Der Einfluß von Cholesterol auf die UV-induzierte Peroxidation der Lipide des menschlichen Stratum corneum

Der Einfluß von Cholesterol auf die UV-induzierte Peroxidation

der Lipide des menschlichen Stratum corneum

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

vorgelegt der

Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät

(mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich)

der Martin-Luther-Universität

von Frau Ute Schönfelder

geb. am: 21.12.1971 in: Grimma

Gutachter:

1. Prof. Dr. R. Schubert, Freiburg

2. Prof. Dr. R. Ulbrich-Hoffmann, Halle

3. Prof. Dr. J. Lasch, Halle

Inhalt

1. Zielstellung und Strategie der Arbeit 1

1.1. Zielstellung 1

1.2. Strategie 2

2. Die Wirkungen ultravioletter Strahlung auf die menschliche Haut 4

2.1. Die Haut des Menschen 4

2.1.1. Funktionen und Aufbau der menschlichen Haut 4 2.1.2. Bau und Differenzierungsprozeß der Epidermis 6 2.1.3. Das Zwei-Kompartiment-Modell des Stratum corneums 8 2.2. Wechselwirkungen von UV-Strahlung mit der menschlichen Haut 11 2.2.1. Positive Wirkungen von UV-Strahlung auf die Haut: Vitamin D Synthese 13

2.2.2. Hautschädigende Effekte von UV Licht 13

2.2.3. Oxidativer Streß an der menschlichen Haut 15

2.2.3.1. Reaktive Sauerstoffspezies und ihre Entstehung 16

2.2.3.2. Antioxidative Abwehrmechanismen 18

2.2.4. Schutzmechanismen der Haut vor ultravioletter Strahlung 21

2.2.4.1. Pigmentierung 21

2.2.4.2. Verdickung der Epidermis 22

2.2.4.3. Zelluläre Anpassungsmechanismen an UV-induzierten oxidativen Streß 22

3. Cholesterol als Stratum corneum Lipid 24

3.1. Eigenschaften und Funktionen von Cholesterol in Biomembranen 24

3.2. Cholesterolbiosynthese in der Haut 24

3.3. Die Bedeutung von Cholesterol und seiner Derivate für die Permeabilitätsbarriere

des Stratum corneums 26

4. Material und Bestrahlungsbedingungen 27

4.1. Chemikalien und Geräte 27

4.2. Lipide 29 4.2.1. Lipidmischungen 29 4.2.2. Lipidextraktion 30 4.2.3. Säulenchromatographie 31 4.2.4. Präparative Dünnschichtchromatographie 31 4.2.5. Liposomen 31 4.2.6. Lipidfilme 33

4.3. Bestrahlungsbedingungen 34

4.3.1. Künstlich erzeugtes UV Licht 34

4.3.2. Natürliches Sonnenlicht 35

5. Nachweis der UV-induzierten Oxidation an Stratum corneum Lipiden 36 5.1. Nachweis und Quantifizierung von Lipidoxidationsprodukten 36 5.1.1. Nachweis und Quantifizierung von Malondialdehyd 37 5.1.1.1. Nachweis von Malondialdehyd mit 2-Thiobarbitursäure 39 5.1.1.2. Weitere Nachweismöglichkeiten und biologische Bedeutung von Malondialdehyd

41 5.1.1.3. Entstehung von MDA in Modellmembranen durch UV Bestrahlung 43 5.1.2. Nachweis und Quantifizierung von Lipidhydroperoxiden 46 5.1.2.1. Nachweis von Lipidhydroperoxiden durch 2’,7’-Dichlorofluorescein 47 5.1.2.2. Weitere Methoden zum Nachweis von Lipidhydroperoxiden 49 5.1.2.3. Bildung von LOOH in Modellmembranen durch UV Bestrahlung 50 5.2. Nachweis der UV-induzierten Lipiddegradation mit AMD unterstützter HPTLC 53

5.2.1. AMD unterstützte HPTLC 53

5.2.2. UV-induzierte Lipiddegradation in Modellmembranen 55

5.3. Messung des Sauerstoff-Verbrauchs 59

5.3.1. Aufbau und Funktionsweise der Clark-Elektrode 59 5.3.2. UV-induzierter Sauerstoff-Verbrauch in Liposomensuspensionen 60

5.4. Diskussion 62

5.4.1. Nachweis der UV-induzierten Oxidation an Modellmembranen aus synthetischen

und semi-synthetischen Lipiden 62

5.4.2. Wirkt Cholesterol als Antioxidans? 67

5.4.3. Nachweis der UV-induzierten Oxidation an Modellmembranen aus humanen

Stratum corneum Lipiden 70

6. Mechanismus der UV-induzierten Lipidperoxidation 74

6.1. Analytik von Cholesteroloxidationsprodukten 75

6.1.1. Trennung von Oxysterolen mittels Dünnschichtchromatographie 78

6.1.1.1. Chromatographisches System 78

6.1.1.2. Entstehung von Cholesteroloxidationsprodukten in Liposomen durch

UV-Bestrahlung 81

6.1.2. Trennung von Oxysterolen durch HPLC 84

6.1.2.1. Chromatographisches System 84

6.1.2.2. Entstehung von Cholesteroloxidationsprodukten in hSCLL durch natürliche

Sonnenstrahlung 86

6.2.1. Dimethylsulfoxid als Hydroxylradikal-Fänger 87

6.2.2. Azid als Singulett-Sauerstoff-Fänger 88

6.3. Diskussion 91

7. Folgen der UV-induzierten Oxidation der Stratum corneum Lipide 96

7.1. Glukose-Efflux-Messung 96

7.1.1. Bau und Funktionsweise der Glukoseoxidase-Enzymelektrode 96

7.1.2. Glukose-Efflux aus Liposomen 97

7.2. Einfluß der Oxidation auf das Proliferationsverhalten von humanen Keratinozyten 98

7.2.1. Bestimmung der Zellproliferation 99

7.2.2. Die Wirkung von Lipiden und Lipidoxidationsprodukten auf das Proliferations

verhalten von Keratinozyten 99

7.3. Diskussion 102

7.3.1. Der Einfluß von UV-Strahlung auf die Membranpermeabilität von Modellvesikeln 102 7.3.2. Der Einfluß von Lipidoxidationsprodukten auf humane Keratinozyten 106

1. Zielstellung und Strategie der Arbeit

1.1. Zielstellung

Mit der vorliegenden Arbeit soll die durch ultraviolette Strahlung induzierte Peroxidation der Lipide des menschlichen Stratum corneum nachgewiesen und die Oxidationsprodukte charakterisiert werden.

Im Mittelpunkt der Untersuchungen steht dabei die Frage, inwieweit die besondere Lipidzusammensetzung die Empfindlichkeit der Stratum corneum Lipide gegenüber einer Oxidation beeinflußt. Seit den 70er Jahren wird in der Literatur eine antioxidative Wirksamkeit von Cholesterol diskutiert. Da Cholesterol in erheblicher Konzentration im menschlichen Stratum corneum vorkommt, soll die Frage beantwortet werden, ob und inwiefern Cholesterol die UV-induzierte Peroxidation der Stratum corneum Lipide beeinflußt.

Darüber hinaus soll geklärt werden, nach welchem Mechanismus die UV-induzierte Oxidation der Stratum corneum Lipide verläuft. Diese Frage wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Abhängig von den am Oxidationsmechanismus beteiligten Spezies, lassen sich zwei Oxidationstypen unterscheiden.

Weiterer Gegenstand der Untersuchungen sind die Konsequenzen der UV-induzierten Oxidation der Stratum corneum Lipide für die menschliche Epidermis. So wird in der vorliegenden Arbeit neben dem Nachweis und der Aufklärung des Mechanismus der UV-induzierten Lipidperoxidation untersucht, welche Auswirkungen die Lipidperoxidation für die Permeabilität der untersuchten Modellmembranen hat. Abschließend soll der Einfluß der Lipidoxidationsprodukte auf die Proliferation der humanen Epidermiszellen (Keratinozyten) anhand von Toxizitätsmessungen untersucht werden.

1.2. Strategie

Als Modell für das menschliche Stratum corneum wurden sowohl Liposomen als auch trockene Lipidfilme verwendet. In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, daß sich beide Systeme gut als Modellmembranen für Oxidationsexperimente eignen [Bose et al. 1989; Bathia et al. 1990; Bose und Chatterjee 1994].

Liposomen sind Vesikel, die aus einer oder mehrerer, in sich geschlossener Lipiddoppelschichten bestehen, die ein wäßriges Kompartiment umschließen. Gewöhnlich bilden amphiphile Lipide (z.B. Phospholipide) spontan derartige Strukturen, wobei sich die hydrophilen Molekülteile an der Wasser/Lipid-Grenzfläche, die hydrophoben Teile im Inneren der Lipiddoppelschicht organisieren. Je nach Größe und Lamellarität (Anzahl der Lipidbilayer) unterscheidet man MLV (multilamellar vesicles), SUV (small unilamellar vesicles; < 50 nm) und LUV (large unilamellar vesicles > 60 nm) [Chatterjee und Agarwal, 1988]. Seit den 60er Jahren werden sie als einfaches Modell zur Untersuchung von Struktur und Funktionen von Biomembranen verwendet. Studien zur Membranfluidität, Phasenübergängen, Membranpermeabilität oder Protein-Lipid-Wechselwirkungen wurden an liposomalen Modellmembranen durchgeführt [Chatterjee und Agarwal 1988]. Ihr Vermögen sowohl hydrophile als auch lipophile Substanzen einzuschließen, machen sie zu potentiellen Carriern, um Arzneistoffe in Organe oder Gewebe zu transportieren [Gregoriadis 1988]. Neben diesen Anwendungsgebieten werden Liposomen auch zur Untersuchung der Lipidperoxidation herangezogen [Bose et al. 1989; Bathia et al. 1990]. Sowohl Oxidationsmechanismen [Bose et al. 1990] als auch die Wirksamkeit von Antioxidantien [Pelle et al. 1990] wurde am Liposomenmodell untersucht.

Liposomen lassen sich nicht nur aus Phospholipiden herstellen. Auch die Lipide des menschlichen Stratum corneums bilden Vesikel [Lasch et al. 1994] und können als simples Modell für das menschliche Stratum corneum fungieren.

