Aus der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Medizinischen Hochschule Hannover
Der Einfluss des durch Hypoxie
induzierbaren Moleküls Adenosin und seiner Rezeptoren A 2A und A 2B auf
plazentare Prozesse
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Vera Kristine Kreuzer
aus Stuttgart
Hannover 2014
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 23.06.2014
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover.
Präsident: Professor Dr. med. Christopher Baum
Betreuerin der Arbeit: PD Dr. med. Frauke von Versen-Höynck Referent/Referentin: Prof. Dr. med. Anibh Martin Das
Korreferent/Korreferentin: Prof.‘in Dr. Inna Doumler-Müller
Tag der mündlichen Prüfung: 23.06.2014
Prüfungsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Hermann Haller Prof. Dr. med. vet. Klaus Otto Prof. Dr. med. Martin Sauer
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
1.1 Allgemeine Bemerkungen ... 1
1.2 Plazenta ... 2
1.2.1 Aufbau und Funktion ... 2
1.2.2 Plazentaentwicklung ... 3
1.3 Präeklampsie ... 5
1.3.1 Pathophysiologie der Präeklampsie ... 5
1.3.2 Präeklampsie und IUGR ... 8
1.3.3 Proangiogenetische und antiangiogenetische Faktoren ... 10
1.3.4 Hypoxie und Ischämie ... 15
1.3.5 Immunologie und Inflammation ... 15
1.3.6 Weitere Mechanismen in der Präeklampsieentstehung ... 16
1.4 Adenosin und Adenosinrezeptoren ... 17
1.4.1 Adenosin ... 17
1.4.2 Adenosinrezeptoren ... 18
1.5 Aminosäuretransporter System A ... 20
2 Fragestellung ... 22
3 Material und Methoden ... 23
3.1 Verwendete Materialien ... 23
3.1.1 Chemikalien ... 23
3.1.2 Kits ... 24
3.1.3 Primer ... 24
3.1.4 Isotope ... 24
3.1.5 Geräte ... 25
3.1.6 Software ... 26
II
3.1.7 Verbrauchsmaterialien ... 26
3.1.8 Humane Materialien ... 26
3.1.9 Zelllinien ... 27
3.1.10 Medien ... 27
3.1.11 Pufferlösungen ... 30
3.2 Angewandte Methoden ... 32
3.2.1 Zellkultur ... 32
3.2.2 Auswahl der Patientinnen ... 33
3.2.3 Plazentagewinnung ... 34
3.2.4 Funktions-Assay zur Bestimmung der Konzentration pro- und antiangiogenetischer Faktoren ... 36
3.2.5 Transport-Assay zur Bestimmung der System-A-Aktivität ... 37
3.2.6 Proteinbestimmung nach Bradford ... 38
3.2.7 Zeitversuch zur 14C-MeAIB-Aufnahme via System A ... 38
3.2.8 ELISA ... 39
3.2.9 Bestimmung der mRNA-Expression ... 40
3.2.10 LDH-Analyse ... 46
3.2.11 Statistische Auswertung ... 46
4 Ergebnisse ... 47
4.1 Allgemeines ... 47
4.3 Proteinkonzentration von sFlt-1 ... 48
4.3.1 Einfluss der Sauerstoffkonzentration ... 48
4.3.2 Einfluss von Adenosin ... 48
4.3.3 Einfluss der Adenosinrezeptoren A2A und A2B ... 49
4.5 Proteinkonzentration von PlGF ... 51
4.5.1 Einfluss der Sauerstoffkonzentration ... 51
4.5.2 Einfluss von Adenosin ... 51
4.5.3 Einfluss der Adenosinrezeptoren A2A und A2B ... 52
Inhaltsverzeichnis
III
4.7 Genexpression von VEGF-A ... 54
4.7.1 Einfluss der Sauerstoffkonzentration ... 54
4.7.2 Einfluss von Adenosin ... 54
4.7.3 Einfluss der Adenosinrezeptoren A2A oder A2B ... 55
4.8 LDH-Konzentration in plazentarem Gewebe ... 57
4.10 Aktivität von System A in plazentarem Gewebe und in Zelllinien ... 58
4.10.1 Allgemeines ... 58
4.10.2 Einfluss der Sauerstoffkonzentration auf die Aktivität von System A in plazentarem Gewebe ... 59
4.10.3 Einfluss von Adenosin auf die Aktivität von System A in HTR-8-Zellen ... 59
4.10.4 Einfluss der Adenosinrezeptoren A2A und A2B auf die Aktivität von System A in plazentaren Gewebeproben ... 60
5 Diskussion... 62
5.1 Allgemeines ... 62
5.2 sFlt-1-Konzentration in plazentarem Gewebe ... 63
5.3 PlGF-Konzentration in plazentarem Gewebe ... 65
5.4 VEGF-A-mRNA-Expression in plazentarem Gewebe ... 67
5.5 System-A-Aktivität in plazentarem Gewebe ... 70
6 Ausblick ... 73
7 Zusammenfassung ... 74
8 Literaturverzeichnis ... 76
9 Anhang ... 88
9.1 Ergebnisse in tabellarischer Übersicht ... 88
9.1.1 sFlt-1-Konzentration in plazentarem Gewebe ... 88
9.1.2 PlGF-Konzentration in plazentarem Gewebe ... 89
9.1.3 VEGF-A-Genexpression in plazentarem Gewebe... 90
9.1.4 LDH/Zytotoxizität ... 91
9.1.5 Aktivität von System A ... 92
IV
9.2 Abbildungsverzeichnis ... 94
9.3 Tabellenverzeichnis ... 95
9.4 Formelverzeichnis ... 96
9.5 Lebenslauf ... 97
9.6 Erklärung gemäß §2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 ... 99
9.7 Danksagung ... 100
Abkürzungsverzeichnis
V
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung vollständiger Begriff
A1R Adenosinrezeptor vom Typ A1
A2AR Adenosinrezeptor vom Typ A2A
A2BR Adenosinrezeptor vom Typ A2B
A3R Adenosinrezeptor vom Typ A3
AAAS American Association for the Advancement
of Science
Abb. Abbildung
AC Adenylatzyklase
AD Adenosin-Deaminase
Ado Adenosin
Aqua bidest. Aqua bidestillata,
zweifach destilliertes Wasser
ARDS acute respiratory distress syndrome,
akutes Atemnotsyndrom
ATP Adenosintriphosphat
AT-1R Angiotensin-II-Rezeptor Typ 1
BSA Bovine Serum Albumin
BM Basalmembran
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat
cDNA complementary deoxyribonucleic acid,
CGS 21680 2-p-(2-Carboxyethyl)phenethylamino-5′-N-
ethylcarboxamidoadenosine hydrochloride hydrate
14C-MeAIB Methylaminoisobutyric Acid, α-[1-14C]
DAG Diacylglycerol
DEPC Diethylpyrocarbonat
df degrees of freedom, Freiheitsgrade
DNA deoxyribonucleic acid,
Desoxyribonukleinsäure
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGF endothelial growth factor
ELISA Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay
ET-1 Endothelin 1
et al. et alii (und andere)
FBS Fetal Bovine Serum
FKS Fetales Kälberserum
G-Protein Guanosintriphosphat-bindende Proteine
GTC Guanidinisothiocyanatlösung
h Stunde
hCG humanes Choriongonadotropin
HELLP-Syndrom Hemolysis- elevated liver enzymes- low
platelets-Syndrom
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-
VI
ethansulfonsäure, eine Pufferlösung
HIF-1α hypoxia-inducible factor 1α
H2O2 Wasserstoffperoxid
HPLC high performance liquid chromatography
ICAM 1 intercellular adhesion molecule 1
IL-6 Interleukin 6
IP Inositolphosphat
IP3 1,4,5-Inositol-Triphosphat
IQR Interquartilsabstand
IUGR intrauterine growth retardation,
intrauterine Wachstumsretardierung
LDH Laktat-Dehydrogenase
MAPK mitogen-aktivierte Proteinkinasen
Max Maximun
Min Minimum
min Minute
MRS 1754 8-[4-[((4-
Cyanophenyl)carbamoylmethyl)oxy]phenyl]- 1,3-di(n-propyl)xanthine hydrate
mTOR Mammalian target of Rapamycin
MVM Mikrovillimembran
MW molecular weight, Molekulargewicht
NECA 5′-(N-Ethylcarboxamido)adenosine
NK Natürliche Killerzellen
NV Normalverteilung
NSAR nicht steroidale Antirheumatika
OD optische Dichte
PCR Polymerase-Ketten-Reaktion
PBS phosphate buffered saline
pH negativ dekadische Logarithmus der
Wasserstoffionenaktivität
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
PLC Phospholipase C
PLGF Placental Growth Factor
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
Rnase Ribonuklease
RNAzol GTC mit Phenol
ROS Reactive Oxygen Species
RT-PCR reverse transcription PCR
q-PCR real time quantitatitve PCR
sENG soluble Endoglin
sFlt-1 soluble fms-like tyrosine kinase 1
SCH-58261 7-(2-phenylethyl)-5-amino-2-(2-furyl)-
pyrazolo-[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5- c]pyrimidine
SD standard deviation, Standardabweichung
SEM standard error of the mean, Standardfehler
Abkürzungsverzeichnis
VII
SNAT 1-3 Subtypen des Aminosäuretransporters
System A
SSW Schwangerschaftswoche
STAT-3 signal transducer and activation of
transcription
TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer
TGF-α, TGF-β transforming growth factor α oder β
TNF- α Tumornekrosefaktor α
VCAM 1 vascular cell adhesion molecule 1
VEGF vascular endothelial growth factor
VEGF R1 vascular endothelial growth factor receptor
Typ 1, Synonym: mFlt-1
VEGF R2 vascular endothelial growth factor receptor
Typ 2, Synonym: KDR
vgl. vergleiche
vWF von-Willebrand-Faktor
1
1 Einleitung
1.1 Allgemeine Bemerkungen
Das Schwangerschaftssyndrom Präeklampsie betrifft 5%-7% der Schwangerschaften weltweit [10]. Die Komplikationen dieser Erkrankung führen jedes Jahr zu 60.000 Todesfällen. Trotz intensiver Forschungsarbeit zur Entstehung dieser Erkrankung, gibt es bisher weder eine zuverlässige Früherkennungsuntersuchung noch eine Therapieoption außerhalb der zeitnahen Entbindung.
