3 Material und Methoden
3.2 Methoden
3.2.7 Hierarchische Clusteranalyse
Um herauszufinden, ob sich innerhalb der untersuchten Versuchsergebnisse (Histolologie und epidermale Lipidanalytik) Gruppen bilden lassen, wurde jeweils eine hierarchische Clusteranalyse durchgeführt. Diese teilt die einzelnen Individuen in Gruppen ein, die sich hinsichtlich der untersuchten Faktoren ähneln.
Die hierarchische Clusteranalyse der epidermalen Lipidgehalte und der histologischen Parameter wurde durchgeführt, indem zunächst eine Mittelwertnormalisierung der einzelnen Parameter durchgeführt wurde. Im Anschluss daran wurde die Clustermethode „centroid linking“ angewandt.
Bei der Lipidanalytik wurde die Fraktion der Triglyceride von der Clusteranalyse ausgeschlossen, da angenommen wird, dass sie größtenteils eine exogene Kontamination ohne Einfluss auf die Permeation darstellen (HEDBERG et al. 1988a, b).
56 4 Ergebnisteil
4.1 In-vitro-Diffusionsversuche 4.1.1 Flufenaminsäure-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Flufenaminsäure sind in Anhangstabelle 1 und 2 dargestellt. Abbildung 19 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Flufenaminsäure-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 20 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 19). In Tabelle 13 sind die in den Diffusionsversuchen mit Flufenaminsäure ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahme [Stunden]
Permeierte Menge an Flufenaminsäure [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 19: Interspeziesvergleich der Flufenaminsäure-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 1,4 mg Flufenaminsäure;
Ratte (n = 4), Rind (n = 8), Hund (n = 4), Schwein (n = 7)
Von den 1,4 mg der topisch applizierten Flufenaminsäure sind nach 30 Stunden bei der Ratte 8,2 %, beim Rind 4,3 %, beim Hund 3,9 % und beim Schwein 3 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
57
Abbildung 20: Auszug aus Abbildung 19; Interspeziesvergleich der Flufenaminsäure-Permeation über die Dauer von 8 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 1,4 mg intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Flufenaminsäure-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation von 1,4 mg Flufenaminsäure ermittelt;
Ratte (n = 4), Rind (n = 8), Hund (n = 4), Schwein (n = 7)
58 4.1.2 Ibuprofen-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Ibuprofen sind in Anhangstabelle 3 und 4 dargestellt. Abbildung 21 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Ibuprofen-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 22 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 21). In Tabelle 14 sind die in den Diffusionsversuchen mit Ibuprofen ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahme [Stunden]
Permeierte Menge an Ibuprofen [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 21: Interspeziesvergleich der Ibuprofen-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 48,6 mg Ibuprofen; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
Von den 48,6 mg des topisch applizierten Ibuprofens sind nach 30 Stunden bei der Ratte 5,8 %, beim Rind 2,8 %, beim Hund 1,9 % und beim Schwein 0,4 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
59
Abbildung 22: Auszug aus Abbildung 21; Interspeziesvergleich der Ibuprofen-Permeation über die Dauer von 8 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 48,6 mg Ibuprofen;
Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4) intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Ibuprofen-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation von 48,6 mg Ibuprofen ermittelt; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
60 4.1.3 Indomethacin-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Indomethacin sind in Anhangstabelle 5 und 6 dargestellt. Abbildung 23 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Indomethacin-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 24 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 23). In Tabelle 15 sind die in den Diffusionsversuchen mit Indomethacin ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 50 100 150 200 250