Im Gegensatz zu einer Vesikelsuspension enthält das Stratum corneum unter physiologischen Bedingungen nur einen geringen Prozentsatz an Wasser (unter 15 %) [Melnick 1990]. Da die Halbwertzeit von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) u. a. vom Reaktionsmedium abhängig ist, kann der hohe Wassergehalt in

den Vesikelsuspensionen zu einer stark von den natürlichen Bedingungen abweichenden ROS Entstehung führen. Wie Halliwell und Gutteridge belegen, ist z. B. die Lebensdauer von Singulett-Sauerstoff in D2O um den Faktor 10 bis 15 höher als in Wasser [Halliwell und Gutteridge 1992]. Um die aus den Vesikelsuspensionen erhaltenen Ergebnisse mit der Situation im menschlichen Stratum corneum vergleichen zu können, wurde zusätzlich die UV-induzierte Lipidperoxidation an trockenen Lipidfilmen untersucht. Bose und

Chatterjee beschrieben ein Lipidfilm-Modell zur Untersuchung der Lipidperoxidation

[Bose und Chatterjee 1994].

Die Liposomen und Lipidfilme, als Modelle für das menschliche Stratum corneum, wurden künstlich erzeugtem und natürlichem UV Licht ausgesetzt und auf diese Weise die Lipidperoxidation induziert. Zur Untersuchung des Einflusses von Cholesterol auf die Oxidation der Stratum corneum Lipide wurde der Cholesterolgehalt in den Modellmembranen variiert.

2. Die Wirkungen ultravioletter Strahlung auf die menschliche

Haut

2.1. Die Haut des Menschen

2.1.1. Funktionen und Aufbau der menschlichen Haut

Die Haut bildet die äußere Begrenzung des menschlichen Körpers gegenüber seiner Umwelt. Mit ihrem breiten Funktionsspektrum ist sie jedoch weit mehr als eine einfache Hülle. Zum einen stellt sie eine Barriere gegenüber schädlichen Umwelteinflüssen, wie chemischen oder physikalischen Noxen sowie Mikroorganismen dar. Gleichzeitig bewahrt sie den Organismus vor dem Verlust von Wasser durch Verdunstung. Zum anderen fungiert die Haut als Sinnesorgan. Rezeptoren für den Tastsinn (Druck, Berührung, Vibration) und das Temperaturempfinden (Thermorezeptoren) sowie Schmerzrezeptoren sind in der Haut lokalisiert. Die Haut spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der Körpertemperatur. Sie ist Ort immunologischer Abwehrmechanismen und Biosynthesen (z.B. Vitamin D3, Cholesterol).

Die Haut ist das größte (Oberfläche bis zu 2 m2) und schwerste (ca. 3 kg) Organ des Menschen. Sie ist aus drei Schichten aufgebaut (Abbildung 1). Die Subcutis, die untere Hautschicht, enthält Fett- und lockeres Bindegewebe. Sie stellt die Verbindung zur angrenzenden glatten Muskulatur her. Sie enthält die Vibrationsrezeptoren. An der Grenze zur darüber liegenden Dermis oder Lederhaut befindet sich der untere Gefäßplexus sowie die Haarfollikel.

Die Dermis besteht aus Bindegewebe, das für die Reißfestigkeit und Elastizität der Haut verantwortlich ist. Das Bindegewebe wird von drei Strukturelementen gebildet: langen, parallel angeordneten Faserbündeln von Kollagen des Typ I und III (Festigkeit), elastischen, verzweigten Elastinfasern (Elastizität) sowie einer viskosen Glukosaminoglykan-Grundsubstanz, in die diese Fasern eingebettet sind. In der Dermis befinden sich außerdem Schweiß- und Talgdrüsen, in ihr verlaufen Nervenbahnen, Blut-und Lypmphgefäße Blut-und sie enthält Sinneszellen (Berührungs- Blut-und Druckrezeptoren).

Zelluläre Bestandteile der Dermis sind die Fibroblasten, die Orte der Glukosaminoglykanproduktion, der Kollagen- und Elastinsynthesen, sowie immunologisch aktive Mastzellen, Makrophagen und Lymphozyten. In der oberen Dermis befindet sich der oberflächliche Gefäßplexus. Unterer und oberflächlicher Gefäßplexus sind durch vertikal verlaufende Gefäße miteinander verbunden. Dieses Gefäßsystem ist nicht nur für die Hautversorgung, sondern auch für die Thermoregulation verantwortlich.

Die Dermis ist mit der darüber befindlichen Epidermis wellenförmig verzahnt. Aufgaben der Epidermis sind vorrangig Barriere- und Schutzfunktionen.

Abbildung 1: Schematischer Querschnitt durch die menschliche Haut mit Epidermis, Dermis und Subcutis [GALDERMA LABORATORIES, Inc. http://www.galderma.com/skin/your-skin.html].

In der menschlichen Epidermis lassen sich lichtmikroskopisch 5 Schichten unterscheiden. Diese werden von Epidermiszellen, den Keratinozyten, unterschiedlicher Differenzierungsstadien gebildet. Die Abbildung 2 zeigt die verschiedenen Epidermisschichten, die nach den morphologischen Merkmalen der sich differenzierenden Keratinozyten bezeichnet werden.

Die Basalzellschicht (Stratum basale) enthält die Keratinoblasten (Stammzellen). Diese sitzen auf der Basalmembran und sind über Hemidesmosomen mit ihr verbunden. Die Basalmembran wird aus einer Vielzahl von Strukturproteinen wie Kollagen Typ IV, Laminin, Fibronectin u.a. gebildet. Sie steht über Ankerfibrillen (Kollagen Typ VII u.a.) mit der Dermis in Verbindung [Fritsch 1990].

Die durch Teilung der basalen Stammzellen entstehenden Tochterzellen wandern während ihrer Differenzierung nach außen. In der Stachelzellschicht (Stratum spinosum) beginnt sich ihre Gestalt zu verändern. Die zuvor säulenförmigen Zellen beginnen abzuflachen und bilden stachelförmige Fortsätze, die benachbarte Zellen über Desmosomen verbinden. Die differenzierenden Keratinozyten produzieren Keratine, die sich intrazellulär zu Filamentbündeln organisieren. Im oberen Stratum spinosum werden intrazelluläre Lamellengranula (Keratinosomen oder Odland-Bodies) sichtbar.

In der Granularzellschicht (Stratum granulosum) finden weitere biochemische und morphologische Veränderungen der Zellen statt. Die Keratinozyten, die immer flacher werden, enthalten durchgängig Keratinosomen. Dabei handelt es sich um Vesikel, die ”geldrollenartige” [Landmann 1991] Stapel von Lipiddoppelschichten enthalten. Die keratinosomalen Lipide werden in den Keratinozyten des Stratum granulosum synthetisiert und vom Golgi-Apparat als Vesikel abgeschnürt. Sie setzen sich vorwiegend aus Sphingolipiden, Sterolen und freien Fettsäuren zusammen. Die Keratinosomen wandern, während die Keratinozyten das Stratum granulosum durchlaufen, an den apikalen Zellpol und verschmelzen schließlich mit der Zellmembran, wobei ihr Lipidinhalt in den Interzellularraum exozytiert wird. Im Stratum granulosum finden neben Synthesen auch Degradationsprozesse statt. Zellkerne und andere Organellen (Mitochondrien) der Keratinozyten werden abgebaut. Die Zellen verlieren ihre Teilungsfähigkeit. Auch die

Plasmamembranen werden sukzessive abgebaut und durch eine Hornhülle ersetzt. Diese verleiht den Keratinozyten zusätzliche Stabilität und Rigidität.

An das Stratum granulosum schließt sich eine dünne, homogene Schicht sehr flacher Keratinozyten an, das Stratum lucidum.

In der äußeren Epidermisschicht, dem Stratum corneum (Hornschicht), haben die Keratinozyten das Ende ihres Differenzierungsprozesses erreicht. Sie werden dann als Corneozyten bezeichnet. Bei den Corneozyten handelt es sich um abgestorbene keratinhaltige Zellreste, die von einer Hornhülle umschlossen sind. Sie sind von sehr flacher Gestalt (ca. 30 µm x 30 µm x 0,5 µm). Eingebettet sind die Corneozyten in dichte multilamellare interzelluläre Lipidschichten.

Weitere in der Epidermis vorkommende Zellpopulationen sind die Melanozyten, immunologisch aktive Langerhans-Zellen, sowie Mechanorezeptoren (Merkel-Zellen). Die Melanozyten befinden sich im Stratum basale, wo sie ähnlich wie die basalen Keratinozyten mit der Basalmembran assoziiert sind. Langerhans-Zellen findet man vorwiegend im Stratum spinosum. Beide Zelltypen sind von heterogener Gestalt. Über zahlreiche dendritische Zellfortsätze stehen sie mit den umgebenden Keratinozyten in Kontakt.

Abbildung 2: Querschnitt durch die menschliche Epidermis. Die Pfeile markieren Melanozyten. Abbildung links: Fritsch 1990; Abbildung rechts: Melnick 1990

2.1.3. Das Zwei-Kompartiment-Modell des Stratum corneums

Das Stratum corneum, bestehend aus verhornten, miteinander verbundenen Corneozyten, eingebettet in eine multilamellare Lipidmatrix, ist die entscheidende Permeabilitätsbarriere der menschlichen Epidermis.

Für eine grobe Beschreibung des Stratum corneums hat sich das ”Brick and Mortar” Modell von Elias durchgesetzt [Elias 1984]. Es vergleicht die Corneozyten mit Ziegelsteinen, die wie in einer Mauer regelmäßig überlappend angeordnet und von einer Mörtelschicht, der interzellulären Lipidmatrix, umgeben sind.

Die multilamellaren, interzellulären Lipidschichten im Stratum corneum sind von charakteristischer und von der übrigen Epidermis abweichender Zusammensetzung. Man findet vorrangig Neutrallipide, wie Triacylglyzerole, Sterole, Sterolester und freie Fettsäuren (Abbildung 3), Sphingolipide (Ceramide, Abbildung 4), sowie Cholesterol-3-sulfat. Die meisten Acylketten der Lipide sowie ein großer Anteil der freien Fettsäuren sind gesättigt. Phospholipide sind im Stratum corneum nur in geringer Konzentration, weniger als 5 % [Melnick 1990], vorhanden. Sie werden im Laufe des Keratinisierungsprozesses zu freien Fettsäuren abgebaut [Landmann 1990].

Die interzellulären Lipide stammen aus den im Stratum spinosum und Stratum granulosum gebildeten Keratinosomen. Nachdem die Keratinosomen an der oberen Grenze des Stratum granulosum in den Interzellularaum sekretiert wurden, erfolgt die Fusion der gestapelten Lipiddoppelschichtscheibchen zu ausgedehnten Lipidschichten.