Bisher wurde die PE anhand der klinischen Endpunkte Proteinurie und Hypertonie definiert.
Inzwischen gibt es Hinweise, dass diese Befunde nur späte Symptome einer frühbeginnenden, vielfältigen Pathogenese sind. Die PE und die intrauterine Wachstumsretardierung scheinen ähnlichen Pathomechanismen zu unterliegen. Bereits während der frühen Plazentation kommt es zu vermindertem Remodeling der mütterlichen Spiralarterien [11, 12]. Anstelle der Umwandlung von kleinkalibrigen zu großkalibrigen Gefäßen zur ausreichenden Versorgung der Plazenta, bleiben die Gefäße eng und behalten ihren hohen Gefäßwiderstand bei. Es können plazentare Hypoxie, oxidativer Stress und mangelhafte Nährstoffversorgung folgen.
Als Reaktion kommt es zur Sekretion von Auto-Antikörpern, Trophoblastenfragmenten und antiangiogenen Faktoren, wie der lösliche Rezeptor von VEGF (sFlt-1) [13] und Endoglin (sEng) [14]. Sie tragen zur Destabilisierung der Balance zwischen pro- und antiangiogenetischen Faktoren bei. Dieser Zustand stimuliert die ohnehin aktivierte Entzündungsantwort [15] bis hin zur endothelialen Dysfunktion im mütterlichen Gefäßsystem [16]. Klinisch manifestiert sich dann bei der Mutter das Vollbild der PE.
Die vorliegendene Arbeit beleuchtet die Rolle des durch Hypoxie induzierbaren Moleküls Adenosin und seiner Rezeptoren A2A und A2B auf die Expression pro- und antiangiogenetischer Faktoren sowie auf die Aktivität des Aminosäuretransporters System A in der Plazenta.
Einleitung
2
1.2 Plazenta
1.2.1 Aufbau und Funktion
Die reife Plazenta ähnelt am Ende der Schwangerschaft in ihrer Form einer Scheibe von 15- 20 cm Durchmesser und 1,5-3 cm Dicke. Sie wiegt etwa 500-600 g [17]. Die Plazenta wird unterteilt in eine mütterliche und eine fetale Seite. Erstere ist durch die Decidua basalis, eine septenbildende Epithelschicht, und die dabei entstehenden Kotyledonen (ca. 15-20) gekennzeichnet. Aus dem mütterlichen Endometrium kommende Spiralarterien treten durch die Decidua basalis hindurch und versorgen den intervillösen Raum mit Blut. Dieser Raum ist der Bereich zwischen Decidua basalis und Chorionplatte. Er ist von einem Zell-Synzytium (fetales Gewebe) ausgekleidet, welches in Form eines Zottenbaumes mit Mikrovillibesatz in den intervillösen Raum hineinragt [18]. Innerhalb der Zotten verlaufen die kindlichen Gefäße.
Diese konfluieren in Richtung Fetalseite schließlich zu den drei großen Gefäßen der Nabelschnur: Aa. umbilicales (doppelt) und V. umbilicalis. Die Nabelschnur entspringt aus der Chorionplatte an der zum Kind gerichteten Oberfläche. Das Chorion ist zum Kind hin von Amnion überzogen. Dieses bildet die innerste Eihautschicht und ist damit Teil der Fruchtblase [6].
Die Plazenta stellt in der Schwangerschaft das entscheidende Bindeglied zwischen mütterlichem und kindlichem Organismus dar. Sie versorgt den Fetus mit Nährstoffen, besorgt den Abtransport von Stoffwechselendprodukten, verhindert die immunologische
Abbildung 1.1 Plazenta: Funktioneller Aufbau [6], gedruckt mit Genehmigung des Urhebers
3
Abstoßung und sezerniert Hormone zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft. Dabei unterliegen mütterliches und fetales Blut einer vollständigen Trennung durch eine feine Zellschicht [6]. Diese wird ab dem vierten Schwangerschaftsmonat aus Synzytiotrophoblasten und der diskontinuierlichen Trophoblastenschicht auf einer Basalmembran sowie dem fetalen Gefäßendothel gebildet [7]. Hier erfolgt der Gasaustausch passiv durch Diffusion. Die Übertragung der Stoffwechselprodukte passiert mittels aktivem Transport entlang der Synzytiotrophoblasten.
1.2.2 Plazentaentwicklung
Die Plazenta entsteht während der Embryogenese aus dem Trophektoderm, welches am 4. Tag post conceptionem (p.c.) durch Teilung aus der Blastozyste hervorgeht. Auch die später entstehenden Zytotrophoblasten entstammen dem Trophektoderm.
Zur Einnistung in den Uterus dringt das Trophektoderm durch die Aussprossung erster Mikrovilli in das Schwangerschaftsendometrium ein. Es folgt eine Verzahnung von Zytotrophoblasten und Dezidualzellen, die zur Verankerung der Blastozyste im Endometrium führt. Die enstehenden Zytotrophoblasten formieren sich als Doppelschicht, wobei sich die dezidualseitig gelegenen Zellen zu Synzytien zusammenschließen. Während der nun folgenden Proliferation entstehen zwischen Chorionplatte und Decidua basalis Trabekel aus Zytotrophoblasten, die sich vielfach verzweigen (siehe Abbildung 1.2). Die dabei entstehenden Leerräume konfluieren zu Lakunen und bilden später die intervillösen Räume.
Abbildung 1.2: baumartig verzweigte Zotten [7], gedruckt mit Genehmigung des Urhebers
Einleitung
4
Aus den Trabekeln wachsen fingerartig Zotten heraus. Sie sorgen für eine Vergrößerung der Oberfläche zum optimalen Nährstoff- und Gasaustausch. Die Einteilung der Zotten erfolgt nach Lokalisation (Stamm-Zotten, Intermediär-Zotten, Terminal-Zotten, verankernde Zotten, (siehe Abbildung 1.2)) und Reife (primär, sekundär, tertiär). Der Aufbau der Zotten entwickelt sich im Laufe der Schwangerschaft. Eine primäre Zotte besteht aus den Trophoblasten des Trabekels mit eingewanderten Zytotrophoblasten und Bindegewebe mit Hofbauer-Zellen (Makrophagen) im Inneren. Durch Einwanderung von Mesenchym in den Kern der Zotte entsteht die sekundäre Zotte. In Abbildung 1.3 ist der Aufbau einer tertiären Terminalzotte im Querschnitt dargestellt. Sie besteht von außen nach innen aus mehrkernigen Synzytiotrophoblasten, vereinzelt einkernigen Zytotrophoblasten mit einer Basalmembran und fetalen Gefäßen [7]. Die reifen Zotten entstehen ab der 20. SSW. Sie bilden die elementare Struktur für den Nährstoff- und Gasaustausch zwischen Fetus und Mutter [7].
Alle Zelllinien der Plazenta entstammen dem Trophektoderm. Der Zytotrophoblast ist dabei die dominierende Zellart und übernimmt vielfältige Aufgaben. Als Synzytiotrophoblast steht er in direktem Kontakt mit dem mütterlichen Blut und übernimmt den Austausch von Nährstoffen und Gasen. Die apikale Oberfläche der Synzytiotrophoblasten ist zu diesem Zweck durch zahlreiche Mikrovilli vergrößert. Die innerhalb einer Zotte darunter liegenden Zytotrophoblasten sind noch mitotisch aktiv. Bei Bedarf verschmelzen sie mit den darüber liegenden Synzytiotrophoblasten und stellen so die Kontinuität des Synzytiums sicher.