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahme [Stunden]
Permierte Menge an Indomethacin [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 23: Interspeziesvergleich der Indomethacin-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 3,5 mg Indomethacin; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
Von den 3,5 mg des topisch applizierten Indomethacins sind nach 30 Stunden bei der Ratte 3,8 %, beim Rind 2,5 %, beim Hund 1,4 % und beim Schwein 0,5 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
61
Abbildung 24: Auszug aus Abbildung 23; Interspeziesvergleich der Indomethacin-Permeation über die Dauer von 8 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 3,5 mg intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Indomethacin-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation 3,5 mg Indomethacin ermittelt;
Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
62 4.1.4 Salicylsäure-Permeation
Die Einzelergebnisse der Diffusionsversuche mit Salicylsäure sind in Anhangstabelle 7 und 8 dargestellt. Abbildung 25 zeigt den über alle eingesetzten Tiere gemittelten zeitlichen Verlauf der Salicylsäure-Permeation bei den verschiedenen Spezies. In Abbildung 26 sind zur übersichtlichen Darstellung gesondert die ersten 8 Stunden der Diffusionsversuche dargestellt (Auszug aus Abbildung 25). In Tabelle 16 sind die in den Diffusionsversuchen mit Salicylsäure ermittelten Parameter für die einzelnen Spezies zusammengestellt.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
0 5 10 15 20 25 30
Zeitpunkte der Probenentnahmen [Stunden]
Permierte Menge an Salicylsäure [µg/cm²]
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 25: Interspeziesvergleich der Salicylsäure-Permeation über die Dauer von 30 Stunden durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 14,7 mg Salicylsäure; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
Von den 14,7 mg der topisch applizierten Salicylsäure sind nach 30 Stunden bei der Rattenhaut 3,8 %, bei der Rinderhaut 2,1 %, bei der Hundehaut 1 % und bei der Schweinehaut 0,6 % in der Akzeptorflüssigkeit nachweisbar.
63
Abbildung 26: Auszug aus Abbildung 25; Interspeziesvergleich der Salicylsäure-Permeation über die Dauer von 8 Stunden bei Rind und Schwein und 4 Stunden bei Hund und Ratte (die Stundenwerte 5 bis 8 sind aufgrund eines Defektes der HPLC-Anlage nicht verfügbar) durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichungen) nach Applikation von 14,7 mg Salicylsäure; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4) intraindividuellen Schwankungen des Papp-Wertes der Salicylsäure-Permeation bei vier Tierarten; die Parameter wurden nach einem 30-stündigen Versuch nach Applikation von 14,7 mg Salicylsäure ermittelt; Ratte (n = 4), Rind (n = 4), Hund (n = 4), Schwein (n = 4)
64
4.1.5 Vergleichende Darstellung der Versuchsergebnisse 4.1.5.1 Papp-Werte
4.1.5.1.1 Vergleich der verwendeten Tierhäute
Die in den Diffusionsversuchen ermittelten Papp-Werte (siehe Tabelle 13 bis 16) der Substanzpermeation sind für jede Spezies gesondert graphisch dargestellt, um die Permeation der verschiedenen Analyten bei den verwendeten vier Spezies miteinander vergleichen zu können. Die Versuchsergebnisse, die für die Abbildung 27 grundlegend sind, sind den Anhangstabellen 1 bis 8 zu entnehmen.
Abbildung 27: Vergleich der in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden ermittelten Papp-Werte der einzelnen Testsubstanzen bei der jeweiligen Spezies durch Angabe des Mittelwertes sowie der Standardabweichung; je Tierart wurden 4 bis 8 Individuen untersucht; *: p < 0,05 (One-way ANOVA); Flu = Flufenaminsäure, Ibu = Ibuprofen, Ind = Indomethacin, Sal = Salicylsäure
Bei allen Spezies ist ein Trend der Papp-Werte erkennbar. Den höchsten Papp-Wert zeigt immer Flufenaminsäure, gefolgt von Ibuprofen. Indomethacin weist einen geringeren Papp-Wert auf
5,0 x 10-7
65
als Ibuprofen; Salicylsäure hat bei allen untersuchten Tierhäuten den geringsten Papp-Wert.
Signifikante Unterschiede sind bei Hund und Schwein zwischen Flufenaminsäure und Salicylsäure vorhanden, sowie zusätzlich beim Schwein zwischen Flufenaminsäure und Ibuprofen bzw. Indomethacin.