Die Erneuerung der Epidermis ist ein kontinuierlicher Prozeß. Die Differenzierung der Keratinozyten dauert in der Regel 28 Tage. An der Basalmembran des Stratum basale entstehen durch Teilung permanent Tochterzellen, die in den Keratinisierungsprozeß eintreten. An der oberen Schicht des Stratum corneum schilfern ständig Corneozyten ab.

OCO C C C H 2 2 H H O O O O O S O

Abbildung 3: Charakteristische Stratum corneum Lipide: Triacylglycerole, freie Fettsäuren, freie und veresterte Sterole sowie Cholesterol-3-sulfat.

CER 1 O O NH O HO HO NH O HO HO CER 2 CER 3 NH O HO HO OH NH O HO HO OH CER 5 NH O HO HO OH CER 7 CER 6 OH NH O HO HO OH _OH NH O HO HO O O CER 4 OH

Abbildung 4: Ceramid-Klassen des menschlichen Stratum corneums [Robson et al. 1994].

Das Sonnenlicht, das die Erdoberfläche erreicht, setzt sich aus ultravioletter Strahlung der Bereiche A und B, aus sichtbarem Licht, sowie infraroter Strahlung zusammen. Ein Großteil der von der Sonne emittierten Strahlung wird in den oberen Schichten der irdischen Atmosphäre, in der Ozonschicht, absorbiert oder gestreut. Dazu gehören die Strahlung des UV-C Bereiches (λ≤ 280 nm), sowie 90 % des UV-B Anteils (λ = 280-320 nm). Faktoren, die die Intensität und spektrale Zusammensetzung der ultravioletten Strahlung auf der Erde beeinflussen sind neben der atmosphärischen Ozonschicht sowohl der Sonnenstand, abhängig von Breitengrad, Jahres- sowie Tageszeit, als auch die Anwesenheit von Wolken, Dunst oder Schmutzpartikeln. In Abbildung 5 ist die spektrale Verteilung der Sonnenstrahlung vor und nach der Abschwächung durch die Erdatmosphäre dargestellt.

Abbildung 5: Spektrum der Sonnenstrahlung vor und nach der Absorption durch die Erdatmosphäre. [Environmental Health Criteria 160, WHO, Genf 1994]

Die Epidermis der menschlichen Haut dient nicht nur zum Schutz gegenüber Fremdstoffen und Mikroorganismen, sie stellt auch eine optische Barriere dar, welche ultraviolette Strahlung reflektiert, absorbiert und streut. Trifft Licht auf die Oberfläche der Haut wird ca. 5 % dieser Strahlung reflektiert [Eichler und Seiler 1991]. Die übrige Strahlung dringt in die Haut ein und wird in Abhängigkeit von ihrer Wellenlänge in unterschiedlichem Maße

absorbiert. Dabei verhält sich die Eindringtiefe der Strahlung in die Haut proportional zur Wellenlänge dieser Strahlung. Mit größerer Wellenlänge gelangt die Strahlung tiefer in die Haut. Während die kurzwellige UV-B Strahlung zum überwiegenden Teil im Stratum corneum absorbiert wird, gelangt ein Großteil des UV-A Lichtes bis in die lebenden Epidermisschichten (Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulosum). Langwelliges UV-A, sowie sichtbares Licht erreicht die Dermis. In der folgenden Tabelle sind die Transmissionswerte durch unterschiedliche Hautschichten für verschiedene Wellenlängenbereiche zusammengefaßt.

Tabelle 1: Transmission ultravioletter und sichtbarer Strahlung durch unterschiedliche Schichten der menschlichen Epidermis [Bruels et al. 1984].

Transmission in %

UV-B (290 nm) UV-A (365 nm) VIS (546 nm)

Stratum corneum 14 64 80

lebende Epidermis

2.2.1. Positive Wirkungen von UV-Strahlung auf die Haut: Vitamin D Synthese

Das Vitamin D3 (Calciol) wird durch UV-B Strahlung (297 nm) in der Haut aus seiner Vorstufe (Provitamin D3: 7-Dehydrocholesterol) gebildet [Iseler und Brubacher 1982].

+2

OH

hν

7-Dehydro-Cholesterol (Provitamin D 3)

Calciol (Vitamin D 3)

Vitamin D3 besitzt hormonelle Funktionen. Es reguliert innerhalb des Mineralstoffwechsels die Kalzium- und Phosphatresorption in Darm und Niere und ist deshalb für den Knochenbau von essentieller Bedeutung. Ein Mangel an Vitamin D3 (beispielsweise durch ungenügende UV-B Bestrahlung) äußert sich u.a. als Rachitis.

2.2.2. Hautschädigende Effekte von UV Licht

Ultraviolette Strahlung beeinflußt das Immunsystem. UV-Strahlung (vorwiegend UV-B) löst einen Schwund der Langerhans-Zellen in der Epidermis aus [Rae et al. 1989]. Außerdem wird die Dichte der HLA-Oberflächen Marker reduziert und somit das Antigen-Präsentationsvermögen dieser Zellen herabgesetzt [Koulu et al. 1985, Beissert und Granstein 1995]. Gleichzeitig wird die Aktivität der natürlichen Killerzellen in der Epidermis verringert [Hersey et al. 1988]. Die Folge ist eine lokale Desensiblisierung des Immunsystems.

Chronische UV-B Exposition bewirkt aber auch eine verstärkte Produktion der Interleukine IL-1 und IL-6 [Ramadori 1992]. Dieses Signal stimuliert verschiedene Abwehrzellen, so daß der Verlust an Langerhans-Zellen in der Haut nach einer gewissen Zeit ausgeglichen

wird. Besonders wenn es bereits zu einem Sonnenbrand gekommen ist, führt die Erhöhung des IL-1 Spiegels zur Fieberentstehung, Gefäßerweiterung (Hautrötung) und Entzündung (Prostaglandinbiosynthese). Die durch IL-1 stimulierte Prostaglandinsynthese wird durch die Aktivierung der Phospholipase A2 durch UV Strahlung unterstützt. Die Phospholipase A2 setzt Arachidonsäure aus Membranlipiden frei. Diese geht in die Prostaglandinsynthese ein. [Black 1987, Punnonen et al. 1987, Hanson und DeLeo 1989].

Chronische UV Exposition verändert darüber hinaus das äußere Erscheinungsbild der Haut (Photoaging oder Lichtalterung). Zu den Anzeichen licht-gealterter Haut gehören grobe und feine Falten sowie Schlaffheit [Kligman und Kligman 1986]. Die Ursache für ein solches Erscheinungsbild liegt in einer Schädigung der Dermis. Das Bindegewebsnetzwerk aus Kollagenfasern und Elastin wird zerstört. Die Verbindungen zwischen den Elastinfasern lösen sich, so daß das Elastin in wirren, ungeordneten Knäulen vorliegt. Das Kollagen wird teilweise abgebaut, während verstärkt die Verbindungen der Grundsubstanz synthetisiert werden [Kligman und Kligman 1986].

Infolge eines Sonnenbrandes entstehen in den oberflächlichen Epidermisschichten ‘sunburn cells’. Es handelt sich dabei um Keratinozyten, die aufgrund von nichtreparablen, UV-induzierten DNA-Schäden einen programmierten Zelltod (Apoptosis) durchlaufen. Die Entstehung von sunburn cells wird hauptsächlich durch UV-B verursacht [Danno und Horio 1987].

UV-Strahlung induziert in den Zellen der Dermis und Epidermis DNA-Schäden, wie Pyrimidindimerbildung, Einzelstrangbrüche oder Protein-DNA-Quervernetzungen [Sies 1986]. Der Anteil der UV-A Strahlung an der Entstehung von DNA-Schäden wurde lange Zeit unterschätzt. Inzwischen weiß man, das auch UV-A die Entstehung von Strangbrüchen und Pyrimidindimeren induzieren kann [Stary et al. 1996]. Der UV-A Effekt wird zum einen dadurch verstärkt, daß der UV-A Anteil am natürlichen Sonnenlicht ca. 20-fach höher ist, als der UV-B Anteil [Pitts 1990]. Zum anderen kann UV-A Licht, wie bereits beschrieben, tiefer in die menschliche Haut eindringen [Bruels et al. 1984], während nur ein kleiner Teil der UV-B Strahlung in tiefere Epidermisschichten gelangt.

Die Induktion von DNA Schäden erfolgt jedoch für UV-A und UV-B Strahlung auf unterschiedlichen Wegen. Während UV-B Licht direkt von der DNA absorbiert wird, schädigt das UV-A Licht die DNA auf indirektem Wege. UV-A Strahlung wird nicht von

der DNA, sondern von endogenen Sensitizern (beispielsweise Riboflavinen, Porphyrinen, NAD(P)H, Hämproteinen) absorbiert, die die Entstehung von ROS (Superoxidanionen, Singulett-Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid) induzieren (Vgl. Abschnitt 2.3.1. sowie Kapitel 6). ROS reagieren mit der DNA und führen zur Bildung von Pyrimidindimeren, Strangbrüchen und DNA-Protein-Quervernetzungen [de Laat JMT und de Gruijl 1996]. Auch andere Hautschädigungen sind auf das Wirken von ROS zurückzuführen, beispielsweise die beschriebene Entstehung von sunburn cells [Danno et al. 1984], die Schädigung der epidermalen Langerhans-Zellen [Horio und Okamoto 1987] oder die Prozesse der Lichtalterung [Kligman und Kligman 1986].

In vivo werden Oxidationsschäden an der DNA weitestgehend repariert. Eine unvollständige Reparatur kann jedoch Mutationen zur Folge haben. Häufige Mutationen, die auf UV-induzierte Pyrimidindimere zurückzuführen sind, sind Basenaustausche (G:C

→ A:T) [Stary et al. 1997]. Für die UV-induzierte Entstehung von Hautkrebs sind u.a. solche Punktmutationen verantwortlich [Kanjilal et al 1993, Beissert und Granstein 1995]. Nach heutigem Erkenntnisstand ist vorrangig die UV-B Strahlung für die Krebsentstehung verantwortlich. Doch gibt es inzwischen Hinweise darauf, daß auch UV-A in hohen Dosen (beispielsweise bei der Benutzung von Sonnenbänken) die Tumorentstehung fördert [de Laat und de Gruijl 1996].

