, Sal = Salicylsäure
Bei allen Spezies ist ein Trend der Papp-Werte erkennbar. Den höchsten Papp-Wert zeigt immer Flufenaminsäure, gefolgt von Ibuprofen. Indomethacin weist einen geringeren Papp-Wert auf
5,0 x 10-7
65
als Ibuprofen; Salicylsäure hat bei allen untersuchten Tierhäuten den geringsten Papp-Wert.
Signifikante Unterschiede sind bei Hund und Schwein zwischen Flufenaminsäure und Salicylsäure vorhanden, sowie zusätzlich beim Schwein zwischen Flufenaminsäure und Ibuprofen bzw. Indomethacin.
4.1.5.1.2 Vergleich der verwendeten Testsubstanzen
Die in den Diffusionsversuchen ermittelten Papp-Werte (siehe Tabelle 13 bis 16) sind für jeden Analyten gesondert in Abbildung 28 graphisch dargestellt, um die Testsubstanzpermeation durch die verschiedenen Tierhäute miteinander vergleichen zu können. Die Versuchsergebnisse, die für die diese Abbildung grundlegend sind, sind den Anhangs-tabellen 1 bis 8 zu entnehmen.
Abbildung 28: Interspeziesvergleich der in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden ermittelten Papp-Werte der einzelnen Testsubstanzen durch Angabe der Mittelwerte sowie der Standardabweichungen; je Tierart wurden 4 bis 8 Individuen untersucht; *: p < 0,05 (One-way ANOVA)
Flufenaminsäure
66
Der Vergleich der Papp-Werte der eingesetzten Testsubstanzen zeigt, dass bei der Haut der Schweine der geringste Papp-Wert auftritt, während eine Zunahme über den Hund und das Rind bis hin zum Schwein beobachtet werden kann. Signifikante Unterschiede sind bei allen Analyten zwischen Ratte und Schwein zu beobachten. Zwischen Hund und Ratte sind bei Flufenaminsäure und Ibuprofen signifikante Unterschiede vorhanden. Darüber hinaus sind die Ergebnisse von Ratte und Rind im Fall der Flufenaminsäure signifikant unterschiedlich.
4.1.5.1.3 Korrelation zwischen den Analyteneigenschaften und den in den Diffusionsversuchen ermittelten Parametern
Bei der Untersuchung des Einflusses physikochemischer Substanzeigenschaften auf das Permeationsverhalten der Analyten wurde ein Zusammenhang zwischen den Parametern Lipophilie, Molekulargewicht und Schmelzpunkt (der Testsubstanzen) mit den in den Diffusionsversuchen ermittelten Papp-Werten und Lag-Zeiten näher charakterisiert. Es kann festgestellt werden, dass eine Korrelation zwischen der Lipophilie und dem Schmelzpunkt mit den Papp -Werten besteht (siehe Abbildung 29 und 30). Das Molekulargewicht scheint weder einen Einfluss auf die Papp -Werte noch auf die Lag-Zeiten zu haben. Darüber hinaus korreliert die Lag-Zeit nicht mit den physikochemischen Parametern Lipophilie und Schmelzpunkt.
4.1.5.1.4 Korrelation zwischen der Lipophilie der Analyten und der Permeabilität Abbildung 29 zeigt den Zusammenhang zwischen dem log Kow der einzelnen Testsubstanzen und den Papp -Werten.
67
0 1 2 3 4 5 6
Ratte Rind Hund Schwein 1,7x10-6
1,2x10-6 1,5x10-6
7,5x10-7 5,0x10-7 2,5x10-7 0 1,0x10-6
Sal Ind Ibu Flu
Log Kow Papp-Wert [cm/s]
Abbildung 29: Korrelation zwischen der Lipophilie (Log KOW) der Analyten und den in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden beobachteten Papp-Werten bei vier verschiedenen Spezies; Flu = Flufenaminsäure, Ibu = Ibuprofen, Ind = Indomethacin, Sal = Salicylsäure; je Tierart wurden 4 bis 8 Individuen untersucht
Abbildung 29 zeigt, dass bei allen untersuchten Spezies mit steigender Lipophilie der Testsubstanzen eine Zunahme der Papp -Werte beobachtet werden kann.
4.1.5.1.5 Korrelation zwischen dem Schmelzpunkt der Analyten und der Permeabilität Abbildung 30 zeigt den Zusammenhang zwischen dem Schmelzpunkt der einzelnen Testsubstanzen und den Papp -Werten.