4.1.5.1.2 Vergleich der verwendeten Testsubstanzen
Die in den Diffusionsversuchen ermittelten Papp-Werte (siehe Tabelle 13 bis 16) sind für jeden Analyten gesondert in Abbildung 28 graphisch dargestellt, um die Testsubstanzpermeation durch die verschiedenen Tierhäute miteinander vergleichen zu können. Die Versuchsergebnisse, die für die diese Abbildung grundlegend sind, sind den Anhangs-tabellen 1 bis 8 zu entnehmen.
Abbildung 28: Interspeziesvergleich der in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden ermittelten Papp-Werte der einzelnen Testsubstanzen durch Angabe der Mittelwerte sowie der Standardabweichungen; je Tierart wurden 4 bis 8 Individuen untersucht; *: p < 0,05 (One-way ANOVA)
Flufenaminsäure
66
Der Vergleich der Papp-Werte der eingesetzten Testsubstanzen zeigt, dass bei der Haut der Schweine der geringste Papp-Wert auftritt, während eine Zunahme über den Hund und das Rind bis hin zum Schwein beobachtet werden kann. Signifikante Unterschiede sind bei allen Analyten zwischen Ratte und Schwein zu beobachten. Zwischen Hund und Ratte sind bei Flufenaminsäure und Ibuprofen signifikante Unterschiede vorhanden. Darüber hinaus sind die Ergebnisse von Ratte und Rind im Fall der Flufenaminsäure signifikant unterschiedlich.
4.1.5.1.3 Korrelation zwischen den Analyteneigenschaften und den in den Diffusionsversuchen ermittelten Parametern
Bei der Untersuchung des Einflusses physikochemischer Substanzeigenschaften auf das Permeationsverhalten der Analyten wurde ein Zusammenhang zwischen den Parametern Lipophilie, Molekulargewicht und Schmelzpunkt (der Testsubstanzen) mit den in den Diffusionsversuchen ermittelten Papp-Werten und Lag-Zeiten näher charakterisiert. Es kann festgestellt werden, dass eine Korrelation zwischen der Lipophilie und dem Schmelzpunkt mit den Papp -Werten besteht (siehe Abbildung 29 und 30). Das Molekulargewicht scheint weder einen Einfluss auf die Papp -Werte noch auf die Lag-Zeiten zu haben. Darüber hinaus korreliert die Lag-Zeit nicht mit den physikochemischen Parametern Lipophilie und Schmelzpunkt.
4.1.5.1.4 Korrelation zwischen der Lipophilie der Analyten und der Permeabilität Abbildung 29 zeigt den Zusammenhang zwischen dem log Kow der einzelnen Testsubstanzen und den Papp -Werten.
67
0 1 2 3 4 5 6
Ratte Rind Hund Schwein 1,7x10-6
1,2x10-6 1,5x10-6
7,5x10-7 5,0x10-7 2,5x10-7 0 1,0x10-6
Sal Ind Ibu Flu
Log Kow Papp-Wert [cm/s]
Abbildung 29: Korrelation zwischen der Lipophilie (Log KOW) der Analyten und den in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden beobachteten Papp-Werten bei vier verschiedenen Spezies; Flu = Flufenaminsäure, Ibu = Ibuprofen, Ind = Indomethacin, Sal = Salicylsäure; je Tierart wurden 4 bis 8 Individuen untersucht
Abbildung 29 zeigt, dass bei allen untersuchten Spezies mit steigender Lipophilie der Testsubstanzen eine Zunahme der Papp -Werte beobachtet werden kann.
4.1.5.1.5 Korrelation zwischen dem Schmelzpunkt der Analyten und der Permeabilität Abbildung 30 zeigt den Zusammenhang zwischen dem Schmelzpunkt der einzelnen Testsubstanzen und den Papp -Werten.
