Die Bedeutung des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 in dendritischen Zellen für die Pathophysiologie einer Dextrannatriumsulfat induzierten Colitis

Tierärztliche Hochschule Hannover

Die Bedeutung des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 in dendritischen Zellen für die Pathophysiologie einer Dextrannatriumsulfat induzierten Colitis

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Katharina Flück

Borken

Hannover 2014

Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Joachim Fandrey Institut für Physiologie Universität Duisburg-Essen Universitätsklinikum Essen 2. Prof. Dr. Gerhard Breves Physiologisches Institut

Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Prof. Dr. Joachim Fandrey

Prof. Dr. Gerhard Breves

2. Gutachter: PD Dr. Maren von Köckritz-Blickwede

Tag der mündlichen Prüfung: 26.09.2014

Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefördert.

Meiner Familie

Ein Teil dieser Dissertation wurde zur Veröffentlichung vorbereitet.

Hypoxia-inducible factor 1 in dendritic cells is crucial for the activation of regulatory T cells in murine colitis

Katharina Flück^1,2, Gerhard Breves², Joachim Fandrey¹, Sandra Winning¹

1 Institut für Physiologie, Universität Duisburg-Essen, Essen, Germany;

2 Physiologisches Institut, Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, Germany

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung... 7

1.1 Immunsystem des Darms ...7

1.2 Rolle von dendritischen Zellen (DCs) im Immunsystem des Darms ...9

1.2.1 Aktivierung der adaptiven Immunantwort im Darm durch DCs ... 10

1.2.2 Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase ... 13

1.3 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen ... 17

1.4 Murine Modelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen ... 20

1.5 Beteiligung von DCs an der Entstehung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ... 22

1.6 Der Hypoxie induzierbare Faktor (HIF) ... 23

1.6.1 Aufbau und Funktion von HIF ... 23

1.6.2 Sauerstoffabhängige Regulation und Aktivierung von HIF-1 ... 25

1.6.3 Sauerstoffunabhängige Regulation und Aktivierung von HIF-1 ... 26

1.6.4 Bedeutung von HIF-1 im Rahmen von Infektionen und Entzündungen ... 28

1.7 Ziel der Dissertation ... 30

2 Material und Methoden ... 31

2.1 Materialien ... 31

2.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 31

2.1.2 Chemikalien ... 33

2.1.3 Puffer und Lösungen ... 35

2.1.4 Antikörper ... 37

2.1.5 Zytokine ... 38

2.1.6 Oligonukleotide ... 39

2.1.7 cDNA-Synthese, PCR und Real Time PCR ... 41

2.2 Methoden ... 42

2.2.1 Tierexperimentelle Methoden ... 42

2.2.2 Zellkultur ... 47

2.2.3 Molekularbiologische Methoden ... 48

2.2.4 Histologische Methoden ... 60

3 Ergebnisse ... 64

3.1 Zur Publikation vorbereitetes Manuskript ... 64

3.1.1 Abstract ... 66

3.1.2 Introduction ... 66

3.1.3 Materials and Methods ... 68

3.1.4 Results ... 70

3.1.5 Discussion ... 75

3.1.6 References ... 78

3.1.7 Figures ... 84

3.1.8 Supplementary Material ... 95

3.2 Weitere Präsentationen ... 101

3.3 Weitere Ergebnisse ... 102

3.3.1 Anstieg des Disease Activity Index durch DSS induzierte Colitis... 102

3.3.2 Veränderungen des Colons durch DSS induzierte Colitis ... 103

3.3.3 Hochgradige Entzündung des Colons durch DSS Behandlung ... 104

3.3.4 Verstärkte Alcianblau Färbung in DSS behandelten CD11cCre/HIF-1α^+f/+f Tieren ... 108

4 Diskussion ... 110

4.1 Auswirkungen einer Colitis auf intestinale DCs ... 110

4.2 Entzündungsparameter HIF-1α^+f/+f und CD11cCre/HIF-1α^+f/+f DSS behandelter Tiere ... 110

4.3 Typ I Interferon Produktion... 115

4.4 Aktivierung regulatorischer T-Zellen durch DCs ... 117

4.5 Wechselwirkungen zwischen IECs und DCs... 123

5 Zusammenfassung ... 128

6 Summary ... 132

7 Literaturverzeichnis ... 135

8 Anhang ... 162

8.1 Abkürzungsverzeichnis ... 162

8.2 Abbildungsverzeichnis ... 168

8.3 Tabellenverzeichnis ... 170

1 Einleitung

1.1 Immunsystem des Darms

Das Immunsystem ist ein komplexes Netzwerk des Körpers, um Pathogene und entartete körpereigene Zellen zu erkennen und unschädlich zu machen. Das Abwehrsystem des Körpers wird dabei in die angeborene und in die adaptive Immunantwort unterteilt.

Zu den wichtigsten Effektorzellen des angeborenen Immunsystems gehören die phagozytierenden Zellen, wie Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen (DC, engl. dendritic cell). Sie können eingedrungene Erreger anhand ihrer Oberflächenproteine erkennen und vernichten. Diese Zellen stellen zudem ein Bindeglied zwischen angeborener und adaptiver Immunantwort dar, da sie aufgenommene Zellen und Partikel in Peptidfragmente zerlegen und durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) den Zellen der adaptiven Immunantwort präsentieren können. Diese Zellen werden demnach auch antigenpräsentierende Zellen (APC, engl. antigen presenting cell) genannt (Medzhitov 2007; Steinman &

Hemmi 2006).

Zu den Zellen der adaptiven Immunantwort gehören unter anderem die B-Zellen, welche Antikörper oder Immunglobuline (Ig) sezernieren können. Diese können Antigen-spezifische Epitope erkennen und so gegen extrazelluläre Pathogene und lösliche Proteine, wie Toxine, schützen (LeBien & Tedder 2008). Eine weitere Zellpopulation der adaptiven Immunantwort sind die T-Zellen. Diese lassen sich in mehrere Subgruppen unterteilen und lösen nach Stimulation durch APCs unterschiedliche Immunantworten aus.

Das mukosale Immunsystem stellt eine große Besonderheit dar, da es mit einer Oberfläche von ca. 400 m² wie keine andere Körperoberfläche einer Vielzahl von Antigenen ausgesetzt ist. Dabei müssen pathogene Faktoren erkannt und eliminiert, apathogene Substanzen und körpereigene Antigene hingegen toleriert werden. Im Darm haben sich dafür unterschiedlichste Mechanismen entwickelt. Zum einen bildet die intestinale Epithelschicht den ersten Schutz gegen eingedrungene Pathogene, die sogenannte first line of defense. Intestinale Epithelzellen (IEC, engl. intestinal

epithelial cell) stehen durch Zell-Zellkontakte, tight junctions, in Verbindung und verhindern so auch sehr kleinen Molekülen den Durchtritt durch die Darmwand (Shen

& Turner 2006; Madara 1998). Die Becherzellen des Darmepithels produzieren Mucine und Kleeblatt-Faktoren (TFF, engl. trefoil factor), welche sich als schützende Schicht auf die IECs legen und so die Anheftung und das Eindringen von Pathogenen vermindern (Taupin & Podolsky 2003; Shirazi et al. 2000; Ohning 2013).

Außerdem produzieren IECs und Paneth-Zellen antimikrobielle Peptide, wie Defensine und bakteriolytische Enzyme, welche gegen invasive Erreger schützen (Müller et al. 2005). Auch die natürliche Darmflora trägt zum Schutz des Darms bei, da die kommensalen Mikroorganismen die Bindungsstellen für Pathogene besetzen und so ein Eindringen in den Darm erschweren (Duerkop et al. 2009).

Immunzellen des angeborenen und erworbenen Immunsystems befinden sich verteilt über den gesamten Darmtrakt in der Lamina propria mucosae oder in organisierten Strukturen, dem darmassoziierten lymphatischen Gewebe (GALT, engl. gut associated lymphoid tissue). Dies muss eine Immunreaktion gegen die Darmflora und Nahrungsbestandteile verhindern, zugleich aber gegen pathogene Mikroorganismen schützen. Zum GALT gehören die Peyer-Plaques, isolierte Lymphfollikel, Kryptopatches und die mesenterialen Lymphknoten (Newberry &

Lorenz 2005). Peyer-Plaques befinden sich im gesamten Dünndarm und bestehen aus mehreren B-Zell-Follikeln mit Keimzentren sowie aus kleineren T-Zell-Regionen.