68
50 150 250 350 450
Ratte Rind Hund Schwein 1,7x10-6
1,2x10-6 1,5x10-6
7,5x10-7 5,0x10-7 2,5x10-7 0 1,0x10-6
Flu Ibu Ind/Sal
Schmelzpunkt [K]
Papp-Wert [cm/s]
Abbildung 30: Korrelation zwischen dem Schmelzpunkt der Analyten und den in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden ermittelten Papp-Werten bei vier verschiedenen Spezies; Flu = Flufenaminsäure, Ibu = Ibuprofen, Ind = Indomethacin, Sal = Salicylsäure; je Tierart wurden 4 bis 8 Individuen untersucht
Abbildung 30 zeigt, dass eine inverse Relation zwischen dem Schmelzpunkt und den Papp -Werten bei allen untersuchten Spezies besteht; im Vergleich zeigen Substanzen mit einem höheren Schmelzpunkt einen geringeren Papp-Wert als Substanzen mit einem niedrigen Schmelzpunkt.
4.1.5.2 Lag-Zeit
4.1.5.2.1 Vergleich der verwendeten Tierhäute
Die in den Diffusionsversuchen ermittelten Lag-Zeiten (siehe Tabelle 13 bis 16) der Substanzpermeation sind für jede Spezies gesondert graphisch dargestellt, um die Lag-Zeit der verschiedenen Analyten bei den verschiedenen Spezies miteinander vergleichen zu können. Die Versuchsergebnisse, die für die Abbildung 31 grundlegend sind, sind den Anhangstabellen 1 bis 8 zu entnehmen.
69
Abbildung 31: Vergleich der in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden ermittelten Lag-Zeiten der untersuchten Testsubstanzen durch Angabe des Mittelwertes sowie der Standardabweichung (*: p < 0,05; One-way ANOVA); Flu = Flufenaminsäure, Ibu = Ibuprofen, Ind = Indomethacin, Sal = Salicylsäure; je Tierart wurden 4 bis 8 Individuen untersucht
Ibuprofen weist bei allen Spezies die geringste Lag-Zeit auf. Es zeigt sich bei den verschiedenen Tierarten jedoch keine übereinstimmende Reihenfolge der weiteren Analyten.
Die beobachteten Ergebnisunterschiede sind nicht signifikant.
4.1.5.2.2 Vergleich der verwendeten Testsubstanzen
Die in den Diffusionsversuchen ermittelten Lag-Zeiten (siehe Tabelle 13 bis 16) sind für jeden Analyten gesondert graphisch dargestellt, um die Lag-Zeiten der verschiedenen Tierhäute miteinander vergleichen zu können. Die Versuchsergebnisse, die für die Abbildung 32 grundlegend sind, sind den Anhangstabellen 1 bis 8 zu entnehmen.
70
Abbildung 32: Interspeziesvergleich der in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden ermittelten Lag-Zeiten der eingesetzten Testsubstanzen durch Angabe des Mittelwertes sowie der Standardabweichung; je Tierart wurden 4 bis 7 Individuen untersucht; *: p < 0,05 (One-way ANOVA)
Die längste Lag-Zeit weist bei allen Analyten das Schwein auf; eine Abnahme der Lag-Zeit findet über den Hund und das Rind zur Ratte statt. Signifikante Unterschiede finden sich bei den Substanzen Flufenaminsäure und Ibuprofen zwischen der Haut der Schweine und der Ratten bzw. Rinder, sowie bei Flufenaminsäure zusätzlich zwischen der Haut der Schweine und der Hunde.
4.2 Ergebnisse der epidermalen Lipidanalytik
Abbildung 33 zeigt beispielhaft ein Chromatogramm der Lipidextrakte von vier Spezies und eines Lipidstandardgemisches.
71
Abbildung 33: Beispiel eines Chromatogrammes mit Angabe der Rf-Werte der untersuchten Lipide (vier Spezies und das Lipidstandardgemisch)
Aus Abbildung 33 wird ersichtlich, dass die zur Verfügung stehenden Lipidstandards nicht die Gesamtheit der epidermalen Lipide abdecken, da eine Vielzahl von Banden durch das
Aus Abbildung 33 wird ersichtlich, dass die zur Verfügung stehenden Lipidstandards nicht die Gesamtheit der epidermalen Lipide abdecken, da eine Vielzahl von Banden durch das