Abbildung 1.3: Terminal-Villus im Querschnitt [7], gedruckt mit Genehmigung des Urhebers FV: fetal vessel (fetales Blutgefäß), S: Synzytiotrophoblast, C: Zytotrophoblast
5
Extravillöse Zytotrophoblasten stellen eine weitere Sonderform der Trophoblasten dar. Im Rahmen der frühen plazentaren Entwicklung (1. Trimester) wandern sie als invasive Zytotrophoblasten in das Interstitium der Decidua basalis ein und arrodieren dort die Spiralarterien. Es folgen epitheliale Zytotrophoblasten, die sich zu einem endothelialen Phänotyp umwandeln, dabei das Endothel der Spiralarterien von innen auskleiden und dann ersetzen [8] (siehe Abbildung 1.4). Auf diese Weise entstehen großkalibrige Kapazitätsgefäße, die die Perfusion der intervillösen Räume mit mütterlichem Blut ermöglichen [19]. Dieser Prozess findet ab dem zweiten Schwangerschaftstrimester statt. Er ist existentiell für die ausreichende Versorgung des wachsenden Fetus mit Nährstoffen.
Während des ersten Trimesters wird der Embryo durch histiotrophe Drüsen des Endometriums versorgt.
1.3 Präeklampsie
1.3.1 Pathophysiologie der Präeklampsie
Die PE ist eine schwangerschaftsinduzierte Erkrankung, definiert durch folgende klinische Untersuchungsbefunde: Hypertonus (>140/90 mmHg, erstmalig nach der 20. SSW aufgetreten) und Proteinurie (>300mg/24h) [20]. Die weltweite Inzidenz liegt zwischen 5%-7%. Die Erkrankung ist eine der häufigsten Ursachen für die Müttersterblichkeit weltweit [10]. Es sterben jährlich etwa 60.000 Frauen an PE [10]. Bisher besteht die einzige
Abbildung 1.4: Invasion der Trophoblasten in die Spiralarterien [8], gedruckt mit Genehmigung des Urhebers
Einleitung
6
Therapiemöglichkeit in der zeitnahen Entbindung. Ursache und Pathophysiologie der Erkrankung sind bis heute Gegenstand intensiver Forschung. Der genaue Pathomechanismus ist noch ungeklärt. Klinisch präsentiert sich die Erkrankung neben den oben genannten Definitionsparametern sehr heterogen. Zu den mütterlichen Manifestationsformen gehören Eklampsie, vorzeitige Plazentalösung, disseminierte intravasale Koagulopathie, das HELLP- Syndrom, Lebereinblutung und -riss, pulmonale Ödeme, akutes Atemnotsyndrom (ARDS), akute Niereninsuffizienz und Tod [21]. Die kindlichen Komplikationen umfassen fetale Wachstumsretardierung, vorzeitige Entbindung mit neonatalen Komplikationen und Folgeerkrankungen und Totgeburt.
Die PE wird nach dem zeitlichen Auftreten der Symptome in eine frühe Form (early onset, Auftreten vor der 34. SSW) und eine späte Form (late onset, Auftreten nach der 34. SSW) unterteilt [22]. Die frühe Form macht dabei 20% der PE-Fälle aus, verläuft schwerwiegender für Mutter und Kind und führt vermehrt zur Frühgeburtlichkeit [23].
Bis heute gibt es keine klinischen Prädiktionsparameter, die die PE mit Sicherheit ankündigen. Folgende mütterliche Risikofaktoren sind jedoch bekannt: Erstgebärende, Mehrlingsschwangerschaft und bereits vorbestehende Erkrankungen wie Hypertonus, Diabetes Mellitus, Nierenerkrankungen und Adipositas [24]. Einige der genannten Faktoren gelten auch als Risikofaktoren für kardiovaskuläre Erkrankungen wie Myokardinfarkt, Hypertonus oder Schlaganfall, außerdem für Diabetes Mellitus Typ II und das metabolische Syndrom. In diesem Zusammenhang fand man heraus, dass Frauen, die an einer PE erkrankten im Verlauf des weiteren Lebens häufiger an den genannten kardiovaskulären Komplikationen leiden [25-30]. Auch Kinder aus einer PE-Schwangerschaft zeigen im weiteren Leben ein erhöhtes Risiko für kardiovaskulären Erkrankungen [24, 31].
Die PE gilt als „Krankheit der Theorien“, da ihre Pathophysiologie bis heute nicht vollständig erforscht ist. Wahrscheinlich übernimmt die Plazenta eine führende Rolle in der Entstehung der PE: Die Entfernung der Plazenta ist bisher die einzige effektive Therapie. Weitere Hinweise auf die Schlüsselrolle der Plazenta sind das Auftreten von Präeklamspien bei Extrauteringravidität [32] oder der hydatiformen Mole, eine Erkrankung bei der nur plazentares, aber kein fetales Gewebe angelegt ist [1, 33, 34].
7
Nach dem aktuellen Wissensstand diskutiert man sowohl eine plazentare als auch eine maternale Genese, Mischformen sind häufig [1]. Die plazentare PE unterliegt einem schwereren Verlauf und ist häufig mit der fetalen Wachstumsretardierung (IUGR) assoziiert.
Sie lässt sich mit einem Zwei-Phasen-Modell erklären. Die erste Phase beginnt bereits in der Frühschwangerschaft mit mangelhafter Plazentation: Die invasiven Trophoblasten wandern nur oberflächlich in die Dezidua ein. Das Remodeling der Spiralarterien erfolgt unzureichend oder unterbleibt, sodass in Myometrium und Decidua basalis die Gefäße enggestellt bleiben [11, 12, 35, 36] (siehe Abbildung 1.5). Die Umwandlung der Zytotrophoblasten von einem epithelialen hin zu einem endothelialen Phänotyp, die „Pseudovaskulogenese“, entfällt [8].
Als Folge wird die Plazenta nicht ausreichend mit mütterlichem Blut perfundiert [37]. Der Widerstand in den Ästen der A. uterina steigt an [38], die Flussgeschwindigkeit des Blutes verdoppelt sich [39]. Infolgedessen kommt es zur intermittierenden Oxygenierung des Gewebes und im Verlauf zu plazentarer Hypoxie und oxidativem Stress [40, 41]. Daraufhin sezernieren die Zytotrophoblasten vermehrt antiangiogenetische und inflammatorische Faktoren in den mütterlichen Kreislauf [2, 8]. Der maternale Organismus reagiert mit einer überschießenden Entzündungsreaktion und endothelialer Dysfunktion [24, 42, 43]. Die zweite Phase, die klinische Manifestation, ist gekennzeichnet durch fetale Wachstumsretardierung und den frühen Beginn der mütterlichen Symptome [2].
Die maternale PE entsteht trotz regelrechter anfänglicher Plazentation. Grundlage ist hier die mütterliche Prädisposition zur systemischen Inflammation mit erhöhter Empfindlichkeit der mütterlichen Gefäße auf oxidativen Stress und inflammatorische Faktoren [2]. Diese
Abbildung 1.5: Remodeling der Spiralarterien bei Präeklampsie, aus [2], gedruckt mit Genehmigung von AAAS
Einleitung
8
mütterliche Prädisposition besteht bei Diabetes Mellitus, chronischer Hypertension, Adipositas oder Autoimmunerkrankungen [44]. Sie führt zu einer verstärkten Entzündungsantwort und endothelialer Dysfunktion, die dann in die maternale PE münden.
Das klinische Bild der PE entsteht wahrscheinlich aus einer Mischung beider Entstehungsformen (siehe Abbildung 1.6).
1.3.2 Präeklampsie und IUGR
Die fetale Wachstumsretardierung wird im medizinischen Alltag meist mit dem englischen Begriff SGA (small for gestational age, klein bezogen auf das Gestationsalter) beschrieben.
Sie umfasst alle Feten unterhalb der zehnten Perzentile der für das Gestationsalter bestimmten Normalverteilung. Der Begriff IUGR (intrauterine growth restriction, intrauterine Wachstumsretardierung) beschreibt eine Untergruppe innerhalb aller SGA-Feten, deren Minderwuchs auf eine krankhafte Störung zurückzuführen ist [45].
Abbildung 1.6: Zwei-Stadien-Modell zur Entstehung von Präeklampsie modifiziert nach [2-4]
9
Die Schwangerschaftskomplikation PE ist durch ein heterogenes Erscheinungsbild gekennzeichnet. Neben den mütterlichen Symptomen kann auch der Fetus betroffen sein: Die early-onset-Variante der PE ist eng mit der intrauterinen Wachstumsretardierung (IUGR oder FGR) assoziiert [46]. Etwa 30% aller PE-Fälle gehen mit einer IUGR einher [47]. Bei der late-onset-Form der PE (ab 34. SSW) findet sich meist ein normales Geburtsgewicht des Fetus [22]. Diese Beobachtungen haben dazu geführt, gemeinsame Entstehungsmechanismen von IUGR und early-onste-PE zu erforschen. Die mangelhafte Plazentation in der Frühschwangerschaft stellt den gemeinsamen Startpunkt dar [46, 48] (siehe Abbildung 1.7).
Beiden Erkrankungen ist das fehlende Remodeling der Spiralarterien gemein [12], woraufhin die Plazenta nicht ausreichend perfundiert wird. Die Minderperfusion führt bei early-onset-PE wie auch bei IUGR zu typischen Veränderungen der maternalen und fetalen Gefäße innerhalb der Plazenta [48, 49]. Daraus folgen Funktionsstörungen der Plazenta, die in beiden Fällen (IUGR mit/ohne PE) durch verminderte PlGF-Werte (placental growth factor, plazentarer Wachstumsfaktor) im maternalen Blut gekennzeichnet sind [50-52]. Trotz der gemeinsamen Genese treten PE und IUGR auch unabhängig voneinander auf. Burton et al. zeigten, dass sich die beiden Schwangerschaftskomplikationen IUGR allein sowie PE+IUGR bei ähnlicher Genese nur in ihrem Schweregrad der Plazenta-Funktionsstörung unterscheiden [53]. Staff et al. schlagen in diesem Zusammenhang vor, PlGF als Signalfaktor für die plazentare Funktion anzusehen (siehe Abbildung 1.7.) [1].