2.2.3. Oxidativer Streß an der menschlichen Haut

Vor ca. 1-2 Milliarden Jahren änderte sich die Zusammensetzung der irdischen Ur-Atmosphäre, die bis dahin hauptsächlich aus Wasserdampf, Stickstoff, Kohlendioxid, Methan und Ammoniak bestand und nahezu sauerstoffrei war. Die Entwicklung von sauerstoffproduzierenden Mikroorganismen und die Entstehung von Grünpflanzen führte zu einem Anstieg der Sauerstoffkonzentration. Heute besteht unsere Atmosphäre zu rund 21 % (v/v) aus Sauerstoff, zu 78 % (v/v) aus Stickstoff und zu 1 % (v/v) aus anderen Gasen, darunter 0,03 % (v/v) Kohlendioxid. Mit dem Anstieg der atmosphärischen Sauerstoffkonzentration konnte sich auf der Erde die aerobe Lebensweise etablieren, die

zur Energiegewinnung Sauerstoff als Elektronenakzeptor innerhalb der Atmungskette nutzt. Sauerstoff in Form von Ozon bewahrt außerdem sämtliches Leben auf der Erde vor einem Großteil solarer UV Strahlung (Abbildung 5). Die stratosphärische Ozonschicht (in ca. 20 km Höhe), die für die UV-Absorption verantwortlich ist, entsteht durch die Photolyse von molekularem Sauerstoff durch ultraviolette Strahlung (λ < 242 nm), wobei zunächst atomarer Sauerstoff gebildet wird. Atomarer Sauerstoff verbindet sich mit molekularem Sauerstoff zu Ozon [Holleman und Wiberg 1985].

O2→ O + O O + O2→ O3

Doch der lebensnotwendige Sauerstoff kann unter bestimmten Bedingungen zu einem gefährlichen Zellgift werden. Die Entstehung von ROS kann zu oxidativen Schäden an Lipiden, Nukleinsäuren und Proteinen führen und macht schützende Abwehrmechanismen erforderlich.

2.2.3.1. Reaktive Sauerstoffspezies und ihre Entstehung

Das natürlich vorkommende Sauerstoffmolekül besitzt zwei ungepaarte Elektronen, die in unterschiedlichen π* Orbitalen lokalisiert sind und parallelen Spin aufweisen. Der Sauerstoff liegt im Triplettzustand (3O2) vor und ist ein Diradikal. Diese Konstellation macht den Triplett-Sauerstoff sehr unreaktiv, da er aufgrund des Spinverbots (Pauli-Prinzip) nicht mit Verbindungen im Singulett-Zustand reagieren kann. Reaktionspartner müssen entweder selbst angeregt sein oder der Sauerstoff muß aktiviert werden.

Die Aktivierung von molekularem Sauerstoff kann auf physikalischem Weg durch Energieübertragung oder chemisch durch Elektronentransfer erfolgen [Elstner 1990]. Die physikalische Aktivierung führt zur Spinumkehr bei einem der beiden ungepaarten Elektronen. Als Folge sind beide π* Orbitale mit einem Elektron besetzt, die antiparallelen Spin aufweisen bzw. zwei Elektronen mit antiparallelem Spin besetzen gemeinsam ein π*

Orbital. Sauerstoff in diesem Zustand wird als Singulett-Sauerstoff bezeichnet (1O2). Biologisch ist nur die letztere Form des Singulett-Sauerstoff von Bedeutung [Elstner 1990]. Die chemische Aktivierung von Sauerstoff geht mit der Aufnahme von Elektronen einher. Der Sauerstoff wird reduziert. Die Aufnahme eines Elektrons durch Triplett-Sauerstoff resultiert in der Bildung des Superoxidanions (O2-). Bei dieser Spezies ist ein π* Orbital komplett mit zwei Elektronen, die antiparallelen Spin aufweisen, besetzt, das zweite π* Orbital enthält ein freies Elektron. Das Superoxidanion ist folglich ein Radikal. Superoxidanionen entstehen unter physiologischen Bedingungen durch die unvollständige Reduktion des Sauerstoffs innerhalb der mitochondrialen Atmungskette. Circa 1-2 % der Elektronen verlassen das Cytochrom c bevor O2 vollständig zu Wasser reduziert wurde [Frei 1994]. Die Entstehung von Superoxidanionen erfolgt auch durch verschiedene enzymatische Reaktionen, z.B. durch die Xanthinoxidase, D-Aminosäureoxidasen oder NADPH abhängige Oxidasen in phagozytierenden Zellen, wie Neutrophilen oder Monozyten [Frei 1994].

Die Aufnahme eines weiteren Elektrons durch Superoxidanionen führt zur vollständigen Besetzung der π* Orbitale des Sauerstoffmoleküls. Bei der entstehenden Spezies handelt es sich um Peroxidanionen (O22-), ihre protonierte Form ist Wasserstoffperoxid (H2O2). Biologisch relevant ist die Entstehung von H2O2 infolge der enzymatisch katalysierten Dismutation von Superoxidanionen zu Sauerstoff und Wasserstoffperoxid (Superoxiddismutasereaktion). H2O2 wird durch die Katalase zu Wasser und Sauerstoff abgebaut.

Die Ein-Elektronenreduktion von H2O2 führt zur homolytischen Spaltung der O-O Bindung und zur Entstehung der äußerst reaktiven Hydroxylradikale (OHy) [Czapski 1984]. Die vollständige Reduktion des Sauerstoffs ist mit der Aufnahme von 4 Elektronen im Wassermolekül, beispielsweise durch die Reaktionen in der mitochondrialen Atmungskette, erreicht.

Reaktive Sauerstoffspezies sind außerdem das Peroxynitrit (ONOO-) und andere Stickoxide, Hypochlorid [Panasenko et al. 1994], Ozon, sowie Alkoxyl- (ROy) und Peroxylradikale (ROOy).

Neben den bereits erwähnten biologischen Quellen reaktiver Sauerstoffspezies entstehen ROS auch auf anderen Wegen. Superoxidanionen, Wasserstoffperoxid und

Hydroxyradikale können im wäßrigen Milieu und Anwesenheit von Metallionen (Fe2+, Cu+) aus molekularem Sauerstoff spontan entstehen. Folgende Reaktionen laufen ab [Halliwell und Gutteridge 1992]:

Fe2+ + O2→ Fe3+ + O2

-2 O2- + 2 H+→ O2 + H2O2

Fe2+ + H2O2→ Fe3+ + OH- + OHyy (Fenton-Reaktion)

(Cu+ + H2O2→ Cu2+ + OH- + OHy)

Die Entstehung von Singulett-Sauerstoff ist durch Energieübertragung von angeregten Sensitizermolekülen auf molekularen Triplett-Sauerstoff, die zur Spinumkehr eines ungepaarten Elektrons führt, möglich. Wie in Kapitel 6 dargestellt ist, führt die Absorption von Strahlungsenergie durch einen Sensitizer (S0) zu dessen Anregung (1S, 3S). Der Sensitizer im angeregten Triplettzustand überträgt seine Energie auf Triplett-Sauerstoff (3O2): 0 S →1S →3S 3 O2 + 3S →1O2 + 1S 2.2.3.2. Antioxidative Abwehrmechanismen

Die Haut, als äußere Umhüllung des menschlichen Organismus, ist permanent Umwelteinflüssen, wie ultraviolettem Licht, ausgesetzt. Durch Absorption von UV-Strahlung durch endogene Sensitizer, die zur Entstehung von ROS führt, werden DNA, Proteine, Zucker und Lipide oxidiert [Sies 1986]. Die Folgen sind u. a. DNA Schädigungen (Mutagenese, Cancerogenese), Proteinschäden (Enzyminaktivierung) und Lipidperoxidation (Membranschäden).

An diesen oxidativen Stress ist die Haut mit einer Reihe von antioxidativen Schutzmechanismen angepaßt. Antioxidantien verhindern die Bildung und die Verbreitung von ROS. Man unterscheidet enzymatische und nicht-enzymatische Antioxidantien, die enzymatischen Antioxidantien werden außerdem in primäre und sekundäre Antioxidantien eingeteilt.

Nicht-enzymatische Antioxidantien

Zu den nicht-enzymatischen Antioxidantien gehören die Radikalfänger. Das sind Moleküle, die ungepaarte Elektronen abfangen und selbst zu Radikalen werden. Da diese Radikale relativ stabil sind, können auf diese Weise Oxidationsketten unterbrochen werden. Zu den nicht-enzymatischen Antioxidantien gehören auch Moleküle, mit deren Hilfe oxidierte Radikalfänger regeneriert werden.

Wichtige lipophile, nicht-enzymatische Antioxidantien sind α-Tocopherol, Ubichinon und Ubichinol, sowie β-Carotin. Diese Moleküle wirken als Radikalfänger (z. B. α -Tocopherol) bzw. können mit Singulett-Sauerstoff reagieren (z. B. α-Tocopherol, β -Carotin). Das Redox-System Ubichinol/Ubichinon ist an der Regenerierung von α -Tocopherol-Radikalen beteiligt, sowie selbst ein Radikalfänger [Fuchs et al. 1992].

Die wichtigsten hydrophilen, nicht-enzymatischen Antioxidantien sind Ascorbat und Glutathion. Beide Moleküle sind am Recyclingmechanismus oxidierter Radikalfänger beteiligt. Glutathion fungiert darüberhinaus selbst als Radikalfänger. Ihm kommt bei der Abwehr von UV-Schäden in Zellen der menschlichen Haut (Fibroblasten, Keratinozyten) eine besondere Bedeutung zu. An dermalen Fibroblastenkulturen konnte gezeigt werden, daß die Reduzierung der intrazellulären Glutathionkonzentration, die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber zytotoxisch wirkendem UV-B und UV-A Licht deutlich erhöht [Tyrrell und Pidoux 1986, 1988]. Wie von Connor und Wheeler an der Haut von Mäusen gezeigt wurde, kommt es unmittelbar nach der UV Exposition zur Abnahme der Glutathionkonzentration [Connor und Wheeler 1987]. Auch der α-Tocopherol-, Ubichinon- und Ascorbat-Spiegel sinkt infolge von UV-B Bestrahlung [Fuchs et al. 1989]. Die Abbildung 6 faßt die Mechanismen der Radikalfängerwirkung und -regenerierung zusammen.

-Tocopherol-Radikal α -Tocopherol α RO ROO

.

.