68
50 150 250 350 450
Ratte Rind Hund Schwein 1,7x10-6
1,2x10-6 1,5x10-6
7,5x10-7 5,0x10-7 2,5x10-7 0 1,0x10-6
Flu Ibu Ind/Sal
Schmelzpunkt [K]
Papp-Wert [cm/s]
Abbildung 30: Korrelation zwischen dem Schmelzpunkt der Analyten und den in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden ermittelten Papp-Werten bei vier verschiedenen Spezies; Flu = Flufenaminsäure, Ibu = Ibuprofen, Ind = Indomethacin, Sal = Salicylsäure; je Tierart wurden 4 bis 8 Individuen untersucht
Abbildung 30 zeigt, dass eine inverse Relation zwischen dem Schmelzpunkt und den Papp -Werten bei allen untersuchten Spezies besteht; im Vergleich zeigen Substanzen mit einem höheren Schmelzpunkt einen geringeren Papp-Wert als Substanzen mit einem niedrigen Schmelzpunkt.
4.1.5.2 Lag-Zeit
4.1.5.2.1 Vergleich der verwendeten Tierhäute
Die in den Diffusionsversuchen ermittelten Lag-Zeiten (siehe Tabelle 13 bis 16) der Substanzpermeation sind für jede Spezies gesondert graphisch dargestellt, um die Lag-Zeit der verschiedenen Analyten bei den verschiedenen Spezies miteinander vergleichen zu können. Die Versuchsergebnisse, die für die Abbildung 31 grundlegend sind, sind den Anhangstabellen 1 bis 8 zu entnehmen.
69
Abbildung 31: Vergleich der in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden ermittelten Lag-Zeiten der untersuchten Testsubstanzen durch Angabe des Mittelwertes sowie der Standardabweichung (*: p < 0,05; One-way ANOVA); Flu = Flufenaminsäure, Ibu = Ibuprofen, Ind = Indomethacin, Sal = Salicylsäure; je Tierart wurden 4 bis 8 Individuen untersucht
Ibuprofen weist bei allen Spezies die geringste Lag-Zeit auf. Es zeigt sich bei den verschiedenen Tierarten jedoch keine übereinstimmende Reihenfolge der weiteren Analyten.
Die beobachteten Ergebnisunterschiede sind nicht signifikant.
4.1.5.2.2 Vergleich der verwendeten Testsubstanzen
Die in den Diffusionsversuchen ermittelten Lag-Zeiten (siehe Tabelle 13 bis 16) sind für jeden Analyten gesondert graphisch dargestellt, um die Lag-Zeiten der verschiedenen Tierhäute miteinander vergleichen zu können. Die Versuchsergebnisse, die für die Abbildung 32 grundlegend sind, sind den Anhangstabellen 1 bis 8 zu entnehmen.
70
Abbildung 32: Interspeziesvergleich der in den Diffusionsversuchen über 30 Stunden ermittelten Lag-Zeiten der eingesetzten Testsubstanzen durch Angabe des Mittelwertes sowie der Standardabweichung; je Tierart wurden 4 bis 7 Individuen untersucht; *: p < 0,05 (One-way ANOVA)
Die längste Lag-Zeit weist bei allen Analyten das Schwein auf; eine Abnahme der Lag-Zeit findet über den Hund und das Rind zur Ratte statt. Signifikante Unterschiede finden sich bei den Substanzen Flufenaminsäure und Ibuprofen zwischen der Haut der Schweine und der Ratten bzw. Rinder, sowie bei Flufenaminsäure zusätzlich zwischen der Haut der Schweine und der Hunde.
4.2 Ergebnisse der epidermalen Lipidanalytik
Abbildung 33 zeigt beispielhaft ein Chromatogramm der Lipidextrakte von vier Spezies und eines Lipidstandardgemisches.
71
Abbildung 33: Beispiel eines Chromatogrammes mit Angabe der Rf-Werte der untersuchten Lipide (vier Spezies und das Lipidstandardgemisch)
Aus Abbildung 33 wird ersichtlich, dass die zur Verfügung stehenden Lipidstandards nicht die Gesamtheit der epidermalen Lipide abdecken, da eine Vielzahl von Banden durch das Fehlen des entsprechenden Standards weder qualitativ noch quantitativ bestimmt werden kann.