Einleitung
10
1.3.3 Proangiogenetische und antiangiogenetische Faktoren
1.3.3.1 Allgemeines
Die PE wird charakterisiert durch mangelnde Trophoblasteninvasion und fehlenden Umbau der Spiralarterien, plazentare Hypoxie, oxidativen Stress, Inflammation und endotheliale Dysfunktion [54]. Letztere ist vor allem durch ein Ungleichgewicht zwischen antiangiogenetischen und proangiogenetischen Faktoren gekennzeichnet. Während die Konzentration antiangiogenetischer Faktoren wie soluble FMS-like Tyrosin-Kinase 1 (sFlt-1) und soluble Endoglin (sEng) ansteigt, sinkt bei PE die Konzentration proangiogenetischer Faktoren wie des Placental Growth Factor (PlGF) und des freien Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A) im mütterlichen Blut [55, 56]. Die Plazenta gilt als Hauptproduktionsort für diese Faktoren. Sie konnten als Proteine in verschiedenen Zellen (Mesenchym, villöse und extravillöse Trophoblasten, Dezidualzellen, Endothelzellen der Blutgefäße) nachgewiesen werden [57].
Abbildung 1.7: Erweiterter Vorschlag zur Entstehung von Präeklampsie und/oder FGR [1], gedruckt mit Genehmigung des Urhebers.
11
1.3.3.2 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
Vascular endothelial growth factors (VEGFs) sind proangiogenetische Faktoren, die maßgeblich Angiogenese, Vaskulogenese und Lymphangiogenese regulieren. Zur VEGF- Familie gehören VEGF-A bis –D und PlGF [58]. Sie werden während der Schwangerschaft vornehmlich in Synzytiotrophoblasten exprimiert und sezerniert [59, 60]. VEGF-A kommt im Rahmen der Vaskulo- und Angiogenese während der Plazentation eine Schlüsselrolle zu. Im Mausmodel wurde gezeigt, dass es nach Ausschalten eines oder beider VEGF-Allele zu mangelnder Angiogenese, dann zu fehlerhafter Plazentation und damit zum Abort der Schwangerschaft kommt [61, 62].
VEGF-A bindet an zwei membranständige Tyrosinkinaserezeptoren, VEGFR-1 (Flt-1) und VEGFR-2 (Flk-1 oder KDR) in der Plazenta. Wie bisher nur im Mausmodel gezeigt wurde, haben diese beiden Rezeptoren in der frühen Embryogenese gegensätzliche Funktionen:
VEGFR-2 vermittelt proangiogene Signale, wohingegen VEGFR-1 die zirkulierenden proangiogenetischen Faktoren einfängt, sie damit für VEGFR-2 unzugänglich macht und damit indirekt zur Inhibition der Angiogenese beiträgt [62, 63]. VEGF-A und PlGF können auch von der nicht-membranständigen, sondern löslichen, Variante des VEGFR-1 (sVEGFR- 1 oder sFlt-1) gebunden werden. In diesem Zustand sind sie inaktiviert, da sie nicht mehr an die membranständigen Rezeptoren binden können [8, 62]. Dieser Mechanismus unterstützt die PE-Entstehung: Plazentare Hypoxie, ein für die PE typischer Zustand, induziert die VEGF-Expression via HIF-1α in Endothelzellen [64, 65]. Bei PE ist der VEGF-Spiegel erhöht, aber der Anteil an ungebundenem VEGF erniedrigt [66]. Dieser Umstand lässt sich durch die gleichzeitig erhöhten sFlt-1-Werte erklären: sFlt-1 fängt VEGF ab, bindet es und behindert so die Angiogenese.
Weiter konnte gezeigt werden, dass ein VEGF-Mangel, hervorgerufen durch anti-VEGF- Antikörper, Deletion auf dem entsprechenden Gen oder sFlt-1-Überschuss, zu den typischen präeklamptischen Symptomen Proteinurie und glomerulärer Nephritis führt [8]. Im Rattenmodel führte die Hemmung der proangiogenetischen Faktoren VEGF-A und PlGF durch sFlt-1 zu einem PE-ähnlichen Syndrom bei schwangeren Ratten [13]. Der Regulation von VEGF kommt daher wahrscheinlich eine wichtige Funktion in der Entstehung dieser Symptome bei PE zu.
1.3.3.3 Soluble VEGF-Receptor-1 (sFlt-1)
sFlt-1, auch sVEGFR-1 genannt, ist der lösliche Rezeptor von VEGF. Er entsteht durch alternatives Spleißen der pre-mRNA, welche für den membranständigen Rezeptor von VEGF
Einleitung
12
(Flt-1 oder VEGFR-1) kodiert. Im Vergleich zu VEGFR-1 fehlen bei sFlt-1 die zytoplasmatische sowie die transmembranöse Domäne [67]. sFlt-1 bindet mit hoher Affinität an VEGF und PlGF und inaktiviert sie [68]. sFlt-1 wird unter dem Einfluss von Hypoxie in den Zytotrophoblasten vermehrt gebildet und in den mütterlichen Kreislauf abgegeben[69- 72]. Bei PE, aber auch bei unkomplizierten Schwangerschaften steigt sFlt-1 im Serum in den letzten beiden Schwangerschaftsmonaten an, PlGF sinkt ab. Diese Veränderung beginnt bei PE-Patientinnen verglichen mit gesunden Schwangeren früher und der Anstieg von sFlt-1 bzw. der Abfall von PlGF ist signifikant größer [13]. Die sFlt-1-Konzentration steigt im Rahmen der PE ca. 5 Wochen vor Beginn der klinischen Symptome im Serum der Patientin signifikant an [56]. Zum Zeitpunkt der Entbindung wurde bei präeklamptischen Patientinnen auch im plazentaren Gewebe eine erhöhte sFlt-1-Konzentration gemessen [55]. Nach der Geburt normalisieren sich die Werte von sFlt-1 und PlGF rasch wieder [13] und auch die Symptome der PE verschwinden, sodass sich hier ein Zusammenhang annehmen lässt.
Die Sekretion von sFlt-1 wird in primären Zytotrophoblasten [72] und in humanem plazentarem Gewebe [73] durch Hypoxie induziert. Hypoxie tritt auch im Rahmen der PE in der Plazenta auf. Dieser Effekt wird durch den Transkriptionsfaktor HiF-1α [74] vermittelt.
Abbildung 1.8: sFlt-1 induziert bei Präeklamspie eine endothelialer Dysfunktion [9], gedruckt mit Genehmigung des Urhebers
sFlt wird bei PE verstärkt exprimiert und fängt VEGF und PlGF ein. Auf diese Weise werden VEGF und PlGF daran gehindert an Rezeptoren auf der Zelloberfläche zu binden. Dadurch entfällt ihre proangiogenetische und schützende Funktion. Es resultiert die endotheliale Dysfunktion.
13
Auch Reoxygenierung nach Hypoxie [75] und TNF-α [73] stimulieren die sFlt-1-Sekretion in humanem plazentaren Gewebe. Bei Primaten führte eine plazentare Minderperfusion zu erhöhten sFlt-1-Leveln und Hypertonie [76]. Beim Menschen konnte nachgewiesen werden, dass die intermittierend, unterbrochene Blutzufuhr während der Geburtswehen zur erhöhten Expression von sFlt-1-mRNA und –Protein führt [77]. Diese Erkenntnisse führen zu der Annahme, dass die erhöhte sFlt-1-Sekretion eng mit der Endotheldysfunktion und der mangelnden Angiogenese im Rahmen der PE assoziiert ist [14, 56, 78].
1.3.3.4 Placental Growth Factor (PlGF)
Der plazentare Wachstumsfaktor (PlGF) stellt einen weiteren potentiellen Einflussfaktor in der Entstehung der PE dar. Im Jahr 1991 wurde PlGF erstmals von Maglione et al.
beschrieben [79]. Er wird in Fettgewebe, Lunge, Herz, Schilddrüse und Skelettmuskel produziert. Während der Schwangerschaft wird PlGF in den Synzytiotrophoblasten synthetisiert und sezerniert [80]. Strukturell gehört PlGF zur VEGF-Familie. Durch alternatives Spleißen des humanen PlGF-Gens entstehen vier verschiedene Isoformen von PlGF. PlGF-1 und -3 sind nicht-heparinbindend, wohingegen PlGF-2 und -4 heparinbindende Domänen besitzen [81, 82]. Verglichen mit den weiteren Mitgliedern der VEGF-Familie bindet PlGF mit höherer Affinität und ausschließlich an den VEGFR-1-Rezeptor (Flt-1, löslich oder membrangebunden) [83]. Bei entzündlichen, malignen und ischämischen Erkrankungen werden über diesen Rezeptor die Effekte Angiogenese und Vaskulogenese vermittelt [1, 25]. Die lösliche Variante des Rezeptors, sFlt-1, gilt bislang als Köder, der PlGF kompetitiv bindet und somit inhibiert [84]. Seine proangiogenetische Wirkung kann PlGF direkt über Flt-1 vermitteln oder im Zusammenspiel mit VEGF: PlGF bindet mit höherer Affinität an sFlt-1 und „opfert“ sich, sodass freies VEGF weiterhin an VEGFR-1 und-2 binden kann [1].