Abbildung 6: Recyclingmechanismen von nicht-enzymatischen Antioxidantien nach Shindo et al. 1994

Enzymatische Antioxidantien

Zu den enzymatischen Antioxidantien gehören Enzyme, die ROS abbauen sowie Enzyme, die oxidierte Radikalfänger regenerieren. Diese antioxidativen Enzyme werden als primäre Antioxidantien bezeichnet [Urban 1995]. Zu den sekundären enzymatischen Antioxidantien werden jene Enzyme gezählt, die oxidierte Proteine abbauen, Lipidhydroperoxide metabolisieren sowie DNA-Schäden reparieren. Primäre enzymatische Antioxidantien sind die Superoxiddismutase (SOD), die Katalase sowie die Glutathion-Peroxidase und -Reduktase (GSH-Px, GSSG-Red).

Wie die nicht-enzymatischen Antioxidantien werden auch die enzymatischen Antioxidantien von UV-Strahlung beeinflußt. Die SOD Aktivität in der Haut von Mäusen sinkt nach einer einmaligen UV-B Bestrahlung signifikant ab und regeneriert sich innerhalb von 72 h [Miyachi et al. 1987]. Ursache ist eine Schädigung des Proteins durch ROS z. B. H2O2 [Bray und Cookle 1974]. Auch die Aktivitäten der Katalase und der Glutathion-Reduktase nehmen infolge von UV-B Bestrahlung ab. Dies wurde sowohl an der Haut von Mäusen [Fuchs et al. 1989] als auch an humanen Keratinozytenkulturen nachgewiesen [Punnonen et al. 1991].

Stunden bis Tage nach einem oxidativen Angriff durch UV-induzierte ROS, kommt es zur Regenerierung der hauteigenen Antioxidantien. Im Falle der Glutathion verbrauchenden

und regenerierenden Enzyme (GSH-Px, GSSG-Red), aber auch der SOD erfolgt eine Erhöhung der Enzymkonzentration einige Tage nach der UV-Exposition [Shindo et al. 1994].

2.2.4. Schutzmechanismen der Haut vor ultravioletter Strahlung

2.2.4.1. Pigmentierung

Die Absorption von UV-Strahlung in der Haut wird durch Makromoleküle, wie Proteine (Tyrosin-, Tryptophanseitenketten) oder DNA, hervorgerufen. Die wichtigsten UV-absorbierenden Substanzen in der Haut sind jedoch die Melanine. Diese Pigmente werden in den Melanosomen der in der Basalschicht der Epidermis vorkommenden Melanozyten produziert. Melanosomen sind vom Golgi-Apparat abgeschnürte, tyrosinasehaltige Vesikel. Im Verlaufe der Melanosomenreifung reichert sich Melanin durch das Wirken der Tyrosinase in den Melanosomen an. Biosynthesevorstufen für Melanin sind Tyrosin und 3,4-Dihydroxyphenylalanin (Dopa). Grundsätzlich werden zwei Arten von Melaninen unterschieden: die schwarzbraunen, nahezu unlöslichen, gegen Chemikalien sehr resistenten Eumelanine und die gelblich, rötlichen Phaeomelanine. Letztere sind in verdünnten Alkalien löslich und kommen seltener vor als die Eumelanine. In den menschlichen Melanozyten werden jedoch stets beide Formen produziert.

Die reifen Melanosomen wandern durch die dendritischen Zellfortsätze der Melanozyten in die benachbarten Keratinozyten, wo sie in Melanosomenkomplexen verpackt werden. Die Hautfarbe des Menschen wird durch Anzahl, Größe und Verteilung dieser Melanosomenkomplexe bestimmt.

Die Melaninbildung wird durch UV Licht induziert. Man kann zwei Arten der UV-induzierten Pigmentierung unterscheiden [Rorsman 1989]. Die sofortige Bräunung (immediate pigment darkening, IPD), die noch während der UV-Bestrahlung einsetzt, beruht auf der Oxidation des in der Haut bereits vorhandenen Melanin-Pigments. Das IPD ist nicht von Dauer, es bildet sich bereits wenige Stunden nach der Bestrahlung zurück.

Diese Bräunung wird hauptsächlich durch UV-A hervorgerufen. Daneben gibt es die verzögerte Bräunung (delayed tanning, DT). Sie ist erst einige Tage nach der UV-Exposition sichtbar und beruht auf der Neubildung von Melanin. Diese Bräunung ist von längerer Dauer. UV-B induziert das DT effektiver als UV-A.

Neben der Absorption von UV Strahlung durch Melanin [Musk und Parsons 1987], besteht die schützende Wirkung dieser Pigmente auch darin, freie Radikale abzufangen und so unschädlich zu machen [Pathak und Stratton 1968].

2.2.4.2. Verdickung der Epidermis

Infolge der Einwirkung von UV-Strahlung auf die menschliche Haut kommt es zu einer deutlichen Verdickung der Epidermisschichten [Lavker und Kaidbey 1997]. Es entsteht eine sogenannte Lichtschwiele. Dies beruht auf Störungen in der Keratinozytendifferenzierung. Die im Normalfall erfolgende Abflachung der Keratinozyten während ihrer Differenzierung, wird durch UV Einwirkung gestört. Die Zellen flachen sich nicht so stark ab und verlieren ihre regelmäßige Anordnung. Außerdem kommt es zu einer verstärkten Proliferation und einer erhöhten Zahl der übereinander liegenden Zellschichten [Bernerd und Asselineau 1997]. Die Folge ist eine Verdickung der gesamten Epidermis bis zum Doppelten ihrer ursprünglichen Ausdehnung [NIH Consens Statement 1989]. Diese Effekte werden sowohl durch UV-B als auch UV-A Strahlung ausgelöst.

Durch die Verdickung der Epidermis (einschließlich der Hornschicht) wird ein größerer Teil der besonders gefährlichen UV-B Strahlung absorbiert [Bruels et al. 1984] und gelangt somit nicht in tiefere Hautschichten.

2.2.4.3. Zelluläre Anpassungsmechanismen an UV-induzierten oxidativen Streß

Oxidativer Stress, hervorgerufen durch H2O2, UV-A Bestrahlung oder Glutathionmangel, bewirkt in humanen Fibroblasten die Induktion der Hämoxygenase 1 [Vile und Tyrrell 1993]. Als Stressantwort steigen sowohl der mRNA Spiegel, als auch die Aktivität dieses mikrosomalen, Häm abbauenden Enzyms. Die Folge des Hämabbaus ist ein intrazellulärer

Anstieg der Konzentration von freiem Fe2+. Diesem Signal folgt eine Erhöhung der Ferritinkonzentration. Ferritin ist ein Fe2+ komplexierendes Protein, das den intrazellulären Fe2+-Spiegel reguliert. Da ungebundenes Fe2+ die Lipidperoxidation induzieren kann (Vgl. Abschnitt 1.2.3.1.), führt eine Erhöhung der Ferritinkonzentration, zu einer effektiveren Komplexierung von Fe2+ Ionen und somit zu einer Erhöhung des antioxidativen Status der Zelle.

3. Cholesterol als Stratum corneum Lipid

+2

3.1. Eigenschaften und Funktionen von Cholesterol in Biomembranen

Das Cholesterolmolekül besitzt eine amphipatische Struktur. Das planare Steroidgerüst enthält eine hydrophile Hydroxylgruppe in 3β-Stellung sowie eine hydrophobe aliphatische Seitenkette am Kohlenstoffatom 17. Cholesterol ist Bestandteil von fast allen eukaryontischen Zellmembranen. Entsprechend seiner Struktur baut es sich so in eine Lipiddoppelschicht ein, daß die hydrophile OH-Gruppe an die wässrige Phase grenzt und sich das Steroidgerüst und die aliphatische Seitenkette im hydrophoben Kettenbereich der Phospholipide befinden.

Cholesterol beeinflußt die Eigenschaften der Lipidmembran. Es ist bereits lange bekannt, daß der Einbau von Cholesterol den Ordnungsgrad der Membran erhöht. Durch die Behinderung der cis-trans-Isomerisierungen an Doppelbindungen kommt es zu einer engeren Packung der Acylketten. Dieser Effekt ist als ‘condensing effect’ beschrieben [Tajima und Gershfeld 1978, Stillwell et al. 1994] und resultiert in einer Verringerung der Membranpermeabilität [Demel et al. 1972]. Darüber hinaus kann Cholesterol die Membranfunktionalität auch durch Wechselwirkung mit Membranproteinen, z. B. der Na+/K+ ATPase in Erytrozytenmembranen, beeinflussen [Yeagle 1983].

3.2. Cholesterolbiosynthese in der Haut

Cholesterol wird im menschlichen Organismus hauptsächlich in der Leber und der Darmmukosa synthetisiert. Hauptort der extrahepatischen, extraintestinalen Cholesterolbiosynthese ist die Haut [Melnick 1990]. Sowohl die Zellen der Dermis als auch der Epidermis (Keratinozyten des Stratum basale) synthetisieren Cholesterol.

Die de novo Synthese von Cholesterol geht vom Acetyl Coenzym A aus. Über die Zwischenverbindung Acetoacetyl Coenzym A wird das 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzym A gebildet (HMG-CoA). Die Reduktion des HMG-CoA zum Mevalonat ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Biosynthese. Mevalonat wird schrittweise phosphoryliert und anschließend decarboxyliert. Das entstehende Isopentenyl-Pyrophosphat (C5) geht in mehrere Kondensationsschritte ein. Es entsteht zunächst Geranyl-Pyrophosphat (C10), anschießend das Farnesyl-Pyrophosphat (C15). Bis zu diesem Syntheseschritt finden alle Reaktionen im Zytosol der Zellen statt. Die Verknüpfung von zwei Molekülen Farnesyl-Pyrophosphat führt zur Entstehung von Squalen (C30), das nicht mehr wasserlöslich ist. Die weiterführenden Reaktionen finden an membranständigen Enzymen statt. Über eine Epoxidierung wird die Sauerstoff-Funktion am C3 eingeführt, es folgen Zyklisierungen, 3 Demethylierungen, die Einführung der ∆5- Doppelbindung, sowie die Sättigung der aliphatischen Seitenkette.