Die Untersuchungsergebnisse der tierartspezifischen Unterschiede epidermaler Lipide sind in Tabelle 17 für jede Spezies dargestellt.
Rf-Wert Cholesterolester 0,86
Triglyceride 0,71
freie Fettsäuren 0,58
Cholesterol 0,54
Ceramid 3 [NP] 0,47 Ceramid 4 [EOH] 0,38
Galactocerebroside 0,24/0,27 Cholesterolsulfat 0,18
Phospholipide 0,06
Schwein Ratte Rind Hund Standard
72
Tabelle 17: Anteil der untersuchten Lipidfraktionen an der Epidermis (Trockensubstanz) und am epidermalen Gesamtlipidgehalt angegeben für jede Spezies als Mittelwert aus allen untersuchten Individuen; Ratte (n = 6), Rind (n = 15), Hund (n = 8), Schwein (n = 13)
Abbildung 34 und 35 zeigen darüber hinaus die vergleichende graphische Darstellung der Ergebnisse der Untersuchung der einzelnen Lipidfraktionsanteile am epidermalen Trockengewicht.
73
Abbildung 34: Epidermales Lipidmuster von vier Spezies dargestellt als Mittelwert (+ Standardabweichung) der einzelnen prozentualen Lipidfraktionsanteile an der Epidermis (Trockensubstanz); Ratte (n = 6), Rind (n = 15), Hund (n = 8), Schwein (n = 13); PL = Phospholipide, CS = Cholesterolsulfat, GC = Galactocerebroside, C4 = Ceramid 4 [EOH], C3 = Ceramid 3 [NP], C = Cholesterol, FFA = freie Fettsäuren, TGL = Triglyceride, CE = Cholesterolester
Aus Abbildung 34 wird ersichtlich, dass sich durch die graphische Darstellung der epidermalen Lipide der vier Tierarten sehr komplexe Muster ergeben. Die detektierten Lipide lassen sich dabei in zwei Gruppen einteilen. Die erste Gruppe umfasst die Lipide, die mehr als 0,5 % des Trockengewichtes der Epidermis ausmachen. Dazu zählen die freien Fettsäuren, Cholesterol und Triglyceride (Ratte und Rind) sowie Cholesterolester (Hund und Ratte). Die zweite Gruppe umfasst alle Lipide, die weniger als 0,5 % des Trockengewichtes der Oberhaut darstellen. Zu dieser Gruppe zählen Phospholipide, Galactocerebroside, Ceramid 3 [NP], Ceramid 4 [EOH], Cholesterolsulfat, Triglyceride (Hund und Schwein) und Cholesterolester (Rind und Schwein).
74
75
Wie aus Abbildung 35 ersichtlich wird, weist die untersuchte Haut der Ratten den höchsten epidermalen Gesamtlipidgehalt auf, gefolgt von der Haut der Rinder über die der Hunde zur Haut der Schweine. Signifikante Unterschiede sind zwischen den Schweinen und den anderen untersuchten Spezies vorhanden.
Die quantifizierten epidermalen Lipidfraktionen zeigen komplexe Verteilungsmuster innerhalb der untersuchten Spezies. Ceramid 4 [EOH] kann beispielsweise nur in der Epidermis der Schweine nachgewiesen werden. Es macht 0,3 % der Oberhaut aus. Alle weiteren Lipidfraktionen sind bei allen vier Spezies nachweisbar. Zum Teil zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Spezies (unter anderem Ceramid 3 [NP] in der Epidermis der Ratten und der Rinder) oder sie sind nicht signifikant (Triglyceride und freie Fettsäuren).
4.2.1 Anteil der untersuchten Lipide am Gesamtlipidgehalt der Epidermis
Tabelle 18 zeigt die Ergebnisse der Berechnung des quantifizierbaren Anteils des epidermalen Gesamtlipidgehaltes.
