2.2 Methoden
2.2.3 Molekularbiologische Methoden
Die Isolation der RNA aus den BmDCs erfolgte mithilfe der Phenol-Chloroform-Extraktionsmethode nach Chomczynski & Sacchi (1987). Dazu wurde das Medium der BmDCs zu Versuchsende komplett aus den 6-Well-Zellkulturplatten entfernt, 700 µl 4 M GTC in jede Vertiefung gegeben und die Platten über Nacht bei -20 °C eingefroren. Nach dem Auftauen wurde der Inhalt in ein 2 ml Eppendorfreaktionsgefäß überführt und 70 µl 2 M Natriumacetat hinzugegeben.
Anschließend wurden die Proben mit 500 µl Phenol und 350 µl Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol versetzt. Die Proben wurden geschüttelt, gevortext, 60 min auf Eis inkubiert und daraufhin für 30 min bei 4 °C und 13200 rpm zentrifugiert. Durch dieses Vorgehen erhält man eine Trennung der Probe in drei
Phasen: die oberste, wässrige Phase enthält die RNA, die Interphase die DNA und die untere, organische Phase die Proteine. Die obere Phase wurde in ein neues 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß überführt, 600 µl Isopropanol zugegeben und die Probe über Nacht bei -20 °C eingefroren. Am nächsten Tag wurden die Proben direkt für 30 min bei 4 °C und 13200 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die RNA-Pellets bei Raumtemperatur 30 – 60 min getrocknet und 300 µl GTC und 500 µl Isopropanol zugegeben. Nach erneuter Inkubation bei -20 °C über Nacht wurden die Proben wieder für 30 min bei 4 °C und 13200 rpm zentrifugiert und das Pellet nach Verwerfen des Überstandes mit 500 µl 75%igem Ethanol gewaschen. Daraufhin wurden die Proben ein letztes Mal bei 4 °C und 13200 rpm für 30 min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, die Pellets getrocknet und anschließend je nach Größe in 10 – 20 µl DEPC-H2O gelöst und für 10 min bei 60 °C erhitzt. Der RNA Gehalt wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Die Reinheit der Proben wurde über das Verhältnis der gemessenen Absorption bei 260 und 280 nm bestimmt. Es wurden nur Proben verwendet bei denen ein Quotient zwischen 1,7 und 2,0 vorlag. Die RNA wurde anschließend bei -20 °C eingefroren.
Die Isolation der RNA aus Gewebeproben erfolgte mithilfe des Qiagen RNeasy Mini Kits. Die RNA wird hierbei an eine Silicagel-Membran gebunden, Kontaminationen entfernt und nachfolgend die gewaschene RNA von der Membran eluiert. Dazu wurden die Proben mit je 600 µl RLT-Puffer, zu welchem 1 % frisches β-Mercaptoethanol gegeben wurde, homogenisiert und über Nacht bei -20 °C eingefroren. Am nächsten Tag wurden 600 µl 70%iges Ethanol zu den Proben gegeben und durch Auf- und Abpipettieren gemischt. 700 µl je Probe wurden auf ein RNeasy-Röhrchen gegeben und für 15 s bei 12000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Nun wurde der Rest der Proben auf die Röhrchen gegeben und ebenso zentrifugiert. Der Durchfluss wurde wieder verworfen. Anschließend wurden je 700 µl RW1 Puffer aus dem RNeasy Mini Kit auf die Röhrchen pipettiert und für 15 s bei 12000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Als nächstes wurden 500 µl RPE Puffer auf die Röhrchen gegeben und unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert.
Der Durchfluss wurde wieder verworfen. Weitere 500 µl RPE Puffer wurden auf je ein Röhrchen gegeben. Die Proben wurden nun für 2 min bei 12000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. Abschließend wurden je 30 µl RNase freies Wasser zum Eluieren der Membran auf die Röhrchen gegeben und für 1 min bei 13200 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. Der Durchfluss wurde noch einmal auf die Membran pipettiert und unter gleichen Umständen zentrifugiert. Der Gehalt der isolierten RNA wurde wie oben beschrieben photometrisch bestimmt und die RNA anschließend bei -20 °C gelagert.
2.2.3.2 Reverse Transkription
Für die cDNA-Synthese der BmDCs wurde 1 µg RNA mit 2,5 µl Oligo-dT Primern und DEPC-H2O auf insgesamt 12 µl gebracht. Für die Gewebeproben wurden 3 µg RNA eingesetzt und diese mit 5 µl Oligo-dT Primern und DEPC-H2O auf 24 µl aufgefüllt.
Die Proben wurden 10 min bei 68 °C erhitzt und anschließend 5 min auf Eis gekühlt.