Die Cholesterolbiosynthese wird sowohl in Leber und Darm als auch in der Haut über die HMG-CoA Reduktase Reaktion reguliert. Hohe Mevalonat- und Cholesterolkonzentrationen hemmen die HMG-CoA Reduktase (Produkthemmung) und inhibieren damit die gesamte Biosynthese von Cholesterol. Die Regulation der hepatischen HMG-CoA Reduktase funktioniert hauptsächlich über die rezeptorvermittelte Aufnahme von Lipoproteinen (LDL). Diese binden an die LDL Rezeptoren der Leberzellen, werden endozytiert und in Lysosomen verdaut. Frei werdendes Cholesterol hemmt die HMG-CoA Reduktase. Die Cholesterolbiosynthese in der Leber wird außerdem durch Oxysterole (7α -und 7β-Hydroxy- sowie 7-Keto-Cholesterol) gehemmt [Kandutsch und Chen 1973].

Die Cholesterolbiosynthese in der Haut läuft unabhängig vom übrigen Cholesterolstoffwechsel ab. Die Regulation der epidermalen HMG-CoA Reduktase erfolgt nicht durch die LDL Konzentration. Die differenzierten Keratinozyten besitzten keine LDL Rezeptoren. Lediglich die undifferenzierten basalen Keratinozyten weisen noch LDL Rezeptoren auf. Die Funktion des HMG-CoA Inhibitors übernimmt in der epidermalen Cholesterolbiosynthese das Cholesterol-3-sulfat [Williams et al. 1985]. Dieses kann im Gegensatz zu LDL die Zellembranen auch ohne Rezeptor passieren. Cholesterol-3-sulfat entsteht durch die Übertragung eines Sulfatrestes vom 3’-Phospho-adenosin-5’-phosphat

(PAPS) auf das Cholesterol. Katalysiert wird diese Reaktion durch die Cholesterol-sulfotransferase.

3.3. Die Bedeutung von Cholesterol und seiner Derivate für die Permeabilitätsbarriere des Stratum corneums

Das Stratum corneum der menschlichen Haut enthält sehr hohe Konzentrationen an freien und veresterten Sterolen, sowie Cholesterol-3-sulfat. In verschiedenen Arbeiten variiert die ermittelte Cholesterolkonzentration zwischen 18,8 % [Lampe et al. 1983] und 43,5 % [Zellmer und Lasch 1997]. Die Konzentrationen von Sterolestern werden mit 12,4 % (Lampe) und 9,4 % (Zellmer), der Gehalt an Cholesterol-3-sulfat mit 3,4 % (Lampe) und 2,1 % (Zellmer) angegeben.

Die besondere Lipidzusammensetzung ist für die Rigidität und geringe Permeabilität des Stratum corneums verantwortlich. Die hauptsächlich aus Ceramiden, Sterolen und freien Fettsäuren bestehenden Lipidschichten werden durch eine Vielzahl von Wasserstoffbrücken stabilisiert. Hinzu kommt der kondensierende Effekt durch die Einlagerung von Cholesterol in hohen Konzentrationen. Zusätzliche Festigkeit bekommen die interzellulären Lipidlamellen durch das Ceramid I, das aufgrund seiner langen Acylkette (Abbildung 4) mehrere benachbarte Lipidschichten durchspannt und somit ihren Zusammenhalt verstärkt. Möglicherweise trägt auch Cholesterol-3-sulfat zur Stabilisierung der MILLs bei. Wie Landmann beschreibt, ermöglicht es durch seine negative Ladung die Verbindung benachbarter Lipidschichten über divalente Kationen (Ca2+) [Landmann 1991]. Diese Ansicht ist jedoch umstritten. Serizawa und Mitarbeiter konnten keinen Zusammenhang zwischen der Cholesterol-3-sulfat Konzentration und dem Zusammenhalt der Stratum corneum Lipidlamellen feststellen [Serizawa et al. 1992].

4. Material und Bestrahlungsbedingungen

4.1. Chemikalien und Geräte

Chemikalien:

Bengal Rosa (4,5,6,7-tetrachloro-2’,4’,5’,7’-tetraiodo-fluorescein sodium salt), Sigma, St. Louis, MO, USA

n-Butanol, > 99,5% (GC), Fluka, Neu-Ulm

Non-Hydroxy Fatty Acid Ceramide (Typ III); Hydroxy Fatty Acid Ceramide (Typ IV), Sigma, St. Louis, MO, USA

Chloroform, HPLC-rein, Merck, Darmstadt Cholesterol, Sigma, St. Louis, MO, USA

Cholesterol-3-sulfat, Sigma, St. Louis, MO, USA CuSO₄ x 5 H2O, VK Labor- und Feinchemikalien

DCF (2’,7’-Dichlorodihydro-fluorescin diacetate), Molecular Probes, Eugene, OR, USA Diethylether, Fluka, Neu-Ulm

Ethylacetat, HPLC-rein, Fluka, Neu-Ulm

β-D-Glukose, Merck, Darmstadt

HEPES (0,1 M); 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure, (pH 7,4), Fluka, Neu-Ulm

Hematin, from bovine blood, Sigma, St. Louis, MO, USA n-Hexan, HPLC-rein, Fluka, Neu-Ulm

H₂O₂ (30%ig), Fluka, Neu-Ulm

HPODE [13(S)-Hydroperoxy-(9Z,11E)-octadeca-dienoic Acid], Sigma, St. Louis, MO, USA

HPTLC-Fertigplatten Si 60, Merck, Darmstadt 7-Keto-Cholesterol, Sigma, St. Louis, MO, USA Kieselgel Si 60, Merck, Darmstadt

PBS (Phosphate Buffered Saline), 0,145 M, pH 7,4; Fluka, Neu-Ulm Na₂HPO₄ x 12 H₂O 1,98 g/l NaH₂PO₄ x H₂O 0,157 g/l NaCl 8,1 g/l PSC-Fertigplatten, Kieselgel 60, Merck, Darmstadt

Scintillationscocktail, Ultima Gold Canberra Packard GmbH, Dreieich Sephadex G 25 Medium, Pharmacia, Fine Chemicals, Upsala, Schweden Stearinsäure, Sigma, St. Louis, MO, USA

1,1,3,3-Tetraethoxypropan, Approx. 97 %, Sigma, St. Louis, MO, USA

TMPD (N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylendiamine), Sigma, St. Louis, MO, USA 2-Thiobarbitursäure, Minimum 98 %, Sigma, St. Louis, MO, USA

Trichloressigsäure, zur Analyse, Merck, Darmstadt

TRIS [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan], 0,1 M, pH 7,4; Merck, Darmstadt TRITON X-100, Serva, Feinbiochemica, Heidelberg

6-[3H]-Thymidin, American Radiolabled Chemicals Inc., St. Louis, MO, USA

Geräte:

AMD, CAMAG, Muttenz, Schweiz

Autosizer II C, Malvern Instruments, Worcestershire, UK

Differential Scanning Calorimeter, Microcal DC-2, Northampton, MA, USA Clark-Elektrode, RE K1-1N, Biolytik, Bochum

Extrusionseinheit, LiposoFast Basic und LiposoFast pneumatic, AVESTIN, Inc., Ottawa, Canada

Porengröße des Filters: 200 nm

Fluoreszenzspektrophotometer, F 4500, HITACHI, Inc.

λex = 515 nm; λem = 553 nm (TBARS)

λ_ex = 470 nm; λ_em = 535 nm (DCF) Spaltbreite: Ex 2,5 nm; Em 5,0 nm

Glukoseoxidase-Enzymelektrode, ESAT 6660, Medingen, Dresden Hochdruck-Quecksilberdampflampe, HBO 200W, Osram, München

Filter: KG 3, UG 11, Schott, Mainz HPLC S 1000, SYKAM, Gilching

DIOL-Säule (250 mm x 4 mm), Altech Associates Inc., Deerfield, IL, USA UV-Detector, Linear 204, Linear Instruments, Reno, Nevada, USA

λabs = 215 nm

ELSD-Detector, MK III, Alltech Associates Inc., Deerfield, IL, USA Drift Tube Temperatur: 73 °C

Gas-Fluß: 1,80 l/min

HPTLC Auftragegerät, LINOMAT II, CAMAG, Muttenz, Schweiz Pocketradiometer, RM 11, Dr. Göbel UV-Elektronik GmbH, Ettlingen Scintillationszähler, Wallac 1410, Berthold, Berlin

TLC Scanner II, CAMAG, Muttenz, Schweiz Lampe: Wolfram; λ_abs = 550 nm

Spaltbreite: 0,3 mm; Spaltlänge: 4 mm Monochromatorbandbreite: 30 nm Zellharvester, IH-110, Wohlen, Schweiz

4.2. Lipide

4.2.1. Lipidmischungen

Für die im folgenden vorgestellten Untersuchungen wurden synthetische und semi-synthetische Lipide in verschiedenen Mischungsverhältnissen zu Liposomen bzw. Lipidfilmen präpariert. Die Lipidmischungen enthielten neben Cholesterol-3-sulfat (ChS), Stearinsäure (SA) und Cholesterol (Ch), die beiden kommerziell erhältlichen Ceramide aus Rinderhirn (Cer) im Verhältnis 1/1. Der Cholesterolgehalt wurde von 0 % (w/w) bis 50 % (w/w) variiert, während die Konzentrationen der anderen Membranlipide, relativ zueinander, konstant gehalten wurden (Tabelle 2). Neben den Liposomen aus synthetischen

und semi-synthetischen Lipiden wurden auch Vesikel aus humanen Stratum corneum Lipiden (hSCLL) untersucht.

Tabelle 2: Lipidzusammensetzung der untersuchten Modellmembranen.

Abkürzungen: Cer, Ceramide; Ch, Cholesterol; ChS, Cholesterol-3-sulfat; SA, Stearinsäure; FA, Fettsäuren; hSCLL, humane stratum corneum Lipid Liposomen. Lipidzusammensetzung der hSCLL nach Zellmer und Lasch 1997

Suspension Lipidzusammensetzung (Gewichts-%)

Cer Ch ChS SA 1 31 50 4 15 2 40 35 5 20 3 49 20 6 25 4 55 10 7 28 5 61 0 8 31 ”hSCLL” *) 20 43 2 20

*) hSCLL enthalten außerdem 15 % Sterolester und Triacylglycerole

4.2.2. Lipidextraktion

Lipide des menschlichen Stratum corneums wurden aus Hornhautstücken der Fußsohle nach einer modifizierten Methode von Bligh und Dyer gewonnen [Bligh und Dyer 1959]. Ca. 1 g Hornhaut wurde mit 30 ml Chloroform/Methanol = 1/1 (v/v) über Nacht gerührt und anschließend abfiltriert. Der Extrakt wurde gegen 10 ml 0,145 M PBS (pH 7,4) ausgeschüttelt. Auf diese Weise trennt sich eine wäßrige von einer organischen Phase ab. Letztere enthält die Lipide und kann in einem Scheidetrichter von der wäßrigen, pufferhaltigen Phase separiert werden. Die Lipide wurden im Stickstoffstrom getrocknet und über Nacht unter reduziertem Druck aufbewahrt. Die exakte Zusammensetzung des Extrakts wurde mit AMD unterstützter HPTLC bestimmt (Tabelle 2).