Einleitung
14
Der Verlust oder die Inaktivierung von PlGF im gesunden Individuum gilt bisher als folgenlos. Im Verlauf der Schwangerschaft ist PlGF ab der 8. SSW im maternalen Blut nachweisbar, steigt bis zur 29.-32. SSW an und fällt dann bis zur Geburt wieder ab. Bei PE zeigten sich mit Rücksicht auf das Gestationsalter stark erniedrigte PlGF-Werte im Vergleich zu normal verlaufenden Schwangerschaften [1]. Im Rahmen der early-onset PE sinken die PlGF-Werte deutlicher ab, als bei der late-onset-Variante [85]. Unter Hypoxie, ein Zustand der sich bei PE in der Plazenta manifestiert, zeigte sich in den bisherigen Veröffentlichungen folgendes Phänomen: In den meisten o.g. Geweben wird die PlGF-Synthese durch Hypoxie induziert [86-89], in den fetalen Trophoblasten führt sie indes zu einer Reduktion des PlGF [70, 90-93]. Hyperoxämie hingegen erhöhte die PlGF-Expression in Trophoblasten [86].
PlGF-mRNA und –Protein wurden in vitro in Keratinozyten vermehrt gebildet nach Behandlung mit Entzündungszytokinen wie transforming growth factor α (TGFα), transforming growth factor β (TGFβ), Interleukin 6 (IL-6) und endothelial growth factor (EGF) [86]. Bisher konnte noch kein mechanistischer Zusammenhang zwischen den reduzierten PlGF-Werten und der Entstehung der PE gezeigt werden, sodass PlGF in Zusammenschau mit sFlt-1 zunächst als Prädiktionsparameter für das Entwickeln einer PE im Verlauf der Schwangerschaft vorgeschlagen wurde [1]. Besondere Bedeutung hat PlGF bei IUGR mit und ohne PE. Die early-onset-Variante der PE geht häufig mit einer Wachstumsretardierung des Fetus einher (siehe Kapitel 1.3.2). In diesen Fällen ist die PlGF- Konzentration noch niedriger als bei PE ohne IUGR [50]. Man geht daher bei PlGF von einem Marker für die plazentare Funktion aus (siehe Abbildung 1.7).
Abbildung 1.9: PlGF induziert direkt und indirekt proangiogenetische Signale, modifiziert nach Fischer et al [5], gedruckt mit Genehmigung des Urhebers
a: PlGF bindet anstelle von VEGF an sFlt-1 und Flt-1, sodass VEGF via Flk1 (KDR) proangiogenetische Signale vermitteln kann. b: PlGF induziert proangiogenetische Signale über die direkte Bindung an Flt-1.
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1.3.4 Hypoxie und Ischämie
Hypoxie wird definiert als die unzureichende Sauerstoffbereitstellung für Zellen und Gewebe.
Der Sauerstoffpartialdruck (pO2) im mütterlichen Blut beträgt im gesunden Zustand 80- 100 mmHg (21% O2) und führt zu einer Sättigung von ≥95% im arteriellen Blut. Die klinische Definition von Hypoxämie beginnt bei einer Sauerstoffsättigung (SaO2) ≤90%, entsprechend einem PaO2 von 60 mmHg. Der Sauerstoffaustausch in der Plazenta erfolgt im intervillösen Raum entlang der Synzytiotrophoblasten. Die treibende Kraft für die Diffusion ist der Partialdruckgradient zwischen mütterlichem und fetalem Blut. Der plazentare pO2 im intervillösen Raum beträgt im ersten Trimester ~20 mmHg (2,6% O2), im zweiten Trimester 60 mmHg (7,9% O2) und 40 mmHg (5,3% O2) im dritten Trimester[94]. Erst am Ende des ersten Schwangerschaftstrimesters beginnen die Spiralarterien den intervillösen Raum mit maternalem Blut, also mit Sauerstoff und Nährstoffen, zu versorgen. Es wird angenommen, dass der niedrige pO2 während des ersten Trimesters die Organogenese vor schädigenden Einflüssen der ROS schützt [7].
Im Rahmen der PE kommt es zu uteroplazentarer Hypoxie, ungenügender Trophoblasteninvasion in die Dezidua und unzureichendem Remodeling der Spiralarterien.
Die daraus resultierende Minderperfusion des intervillösen Raumes führt zur Unterversorgung des fetalen Bluts mit Sauerstoff [11]. Es konnte im Tiermodell gezeigt werden, dass uteroplazentare Hypoxie zu präeklamptischen Symptomen (Hypertension, Proteinurie) und Erhöhung der antiangiogenetischen Faktoren sFlt-1, sENG und Endothelin-1 (ET-1) führt [95-97]. In humanen Plazentaproben konnte gezeigt werden, dass Hypoxie zur Produktion des Transkriptionsfaktors HIF-1α führt und dieser die vermehrte Produktion von sFlt-1 induziert [74, 98]. Obwohl der genaue Pathomechanismus der PE-Entstehung noch nicht ausreichend verstanden ist, scheint die Hypoxie in der Plazenta eine wesentliche Rolle zu spielen.
1.3.5 Immunologie und Inflammation
Die Plazentation in der frühen Embryonalphase jeder Schwangerschaft bedarf der feinen Abstimmung der Immuntoleranz zwischen Mutter und Kind. Es gibt Hinweise, dass PE mit einer übersteigerten Immunantwort des mütterlichen Organismus auf paternale bzw. fetale Antigene einhergeht [99]. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass PE besonders häufig bei der ersten Schwangerschaft oder bei Schwangerschaften nach einer kurzen Beziehungszeit auftritt [8, 100]. Des Weiteren ist bekannt, dass natürliche Killerzellen (NK) an der fetomaternalen Schnittstelle vorhanden sind und dort maßgeblich für die
Einleitung
16
Entstehung der Immuntoleranz, das Remodeling der Gefäße und die Aktivierung proangiogenetischer Faktoren verantwortlich sind [8, 101].
Bereits bei einer gesunden Schwangerschaft reagiert der mütterliche Organismus mit einer Entzündungsantwort auf die Plazentation [102]. Bei PE geht man von einer überschießenden Entzündungsreaktion aus [40], die durch Aktivierung des Komplementsystems und der neutrophilen Granulozyten zu einer Schädigung des Gefäßendothels führen [103]. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass proinflammatorische Zytokine, wie IL-6 und Tumornekrosefaktor-α (TNFα) im Rahmen der PE erhöht sind [104]. Im Blut präeklamptischer Mütter konnte außerdem zirkulierende fetale DNA und Mikropartikel der Synzytiotrophoblastenmembran nachgewiesen werden. Beides unterhält die systemische Entzündungsreaktion und führt zu oxidativem Stress und endothelialer Dysfunktion [40, 105].
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die beschriebene Endothelzelldysfunktion in präeklamptischen Plazenten mit erhöhten Zellaktivierungsmarkern wie intercellular adhesion molecule 1 (ICAM1) [106], vascular cell adhesion molecule (VCAM1) [107], ET-1 [108], von-Willebrand-Faktor (vWF) [109] und Thrombomodulin [110] einhergeht. Sie sind ein Hinweis auf die erhöhte Immun- und Entzündungsreaktion in präeklamptischem Gewebe.
1.3.6 Weitere Mechanismen in der Präeklampsieentstehung
Bisher konnte in der Erforschung der PE kein ursächliches Gen identifiziert werden. Es gibt dennoch Hinweise auf eine genetische Prädisposition. Dazu gehört die Tatsache, dass das Risiko einer erneuten PE nach vorangegangener PE für die Frau zwei- bis vierfach erhöht ist [111]. Sollte eine Frau von einem Mann schwanger werden, der in einer vorherigen Partnerschaft bereits eine PE-Schwangerschaft erlebt hat, so ist das Risiko für eine erneute PE (der neuen Frau) verdoppelt [112]. Die Theorien reichen hier von der Vererbung einzelner Gene, über genomisches Imprinting bis hin zu der Annahme, es könnte sich um eine polygene Erkrankung handeln [8].
Zusätzlich zu den genannten molekularen und zellulären Veränderungen bei PE, kommt es zu einer Störung im Renin-Angiotensin-Aldosteron-System. Während die Hormone dieses Systems unter gesunden Schwangerschaftsbedingungen ansteigen, fallen sie bei PE (verglichen mit der gesunden SS) ab [113]. Zeitgleich kommt es zu einer Hypersensitivität für Angiotensin-II, welches zu Vasokonstriktion und Erhöhung des Blutdrucks führt –ein PE-
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definierendes Symptom. Außerdem wird ein agonistisch-wirkender AT-1-Autoantikörpern (AT1-AA) produziert, welcher die Hypersensitivität auf Angiotensin-II erklären könnte [114].