Zu den Proben der BmDCs wurde daraufhin 13 µl Mastermix, zu den Gewebeproben 26 µl Mastermix gegeben. Die Umschreibung der RNA erfolgte im Thermocycler bei 45 °C für 90 min und 52 °C für 30 min. Die Denaturierung erfolgte bei 95 °C für 15 min. Die cDNA wurde anschließend bei 4 °C gelagert.
Tabelle 2.12: Mastermix für die cDNA Synthese
Volumen (µl)
M-MLV Buffer (5x) 5
dNTP 5
DEPC-H2O 2,5
M-MLV Reverse Transkriptase 0,5
2.2.3.3 PCR und quantitative Real Time PCR
cDNA kann mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, engl. polymerase chain reaction) amplifiziert werden. Der Mastermix für die PCR wird wie in Tabelle 2.13 hergestellt, in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt und 0,5 µl cDNA hinzugegeben.
Tabelle 2.14 zeigt ein exemplarisches PCR-Programm, bei welchem die Annealing-Temperatur und die Zyklenzahl abhängig von den verwendeten Primern angepasst wurden. Die amplifizierte Menge cDNA wurde nun zusammen mit einem Größenstandard auf ein 2%iges Agarosegel mit 0,07 % Ethidiumbromid aufgetragen, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und durch UV-Licht in einer Geldokumentationskammer dargestellt.
Tabelle 2.13: Mastermix für PCR
Volumen (µl)
PCR-Puffer (5x) 5
dNTP 2
je Primer (20 pmol/µl) 0,5
H2O 17
Taq-Polymerase 0,05
Tabelle 2.14: Exemplarisches PCR-Programm
Die Annealing-Temperatur und die Zyklenzahl wurden der zu amplifizierenden DNA entsprechend angepasst.
Temperatur (°C) Dauer (min) Zyklen
Initiale Denaturierung 96 3 1
Denaturierung 96 1
Annealing 60 1,5 x 30
Elongation 72 1
Finale Elongation 72 10 1
Die Quantifizierung der cDNA erfolgte mittels Echtzeit-PCR (Real Time PCR). Hierzu wurden Reaktionsansätze von 50 µl je Probe erstellt und diese, sowie ein Leerwert, als Doppelbestimmung (2 x 20 µl) in 96-Well-Platten pipettiert. Die PCR-Reaktion mit gleichzeitiger Fluoreszenz-Messung wurde als Zweistufen-PCR mithilfe des iCycler Detektionssystems von Bio-Rad durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mittels der ΔΔCT Methode (engl. Cycle Threshold). Dabei werden die ermittelten CT-Werte der einzelnen Proben auf die CT-Werte des homogen exprimierten Gens ribosomales Protein normalisiert und die Unterschiede der Genexpression der zu vergleichenden Proben als n-fache Änderung berechnet (Winer et al. 1999).
Tabelle 2.15: Mastermix für Real Time PCR
Volumen (µl)
MESA Green qPCR MastermixPlus 25
H2O 22
je Primer (20 pmol/µl) 1
cDNA 1
Tabelle 2.16: Exemplarisches Real Time PCR-Programm
Die Annealing-Temperatur und die Zyklenzahl wurden der zu amplifizierenden DNA entsprechend angepasst.
Temperatur (°C) Dauer (min) Zyklen
Initiale Denaturierung 95 10 1
Denaturierung 95 0,25
Annealing/
Elongation
60 1,5 x 40
2.2.3.4 PCR Array
Mit Hilfe eines PCR Arrays ist die Quantifizierung sehr vieler mRNAs in einer Probe gleichzeitig möglich. Im verwendeten Array wurde die Expression von mRNAs untersucht, welche im Zusammenhang mit Morbus Crohn stehen (RT2 Profiler PCR Array Mouse Crohn´s Disease, PAMM-169ZA, Qiagen). Es handelte sich um eine 96-Well-Platte auf welcher insgesamt 84 mRNAs untersucht werden konnten.
Zusätzlich waren fünf Referenzgene, eine Kontrolle auf genomische DNA, drei reverse Transkriptase Kontrollen und drei positive PCR Kontrollen auf der Platte vorhanden.