4.2.3. Säulenchromatographie

Der Stratum corneum Lipidextrakt wurde säulenchromatographisch weiter aufgereinigt. Verwendet wurde eine Säule von 65 cm Länge mit 1,5 cm Durchmesser. Das Kieselgel (Si 60) wurde im Elutionsmittel in die Säule gefüllt und einige Stunden bei 4 °C equilibriert. Der Lipidextrakt (20 mg) wurde auf die Säule aufgetragen und mit Diethylether/n-Hexan = 85/15 (v/v) eluiert. Die Flußrate betrug 0,5 ml/min. Das Eluat wurden in 50 Fraktionen von jeweils ca. 1 ml aufgefangen. Die lipidhaltigen Fraktionen wurden vereinigt und ihre Zusammensetzung mit AMD unterstützter HPTLC bestimmt.

4.2.4. Präparative Dünnschichtchromatographie

Auf PSC-Fertigplatten (Kieselgel 60) wurden 5 mg Stratum corneum Lipidextrakt aufgetragen und die Platte mit Chloroform/Methanol = 95/5 (v/v) in einer Horizontalkammer entwickelt. In diesem Laufmittelgemisch wurden die Lipide von polaren Verunreinigungen getrennt, die auf der Auftragelinie liegen blieben. Nach der Entwicklung konnten diese polaren Substanzen aus der Platte herausgekratzt werden. Das übrige Kieselgel wurde ebenfalls von der Platte entfernt. Die Lipide wurden mit Chloroform/Methanol = 1/1 (v/v) extrahiert und das Kieselgel durch mehrfaches Zentrifugieren abgetrennt.

4.2.5. Liposomen

Zur Präparation der Liposomen wurden die Lipide in Chloroform, Methanol bzw. Chloroform/Methanol = 1/1 (v/v) gelöst und in den verschiedenen Zusammensetzungen gemischt (Tabelle 2). Die Lösungsmittel wurden im Stickstoffstrom verdampft und das Lipid über Nacht unter reduziertem Druck getrocknet. Mit der Zugabe von 1 ml Puffer (Tris/HCl 0,1 M, pH 7,4) und anschließendem Vortexen wurden die Lipide hydratisiert. Durch Filterextrusion wurden Vesikel einheitlicher Größe präpariert. Die Extrusionseinheit wurde auf eine Temperatur über der Kettenschmelztemperatur der Lipide temperiert.

Die Kettenschmelztemperaturen der Membranlipide wurden durch Diffential Scanning Calorimetry (DSC) bestimmt. In Abhängigkeit von der Lipidzusammensetzung, insbesondere der Cholesterolkonzentration, unterscheiden sich die Temperaturprofile der Vesikelsuspensionen, wie Abbildung 7 zeigt. In den Liposomen ohne Cholesterol wurden drei Maxima bei 33,1 °C, 61,5 °C und 68,1 °C gefunden. In den Vesikeln mit 10 % Cholesterol kommt es zum Abflachen und einer Verschiebung der Maxima. Während das erste lokale Maximum nicht mehr auftritt, liegen die beiden anderen Temperaturmaxima bei 59,9 °C und 65,9 °C. In der Suspension mit 35 % Cholesterol wurde lediglich ein sehr flacher Übergang bei 61,1 °C gefunden.

Die Liposomen wurden bei 75 °C insgesamt 10 mal extrudiert und bis zur Verwendung im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 2 4 6 8 10 12 14 35 % Ch 10 % Ch 0 % Ch Cp/ °C Temperatur (°C)

Abbildung 7: Temperaturprofile von Liposomensuspensionen mit unterschiedlichem Cholesterolgehalt. Die Maxima liegen bei 33,1 °C, 61,5 °C und 68,1 °C (0 % Cholesterol), bei 59,9 °C und 65,9 °C (10 % Cholesterol) und 61,1 °C (35 % Cholesterol).

Die Größenverteilung der Liposomensuspension wurde durch dynamische Lichtstreuung ermittelt. In Abbildung 8 ist die Größenverteilung der Vesikel nach der Extrusion

dargestellt. Circa 70 % aller Liposomen haben einen Durchmesser zwischen 180 nm und 280 nm. 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 5 10 15 20 25 30 Größenklasse (nm) V e rt eilu ng ( % )

Abbildung 8: Größenverteilung der Vesikel nach Filterextrusion (Porengröße 200 nm).

4.2.6. Lipidfilme

Je 10 µl Liposomensuspension (10 mg/ml) wurden auf ein Deckgläschen pipettiert und bei Raumtemperatur angetrocknet. Die entstandenen Lipidfilme wurden bis zur Verwendung bei -18°C aufbewahrt.

4.3. Bestrahlungsbedingungen

4.3.1. Künstlich erzeugtes UV Licht

Als UV-Strahlungsquelle diente eine Hochdruck-Quecksilberdampflampe (HBO 200 W). Diese Lampen emittieren ein Linienspektrum, das von UV-C (238 nm) über UV-B und UV-A, bis in den sichtbaren Bereich (579 nm) reicht (Abbildung 9). Wellenlängen mit den höchsten Intensitäten sind 366 nm und 546 nm. Zur Eingrenzung des Strahlungsbereiches wurden zwei Filter verwendet (KG 3, UG 11, SCHOTT). So ließ sich aus dem breiten Spektrum ein Bereich auswählen, der von 300 nm bis 400 nm reichte (Abbildung 9). Der Abstand der Probenküvette von der Strahlungsquelle betrug 15 cm. Die Intensitäten der UV-Strahlung an dieser Stelle betrugen 52,1 mW/cm2 UV-A und 0,211 mW/cm2 UV-B.

200 300 400 500 600 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 313 334

T

ransm

ission (

%

)

Em

issi

on (

%

)

Wellenlänge (nm)

Abbildung 9: Linienemissionspektrum der Hochdruck-Quecksilberdampflampe HBO 200 W. Die Intensitäten sind relativ zur Intensität der Wellenlänge 366 nm in Prozent angegeben. Die Transmission der Filter ist ebenfalls in Prozent dargestellt. Aus der

Kombination beider Filter resultiert ein effektiver Strahlungsbereich von 300 nm bis 400 nm.

4.3.2. Natürliches Sonnenlicht

Die Liposomen wurden an einem sonnigen Sommertag über 12 h der natürlichen Sonnenstrahlung ausgesetzt. Die Abbildung 10 zeigt die an diesem Tag gemessene Intensität der UV Strahlung in Halle/Saale.

8 10 12 14 16 18 20 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 UV-A Intensi tät (m W /cm 2 ) Uhrzeit 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 UV-B Intensi tät (m W /cm 2 )

Abbildung 10: UV Strahlungsintensitäten des natürlichen Sonnenlichts an einem sonnigen Sommertag (14.08.97) in Halle/S. (52° nördliche Breite, 12° östliche Länge). UV-A Strahlung ({), UV-B Strahlung (z).

5. Nachweis der UV-induzierten Oxidation an Stratum corneum

Lipiden

5.1. Nachweis und Quantifizierung von Lipidoxidationsprodukten

Es gibt unterschiedliche Strategien zum Nachweis der Lipidperoxidation. So lassen sich entstehende Oxidationsprodukte direkt oder über Folgereaktionen nachweisen und quantifizieren. Beispielsweise können Lipidperoxide sowohl durch ihre Reaktion mit Iodid zu elementarem Iod, als auch durch einen enzymatischen Test mittels Glutathion-Peroxidase, die GSH zu GSSG oxidiert, detektiert werden [Gutteridge und Halliwell 1990]. Weitere Spezies, die während der Lipidperoxidation entstehen, sind gasförmige Kohlenwasserstoffe, wie Ethan, das gaschromatographisch quantifiziert werden kann [Halliwell und Gutteridge 1989]. Auch der Nachweis von Aldehyden, wie 4-Hydroxy-nonenal, hat sich als Methode zur Detektion der Lipidperoxidation etabliert [Esterbauer et al. 1986].

Neben dem Nachweis von Oxidationsprodukten kann die Lipidperoxidation über den Abbau bzw. Verlust von ungesättigten Fettsäuren verfolgt werden. Chromatographische Methoden (z. B. Dünnschichtchromatographie oder HPLC) sind für die Quantifizierung dieser Verbindungen am besten geeignet [Kim und LaBella 1987, Gutteridge und Halliwell 1990].

Darüber hinaus werden verschiedene spektroskopische Methoden genutzt, um den zeitlichen Verlauf der Lipidperoxidation zu beobachten. Die im Verlauf der Oxidation von mehrfach ungesättigten Lipidketten entstehenden konjugierten Diene absorbieren ultraviolette Strahlung im Bereich von 230 bis 235 nm [Halliwell und Gutteridge 1989]. Die Oxidation von Lipiden ist mit einem Verbrauch von Sauerstoff verbunden. Die Änderung der Sauerstoffkonzentration weißt die Lipidperoxidation direkt nach [Halliwell und Gutteridge 1989].

In der vorliegenden Arbeit wurde die durch UV Licht induzierte Lipidperoxidation mit den folgenden Methoden nachgewiesen und quantifiziert. Erstens wurden Lipidoxidationsprodukte (MDA, LOOH) direkt nachgewiesen. Zweitens wurde das

Ausmaß der Oxidation indirekt bestimmt, indem die Konzentrationen von nicht-oxidierten Membranlipiden bestimmt wurden. Als dritte Nachweismethode diente die Messung des während der Oxidation verbrauchten Sauerstoffs.

5.1.1. Nachweis und Quantifizierung von Malondialdehyd

Malondialdehyd (MDA) ist ein Endprodukt der Lipidperoxidation, das ausschließlich aus mehrfach ungesättigten Lipiden entsteht. Im Laufe der Oxidation von Lipidketten mit mehreren isolierten Doppelbindungen entsteht ein Peroxylradikal (Abbildung 11). Dieses kann sich zu einem zyklischen Peroxid stabilisieren, aus dem ein bi-zyklisches Endoperoxid hervorgeht. Im sauren Milieu und bei hohen Temperaturen (100 °C) wird aus den Endoperoxiden MDA freigesetzt. Die Konzentration von MDA ist ein Maß für die stattgefundene Lipidperoxidation.