Sie werden von einen follikelassoziiertem Epithel bedeckt, welches spezialisierte Epithelzellen, die sogenannten M-Zellen (Mikrofaltenzellen), enthält. Diese besitzen eine gefaltete Oberfläche und ermöglichen den Eintritt von Antigenen aus dem Lumen in die Peyer-Plaques. Dort werden die Antigene von APCs aufgenommen, welche in die T-Zell-Regionen der Peyer-Plaques oder in die mesenterialen Lymphknoten einwandern, um entsprechende Immunreaktionen auszulösen (Murphy et al. 2009). In den B-Zell-Follikeln findet zudem ein Klassenwechsel zu IgA statt, welches in das Darmlumen sekretiert wird und gegen luminale Antigene wirken kann (Brandtzaeg 2009). Isolierte Lymphfollikel sind kleine Zellaggregate, welche im gesamten Darmtrakt zu finden sind. Sie bestehen zu einem großen Teil aus B-Zellen, welche wiederum IgA produzieren können. Wie die Peyer-Plaques sind auch die

isolierten Lymphfollikel von M-Zellen bedeckt, welche den Durchtritt von Antigenen gewähren. Kryptopatches sind im Dünndarm und im Colon an der Basis der epithelialen Krypten lokalisiert. Sie bestehen unter anderem aus lineage-marker negativen (lin^-)c-kit⁺ Zellen und DCs. Ihre Aufgabe ist noch nicht vollständig geklärt, aber es wird vermutet, dass sie an der extrathymischen Differenzierung von T-Zellen beteiligt sind (Oida et al. 2000). Die mesenterialen Lymphknoten stellen die größten Lymphknoten des Körpers dar. Sie bestehen aus einem äußerem Cortex (Rinde), welcher B-Zellen enthält, und einer inneren Medulla (Mark), welche vor allem aus T-Zellen und DCs besteht. Antigenbeladene APCs aus dem umliegenden intestinalen Gewebe strömen über afferente Lymphgefäße zu den mesenterialen Lymphknoten, um dort spezifische Immunreaktionen auszulösen. Naive Lymphozyten treten aus dem Blut über spezielle postkapilläre Venolen in die Lymphknoten ein.

1.2 Rolle von dendritischen Zellen (DCs) im Immunsystem des Darms

DCs wurden erstmals im Jahre 1973 von Steinman beschrieben (Steinman & Cohn 1973). Sie stellen das Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität dar. Unreife DCs wandern durch die Peripherie und nehmen kontinuierlich Fremdmaterial auf. Dies geschieht zum einen durch Eintritt von Antigenen durch die oben beschriebenen M-Zellen, zum anderen sind intestinale DCs in der Lage Antigene direkt aus dem Darmlumen aufzunehmen. Dafür strecken sie ihre langen zytoplasmatischen Fortsätze, die Dendriten, durch die Epithelzellen des Darms.

Durch eigene Produktion von tight junction Proteinen können DCs die tight junctions des Epithels penetrieren ohne die Barriere zu schädigen (Rescigno et al. 2001). DCs identifizieren sogenannte Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP, engl.

pathogen-associated molecular pattern) auf Antigenen durch Mustererkennungs- Rezeptoren (PRR, engl. pattern-recognition receptor), wie Toll-like Rezeptoren (TLRs) (Medzhitov & Janeway 2000). Bestandteile von Bakterien, wie z. B.

Lipopolysaccharid (LPS), ein Zellwandmolekül gramnegativer Bakterien, oder auch virale Bestandteile, wie doppelsträngige DNA, binden an die transmembranären TLRs und lösen eine Signalkaskade aus, die zu einer spezifischen Immunantwort führt. DCs können PAMPs nicht nur über TLRs, sondern auch über intrazelluläre

Proteine erkennen. Diese Proteine bezeichnet man als NOD1 und NOD2 (Nukleotidbindungs-Oligomerisierungsdomäne). NOD1 bindet γ-Glutamyl- Diaminopimelinsäure, ein Abbauprodukt von Proteoglykanen gramnegativer Bakterien. NOD2 bindet Muramyldipeptid, das in den Proteoglykanen aller Bakterienarten vorkommt (Strober et al. 2006). Durch die Antigenaufnahme wird ein Reifungsprozess in den DCs ausgelöst. Es kommt zu einer gesteigerten Sekretion von Zytokinen und Chemokinen. Des Weiteren erhöht sich die Expression der MHC-Proteine und der kostimulatorischen Moleküle (Banchereau & Steinman 1998).

1.2.1 Aktivierung der adaptiven Immunantwort im Darm durch DCs

Die gereiften DCs wandern nun über die Lymphgefäße in die T-Zellregionen der mesenterialen Lymphknoten. Dort induzieren sie die Differenzierung und Proliferation von spezifischen T-Zellen (Banchereau & Steinman 1998). Aufgenommene Antigene werden im Zytoplasma der DCs in kleine Peptidfragmente gespalten. Diese Peptidfragmente werden über MHC-Moleküle präsentiert, welche von dem T-Zellrezeptor (TCR, engl. T-cell receptor) erkannt werden. Für die Zellaktivierung müssen außerdem die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 mit dem CD28 Rezeptor auf der Oberfläche von T-Zellen interagieren. Durch MHC-I-Moleküle werden CD8⁺ T-Zellen aktiviert, welche sich überwiegend zu zytotoxischen T-Zellen ausdifferenzieren (CTL, engl. cytotoxic T-lymphocyte) und z. B. virusbefallene Zellen direkt abtöten. MHC-II-Moleküle aktivieren CD4⁺ positive T-Zellen, welche sich in verschiedene Subgruppen aufteilen lassen (König et al. 1992; Murphy et al. 2009).

Abb. 1.1: Aktivierung der adaptiven Immunantwort durch DCs.

Intestinale DCs nehmen Antigene auf, migrieren in die mesenterialen Lymphknoten und aktivieren dort CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen. CD4⁺ T-Zellen differenzieren zu Effektor T-Helfer-Zellen (Th1, Th2 und Th17-Zellen) oder zu regulatorischen T-Zellen (Tregs). CD8⁺ T-Zellen differenzieren zu zytotoxischen T-Zellen (CTL) (modifiziert nach Westendorf et al. 2010).

Die Anwesenheit von entzündlichen Mediatoren wie LPS oder Interferon (IFN)-γ bewirkt die Ausdifferenzierung von naiven CD4⁺ T-Zellen zuTh1-Zellen, welche eine proinflammatorische Immunreaktion mit hoher Produktion von IFN-γ, Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interleukin (IL)-2 und IL-12 auslösen. Dies wiederum führt zu einer Aktivierung von Makrophagen und weiterer DCs, wohingegen die Differenzierung von CD4⁺ T-Zellen zu Th2, Th17 und Tregs gehemmt wird.

Th2-Zellen werden vornehmlich bei einer parasitären Infektion mit Helminthen und Ausschüttung von IL-4 gebildet. Sie stimulieren die Antikörperproduktion der B-Zellen und aktivieren zudem Mastzellen, eosinophile und basophile Granulozyten (Murphy et al. 2009; Bluestone et al. 2009; Coffman 2006). In Anwesenheit von inflammatorischen Zytokinen, wie IL-6 und TGF-β (engl. transforming growth factor),

erfolgt die Differenzierung zu Th17-Zellen (Ivanov et al. 2006). Th17-Zellen weisen eine proinflammatorische Funktion auf und schützen vor mikrobiellen Infektionen und verstärken die Reaktion neutrophiler Zellen (Murphy et al. 2009). Sie sezernieren unter anderem IL-6, IL-17, IL-22 und TNF-α.

DCs können Antigene auch B-Zellen präsentieren, welche verschiedene Immunglobuline sezernieren. Aktivierte B-Zellen stimulieren zudem Th2-Zellen und regen diese zur Zytokinproduktion an. Dies führt zur weiteren Aktivierung nahegelegener B-Zellen und somit vermehrter Antikörperproduktion (Murphy et al.

2009).

Die so aktivierten Effektorzellen verlassen die organisierten Strukturen des GALT oder die mesenterialen Lymphknoten schließlich über die efferenten Lymphgefäße und gelangen über den Ductus thoracicus und den Blutkreislauf wieder in mukosales Gewebe (Murphy et al. 2009). Die DCs der Peyer-Plaques und der mesenterialen Lymphknoten übernehmen hierbei eine entscheidende Aufgabe. Sie vermitteln die Expression der darmspezifischen Adhäsionsmoleküle α4β7-Integrin und CCR9 (CC Chemokin Rezeptor 9) auf Lymphozyten (Johansson-Lindbom et al. 2003). Das α4β7-Integrin bindet an das mukosale gefäßspezifische Adressin MAdCAM-1 (engl.

mucosal vascular addressin cell-adhesion molecule 1), welches vor allem auf intestinalen Endothelzellen vorkommt. CCR9 bindet den Liganden CCL25, welcher von Epithelzellen des Dünndarms exprimiert wird. Die aktivierten Lymphozyten gelangen somit direkt zurück in die Lamina propria und das Epithel des Darms, wo sie gemeinsam mit den Zellen des angeborenen Immunsystems ihre Effektorfunktion ausüben.