Tabelle 2.17: Zusammenstellung der im Array untersuchten Gene
Abkürzung Beschreibung des Genes
Abcb1a ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1A Adh1 Alcohol dehydrogenase 1 (class I)
Aldob Aldolase B, fructose-bisphosphate Atg16l1 Autophagy-related 16-like 1 (yeast) C3 Complement component 3
Casp1 Caspase 1
Ccl11 Chemokine (C-C motif) ligand 11 Ccl12 Chemokine (C-C motif) ligand 12 Ccl20 Chemokine (C-C motif) ligand 20 Ccl25 Chemokine (C-C motif) ligand 25 Ccl5 Chemokine (C-C motif) ligand 5 Ccr1 Chemokine (C-C motif) receptor 1 Ccr2 Chemokine (C-C motif) receptor 2 Ccr5 Chemokine (C-C motif) receptor 5 Ccr9 Chemokine (C-C motif) receptor 9 Cd55 CD55 antigen
Chi3l1 Chitinase 3-like 1
Cldn8 Claudin 8
Col1a2 Collagen, type I, alpha 2 Cr2 Complement receptor 2 Csta Cystatin A
Cx3cl1 Chemokine (C-X3-C motif) ligand 1 Cx3cr1 Chemokine (C-X3-C) receptor 1 Cxcl1 Chemokine (C-X-C motif) ligand 1 Cxcl10 Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 Cxcl11 Chemokine (C-X-C motif) ligand 11 Cxcl12 Chemokine (C-X-C motif) ligand 12 Cxcl2 Chemokine (C-X-C motif) ligand 2 Cxcl3 Chemokine (C-X-C motif) ligand 3 Cxcl9 Chemokine (C-X-C motif) ligand 9 Cxcr1 Chemokine (C-X-C motif) receptor 1 Cxcr3 Chemokine (C-X-C motif) receptor 3 Edn3 Endothelin 3
Egr3 Early growth response 3 Fpr1 Formyl peptide receptor 1
Gcg Glucagon
H2-Aa Histocompatibility 2, class II antigen A, alpha H2-Eb1 Histocompatibility 2, class II antigen E beta Hsp90b1 Heat shock protein 90, beta (Grp94), member 1 Hspa5 Heat shock protein 5
Ifng Interferon gamma Il13 Interleukin 13 Il17a Interleukin 17A Il1b Interleukin 1 beta
Il1rn Interleukin 1 receptor antagonist Il23a Interleukin 23, alpha subunit p19
Il2ra Interleukin 2 receptor, alpha chain Il5 Interleukin 5
Il6 Interleukin 6
Irf5 Interferon regulatory factor 5 Isg15 ISG15 ubiquitin-like modifier Itgb2 Integrin beta 2
Lcn2 Lipocalin 2 Ltb Lymphotoxin B Lyz1 Lysozyme 1
Mmp10 Matrix metallopeptidase 10 Mmp12 Matrix metallopeptidase 12
Mmp1a Matrix metallopeptidase 1a (interstitial collagenase) Mmp3 Matrix metallopeptidase 3
Mmp7 Matrix metallopeptidase 7 Muc1 Mucin 1, transmembrane
Nod2 Nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 Nos2 Nitric oxide synthase 2, inducible
Nr3c2 Nuclear receptor subfamily 3, group C, member 2 Pck1 Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic Pecam1 Platelet/endothelial cell adhesion molecule 1 Reg1 Regenerating islet-derived 1
Reg2 Regenerating islet-derived 2
S100a8 S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A) S100a9 S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B) Saa3 Serum amyloid A 3
Sele Selectin, endothelial cell Selenbp1 Selenium binding protein 1 Sell Selectin, lymphocyte
Sod2 Superoxide dismutase 2, mitochondrial
Stat1 Signal transducer and activator of transcription 1 Stat3 Signal transducer and activator of transcription 3 Tdo2 Tryptophan 2,3-dioxygenase
Tff1 Trefoil factor 1
Timp1 Tissue inhibitor of metalloproteinase 1 Tnf Tumor necrosis factor
Tyk2 Tyrosine kinase 2 Ubd Ubiquitin D
Vwf Von Willebrand factor homolog Actb Actin, beta
B2m Beta-2 microglobulin
Gapdh Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Gusb Glucuronidase, beta
Hsp90ab1 Heat shock protein 90 alpha (cytosolic), class B member 1 MGDC Mouse Genomic DNA Contamination
RTC Reverse Transcription Control RTC Reverse Transcription Control RTC Reverse Transcription Control PPC Positive PCR Control
PPC Positive PCR Control PPC Positive PCR Control
Für den PCR-Array wurden Colonproben von DSS behandelten Wild-typ und Knock-out Tieren benutzt. Dazu wurde die RNA aus Colongewebe mit Hilfe des Qiagen RNeasy Mini Kits, wie in Abschnitt 2.2.3.1 beschrieben, isoliert. Nach photometrischer Bestimmung des RNA Gehaltes wurden 500 ng RNA für die Umschreibung in cDNA mittels des RT2 First Strand Kits eingesetzt. Dazu wurde zunächst ein Mix aus RNA, RNase freiem Wasser und dem Puffer GE des Kits erstellt. Dieser Puffer sollte genomische DNA eliminieren. Dieser Mix wurde 5 min bei
42 °C inkubiert und direkt danach für 1 min auf Eis gelagert. Als nächstes wurde der in Tabelle 2.18 beschriebene Reverse Transkriptase Mix erstellt. 10 µl des ersten Mix wurden nun zu 10 µl des Reverse Transkriptase Mix gegeben und vermischt. Dieser Ansatz wurde 15 min bei 42 °C und danach 5 min bei 95 °C inkubiert. Anschließend wurden 91 µl RNase freies Wasser dazu gegeben.