Anteil der untersuchten Lipide am epidermalen Gesamtlipidgehalt [%]
Ratte (n = 6)
Rind (n = 15)
Hund (n = 8)
Schwein (n = 13)
Mittelwert 31,7 37,5 32,8 60,8
Standardabweichung 7,3 16,0 12,3 21,1
Tabelle 18: Prozentualer Anteil der untersuchten Lipide von vier Spezies am epidermalen Gesamtlipidgehalt;
Ratte (n = 6), Rind (n = 15), Hund (n = 8), Schwein (n = 13)
Durch die dünnschichtchromatographische Untersuchung der epidermalen Lipide sind beim Schwein etwa 2/3 der epidermalen Lipide detektierbar, während bei den drei anderen untersuchten Spezies (Hund, Ratte und Rind) mit etwa 1/3 ein relativ geringer Anteil der epidermalen Lipide sowohl qualitativ als auch quantitativ nachgewiesen werden kann.
4.3 Ergebnisse der histologischen Untersuchung
Abbildung 36 bis 39 zeigen vergleichend die lichtmikroskopischen Bilder der Transversal- und Horizontalschnitte der vier untersuchten Spezies.
76
Abbildung 36: Transversalschnitt der Haut von Ratte (A) und Rind (B) 40-fach (großes Bild) und 20-fach (kleines Bild) vergrößert (HE-Färbung, 8 µm Dicke)
A
100 µm
B
100 µm
77
Abbildung 37: Transversalschnitt der Haut von Hund (C) und Schwein (D) 40-fach (großes Bild) und 20-fach (kleines Bild) vergrößert (HE-Färbung, 8 µm Dicke)
100 µm
C
D
100 µm
78
Abbildung 38: Horizontalschnitt der Haut von Ratte (A) und Rind (B) in 100 µm Tiefe 10-fach vergrößert (HE-Färbung, 8 µm Dicke); LPH = laterales Primärhaar, PH = Primärhaar, SH = Sekundärhaar
A
100 µm
PH
SH LPH
B
100 µm
PH
SH
79
Abbildung 39: Horizontalschnitt der Haut von Hund (C) und Schwein (D) in 100 µm Tiefe 10-fach vergrößert (HE-Färbung, 8 µm Dicke); LPH = laterales Primärhaar, PH = Primärhaar, SH = Sekundärhaar
C
100 µm
LPH SH
PH
100 µm
PH SH
D
80 4.3.1.1 Dicke der vitalen Epidermis
Die Versuchsergebnisse der Dickenmessung der Oberhaut sind den Anhangs-tabellen 10 und 11 zu entnehmen. Abbildung 40 zeigt die graphische Darstellung der Mittelwerte der jeweiligen Tierart.
Ratte Rind Hund Schwein
0 10 20 30 40 50 60 70
Dicke [µm]
Abbildung 40: Dicke der vitalen Epidermis von vier Spezies (pro Spezies n = 3) dargestellt als Mittelwert (+ Standardabweichung)
Wie aus Abbildung 40 ersichtlich ist, weist die Euterhaut der Rinder mit einem mittleren Wert von 57,3 µm die dickste lebende Epidermis der in dieser Arbeit untersuchten Tierhäute auf.
Die untersuchte Bauchhaut der Schweine hat eine mittlere Epidermisdicke von 36,3 µm. Die Bauchhaut bzw. Bauch- und Rückenhaut der Hunde bzw. Ratten weisen mit 10,2 µm bzw.
9,5 µm die geringsten Dicken der vitalen Epidermis auf.
4.3.1.2 Dicke des Stratum corneum
Die Versuchsergebnisse der Dickenmessung der Hornschicht sind den Anhangstabellen 10 und 11 zu entnehmen. Abbildung 41 zeigt die graphische Darstellung der Mittelwerte der Hornschichtdickenmessung der untersuchten Spezies.