Abb. 1.2: Zusammenspiel der Immunzellen.

Durch Bindung von Pathogenen an Mustererkennungs-Rezeptoren (PRR, engl. pattern-recognition receptor) wie Toll-like Rezeptoren (TLR) werden DCs aktiviert. Diese vermitteln die Differenzierung von naiven T-Zellen in verschiedene Subtypen. Th1-Zellen produzieren unter anderem IFN-γ, welches Makrophagen aktivieren kann. Th2-Zellen unterstützen die Antikörperproduktion von B-Zellen und rekrutieren eosinophile Granulozyten. CD8⁺ T-Zellen wirken zytotoxisch und lösen Zelllyse aus.

Aktivierte Makrophagen sezernieren proinflammatorische Zytokine und Chemokine und rekrutieren neutrophile Granulozyten. Regulatorische T-Zellen kontrollieren die Funktion der Effektorzellen und dämmen die Reaktion ein (aus Mills 2004).

1.2.2 Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase

Die besondere Aufgabe im Gastrointestinaltrakt stellt die Unterscheidung zwischen körpereigenen und körperfremden Stoffen dar. Autoreaktive Lymphozyten, welche auf körpereigene Produkte reagieren, werden daher schon im Thymus bzw. im Knochenmark eliminiert. Diesen Vorgang bezeichnet man als zentrale Toleranz oder

negative Selektion. Da viele körpereigene Antigene sich aber der Präsentation im Thymus oder Knochenmark entziehen können, haben sich verschiedene Mechanismen der peripheren Toleranz entwickelt. Dabei werden Lymphozyten in einen anergen Zustand versetzt wodurch eine Immunreaktion ausbleibt. Dies geschieht z. B. durch das Fehlen entzündungsspezifischer Zytokine oder kostimulatorischer Moleküle bei der Antigenpräsentation (Murphy et al. 2009; Palmer 2003; Ohashi & DeFranco 2002). Im Darm muss zudem zwischen apathogenen Nahrungsbestandteilen, der kommensalen Mikroflora und pathogenen Erregern unterschieden werden. Es werden kontinuierlich Immunantworten ausgelöst, welche streng kontrolliert werden müssen. Diese Aufgabe übernehmen die regulatorischen T-Zellen (Tregs). Kennzeichnend für die Identifizierung als Treg ist die Expression des Transkriptionsfaktors Foxp3 (engl. forkhead box P3) (Hori et al. 2003). Tregs entwickeln sich zum einen im Thymus und werden daraufhin als natürliche Tregs (nTregs) bezeichnet. Im Darm kann zum anderen die Bildung von Tregs induziert werden (iTregs). Diese besondere Aufgabe übernehmen tolerogene DCs.

Tolerogene DCs werden durch IECs induziert. IECs produzieren unter anderem das Zytokin TSLP (engl. thymic stromal lymphopoietin), welches die Differenzierung von mukosalen DCs zu tolerogenen DCs fördert. Diese haben die Fähigkeit naive CD4⁺ T-Zellen zu Foxp3⁺ Tregs zu konvertieren (Sun et al. 2007; Annacker et al.

2005). Die Produktion von TGF-ß und IL-10 durch DCs spielt hierbei eine große Rolle (Coombes et al. 2007; Groux et al. 1999). Des Weiteren ist die Bildung von Retinsäure (RA, engl. retinoic acid) durch DCs erforderlich (Coombes et al. 2007;

Benson et al. 2007). Retinsäure ist ein Vitamin A Metabolit. Es entsteht durch den Abbau von Retinol (Vitamin A) durch Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) zu Retinal, welches durch Aldehyd-Dehydrogenasen (Aldh) weiter zu Retinsäure oxidiert wird (Duester 2000). Es sind mehrere Isoformen der Aldhs beschrieben. Für die DCs in mesenterialen Lymphknoten spielt Aldh1a2 dabei die größte Rolle (Iwata et al. 2004).

Die durch DCs induzierten Tregs haben große Bedeutung in der Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase. Es sind verschiedene Suppressionsmechanismen der Tregs beschrieben. Zum einen inhibieren sie die Proliferation der Effektorzellen durch Produktion von antiinflammatorischen Zytokinen, wie TGF-β, IL-10 und IL-35.

Zum anderen können sie die direkte Zytolyse der Zielzelle, ähnlich wie CTLs, durch Produktion von Granzymen einleiten. Zielzellen der Tregs sind hierbei vor allem aktivierte, proinflammatorische T-Zellen. Des Weiteren können sie durch verschiedene Mechanismen den Metabolismus der Zielzellen stören oder die Fähigkeit von DCs, naive T-Zellen zu aktivieren, hemmen (Workman et al. 2009).

Abb. 1.3: Suppressionsmechanismen von Tregs.

Durch Sekretion von inhibitorischen Zytokinen, wie TGF-β, IL-10 und IL-35, können Tregs Effektorzellen hemmen. Die Produktion von Granzymen führt zur Lyse der Zielzelle. Durch Bindung von IL-2 an den Rezeptor CD25 wird den Effektorzellen IL-2 entzogen, welches sie zur Proliferation benötigten. Anti-proliferativ wirkendes zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) kann in Zielzellen eingeschleust werden oder von Tregs produziertes Adenosin an den Adenosin-Rezeptor 2A auf Zielzellen binden, so dass die Bildung des proinflammatorischen Zytokins IL-6 unterbleibt. Die Fähigkeit von DCs T-Zellen zu aktivieren, kann durch Interaktion von LAG-3 mit MHC-II oder von CTLA-4 mit CD80/CD86 inhibiert werden (aus Workman et al. 2009).

Tregs wirken zudem protektiv im Rahmen einer Colitis. Sie können die Ausprägung einer Colitis verhindern oder eine bestehende Colitis lindern (Mottet et al. 2003;

Uhlig, Coombes, et al. 2006; Izcue et al. 2006). Es ist außerdem ein positiver Rückkopplungsmechanismus zwischen Tregs und tolerogenen DCs beschrieben (Min et al. 2003). Tregs können die Bildung von tolerogenen DCs stimulieren, welche wiederum weitere Tregs aktivieren.

Die durch DCs produzierte Retinsäure fördert nicht nur die Induktion von Tregs, sondern weist zudem noch weitere wichtige Effekte für die intestinale Immunität auf.

Zum einen wird die Expression der darmspezifischen Adhäsionsmoleküle α4β7-Integrin und CCR9 durch die Anwesenheit von Retinsäure erhöht (Iwata et al.

2004; Benson et al. 2007). Dies ermöglicht vor allem induzierten Tregs effizienter in den Darm zu gelangen. Des Weiteren hemmt Retinsäure die Differenzierung von naiven T-Zellen zu Th17-Zellen wodurch einer proinflammatorischen Antwort entgegen gewirkt wird (Mucida et al. 2007).

Abb. 1.4: Rolle der Retinsäure in der intestinalen Immunität.

Die Produktion von TSLP durch intestinale Epithelzellen erzeugt tolerogene DCs. Diese generieren mit Hilfe der Aldehyd Dehydrogenase Aldh1a2 Retinsäure (RA) aus Vitamin A. Retinsäure induziert die Expression der darmassoziierten Adhäsionsmoleküle α4β7-Integrin und CCR9 auf Lymphozyten.

Zusammen mit IL-5 und IL-6 unterstützt Retinsäure den Klassenwechsel zu IgA produzierenden B-Zellen im mesenterialen Lymphknoten. Die Differenzierung naiver T-Zellen zu Tregs wird durch Retinsäure gefördert, wohingegen die Aktivierung von Th17- und Th1-Zellen gehemmt wird (modifiziert nach Coombes & Powrie 2008).