1.4 Adenosin und Adenosinrezeptoren
1.4.1 Adenosin
Adenosin ist ein endogenes Nukleosid, bestehend aus dem Zucker β-D-Ribose und einer Nukleinbase, dem Adenin. Adenosin ist ubiquitär im Körper vorhanden und spielt eine zentrale Rolle im Energiehaushalt der Zellen. Das reine Nukleosid vermittelt zahlreiche Effekte. Dazu gehört in den meisten Geweben die Vasodilatation durch Antagonisierung der Wirkung von Katecholaminen [115]. Eine Ausnahme bilden die Plazenta [116], die Nieren [117] und die Lunge [118], wo Adenosin eine Vasokonstriktion vermittelt. Weiterhin fördert Adenosin die Angiogenese [119], Proliferation [120] und Inflammation [121]. Außerdem schützt es vor oxidativem Stress [122, 123]. Die physiologische extrazelluläre Adenosinkonzentration liegt bei 30 bis 300 nM. Zu den Stimuli für die Erhöhung der Adenosinkonzentration gehören Hypoxie, Ischämie und Inflammation [123, 124]. Sie kann unter hypoxischen Bedingungen bis auf 10 µM ansteigen [125]. Im Rahmen der Sepsis, ein Zustand der mit Ischämie und Entzündung einhergeht, steigen die Adenosinwerte über 10 µM an [124, 126]. Bei rheumatoider Arthritis konnten in der Synovialflüssigkeit Adenosinkonzentrationen bis 100 µM nachgewiesen werden [127]. Die extrazelluläre Adenosinanreicherung erfolgt durch bidirektionalen Transport über Adenosintransporter, extrazellulär abgebautes Adenosintriphosphat (ATP) und Hydrolyse von S- Adenosylhomocystein. Die Inaktivierung von Adenosin erfolgt bei Phosphorylierung durch die Adenosinkinase und bei Deaminierung durch die Adenosindeaminase [125].
Die Adenosinkonzentration im maternalen Plasma steigt während der Schwangerschaft allgemein an. Die Adenosinkonzentration bei einer präeklamptischen Schwangerschaft übersteigt die Werte bei gesunder Schwangerschaft [128]. Außerdem korreliert die Höhe der mütterlichen Adenosinkonzentration mit dem Schweregrad der PE [128]. Auch im fetalen Kreislauf ist die Adenosinkonzentration bei präeklamptischer Schwangerschaft gegenüber dem Wert bei gesunder Schwangerschaft signifikant erhöht [129]. Des Weiteren übersteigen auch bei IUGR die Adenosinwerte im fetalen Blut die Werte bei gesunder Schwangerschaft [130]. Adenosin kommt somit eine wichtige Rolle im Rahmen der Präeklampsieentstehung zu.
Weitere Hinweise zur Funktion von Adenosin bei PE zeigten sich im Rattenmodel. Die
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18
intravasale Verabreichung von ATP führte zu Albuminurie, einem der PE-definierenden Symptome [131]. Darüber hinaus konnte in diesem Versuch auch gezeigt werden, dass die ATP-Infusion ausschließlich bei den schwangeren Tieren zu Albuminurie, systemischer Inflammation und Erhöhung des Angiotensin-II-Rezeptor-Typ-1 (AT-1R) führte [131].
Hierbei zeigt sich eine mögliche krankheitsinduzierende Funktion von Adenosin.
Leonard et al. konnten 2011 zeigen, dass Adenosin erhöhte sFlt-1-Spiegel um 43%
abmilderte. Zeitgleich stieg die mFlt-Konzentration, sodass man von einem Wechsel der löslichen (=antiangiogenen) Variante auf die membrangebundene (=proangiogene) Variante ausgehen kann [132]. Dieser Versuch zeigte den möglichen protektiven Effekt von Adenosin bei PE.
Zahlreiche Studien zeigen, dass die Zugabe von Adenosin zu unterschiedlichen Gewebetypen zu einer Erhöhung von VEGF führt [119, 133-139]. Auf diese Weise wird die Angiogenese stimuliert. Adenosin regt auch unter Umgehung von VEGF die Endothelzellproliferation an.
Dies kann ein Hinweis auf weitere von Adenosin beeinflusste pro- und antiangiogenetische Faktoren sein [133, 135, 136, 140, 141]. Bisher wurde der Einfluss von Adenosin auf humanes plazentares Gewebe noch nicht erarbeitet. Ein Versuch im Rattenmodel zeigte, dass unter normoxischen Bedingungen die Zugabe von Adenosin zu plazentaren Gewebeproben zu einer deutlichen Erhöhung der extrazellulären sFlt-1-Konzentration führte [142]. Auch die Zugabe von Dipyridamol (Antagonist des Adenosintransporters) führt zur Erhöhung der extrazellulären Adenosinkonzentration. Im gleichen Versuchsaufbau erzielte man eine Erhöhung von sFlt-1. Weiterhin konnte dort gezeigt werden, dass eine Blockade der Adenosinsignalweiterleitung durch einen Adenosinrezeptorantagonisten den erwarteten sFlt-1-Anstieg unter Hypoxie verhinderte. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass Adenosin unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen die Expression von sFlt-1 reguliert und somit eine entscheidende Rolle im Rahmen der PE spielt [142].
1.4.2 Adenosinrezeptoren
Adenosin vermittelt seine Effekte über membranständige Adenosinrezeptoren. Diese kommen ubiquitär im Körper vor und vermitteln vielfältige Signale [143]. Sie sind beteiligt an physiologischen und pathologischen Prozessen wie Angiogenese, Entzündung, Abwehren von Oxidativem Stress, Immunantwort, u.a. [143-145]
Die Adenosinrezeptoren liegen strukturell als Monomer vor, können sich aber auch zu funktionalen Homo- und Heterooligomeren zusammenschließen [146]. Jedes Monomer besteht aus sieben Transmembrandomänen mit einem intrazellulären Carboxyterminus und
19
einem extrazellulären Aminoterminus [147]. Alle vier Rezeptoren, Adenosin-A1-Rezeptor (A1R), Adenosin-A2A-Rezeptor (A2AR), Adenosin-A2B-Rezeptor (A2BR) und Adenosin-A3- Rezeptor (A3R), gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Hinsichtlich ihres Effektes auf die intrazelluläre Adenylatzyklase (AC), und somit auch auf die intrazelluläre cAMP-Produktion, werden die Adenosinrezeptoren A1R und A3R als inhibierend (Gi/o) und die Adenosinrezeptoren A2AR und A2BR als aktivierend (Gs) bezeichnet. A2AR und A2BR führen im weiteren Verlauf zu einer Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) [143, 148], sodass weitere Proteine aktiviert und phosphoryliert werden. A2BR und A3R können variabel auch an Gq-Proteine gekoppelt sein. Sie vermitteln ihre Effekte dann über die Aktivierung der Phospholipase C (PLC), die zu einer Erhöhung der Konzentrationen von 1,4,5-Triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) führt. Der A1R kann variabel auch an ein G0-Protein gekoppelt sein und stimuliert darüber die AC im Riechepithel. Der Rezeptortyp A2A aktiviert außerdem die Inositolphosphat-Expression (IP), aktiviert die Proteinkinase C (PKC) und erhöht den intrazellulären Kalziumspiegel. Daraufhin werden Neurotransmitter ausgeschüttet oder Muskelkontraktionen ausgelöst [144]. Über ein Netzwerk unterschiedlicher Signalwege aktivieren alle vier Adenosinrezeptoren die Familie der mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) [125, 143, 149, 150].
Die Rezeptoren A2A und A2B kommen ubiquitär im gesamten Körper vor und werden meist co-exprimiert [151]. A2BR hat im Vergleich zu den anderen drei Rezeptortypen die niedrigste Affinität zu Adenosin. Während A1R, A2AR und A3 bereits bei Adenosinkonzentrationen im Nanomolar-Bereich aktiviert werden, passiert dies bei A2BR erst im Mikromolar-Bereich [143]. Es wird daher angenommen, dass A2BR seine volle Funktion erst bei hohen Adenosinkonzentrationen im Rahmen pathologischer Prozesse entfaltet [151].
In der Plazenta konnten alle vier genannten Adenosinrezeptoren nachgewiesen werden. Dabei zeigten sich nach immunhistochemischer Färbung alle Rezeptoren auf Trophoblasten und Endothelzellen. Der A2BR konnte hingegen als einziger Rezeptor nicht auf Fibroblasten und Myofibroblasten nachgewiesen werden [152].
Die gleiche Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass alle vier Adenosinrezeptoren in präeklamptischer Plazenta verstärkt exprimiert werden. Dieser Unterschied wurde allerdings nicht bei IUGR ohne PE festgestellt. Die Behandlung von plazentaren Gewebeproben mit Hypoxie führte zu einer isolierten Erhöhung der Expression des Adenosinrezeptors A2A. Die anderen Adenosinrezeptoren zeigten keine Expressionsveränderung unter Hypoxie [152]. Hier zeigt sich ein möglicher Schritt zur Präeklampsientstehung.