81 (+ Standardabweichung; diese ist beim Hund mit 0,02 so gering, dass sie nicht dargestellt wird)
Wie aus Abbildung 41 ersichtlich ist, weist die Haut der Schweine mit 14,6 µm die dickste Hornschicht der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Tierarten auf, gefolgt von der Haut der Hunde mit einer Hornschichtdicke von 12 µm. Das Stratum corneum der Rinder ist 10,1 µm dick, die Hornschicht der Ratten weist eine durchschnittliche Dicke von 7,2 µm auf.
4.3.1.3 Gesamtdicke der Epidermis und relative Dicke des Stratum corneum
Die Ergebnisse der Berechnung der Gesamtdicke der Epidermis sowie der relativen Hornschichtdicke sind Tabelle 19 zu entnehmen.
Gesamtdicke der Epidermis inkl. Stratum corneum
[µm]
Relative Dicke des Stratum corneum
[% der Gesamtdicke der Epidermis]
Spezies (n = 3)
Mittelwert Standardabweichung Mittelwert Standardabweichung Ratte
Tabelle 19: Gesamtdicke der Epidermis (einschließlich Hornschicht) sowie die relative Hornschichtdicke von vier Spezies (pro Spezies n = 3) dargestellt als Mittelwert und Standardabweichung
82
Die Haut der Rinder weist mit 67,5 µm die dickste Epidermis (inklusive Hornschicht) auf. Bei den Schweinen beträgt die mittlere Gesamtdicke der Epidermis 49,1 µm. Die Häute der Hunde und Ratten haben mit Gesamtdicken von 21,8 µm bzw. 17,2 µm im Gegensatz zu den anderen beiden Tierarten sehr dünne Oberhäute.
Die Ratten und die Hunde weisen mit 55,2 % bzw. 42,2 % eine höhere relative Dicke der Hornschicht auf als die Schweine (29,8 %) und die Rinder (15,1 %).
4.3.1.4 Untersuchung der Haarfollikel
Bei der lichtmikroskopischen Untersuchung der Haarfollikel ist aufgrund der Größenunterschiede der Follikel bei allen untersuchten Tierarten eine Unterscheidung in Primär- sowie Sekundärhaarfollikel möglich. Zentrale und laterale Primärhaafollikel werden nicht separat betrachtet, da sie im Lichtmikroskop zum Teil schwer voneinander abzugrenzen sind.
4.3.1.4.1 Haarfollikeldichte
Die Ergebnisse der Untersuchung der Haarfollikeldichte sind in Tabelle 20 dargestellt.
Haarfollikel
Tabelle 20: Anzahl der Haarfollikel (Primär- und Sekundärhaarfollikel sowie die Gesamtzahl der Haarfollikel) pro cm² Haut von vier Spezies (pro Spezies n = 3)
Die Haut der Ratten weist die höchste Dichte an Haarfollikeln pro cm² auf, gefolgt von der Hundehaut. Die Euterhaut der Rinder und die Schweinehaut haben noch wesentlich geringere Haarfollikeldichten als die bereits beschriebenen Tiere. Das Verhältnis von Primär- zu Sekundärhaarfollikeln beträgt bei der Rattenhaut 1 zu 17,5; bei der Hundehaut ist das
83
Verhältnis mit 1 zu 7,1 geringer. Bei der Haut der Rinder und der Schweine ist das Verhältnis von Primär- und Sekundärhaarfollikeln umgekehrt im Vergleich zu den Ratten und den Hunden. Beim Rind beträgt das Verhältnis von Primär- zu Sekundärhaarfollikeln 1,1 zu 1 und beim Schwein 10 zu 1.
4.3.1.4.2 Haarfollikeldurchmesser
Die Messergebnisse der Haarfollikeldurchmesser sind den Anhangstabellen 10 und 11 zu entnehmen. Abbildung 42 zeigt die graphische Darstellung der Haarfollikel-durchmessermessung der Primär- und Sekundärhaarfollikel der untersuchten Spezies.