1.3 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen

Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) handelt es sich um rezidivierende oder kontinuierlich auftretende inflammatorische Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts. CED treten weltweit mit einer erhöhten Häufigkeit in Nordamerika, Großbritannien und Skandinavien auf. Die Anzahl der Neuerkrankten (Inzidenz) liegt bei 4-10/100.000 Einwohnern pro Jahr. Die Anzahl der Erkrankten (Prävalenz) liegt bei 40-100/100.000 Einwohnern (Hendrickson et al. 2002). Meist manifestiert sich die Krankheit zwischen dem 15. und 30. Lebensjahr (Xavier &

Podolsky 2007). Die Hauptformen sind hierbei der Morbus Crohn (MC) und die Colitis ulcerosa (CU). MC stellt eine Entzündung dar, welche jeden Abschnitt des Gastrointestinaltrakts befallen kann. Am häufigsten sind die Ileocaecal-Region und das terminale Ileum allein betroffen. Histologisch sind granulomatöse Läsionen und transmurale leukozytäre Infiltrationen zu erkennen. Bei der CU beschränkt sich die Entzündung auf das Colon, wobei lediglich die Tunica mucosa betroffen ist. Es sind oberflächliche Ulzerationen und Kryptenabszesse auffindbar. Zudem kann es zu einem Verlust der Becherzellen kommen (Xavier & Podolsky 2007). Beides sind multifaktoriell bedingte Erkrankungen mit noch nicht vollständig geklärter Ätiologie.

Es wird davon ausgegangen, dass die Entstehung einer CED durch genetische Prädisposition begünstigt wird. Die am häufigsten beschriebene genetische Ursache für MC ist eine Mutation im NOD2/CARD15 Gen (engl. caspase recruitment domain family member 15) (Strober et al. 2007). Wie bereits oben erwähnt, erkennt NOD2 bakterielle Zellwandpolymere und aktiviert über NF-κB (engl. nuclear factor ‚kappa- light-chain-enhancer‘ of activated B-cells) weitere zahlreiche proinflammatorische Gene. Des Weiteren ist NOD2/CARD15 für die Sekretion antimikrobiell wirksamer α-Defensine verantwortlich (Kucharzik et al. 2006). Mutationen könnten somit zu einer gestörten Immunreaktion und einer verminderten Fähigkeit des Darmepithels, Bakterien zu eliminieren, führen (Strober et al. 2007). Für CU sind Mutationen sowohl im Gen für IFN-γ als auch im MDR1 Gen (engl. multidrug resistance gene) beschrieben (Abraham & Cho 2009; Annese et al. 2006). Des Weiteren wurden auch genetische Veränderungen von IL-12 und des IL-23 Rezeptors in Zusammenhang mit der Entstehung von CED gebracht (Duerr et al. 2006).

Einen weiteren Einfluss auf die Entstehung von CED nehmen Umweltfaktoren.

Stress, die Einnahme nichtsteroidaler Antiphlogistika, welche die Epithelbarriere schädigen, und Rauchen werden als Auslöser für CED diskutiert (Mawdsley &

Rampton 2005; Podolsky 2002). Rauchen wirkt sich dabei positiv auf CU aus, wobei es MC eher verschlimmert.

Auch die kommensale Mikroflora kann einen Einfluss auf die Entwicklung von Darmerkrankungen nehmen. Eine Dysregulation zwischen Mikroflora und der epithelialen Barriere kann zu einer intestinalen Entzündung führen. Es wurde gezeigt, dass Patienten mit MC und CU zum einen eine erhöhte Permeabilität des Darmepithels und zum anderen eine veränderte Zusammensetzung der intestinalen Mikroflora aufweisen (Welcker et al. 2004; Sartor 2008). Des Weiteren hat eine Therapie mit Antibiotika, wie Metronidazol, bei CED Patienten einen positiven Effekt, was für eine Beteiligung der Darmflora spricht. Einzelne Erreger, welche die Erkrankung auslösen, konnten bislang nicht identifiziert werden. Viele Studien beschäftigen sich mit dem Zusammenhang zwischen MC und dem Erreger Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP). MAP löst die Paratuberkulose, eine chronische Enteritis, in Wiederkäuern aus, welche auch Johne´sche Krankheit genannt wird. Die Paratuberkulose ist eine in Deutschland meldepflichtige Tierseuche, welche sich in unstillbaren, wässrigen Durchfällen und starker Abmagerung äußert und zum Tod führen kann (Baumgärtner 2012).

Histologisch ähnelt das Erscheinungsbild dem MC des Menschen. Es ist gekennzeichnet durch eine granulomatöse Enteritis, die vor allem im Ileum und Caecum auftritt. Auf Grund dessen wurde eine Beteiligung MAPs an MC diskutiert (Chiodini et al. 1984). MAP wird über kontaminierte Milch- und Fleischprodukte übertragen, da es als intrazellulärer Erreger auch starke Erhitzung übersteht (Lund et al. 2002). Tatsächlich wurde MAP in Patienten mit MC identifiziert (Olsen et al. 2009;

Naser et al. 2004). Allerdings wurde MAP auch zu einem geringeren Anteil in Patienten mit CU und in gesunden Patienten gefunden (Autschbach et al. 2005;

Davis & Madsen-Bouterse 2012). Es wird somit vermutet, dass MAP nicht als Auslöser des MC gilt, sondern dass eine persistierende MAP Infektion den Ausbruch der Krankheit in genetisch prädisponierten Menschen fördert (Sartor 2006).

Des Weiteren kann die Entstehung einer CED durch Defekte in der Immunfunktion begünstigt werden. Patienten mit MC weisen eine überschießende Th1-Immunreaktion mit erhöhter IFN-γ und IL-12 Produktion auf (Strober et al. 2002;

Sartor 2006). Zusätzlich wurde gezeigt, dass auch Th17-Zellen einen großen Einfluss auf das Fortschreiten der Erkrankung haben (Elson et al. 2007). Das von APCs produzierte Zytokin IL-23 stimuliert die Differenzierung von naiven T-Zellen zu Th17-Zellen. Es beinhaltet die gleiche Untereinheit p40 wie das von Th1-Zellen sezernierte IL-12. Die Behandlung mit einem IFN-γ Antikörper in Studien zeigte nur geringen Effekt, wohingegen ein p40 Antikörper, welcher sowohl IL-12 als auch IL-23 blockiert, einen deutlich positiven Effekt bei Patienten mit MC aufwies, was für eine Beteiligung der Th17-Zellen spricht (Mannon et al. 2004). Bei der CU hingegen wird davon ausgegangen, dass es sich um eine atypische, Th2 vermittelte Entzündung handelt. CU Patienten weisen eine erhöhte Produktion von IL-5 und IL-13 auf, nicht jedoch von IL-4. Es wird davon ausgegangen, dass natürliche Killer T-Zellen durch APCs, welche einen atypischen MHC-Rezeptor tragen, aktiviert werden. Dadurch kommt es zu einer gesteigerten Produktion von IL-13, welches das Epithel schädigt und die Entstehung von Ulzerationen fördert (Fuss et al. 2004). Insgesamt kann allerdings kein Faktor isoliert betrachtet werden. Meist handelt es sich um ein Zusammenspiel der Faktoren, welche in Kombination zu schwerwiegenden entzündlichen Veränderungen im Darm führen können.

Abb. 1.5: Auslösende Faktoren einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung.

Genetische Prädispositionen und fehlgeleitete Immunreaktionen sind an der Entstehung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (CED) beteiligt, ebenso wie die kommensale Darmflora und begünstigende Umweltfaktoren. Meist wirken alle Faktoren synergistisch (modifiziert nach Sartor 2006).

1.4 Murine Modelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen

Zur Untersuchung von CED werden viele verschiedene Tiermodelle heran gezogen (Hoffmann et al. 2002). Zum einen bildet sich in bestimmten Mausstämmen eine Spontancolitis. Dabei handelt es sich unter anderem um SAMP1/Yit Mäuse, welche sich ursprünglich von Seneszenz-Mäusen ableiten (Matsumoto et al. 1998). Des Weiteren entwickeln C3H/HeJBir Mäusen, welchen der TLR4 fehlt, eine spontane Colitis (Cong et al. 1998). Außerdem kann eine Colitis in verschiedenen transgenen Tieren induziert werden. So entwickeln z. B. IL-2 Knock-out oder IL-10 Knock-out Tiere unter speziellen Bedingungen eine entzündliche Darmerkrankung (Contractor et al. 1998; Kühn et al. 1993). Unter keimfreien Haltungsbedingungen bleibt eine Erkrankung aus, wohingegen sich unter SPF-Bedingungen (engl. special pathogen free) in IL-10 Knock-out Tieren eine milde Entzündung des proximalen Colons und in IL-2 Tieren eine komplette Colitis entwickelt. Unter konventionellen Haltungsbedingungen entwickeln IL-10 Knock-out Mäuse eine hochgradige chronische Enterocolitis (Kühn et al. 1993). Dies spiegelt zudem eine Bedeutung der mukosalen Mikroflora für die Entwicklung einer Darmerkrankung wider. In

immunsupprimierten SCID (engl. severe combined immunodeficiency) oder RAG- defizienten (engl. recombination activation gene) Mäusen kann durch Transfer von bestimmten T-Zellpopulationen eine Entzündung ausgelöst werden und die Funktion der T-Zellen untersucht werden. Der Transfer von CD45RB^high-T-Lymphozyten (undifferenzierte T-Lymphozyten) führt hierbei zu einer schweren Colitis, wohingegen der Transfer von CD45RB^low-T-Lymphozyten (reife T-Lymphozyten) einen protektiven Effekt aufweist (Hoffmann et al. 2002). Durch diese Modelle erfolgte der Nachweis, dass sich regulatorische T-Zellen positiv auf eine Colitis auswirken (Izcue et al.