Feoktistov et al. konnten nachweisen, dass in Endothelzellen vornehmlich A2AR vorhanden
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sind. Außerdem zeigten sie, dass es dort nach Aktivierung mit Adenosin unter normoxischen Bedingungen nicht zu einer VEGF-Erhöhung kommt [135]. Der Einfluss von Hypoxie führte hingegen zu vermehrter Expression von A2BR und nachfolgend zu erhöhter VEGF- Expression. Zeitgleich wurde die Expression des A2AR herunterreguliert [119].
Beiden Rezeptoren scheint daher eine wichtige Rolle bei hypoxischen Prozessen beispielsweise im Rahmen der PE zuzukommen.
1.5 Aminosäuretransporter System A
Kontinuierliches und ausreichendes fetales Wachstum ist die Grundlage für eine gesunde Entwicklung der Schwangerschaft [153, 154]. Aminosäuren stellen dabei wichtige Bausteine in der Proteinsynthese als auch in der Energiebereitstellung für den Fetus dar. Sie tragen zu 20-40% zur Energieversorgung bei [155]. Aminosäuren gelangen entgegen ihrem Konzentrationsgradienten durch aktiven Transport aus dem mütterlichen Blut in den kindlichen Kreislauf. Der plazentare Aminosäuretransporter System A sitzt in der Basalmembran (BM) und der Mikrovilli-Seite (MVM) der Synzytiotrophoblasten. System A kommt besonders häufig an der MVM vor und sorgt dort für den Transport neutraler Aminosäuren wie Alanin, Glutamin, Glycin und Serin[156] von der Mutter zum Fetus [156].
System-A ist natriumabhängig, sodass der Natriumgradient über der MVM die treibende Kraft darstellt. Dieser wird durch die Na+-/K+-ATPase aufrechterhalten. Es gibt in der Plazenta drei Isoformen des Aminosäuretransporters: SNAT 1, SNAT 2 und SNAT 4 [157].
Die Aktivität von System A wird durch Insulin [158-161], IL-6 [162] und TNFα [162] erhöht.
Der Effekt von IL-6 wird dabei durch die STAT-3-Signalweitergabe vermittelt [162]. Auch Glucagon, Cortisol, der pH-Wert und die Sauerstoffkonzentration beeinflussen die Aktivität von System A [163-166]. In Hepatozyten von Ratten konnte Adenosin die Aktivität von System A erhöhen [167].
In plazentarem Gewebe steigt die Aktivität von System A bei abfallender Aminosäurekonzentration [168-170]. Dieses Phänomen nennt man adaptive Regulation.
Wahrscheinlich verhindert dieser Mechanismus bis zu einem gewissen Grad die Ausbildung einer Wachstumsretardierung bei plazentarer Malperfusion oder Nährstoffmangel der Mutter [170]. Es gibt Hinweise, dass dieser Mechanismus durch den mTOR-Signalweg vermittelt wird [171], da mTOR bei Nährstoffmangel für die Heraufregulierung der Aminosäuretransporter sorgt [172, 173]. Bei IUGR ist die Aktivität von System A herabgesetzt [157, 174-178] und die Aminosäurekonzentration im fetalen Blut vermindert [179]. Bisher ist nicht eindeutig geklärt, ob dieser Aktivitätsabfall die Wachstumsretardierung
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auslöst oder Folge des verminderten Wachstums ist [180]. Einen Hinweis gab es dazu im Tiermodell. Hier konnte bereits gezeigt werden, dass die Verringerung der System A- Aktivität zur Ausprägung von IUGR führt [181, 182]. Im Rahmen der IUGR ist nicht nur die Aktivität des Aminosäuretransporters System A vermindert, sondern auch die Aktivität des mTOR-Signalwegs [183, 184]. Der Zusammenhang zwischen mTOR und System A konnte in der Zellkultur (Zytotrophoblasten aus frischer Plazenta isoliert) bereits nachgewiesen werden.
Eine Aktivierung des mTOR-Signalwegs führte zu einer Aktivierung von System A [173].
Fragestellung
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2 Fragestellung
Die Schwangerschaftskomplikationen PE und IUGR können zeitgleich auftreten. Man geht von einer gemeinsamen Pathophysiologie in der Frühschwangerschaft aus. Dazu gehört die mangelnde Umwandlung mütterlicher Spiralarterien wegen unzureichender Trophoblasteninvasion. Nachfolgend kommt es zu gestörter plazentarer Perfusion mit Hypoxie und mangelnder Nährstoffversorgung. Gleichzeitig entsteht ein Ungleichgewicht zwischen pro- und antiangiogenetischen Faktoren. Bei IUGR fällt zusätzlich die Aktivität des Aminosäuretransporters System A in der Plazenta.
Adenosin, ein durch Hypoxie induzierbares Molekül, reguliert vielfältige Zellfunktionen.
Während einer präeklamptischen Schwangerschaft und auch bei IUGR ist die Adenosinkonzentration im maternalen und fetalen Blut erhöht. Die Funktion von Adenosin und seinen Rezeptoren A2A und A2B in der Plazentaentwicklung ist bisher unbekannt.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Rolle von Adenosin in der Pathophysiologie von PE und IUGR zu definieren. Dazu wird im ersten Schritt der Einfluss der Sauerstoffkonzentration, des hypoxie-induzierbaren Moleküls Adenosin und seiner Rezeptoren auf die Expression pro- und antiangiogenetischer Faktoren in der Plazenta erarbeitet. Anschließend wird der Einfluss von Sauerstoff, Adenosin und seiner Rezeptoren auf die Aktivität des Aminosäuretransporters System A ermittelt. Die wesentlichen Fragen lauten:
1) Ist die Expression von sFlt-1, VEGF-A oder PlGF in der Plazenta sauerstoffabhängig?
2) Beeinflussen Adenosin bzw. die Adenosinrezeptoren A2A oder A2B die Expression von sFlt-1, VEGF-A oder PlGF?
3) Ist die Aktivität des System-A-Transporters durch Adenosin modifizierbar?
Zur Beantwortung dieser Fragestellungen wurden Untersuchungen auf Protein- und mRNA- Ebene vorgenommen. Die funktionellen Tests unter Einsatz von Agonisten und Antagonisten an den Adenosinrezeptoren A2A und A2B sowie das Transportassay zur Aktivitätsbestimmung von System A erfolgten an frischen plazentaren Gewebeproben („villous explants“) reifer Plazenten oder an Zelllinien (HTR8/SVneo und BeWo).
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3 Material und Methoden
3.1 Verwendete Materialien
3.1.1 Chemikalien
Tabelle 3.1: Chemikalien
Bezeichnung Hersteller
Adenosin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Adenosin-Deaminase Calbiochem®, Merck KGaA, Darmstadt
Agarose Ultra Pure™ Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, USA
Aprotinin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
BioRad Protein Assay Dye Reagent Bio-Rad, Laboratories GmbH, München Bovine Serum Albumin Standard (BSA) Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,
USA
Calciumchlorid Sigma-Aldrich, Steinheim
CGS 21680 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Chloroform/Trichlormethan Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Cholinchlorid Sigma-Aldrich, Steinheim
DEPC AppliChem GmbH, Darmstadt
Dextrose Sigma-Aldrich, Steinheim
Dipyridamol Sigma-Aldrich, Steinheim
DMEM Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad,
USA
DMSO liquid Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ethanol 99% Th. Geyer GmbH & Co. KG, Renningen
Ethanol für die Spektroskopie Uvasol® Merck Chemicals, Merck KGaA, Darmstadt FastStart Universal SYBR Green Master
(ROX)
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Fetal Bovine Serum (FBS, FKS) Biochrom AG, Berlin
Ham‘s F-12 Nutrient Mix Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, USA
HEPES Sigma-Aldrich, Steinheim
HPLC grade water J.T. Baker®, Covidien plc, Dublin, Irland
H2O2 30% Omnilab-Laborzentrum GmbH Co. KG,
Bremen
Insulin Sigma-Aldrich, Steinheim
Kaliumchlorid Sigma-Aldrich, Steinheim
Leupeptin SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg
Magnesiumchlorid Sigma-Aldrich, Steinheim
Methanol J.T. Baker®, Covidien plc, Dublin, Irland
MRS 1754 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Material und Methoden
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Natriumchlorid Sigma-Aldrich, Steinheim
NECA Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ouabain Octahydrat (=Strophantin) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Penicillin/Streptomycin Biochrom AG, Berlin
Phenol AppliChem GmbH, Darmstadt