Ratte Rind Hund Schwein
Abbildung 42: Ergebnisse der Durchmesser-Messung der Primär- (links) und Sekundärhaarfollikel (rechts) von vier Tierarten (pro Spezies n = 3) durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichung)
Die Primärhaarfollikel der Schweine weisen mit 98 µm den größten Durchmesser aller im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Tierarten auf; der mittlere Durchmesser der Sekundärhaarfollikel beträgt 18 µm. Der mittlere Durchmesser der Primärhaarfollikel der Ratten bemisst sich bei 89,3 µm, die Sekundärhaare sind 19,6 µm dick. Bei den Rindern beträgt die mittlere Dicke der analysierten Primärhaarfollikel 65,4 µm, während die Sekundärhaarfollikel einen Durchmesser von 16,2 µm aufweisen. Beim Hund sind die Primärhaarfollikel durchschnittlich 52,4 µm dick, die Sekundärhaarfollikel 17,5 µm. Während die Durchmesser der Primärhaarfollikel im Vergleich der untersuchten Tierarten großen Schwankungen unterliegen, sind die Sekundärhaarfollikeldurchmesser bei allen Spezies annähernd gleich.
84 4.3.1.4.3 Eindringtiefe der Haarfollikel
Die Versuchsergebnisse der Messung der Eindringtiefe der Haarfollikel sind den Anhangstabellen 10 und 11 zu entnehmen. Abbildung 43 zeigt die graphische Darstellung der Mittelwerte der untersuchten Spezies.
Ratte Rind Hund Schwein
0 200 400 600 800 1000 1200
Eindringtiefe der Haarfollikel [µm]
Abbildung 43: Ergebnisse der Messung der Haarfollikeleindringtiefe bei vier Spezies (pro Spezies n = 3) durch Angabe der Mittelwerte (+ Standardabweichung)
Aus Abbildung 43 wird deutlich, dass die Haarfollikel in der Haut der Hunde am Tiefsten verwurzelt sind (938,8 µm). Die Haarfollikel der Schweine und Rinder sind mit 820 µm bzw.
810,5 µm ungefähr gleich tief verankert. Dahingegen weist die Haut der Ratten mit 549,7 µm die geringste Eindringtiefe der Haarfollikel auf. Die Haare der untersuchten Tierarten zeigen bei der Messung der Haarfollikeleindringtiefe keine Unterschiede zwischen den Primär- und Sekundärhaarfollikeln wie es bei der Haarfollikeldichte sowie dem Haarfollikeldurchmesser möglich ist (siehe Kapitel 4.3.1.4.1 und 4.3.1.4.2).
4.4 Hierarchische Clusteranalyse
Durch die hierarchische Clusteranalyse kann sowohl das komplexe Bild der epidermalen Lipidprofile als auch der histologischen Untersuchung etwas vereinfacht dargestellt werden.
Abbildung 44 und 45 zeigen die graphische Darstellung der hierarchischen Clusteranalyse der epidermalen Lipidprofile bzw. der Histologie.
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Abbildung 44: Darstellung der hierarchischen Clusteranalyse der mittels HPTLC untersuchten Tiere (mit Nummern) nach Mittelwertnormalisierung über die untersuchten Lipide (exklusive der Trigylceride); angewandt wurde die Clustermethode „centroid linking“; die Länge der horizontalen Balken beschreibt die Ähnlichkeit der epidermalen Lipidprofile
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Wie aus Abbildung 44 ersichtlich ist, können die Tiere anhand ihrer epidermalen Lipidmuster in tierartspezifische Verwandtschaftsbeziehungen gesetzt werden. So bilden die untersuchten Hunde und Ratten einen Cluster, während sich die Rinder und die Schweine in mehrere,
Wie aus Abbildung 44 ersichtlich ist, können die Tiere anhand ihrer epidermalen Lipidmuster in tierartspezifische Verwandtschaftsbeziehungen gesetzt werden. So bilden die untersuchten Hunde und Ratten einen Cluster, während sich die Rinder und die Schweine in mehrere,