2006). Ein weiteres Colitismodell ist das der chemisch induzierbaren Darmerkrankungen. Durch rektale Verabreichung von Oxazolon oder TNBS (engl.

trinitrobenzene sulfonic acid) kann eine Colitis ausgelöst werden (Morris et al. 1989;

Boirivant et al. 1998). Des Weiteren entsteht durch die orale Gabe von Dextrannatriumsulfat (DSS, engl. dextran sodium sulfate) eine schwere Colitis, welche durch starke leukozytäre Infiltrationen, fokale Kryptenzerstörung, lymphoide Hyperplasie und epitheliale Ulzeration gekennzeichnet ist (Okayasu et al. 1990;

Cooper et al. 1993). Die Wirkungsweise dieses Modells ist bislang noch nicht vollständig geklärt. Es wird allerdings meist davon ausgegangen, dass DSS direkt zytotoxisch auf die Epithelzellen der Colonschleimhaut wirkt und diese somit zerstört.

Daraufhin werden Phagozyten aktiviert, welche eine Immunreaktion mit erhöhter proinflammatorischer Zytokinproduktion auslösen (Okayasu et al. 1990). Weitere Studien zeigen jedoch, dass es sich bei der Immunantwort im DSS Modell um eine Mischform aus einer Th1- und Th2-Antwort handelt (Dieleman et al. 1998). Des Weiteren konnte zudem gezeigt werden, dass auch in SCID-Mäusen, welche keine funktionalen T- und B-Lymphozyten besitzen, eine DSS Colitis ausgelöst werden kann (Dieleman et al. 1994; Axelsson et al. 1996).

1.5 Beteiligung von DCs an der Entstehung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Wie bereits erwähnt, haben DCs großen Einfluss auf die Regulation der Immunantwort. Verschiedene Studien befassen sich mit ihrer Bedeutung bei CED.

Abe et al. zeigten, dass die Ablation von DCs in einem Colitismodell während der Erkrankung zu einer Verbesserung der Symptome führte. Wurden die DCs jedoch schon vor Ausbruch der Colitis entfernt, führte dies zu einer Verschlechterung. Die Behandlung der Mäuse mit einem TLR9-Liganden vor Induktion der Colitis, zeigte wiederum protektive Wirkung (Abe et al. 2007). DCs spielen hiernach eine zeitlich abhängige Rolle bei der Entstehung von entzündlichen Darmerkrankungen. Uhlig et al. beschrieben zudem eine T-Zell unabhängige Entwicklung einer Colitis durch direkte Aktivierung von DCs durch CD40 Stimulation (Uhlig, McKenzie, et al. 2006).

Des Weiteren besteht ein Zusammenhang zwischen den prädisponierenden Genen für CED und DCs. Das oben beschriebene NOD2 wird auch auf DCs exprimiert.

Mutationen können zu Dysfunktionen dieser Zellen und somit zu fehlgeleiteten Immunreaktionen oder schließlich auch zum Ausbruch von CED beitragen (Strober et al. 2007). In Patienten mit CED konnte eine erhöhte Expression von TLR2 und TLR4 auf intestinalen DCs festgestellt werden. Patienten mit MC zeigten zudem eine gesteigerte Expression des Aktivierungsmarkers CD40 auf DCs sowie eine vermehrte Produktion der proinflammatorischen Zytokine IL-12 und IL-6 durch DCs (Hart et al. 2005). Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass DCs im terminalen Ileum in der Lage sind die Untereinheit p40 der Zytokine IL-12 und IL-23 zu produzieren (Becker et al. 2003). IL-23, welches Th17-Zellen aktivieren kann, spielt eine bedeutende Rolle in der Pathogenese von CED (Yen et al. 2006; Hue et al. 2006a; Izcue et al. 2008). Bei Patienten mit MC konnte eine erhöhte Menge an durch DCs produziertem IL-23 sowie eine verringerte Produktion von IL-10 festgestellt werden (Sakuraba et al. 2009). Des Weiteren sind DCs auch als Quelle des proinflammatorischen Zytokins TNF-α beschrieben (de Baey et al. 2003).

Baumgart et al. hingegen beschrieben einen Mangel an unreifen DCs bei CED Patienten (Baumgart et al. 2005). Die Bedeutung von DCs im Rahmen von Darmentzündungen kann somit als sehr entscheidend angesehen werden.

1.6 Der Hypoxie induzierbare Faktor (HIF)

Überschreitet der Bedarf an Sauerstoff das Angebot, so entsteht ein Sauerstoffmangel, die sogenannte Hypoxie (Fandrey 2007). Geringe Sauerstoffkonzentrationen sind kennzeichnend für entzündetes Gewebe. Dies wird zum einen durch mangelhafte Durchblutung bei gleichzeitig erhöhtem Sauerstoffverbrauch durch rekrutierte Immunzellen bedingt (Karhausen et al. 2005;

Eltzschig & Carmeliet 2011). Im Falle des Darmes liegen noch weitere Ursachen vor.

Die Epithelzellen des Darms nehmen eine besondere Stellung ein. Sie trennen das fast anoxische Darmlumen von den reich durchbluteten Zellen der Lamina propria mucosae und sind somit großen Sauerstoffschwankungen ausgesetzt. Im gesunden Darm weisen die Epithelzellen daher schon eine „physiologische Hypoxie“ auf. Wird das Epithel nun durch eine Darmentzündung geschädigt, so tritt die Anoxie des Darmlumens tiefer in das Gewebe ein (Karhausen et al. 2004). Auch die Zellen der Lamina propria mucosae und der Tela submucosa sind nun hypoxischen Bedingungen ausgesetzt. Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF) nimmt für die Anpassung des Zellstoffwechsels an hypoxische Bedingungen eine zentrale Rolle ein (Semenza et al. 1997). HIF reguliert die Sauerstoffhomöostase und induziert die transkriptionelle Genexpression, welche unter anderem für die Angiogenese, Erythropoiese und anaerobe Glykolyse benötigt wird.

1.6.1 Aufbau und Funktion von HIF

HIF ist ein heterodimerer Proteinkomplex aus einer sauerstoffabhängig regulierten α- und einer konstitutiv exprimierten β-Untereinheit, welche auch als ARNT (engl. aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) bezeichnet wird (Wang et al. 1995). Bei Mensch und Maus sind bislang drei Isoformen der α-Untereinheit (HIF-1α, -2α, -3α) sowie drei Isoformen des HIF-β Proteins identifiziert. Die HIF-1α Untereinheit weist eine extrem kurze Halbwertszeit auf und wird unter normoxischen Bedingungen kontinuierlich abgebaut und neugebildet. Unter Hypoxie erfolgen die Stabilisierung des Proteins und die Translokation in den Nukleus. Dort folgt die Dimerisierung mit der β-Untereinheit. Beide Untereinheiten gehören zur Familie der basischen-Helix-

Loop-Helix (bHLH) und PER-ARNT-Sim (PAS) Transkriptionsfaktoren. Die bHLH Domänen am N-terminalen Ende ermöglichen die Bindung der Untereinheiten an die Hypoxie-responsiven Elemente (HRE) des jeweiligen Zielgens. Die nachfolgenden PAS Domänen vermitteln die Dimerisierung zwischen der α- und β-Untereinheit des HIF-Komplexes. Die Transaktivierungsdomäne (TAD), welche sich im Falle der HIF-1α Untereinheit in eine N-terminale (NAD) und C-terminale (CAD) Aktivierungsdomäne aufgliedert, dient der Aktivierung von Zielgenen. Die sauerstoffabhängigen Abbaudomänen (ODDD, engl. oxygen-dependent degradation domain) der α-Untereinheit bedingen die posttranslationale, sauerstoffabhängige Regulation der Aktivität des Transkriptionsfaktors (Wenger et al. 2005; Fandrey et al.