Lipidperoxyl Radikal zyklisches Lipidperoxid

.

.

.

.

.

5.1.1.1. Nachweis von Malondialdehyd mit 2-Thiobarbitursäure

MDA wird durch seine Reaktion mit 2-Thiobarbitursäure (TBA) nachgewiesen. Es entsteht ein fluoreszierendes Addukt (Abbildung 12).

C C 2

+

Abbildung 12: Reaktion von Malondialdehyd mit 2-Thiobarbitursäure.

Nach der Bestrahlung mit ultraviolettem Licht wurde in Liposomen und Lipidfilmen die MDA Konzentration bestimmt. Je 50 µl Liposomensuspension wurden mit 100 µl Trichloressigsäure (10 %) und 150 µl 2-Thiobarbitursäure (0,67 %) über 15 Minuten bei 100 °C inkubiert. Der entstehende Fluorophor wurde mit 500 µl n-Butanol extrahiert und fluoreszenzspektrophotometrisch quantifiziert.

Die Maxima der Anregungs- und Emissionsspektren liegen bei 532 nm und 553 nm (Abbildung 13). Aufgrund der starken Überlappung von Anregungs- und Emissionsspektrum wurde zur Anregung eine Wellenlänge unterhalb des Anregungsmaximums gewählt (λex = 515 nm; λem = 553 nm). Als Eichstandard diente 1,1,3,3-Tetraethoxypropan, das unter den Reaktionsbedingungen Malondialdehyd freisetzt. Die Fluoreszenzintensität und die MDA Konzentration stehen in einer linearen Beziehung zueinander, wie die Abbildung 14 zeigt.

0 200 400 600 800 600 500 550 650 450 Fl uor e s ze nz ( w il lk ür li che Ei n hei te n) Wellenlänge (nm)

Abbildung 13: Anregungs- ( ) und Emissionsspektrum ( ) des MDA-TBA-Adduktes. Anregungsmaximum: 532 nm; Emissionsmaximum: 553 nm. TBARS (µM) 0 5 10 15 20 25 30 35 Fluore s ze nz (w ill k ü rliche E inhe ite n ) 0 50 100 150 r=0,9968

5.1.1.2. Weitere Nachweismöglichkeiten und biologische Bedeutung von Malondialdehyd

Alternativ zu dem vorgestellten Fluoreszenztest läßt sich MDA auch in freier Form nachweisen. Bei pH-Werten kleiner als 4,65 liegt MDA als Enol vor. Die Ausbildung einer zyklischen Struktur durch eine Wasserstoffbrückenbindung, führt zur Absorption im UV-Bereich (λabs = 245 nm) [Bird und Draper 1984, Draper und Hadley 1990].

Das Addukt aus MDA und TBA läßt sich auch photometrisch nachweisen. Der Farbstoff hat sein Absorptionsmaximum bei 532 nm (Abbildung 13). Daneben ist die Separierung und Quantifizierung des MDA-TBA-Adduktes mittels HPLC beschrieben [Montfoord et al. 1987, Bird und Draper 1984].

Stehen primäre Aminogruppen zur Verfügung, so entstehen mit MDA weitere fluoreszierende Verbindungen, wie SCHIFFsche Basen (λex = 340-360 nm, λem = 390-430 nm) und substituierte Pyridinderivate. MDA neigt außerdem zur Polymerisation. Das entstehende Polymer fluoresziert ebenfalls (λex = 360 nm, λem = 470 nm) [Gutteridge et al. 1982]. In Abbildung 15 sind diese Reaktionsmöglichkeiten zusammengefaßt.

Die Entstehung von SCHIFFschen Basen durch die Polymerisation von Lipidoxidationsprodukten mit primären Aminogruppen von Proteinen ist auch für die Akkumulation von fluoreszierenden Verbindungen in der menschlichen Haut (Lipofuscine) verantwortlich [Dayan und Wolman 1993].

Malondialdehyd und andere Lipidoxidationsprodukte können in vivo mit DNA reagieren. Auf diese Weise kommt es zu Quervernetzungen der DNA Stränge, was Mutationen auslöst [Mukai und Goldstein 1976] sowie zur Bildung fluoreszierender Polymere führt [Fujimoto et al. 1984, Wang und Liehr 1995].

Lipidperoxidationsprodukte, insbesondere MDA spielen u. U. auch eine Rolle bei der Entstehung verschiedener Erkrankungen wie z. B. der Alzheimerschen Krankheit. Im Gehirn von Menschen, die an dieser Krankheit gestorben sind, wurden signifikant höhere MDA-Konzentrationen nachgewiesen als in Gehirnen von Menschen vergleichbaren Alters [Chia et al. 1983, 1984].

CH 2 C C O H O H R -NH 2 1 MDA R N1 CH CH CHOH SCHIFFsche Base R -NH 2 2 R ₁ NH CH CH HC O R N₁ CH CH CH NH R₂ R 1 NH NH R₂ Aminoiminopropen

SCHIFFsche Base (fluoreszierend)

R - NH 2 OHC-CH -CHO₂ N R R H CHO OHC 1,4-disubstituiertes 1,4-Dihydropyridin 3,5-dicarbaldehyd -OHC-CH -CHO₂ OHC CH 2 CH C CHO CHO Poly-MDA (fluoreszierend)

Abbildung 15: Entstehung von fluoreszierenden Produkten aus MDA und primären Aminen bzw. durch MDA-Polymerisation [Halliwell und Gutteridge 1989].

5.1.1.3. Entstehung von MDA in Modellmembranen durch UV Bestrahlung

Die UV-induzierte Lipidperoxidation führt zur Entstehung von MDA (Abbildungen 16 und 17). Sowohl in Liposomensuspensionen als auch Lipidfilmen steigt die MDA-Konzentration mit zunehmender Bestrahlungsdauer an. Aufgrund der vielfältigen Reaktionsmöglichkeiten von MDA bezeichnet man die nachgewiesenen Verbindungen als thiobarbitursäure reaktive Substanzen (TBARS). Unter den vorliegenden Reaktionsbedingungen ist TBA der Hauptreaktionspartner für MDA. Abbildung 16 zeigt die Bildung von TBARS in UV-bestrahlten Liposomensuspensionen.

0 2 4 6 8 0 20 40 60 80 100 p<0,05

*

*

*

*

Abbildung 16: Entstehung von TBARS in Liposomensuspensionen unterschiedlicher

Lipidzusammensetzung während der Bestrahlung mit künstlich erzeugtem UV Licht: hSCLL (†), Liposomen ohne Cholesterol (z), Liposomen mit 50 % (w/w) Cholesterol

({). Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung von drei unabhängigen Messungen

an. Die Mittelwertsunterschiede wurden durch einfache Varianzanalyse geprüft.

Die Konzentration von TBARS, die infolge der UV-induzierten Oxidation in den Liposomensuspensionen entsteht, hängt von der Lipidzusammensetzung der Vesikelmembranen ab. In Liposomen mit hohem Cholesterolgehalt (50 %, w/w) wurde die geringste Konzentration an TBARS gemessen ({). Liposomen ohne Cholesterol bildeten während der UV-Bestrahlung höhere Konzentrationen an TBARS (z). Die

TBARS-Konzentrationen nach 8 h UV-Bestrahlung in diesen Vesikelpopulationen unterscheiden sich signifikant. In den hSCLL entsteht die höchste TBARS Konzentration (†). Bereits nach 4-stündiger Bestrahlung wird in hSCLL eine signifikant höhere TBARS-Konzentration gebildet als in den Liposomen aus synthetischen Lipiden (z, {).

Infolge der UV Bestrahlung der Lipidfilme entstehen ebenfalls TBARS, wie die Abbildung 17 zeigt. Ebenso wie in den Liposomensuspensionen hängt die Konzentration an entstehenden TBARS von der Lipidzusammensetzung ab. In den Lipidfilmen mit 50 % (w/w) Cholesterol enstanden weniger TBARS ({) als in den Lipidfilmen ohne Cholesterol (z). In den hSCL-Filmen wurde die höchste TBARS-Konzentration nachgewiesen (†). Wie aus dem Vergleich von Abbildung 16 und 17 hervorgeht, entstehen unter identischen Bestrahlungsbedingungen in den Lipidfilmen weniger TBARS als in den Liposomensuspensionen. 0 2 4 6 8 0 10 20 30 40 50 T BARS (pm o l/ m g Li pi d) Bestrahlungsdauer (h)

Abbildung 17: Entstehung von TBARS in Lipidfilmen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung

während der Bestrahlung mit künstlich erzeugtem UV Licht: hSCL-Filme (†), Lipidfilme ohne Cholesterol (z), Lipidfilme mit 50 % (w/w) Cholesterol ({). Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung von drei unabhängigen Messungen an. Die

Die Lipidperoxidation wurde nicht nur durch die Bestrahlung mit künstlich erzeugtem UV Licht induziert, sondern auch durch Bestrahlung mit natürlichem Sonnenlicht. Abbildung 18 zeigt die TBARS-Konzentrationen in Liposomensuspensionen vor und nach einer 12-stündigen Bestrahlung mit natürlichem Sonnenlicht (Abbildung 10).

Die Konzentration der entstehenden TBARS ist abhängig von der Lipidzusammensetzung der Vesikelmembranen. In den Liposomen mit hohem Cholesterolgehalt (50%, w/w) entstehen im Verlauf der Sonnenlicht-induzierten Oxidation signifikant weniger TBARS (weiße Balken), als in den Liposomen ohne Cholesterol (schwarze Balken). In hSCLL wurde die höchste Konzentration von TBARS nachgewiesen (gestreifte Balken). Dieses Ergebnis gleicht den Befunden, die durch die Bestrahlung von Liposomen mit künstlich erzeugtem UV Licht erhalten wurden (Abbildung 16).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 p<0,05

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Abbildung 18: Entstehung von TBARS in Liposomensuspensionen unterschiedlicher

Lipidzusammensetzung während der Bestrahlung mit natürlichem Sonnenlicht:

Liposomen ohne Cholesterol (schwarze Balken), Liposomen mit 50 % (w/w) Cholesterol (weiße Balken), hSCLL (gestreifte Balken). Die Fehlerbalken geben die

Standardabweichung von drei unabhängigen Messungen an. Die Mittelwertsunterschiede wurden durch einfache Varianzanalyse geprüft.