Reverse Transkriptase Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, USA
SCH 58261 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Total RNA Isolation Reagent ABgene® Thermo Fisher Scientific, Epsom, UK
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Trypan Blue solution 0,4% Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Trypsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ultima Gold Scintillation Solution Perkin Elmer Inc., Waltham, USA Uvasol® (Ethanol) Th. Geyer GmbH & Co. KG, Renningen
2-Propanol J.T. Baker®, Covidien plc, Dublin, Irland
3.1.2 Kits
Tabelle 3.2: Kits
Bezeichnung Hersteller
Quantikine Human Soluble VEGF R1/Flt-1 Immunoassay
R&D Systems Inc., Minneapolis, USA Quantikine Human PlGF Immunoassay R&D Systems Inc., Minneapolis, USA Quantikine Human VEGF Immunoassay R&D Systems Inc., Minneapolis, USA High Capacity cDNA Reverse Transkription
Kit
Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, USA
LDH-Kit Sigma-Aldrich, Taufkirchen
3.1.3 Primer
Tabelle 3.3: Primer
Bezeichnung Hersteller
18S-rRNA-Primer Eurogentec, Seraing, Belgien
VEGF-Primer Eurogentec, Seraing, Belgien
3.1.4 Isotope
Tabelle 3.4: Isotop
Bezeichnung Menge
14C-MeAIB ARC, Inc., St. Louis, USA
25
3.1.5 Geräte
Tabelle 3.5: Geräte
Bezeichnung Menge
Absaugpumpe Gast® MFG Corporate, USA
Accu Jet Magenta Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA
Autoklaviergeräte: HST 6-6-6 LVSA 50/70
Zirbus Technology, Bad Grund Biometra Standard Power Pack P25 Biometra GmbH, Göttingen
BioPhotometer Eppendorf AG, Hamburg
Dispenser Multipette Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA
Eismaschine Ziegra, Isernhagen
Microplate Reader sunrise™ basic Tecan Austria GmbH, Grödig, Österreich Microplate Reader RC STD™ Tecan Austria GmbH, Grödig, Österreich Geldokumentationssystem Biostep GmbH, Jahnsdorf
Gelelektrophoresesystem Horizon 58 Gibco BRL, Eggenstein
Gefrierschrank -80° Sanyo Electric Biomedical Co. Ltd., Japan
Gefrierschrank -20° Liebherr, Ochsenhausen
Inkubationssystem Xvivo Biospherix Ltd, Lacona, USA
Inkubator Sanyo Electric Biomedical Co. Ltd., Japan
Lichtmikroskop Olympus IX 51 Olympus, Hamburg
Mikrowelle Panasonic, Japan
Mastercycler PTC-200, Peltier Thermal CyclerCycler (für rt-PCR)
Biozym Diagnostik GmbH, Oldendorf pH-Einstabmesselektrode SE100 Knick GmbH & CoKG, Berlin
Photometer Multiskan EX LabSystems Thermo Fisher Scientific Inc., Dänemark Pipettierhilfe Accu-jet pro Brand GmbH+CoKG, Wertheim
Präzisionswaage AW series BP61 Sartorius AG, Göttingen
Rotor Gene 600 PCR-Gerät (für q-PCR) Corbett Research, Hilden, Deutschland Schüttler Mini Rocker Shaker PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Scintillation-Counter, multi-purpose, LS6500 Beckman Coulter GmbH, Krefeld
Sonifier Bandelin Sonoplus HD2070 BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin
Sterilbank HeraSafe 300 Kendro Laboratory Products, Hanau Transilluminator BioView Vilber Lourmat Deutschland GmbH,
Eberhardzell
Vortex Heidolph Reax Control Heidolph Instruments GmbH & Co. KG Schwabach
Wärmeschrank: Memmert Modell 400 Memmert, Schwachbach
Wasserbad GFL 1083 Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel
Werkbank mit Abzug mc6 Waldner Laboreinrichtung, Wangen Zentrifugen: 5415C und 5415D
Zentrifuge Hettich "Rotina 35R"
Eppendorf, Hamburg
Andreas Hettich GmbH, Tuttlingen
Material und Methoden
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3.1.6 Software
Tabelle 3.6: Software
Bezeichnung Menge
Ascent software 2.6 Thermo Fisher Scientific Inc., Dänemark
GraphPad Prism6 GraphPad Software Inc., USA
Magellan™ Data analysis software V.3.11 Tecan Group Ltd., Schweiz Magellan™ Data analysis software V.6.6 Tecan Group Ltd., Schweiz
Rotor Gene 6000 Software 1,7 Corbett Research (Qiagen), Hilden Wat View Xvivo Control Biospherix Ltd, Lacona, USA
3.1.7 Verbrauchsmaterialien
Tabelle 3.7: Verbrauchsmaterialien
Bezeichnung Menge
24 Well Multidishes Nunclon ™ Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA 96 Well Optical Bottom Plates Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA
Petrischalen Sarstedt, Nümbrecht
Kryo Box Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA
Kryo-Röhrchen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Multipettenaufsätze in versch. Größen Eppendorf AG, Hamburg
Neubauer-Zählkammer Omnilab- Laborzentrum, Bremen
Nunc Easy Flasks™ T75 Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA
Parafilm American National CanTM, USA
Rastereinsatz 9x9 Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA Safe Seal Reagiergefäß 0,5 ml, 1 ml, 2 ml Sarstedt AG & Co. KG, Nürnbrecht
Serologische Pipetten 5ml, 10 ml Sarstedt AG & Co. KG, Nürnbrecht Sterling Nitril- Untersuchungshandschuhe Kimberly Clark, UK
Strip tubes 0,1 ml für Rotor Gene LTF Labortechnik, Wasseburg
Szintillationsgefäße Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA Pipettenspitzen epTIPS 0,1-10 µl; 0,5-20 µl Eppendorf AG, Hamburg
Pipettenspitzen gelb 200 µl, 1000µl Sarstedt AG & Co. KG, Nürnbrecht Polypropylen Röhrchen 15 ml, 50 ml Greiner Bio-One International AG
Kremsmünster, Österreich Combitips plus 1ml, 2,5ml, 5ml, 10 ml Eppendorf AG, Hamburg
Glasflasche 1l Duran® Omnilab-Laborzentrum GmbH Co. KG
Bremen
3.1.8 Humane Materialien
Zur Erforschung der lebensnahen plazentaren Funktion wurden in dieser Arbeit plazentare Gewebeproben verwendet. Die Plazenten entstammten primären Sectiones von gesunden Schwangeren am Ende des dritten Trimenons. Die Patientin wurde zuvor über das Forschungsvorhaben aufgeklärt und ihre schriftliche Zustimmung eingeholt (siehe auch Kapitel 3.2.2 Auswahl der Patientinnen).
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3.1.9 Zelllinien
3.1.9.1 HTR8/SVneo
HTR8/SVneo-Zellen sind humane Ersttrimestertrophoblasten, die mittels Simian Virus Transfection immortalisiert wurden [185]. Bezugsquelle: Dr. C. Graham, Queens University Kingston, Ontario, Kanada.
3.1.9.2 BeWo
BeWo-Zellen sind immortalisierte Trophoblasten, isoliert aus humanem Chorionkarzinom.
Diese Zelllinie zeigt strukturelle und funktionelle Eigenschaften gesunder, plazentarer Trophoblasten [186, 187]. Bezugsquelle: CLS, Cell Lines Service GmbH, Eppelheim.
3.1.10 Medien
3.1.10.1 RPMI-Medium für HTR8/SVneo-Zellen
Tabelle 3.8: RPMI-Medium
Zusatz Menge
RPMI 1640 495 ml
FKS 5 ml
Penicillin/Streptomycin 500 µl
3.1.10.2 F12-Medium für BeWo-Zellen
Tabelle 3.9: F12-Medium
Zusatz Menge
Ham`s F12 Nutrient Mix 495 ml
FKS 5 ml
Penicillin/Streptomycin 500 µl
3.1.10.3 DMEM-F12-Medium für Plazentagewebe
Tabelle 3.10: DMEM-F12-Medium
Zusatz Menge
DMEM 495 ml
Ham’s F-12 Nutrient Mix 495 ml
FKS 10 ml
Penicillin/Streptomycin 1 ml
Material und Methoden
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3.1.10.4 Adenosinkonzentrationsreihe
Tabelle 3.11: Adenosin-Medium 1mM
Zusatz Menge
DMEM-F12-Medium 10 ml
Adenosin (MW 267,25) 0,00267 g
Zur Herstellung einer Verdünnungsreihe wurde 1 mM Adenosin-Medium als Ausgangssubstanz verwendet. Es entstanden dabei Adenosin-Medien in absteigender Konzentration: 100 µM, 10 µM, 1 µM. Diesen wurde außerdem 1 µl DMSO/10 ml Medium zugesetzt.
3.1.10.5 Medium mit A
2A-Rezeptormodulatoren
3.1.10.5.1 Ansatz für A2AR-Agonist
Tabelle 3.12: A2AR-Agonist, Zielkonzentration: 1 µM
Zusatz Menge
Nährmedium 12 ml
CGS 21680 (0,1mM Stammlösung in DMSO)
120 µl
Adenosin-Deaminase 4,8 µl
3.1.10.5.2 Ansatz für A2AR-Antagonist
Tabelle 3.13: A2AR-Antagonist, Zielkonzentration 1 µM
Zusatz Menge
Nährmedium 12 ml
SCH 58261 (1mM Stammlösung in DMSO) 12 µl
Adenosin Deaminase 4,8 µl
3.1.10.5.3 Ansatz für A2AR-Agonist-Antagonist-Mischung
Tabelle 3.14: A2AR-Agonist-Antagonist, Zielkonzentrationen: CGS 1 µM; SCH 1 µM
Zusatz Menge
Nährmedium 12 ml
CGS 21680 (0,1mM Stammlösung in DMSO)
120 µl SCH 58261 (1mM Stammlösung in DMSO) 12 µl
Adenosin Deaminase 4,8 µl