2006).

Abb. 1.6: Struktur des Hypoxie-induzierbaren Faktors HIF-1.

Die basischen Helix-Loop-Helix (bHLH) Domänen dienen der Bindung der Untereinheiten an DNA. Die PAS Domänen ermöglichen die Dimerisierung der Untereinheiten. Die N- und C-terminalen sauerstoffabhängigen Abbaudomänen (engl. oxygen-depending degradation domain, NODDD bzw.

CODDD) sowie die transaktivierenden Domänen (NAD bzw. CAD) der α-Untereinheit dienen der sauerstoffabhängigen Regulation und der Aktivierung von Zielgenen (modifiziert nach Schofield &

Ratcliffe 2004).

Hydroxylierung

1.6.2 Sauerstoffabhängige Regulation und Aktivierung von HIF-1

Unter normoxischen Bedingungen vermitteln spezielle Prolylhydroxylasen (PHDs) die Hydroxylierung von spezifischen Prolinresten innerhalb der ODDDs der α-Untereinheit. Diese werden von dem von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsuppressorproteinkomplex, welcher zur Familie der E3-Ubiquitin-Ligase Komplexe gehört, erkannt. Nach vermittelter Ubiquitinierung wird das HIF-1α Protein daraufhin dem proteasomalen Abbau zugeführt (Ivan et al. 2001). Des Weiteren hydroxyliert die Asparaginhydroxylase HIF-1-inhibierender Faktor (FIH-1, engl. factor inhibiting HIF-1) sauerstoffabhängig den Asparaginrest in der C-terminalen Transaktivierungsdomäne (CAD) der α-Untereinheit. Dies verhindert die Interaktion der CAD mit dem Koaktivator p300/Creb-bindenden Protein (CPB), wodurch die transkriptionelle Steuerung von Genen durch den HIF-Komplex inhibiert wird (Mahon et al. 2001).

Unter hypoxischen Bedingungen kommt es zu einer Hemmung der PHD und der FIH-1 Aktivität. Eine Veränderung des Eisenhaushaltes der Zelle sowie eine Inhibition mit NO kann zudem eine Hemmung der PHDs unter Normoxie induzieren (Zhou et al. 2003; Metzen et al. 2003). Die Hydroxylierung der HIF-1α Untereinheit unterbleibt, wodurch diese in den Kern translozieren und Koaktivatoren rekrutieren kann. Die Dimerisierung mit der β-Untereinheit führt schließlich zur transkriptionellen Aktivität.

Abb. 1.7: Sauerstoffabhängige Regulation der HIF-α Aktivität.

Unter normoxischen Bedingungen hydroxylieren die sauerstoffabhängigen Prolylhydroxylasen (PHDs) und der HIF-1-inhibierende Faktor (engl. factor inhibiting HIF, FIH-1) die Prolin- und Asparaginreste des HIF-α. Dadurch erfolgen die durch das von Hippel-Lindau Tummorsuppressorprotein vermittelte Ubiquitinierung und der proteasomale Abbau von HIF-α. Zudem wird die Interaktion der C-terminalen Transaktivierungsdomäne mit dem Koaktivator p300/CPB verhindert. Unter hypoxischen Bedingungen werden PHDs und FIH-1 gehemmt. HIF-α wird stabilisiert und transloziert in den Nukleus. Dort dimerisiert es mit der β-Untereinheit, rekrutiert Koaktivatoren, und bildet somit das transkriptionell aktive HIF Heterodimer (modifiziert nach Schofield & Ratcliffe 2004).

1.6.3 Sauerstoffunabhängige Regulation und Aktivierung von HIF-1

In verschiedenen Forschungen konnte gezeigt werden, dass eine HIF Aktivierung nicht nur durch Hypoxie ausgelöst werden kann, sondern auch durch inflammatorische Stimuli. So induziert LPS durch Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB die HIF-1α mRNA Expression (Frede et al. 2006).

Jantsch et al. konnten zeigen, dass dieser Effekt außerdem von TLR4 und dem Adaptorprotein MyD88 (engl. myeloid differentiation primary resonse gene 88) abhängig ist. DCs von MyD88 Knock-out Mäusen zeigten nach LPS Stimulation keine Induktion von HIF-1α (Jantsch et al. 2011). Weitere Studien beschrieben eine

HIF-1α mRNA Induktion durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und inflammatorische Zytokine, wie IL-1β und TNF-α (Acker et al. 2006; Westra et al.

2007). In humanen Hepatomzellen konnte ebenfalls eine HIF-1 Aktivierung durch entzündliche Prozesse gezeigt werden (Hellwig-Bürgel et al. 1999). Des Weiteren kann die HIF-1α Transkription auch durch IFN-α über den JAK-ISGF3 (Janus Kinase – IFN-γ-stimulierter Genfaktor-3) Signalweg in humanen Endothelzellen induziert werden (Gerber & Pober 2008).

Abb. 1.8: Sauerstoffunabhängige Regulation der HIF-1α Aktivität.

Unter normoxischen Bedingungen wird HIF-1α sauerstoffabhängig von den PHDs hydroxyliert, ubiquitiniert und proteasomal abgebaut. Unter hypoxischen Bedingungen oder durch NO Einwirkung wird die Aktivität der PHDs gehemmt, was zu einer HIF-1α Proteinstabilisierung führt.

Inflammatorische Zytokine und Lipopolysaccharide (LPS) führen über die Aktivierung von Signalkaskaden zu einer vermehrter Expression und Translation von HIF-1α mRNA und durch die zusätzliche Rekrutierung von Koaktivatoren zu einer gesteigerten Transkription von HIF-1 Zielgenen (modifiziert nach Frede et al. 2007).

1.6.4 Bedeutung von HIF-1 im Rahmen von Infektionen und Entzündungen Verschiedene Studien konnten verdeutlichen, dass der Transkriptionsfaktor HIF-1 eine wichtige Rolle im Entzündungsgeschehen spielt. So konnte gezeigt werden, dass Mäuse mit einem HIF-1α Knock-out in myeloischen Zellen eine deutliche Beeinträchtigung in ihrer Immunfunktion aufweisen. HIF-1α defiziente Makrophagen besitzen eine verminderte Fähigkeit zur Phagozytose und sind in ihrer Motilität und Zellaggregation beeinträchtigt (Cramer et al. 2003). Zudem induziert HIF-1α die Expression des β2-Integrins, ein Rezeptor, welcher für die Rekrutierung von Leukozyten eine wichtige Rolle spielt (Kong et al. 2004). Auch Peyssonnaux et al.

konnten zeigen, dass die bakterizide Aktivität und die Produktion von TNF-α in Makrophagen nach Infektion mit Streptokokken HIF-1α abhängig ist (Peyssonnaux et al. 2005). Des Weiteren besteht ein Zusammenhang zwischen HIF-1 und der Induktion von bestimmten TLRs. Kuhlicke et al. konnten eine hypoxische, HIF-1α abhängige Induktion von TLR2 und TLR9 in verschiedenen Zellen nachweisen (Kuhlicke et al. 2007).

Weitere Studien beschäftigten sich intensiv mit der Bedeutung von HIF-1 in intestinalen Epithelzellen im Rahmen entzündlicher Darmveränderungen. Ein Verlust von HIF-1α in Epithelzellen führte dabei zu einer deutlichen Verschlechterung der Symptome, wohingegen die Stabilisierung von epithelialem HIF-1 einen protektiven Effekt aufweist (Karhausen et al. 2004). Die Behandlung mit dem Hydroxylase Inhibitor Dimethyloxalylglycin (DMOG), welcher den Abbau von HIF-1α verhindert, führte zudem zu einer reduzierten Apoptoserate der Epithelzellen im DSS Colitismodell (Cummins et al. 2008). Des Weiteren resultierte eine gesteigerte HIF Expression durch die genetische Deletion der Prolylhydroxylase 1 (PHD1) in einer gemilderten Ausprägungsform der Colitis mit reduzierter epithelialer Apoptose und somit gesteigerter Barrierefunktion (Tambuwala et al. 2010).

Der Einfluss von HIF-1 auf die Funktion von DCs wurde in einigen Studien beschrieben. Jantsch et al. zeigten, dass Hypoxie die LPS vermittelte Aktivierung von DCs erhöht. Die Stimulation von murinen DCs mit LPS unter hypoxischen Bedingungen führte zu einer erhöhten Expression der Aktivierungsmarker CD80 und CD86, sowie des MHC-II-Oberflächenmoleküls. Ein Knock-down von HIF-1α

resultierte hingegen in einer verminderten Expression der Aktivierungsmarker und einer eingeschränkten Fähigkeit der DCs allogene T-Zellen zu stimulieren (Jantsch et al. 2008). Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu Befunden von Mancino et al., welche besagen, dass LPS stimulierte DCs unter Hypoxie eine geringere Expression der Aktivierungsmarker CD40, CD80, CD83 und CD86 aufweisen, wohingegen die Produktion von TNF-α und IL-1β erhöht ist (Mancino et al. 2008). Auch Bosseto et al.

stellten eine reduzierte Expression von CD80 und CD86 in DCs unter Hypoxie fest.

Die Produktion des proinflammatorischen Zytokins IL-12p70 durch DCs hingegen war unter Hypoxie erhöht. Eine zusätzliche Infektion der Zellen mit Leishmania führte wiederum zu einer erhöhten IL-12p70 Produktion unter Normoxie (Bosseto et al.

2010). Des Weiteren konnte ein direkter Zusammenhang zwischen HIF-1α in DCs und der Produktion von Typ I Interferonen nachgewiesen werden. Ein Knock-out von HIF-1α in DCs führte zu einer verringerten Produktion von Typ I Interferonen nach LPS Stimulus, wodurch die Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen beeinträchtigt wurde (Wobben et al. 2013).

1.7 Ziel der Dissertation

Dendritische Zellen sind wie alle Immunzellen im entzündeten Gewebe hypoxischen Bedingungen ausgesetzt und müssen sich diesen anpassen (Eltzschig & Carmeliet 2011). Hierfür wird der Transkriptionsfaktor HIF-1 benötigt, welcher die zelluläre Adaptation an Hypoxie reguliert. Verschiedene Studien haben die unterschiedlichsten Effekte von HIF-1 für die Funktion von Immunzellen und speziell von DCs beschrieben. Im Rahmen einer experimentellen Colitis wurde bislang allerdings nur die Bedeutung von HIF-1 in intestinalen Epithelzellen untersucht (Karhausen et al. 2004; Cummins et al. 2008). Hierbei wird HIF-1 eine protektive Rolle zugeschrieben.

Da DCs von zentraler Bedeutung im Immungeschehen des Darmes sind, sollte in dieser Arbeit nun der Effekt von dendritischem HIF-1 auf die Ausprägung einer experimentellen Colitis untersucht werden. Dazu wurde durch orale Gabe von DSS eine experimentelle Colitis in Kontrollmäusen (HIF-1α^+f/+f) und in Mäusen mit einem Knock-out von HIF-1α in DCs (CD11cCre/HIF-1α^+f/+f) induziert. Der Schweregrad der Entzündung, die Expression von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen sowie der Einfluss von DCs auf weitere Immunzellen wurde untersucht. Da die Antigen- präsentation von intestinalen DCs vornehmlich in mesenterialen Lymphknoten stattfindet, wurden diese zusätzlich zum Colon untersucht. Zur Unterstützung dieser in vivo Untersuchungen wurden zudem DCs aus dem Knochenmark der beschriebenen Tiere generiert, unter verschiedenen Bedingungen kultiviert und in ihrer Aktivierbarkeit verglichen.

2 Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien Tabelle 2.1: Geräte

Gerät Hersteller

Absaugpumpe Biotec

Auflichtmikroskop CK 40 Olympus

Brutschrank Hera cell Heraeus Instruments

CO2 Brutschrank Thermo

ELISA-Reader Spectra Count Packard

Spektrophotometer-System Epoch/Take 3 Biotec

Fluoreszenz- und Chemilumineszenzsystem Fusion-FX 7 Peqlab

Fluoreszenzmikroskop Eclipse E1000 Nikon

Gas Mixer Q Ruskinn

Gefrierschrank Liebherr

Heizblock HTM 130 / HTM 130-6 HLC

Hypoxie-Brutschrank BB6620 CUO2 Heraeus Instruments

iCycler iQ5, Multicolor Real-Time PCR Detection System Bio-Rad

Invivo2 400 Hypoxia Workstation Ruskinn

Kamerasystem DS Ri1 Nikon

Kühlschrank Liebherr

Mastercycler Eppendorf

Microm HM 340E Thermo Scientific

Mini Protean 3 Bio-Rad

Mini-Protean® Tetra Cell Bio-Rad

pH-Meter Eutech Instruments

Photometer SmartSpec 3000 Bio-Rad

ScanScope CS2 Aperio

Schüttler Titramax 101 Heidolph

Sterilbank HERA Safe Heraeus Instruments

Thermocycler Tpersonal / Tprofessional Biometra

UV-Geldokumentationsanlage BioDoc-It UVP

Vortexer Bioproducts

Western Blot-Kammer Mini Trans-Blot© Bio-Rad

Zählkammer nach Neubauer BD

Zentrifugen Eppendorf und Heraeus

Tabelle 2.2: Verbrauchsmaterialien

Bezeichnung Hersteller

8er Kette optisch klar flacher Deckel Sarstedt

Bechergläser Schott

Deckgläser Engelbrecht

Einmalspritzen (2 ml, 5 ml, 10 ml) B. Braun

Erlenmeyerkolben Schott

Gel-blotting-Papiere, GB003 Schleicher & Schuell

hema-screen^TM Immunostics.inc.

Kanülen (G27 ¾") BD

Microtome Blade S35 Feather

96 Multiply® PCR Platte natur Sarstedt

Nitrocellulose-Transfermembran, 0,2 µm Porengröße Schleicher & Schuell

Pinzetten Oehmen

Plastikpipetten (steril, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Greiner bio-one PP-Schraubverschluss Röhrchen (15 ml, 50 ml) Greiner bio-one

Reaktionsgefäß (1,5 ml, 2 ml) Eppendorf

Rotilabo®-Einbettkassetten Roth

Safe-Lock Tubes 0,5 ml Eppendorf

Scheren Oehmen

SuperFrost® Plus Objektträger R. Langenbrinck

Zellkulturflaschen (T25, T75, T175) Greiner bio-one

Zellkulturplatte steril (6 Vertiefungen) Greiner bio-one

2.1.2 Chemikalien Tabelle 2.3: Chemikalien

Bezeichnung Hersteller

4,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Sigma

Aceton Sigma

Acrylamid/Bisacrylamid (30 %) Bio-Rad

Agarose Invitrogen

Alcian Blue Solution Sigma

Ammoniumchlorid Sigma

Ammoniumpersulfat (APS) Bio-Rad

Bromphenolblau Sigma

Bovines Serum Albumin (BSA) SERVA

Cytoseal XYL Thermo Scientific

Fluorescence Mounting Medium Dako

Dextrannatriumsulfat MP Biomedicals

Diethylpyrocarbonat (DEPC) Sigma

ECL Advance™ Western Blotting Detection Kit GE Healthcare

Eosin Y Lösung Sigma

Essigsäure Fluka

Ethanol Roth

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck

Ethidiumbromid Sigma

Fetal calf serum (FCS) Biochrom AG

Glutamin Invitrogen

Glycerin Merck

Glycin Fluka

Guanidinthiocyanat (GTC) Roth

Isopropanol Sigma

Kaliumchlorid AppliChem

Kaliumdihydrogenphosphat Merck

Lipopolysaccharid (LPS) Sigma

Mayers Hämalaunlösung Merck

Mouse IL-6 ELISA MAX™ Deluxe BioLegend

Mouse IL-10 ELISA MAX™ Deluxe BioLegend

Mouse TSLP ELISA MAX™ Deluxe BioLegend

β-Mercaptoethanol Merck

Methanol Sigma

Natriumacetat Sigma

Natriumazid AppliChem

Natriumchlorid Fluka

Natriumdodecylsulfat (SDS) Roth

Natriumhydrogencarbonat Fluka

Natriumdihydrogenphosphat Fluka

Natriumpyruvat Gibco

Normal goat serum (NGS) Sigma

Normal rabbit serum (NRS) Invitrogen

Nukleosidtriphosphate Invitrogen

Paraffin McCormick

Paraformaldehyd (PFA) Sigma

Penicillin Gibco

Phenol AppliChem

Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol AppliChem

Pimonidazole HPI

Ponceau S Sigma

Protease-Inhibitor Roche Diagnostics

RPMI-Medium 1640 Gibco

Salzsäure Fluka

Streptomycin Gibco

Target Retrieval Solution Dako

Tris-aminomethan (Tris-Base) Fluka

Tris-HCl Roth

Trypanblau Merck

Trypsin-EDTA Gibco

Tween 20 Roth

Vector Mouse on Mouse (M.O.M.^TM) Kit Vector Labs

Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck

Xylol Roth

2.1.3 Puffer und Lösungen

BmDC-Medium: RPMI 1640

10 % FCS 4 mM Glutamin 1mM Natriumpyruvat 100 U/ml Penicillin 100 µg/ml Streptomycin 0,06 mM β-Mercaptoethanol

Blotpuffer (Western Blot): 25 mM Tris-Base 96 mM Glycin 20 % Methanol

DEPC-H2O: 500 ml H2O 0,5 ml DEPC

1 h bei RT rühren, autoklavieren Laufpuffer (Western Blot): 25 mM Tris-Base

192 mM Glycin 3,5 mM SDS Lower Buffer 1,5 M Tris-Base (Western Blot): 13,9 mM SDS

pH 8,8

Lysepuffer (Gesamtlysat): 150 mM NaCl 10 mM Tris-Base 1 mM EDTA 0,5 % NP 40

1 % Protease-Inhibitor

PBS: 137 mM NaCl

2,7 mM KCl 10 mM Na2HPO4

2 mM KH2PO4

pH 7,2

PBS-T: 1 x PBS

0,05 % Tween 20

4 x SDS (Western Blot): 0,4 ml Aqua dest.

1,6 ml 0,5 M Tris pH 6,8 3,2 ml 10 % SDS

0,8 ml β-Mercaptoethanol 0,4 ml 0,5 % Bromphenolblau 10 % Glycerin

TAE (PCR): 40 mM Tris-Base 0,11 % Essigsäure 1 mM EDTA pH 8,0

TBS: 137 mM NaCl

20 mM Tris-HCl pH 7,6

TBS-T: 1 x TBS

0,1 % Tween 20 Upper Buffer 252 mM Tris-Base (Western Blot): 6,9 mM SDS

pH 6,8

2.1.4 Antikörper

Tabelle 2.4: Antikörper für Western Blot

Antikörper Typisierung Hersteller

β-Aktin Kaninchen Abcam

HIF-1α Kaninchen Cayman chemical

HRP-konjugiert anti-Kaninchen Ziege Sigma

Tabelle 2.5: Antikörper für die Immunfluoreszenz

Primärantikörper Typisierung Hersteller

Foxp3 Ratte eBioscience

Muc-2 Kaninchen Santa Cruz

Pimonidazole (HP-1) Maus HPI

Sekundärantikörper Antigen Hersteller

anti-Kaninchen Alexa 568 Ziege IgG Invitrogen

anti-Maus Alexa 568 Ziege IgG Invitrogen

anti-Ratte Alexa 568 Ziege IgG Invitrogen

2.1.5 Zytokine muGM-CSF

Das murine GM-CSF wurde aus dem Überstand der Zelllinie NIH 3T3-GM-CSF gewonnen. Die Zellen wurden unserem Institut von Herrn Prof. Dr. Dittmer (Universität Duisburg-Essen, Essen) zur Verfügung gestellt.

muIL-4

Das murine Interleukin-4 wurde aus dem Überstand der Zelllinie NIH 3T3-IL-4 gewonnen. Die Zellen wurden unserem Institut von Herrn Prof. Dr. Dittmer (Universität Duisburg-Essen, Essen) zur Verfügung gestellt.

2.1.6 Oligonukleotide Tabelle 2.6: Murine Primer

Zielgen Sequenz Produktlänge

(bp)

qPCR

Bedingungen 5’ α4-Integrin

3’ α4-Integrin

TAC AAT GGC CGA GTC GAT GG ATG CAC CAA CGG CTA CAT CA

151 60°C, 40 Zyk.

5‘ Aldh1a2 3‘ Aldh1a2

ATC GCT TCT CAC ATC GGC AT CAG CGT AGT CCA AGT CAG CA

166 60°C, 40 Zyk.

5’ β7-Integrin 3’ β7-Integrin

TGA GAC CCC AAG AGA AGG GAG GAT TTC CAC AGA GAG CCG GT

116 60°C, 40 Zyk.

5’ CCR 9 3’ CCR 9

ACT CAC AAG CCT TAT TCC TGG C CCA AGG TGC CCA CAA TGA AC

179 60°C, 40 Zyk.

5’ CD 4 3’ CD 4

TGA AGG AAA CGC TCC CAC TC AGC AGT GCT GAT GTC TTG CT

136 60°C, 40 Zyk.

5’ CD 8a 3’ CD 8a

ACC CTT GGC CGG AAT CTG CG CTG TCT GAC TAG CGG CCT GGG A

112 60°C, 40 Zyk.

5‘ F4/80 3‘ F4/80

TCT GGG GAG CTT ACG ATG GA GAA TCC CGC AAT GAT GGC AC

237 60°C, 40 Zyk.

5‘ Foxp 3 3‘ Foxp 3

CTG GCG AAG GGC TCG GTA GTC CT CTC CCA GAG CCC ATG GCA GAA GT

250 60°C, 40 Zyk.

5’ HIF-1α 3’ HIF-1α

GAA ATG GCC CAG TGA GAA AA CTT CCA CGT TGC TGA CTT GA

119 60°C, 40 Zyk.

5’ HIF-1α Exon 2 3’ HIF-1α Exon 2

CAT CCA GAA GTT TTC TCA CAC G GGC GAA GCA AAG AGT CTG AA

138 60°C, 40 Zyk.

IFN-α 4 QuantiTect Primer Assay, Qiagen 53°C, 42 Zyk.

IFN-α 12 QuantiTect Primer Assay, Qiagen 53°C, 42 Zyk.

5’ IL-1β 3’ IL-1β

CCT CTC CAG CCA AGC TTC CT TTT GGA AGC AGC CCT TCA TC

151 60°C, 40 Zyk.

5’ IL-6 3’ IL-6

TCC TAC CCC AAT TTC CAA TGC CAT AAC GCA CTA GGT TTG CCG

151 60°C, 40 Zyk.

5’ IL-10 3’ IL-10

TGC CCC AGG CAG AGA AGC AT GGG AGA AAT CGA TGA CAG CGC C

109 60°C, 40 Zyk.

5’ IL-23 p19 3’ IL-23 p19

ACC AGC GGG ACA TAT GAA TCT AGA CCT TGG CGG ATC CTT TG

147 65°C, 45 Zyk.

5’ Lipocalin 2 3’ Lipocalin 2

ACG GAC TAC AAC CAG TTC GC CAT TGG TCG GTG GGG ACA GA

188 60°C, 40 Zyk.

5’ MUC 1 3’ MUC 1

TCA CCC CAG TTG TCT GTT GG GCC TGA CCT GAA CTT GAT GC

192 57°C, 40 Zyk.

5’ MUC 2 3’ MUC 2

GCT GAC GAG TGG TTG GTG AAT G GAT GAG GTG GCA GAC AGG AGA C

135 63°C, 40 Zyk.

5’ MUC 3 3’ MUC 3

AGT GCT GTT GGT GAT CCT CG AGA GTC CAG GGG CAT GTA GT

193 57°C, 40 Zyk.

5’ OX 40 3’ OX 40

GCC CTG CAT TTG CTG TTC TC AGC TGT TTC CCC AAC AAG GT

132 60°C, 40 Zyk.

5’ RARα 3’ RARα

CAG AGC AGC AGT TCC GAA GA CCG GGT CAC CTT GTT GAT GA

222 60°C, 40 Zyk.

5’ rib. Protein 3’ rib. Protein

AGA TGA TCG AGC CGC GC

GCT ACC AGG GCC TTT GAG ATG GA

163 60°C, 40 Zyk.

5’ SAA 3’ SAA

GAA AGA AGC TGG TCA AGG GTC TCC GGG CAG CAT CAT AGT TC

119 60°C, 40 Zyk.

5’ TFF 3 3’ TFF 3

CCT GGT TGC TGG GTC CTC TG GCC ACG GTT GTT ACA CTG CTC

133 60°C, 40 Zyk.

5’ TGF-β 3’ TGF-β

AAC CCC AAA GCC AGA GTG G CGT CTG TCA CGT CGA AGG AG

151 62°C, 40 Zyk.

5’ TSLPR 3’ TSLPR

TTT CCG GGG CAG CAT CC CGC ATC TTT CAC CCT GCG AA

188 62°C, 40 Zyk.