Tabelle 2.18: Reverse Transkriptase Mix für PCR Array
Volumen (µl)
5x Puffer BC3 4
Kontrolle P2 1
RE3 Reverse Transkriptase Mix 2
RNase freies Wasser 3
Von der erstellten cDNA wurden nun 102 µl für den PCR Ansatz genutzt. Es wurden 1350 µl 2x RT2 SYBR Green Mastermix und 1248 µl RNase freies Wasser hinzugeben. 25 µl dieses Ansatzes wurden jeweils in eine Vertiefung der 96-Well-Platte des PCR Arrays gegeben. Das PCR Programm wurde im iCycler von BioRad durchgeführt.
Tabelle 2.19: Real Time PCR Programm für PCR Array
Temperatur (°C) Dauer (min) Zyklen
Initiale Denaturierung 95 10 1
Denaturierung 95 0,25
Annealing/
Elongation
60 1 x 40
Die Auswertung erfolgte nach der ΔΔCT Methode mittels einer kostenfrei zur Verfügung gestellten auf Excel basierenden Analyse Software von SABiociences™.
Gene mit einem CT-Wert von ≥ 35 für die Expression der Amplifikate wurden in der Analyse ausgeschlossen. Für die Auswertung wurden Gene ausgewählt, die einen deutlichen Unterschied in der Expression zwischen Wild-typ und Knock-out Tieren zeigten.
2.2.3.5 Proteinisolierung
Zu Versuchsende wurden die ausdifferenzierten BmDCs in 6-Well-Zellkulturplatten auf Eis gestellt und das Medium abgesaugt. In jede Vertiefung wurden 65 µl Lysepuffer pipettiert und die Zellen mit Zellschabern vom Boden der Platten abgeschabt. Die Zellsuspension wurde in Eppendorfreaktionsgefäße überführt und 20 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Suspension für 5 min und 10000 rpm bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Reaktionsgefäße gegeben.
Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurden 5 µl des Proteinlysates verwendet.
2.2.3.6 Proteinbestimmung nach Lowry
Der Proteingehalt der Proben wurde nach der Methode von Lowry bestimmt (Lowry et al. 1951). Dafür wurden je 5 µl eines BSA-Standards (25-0,1 mg/ml BSA) und 5 µl der Proben in eine 96-Well-Zellkulturplatte pipettiert, mit 10 µl Reagenz A und 80 µl Reagenz B versetzt und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Extinktion bei 700 nm im ELISA-Reader gemessen und die Proteinkonzentration anhand der Standardreihe berechnet. Alle Messungen wurden als Doppelbestimmungen durchgeführt.
2.2.3.7 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) Durch die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach der Methode von Laemmli (1970) erfolgte die Auftrennung der Proteine unter denaturierenden Bedingungen. Es wurden dabei 5%ige Sammelgele und 7,5%ige Trenngele verwendet. Von den
Lysaten wurden 40 – 60 µg Probe im Verhältnis 1:4 mit 4xSDS-Probenpuffer versetzt und für 5 min bei 95 °C denaturiert. Anschließend wurden sie auf das Gel aufgetragen und bei 120 V für 90 min aufgetrennt.
Tabelle 2.20: Zusammensetzung der Trenn- und Sammelgele
Sammelgel (5 %) Trenngel (7,5 %)
A. dest. 2,92 ml 5 ml
Bisacrylamid 30 % 0,83 ml 2,5 ml
4x upper buffer pH 6,8 1,25 ml -
4x lower buffer pH 8,8 - 2,5 ml
2.2.3.8 Western Blot
Der Proteintransfer aus Polyacrylmaid-Gelen auf Nitrocellulosemembranen erfolgte elektrophoretisch nach der Methode von Towbin (Towbin et al. 1979) bei 110 V für 90 min. Anschließend wurden die Membranen kurz in Ponceau S Lösung getaucht, um die Effizienz des Transfers zu überprüfen und danach mit TBS-T gewaschen. Die Blockierung der unspezifischen Bindungen erfolgte mit 5 % Magermilch in TBS-T für eine Stunde. Die Membranen wurden nun über Nacht mit den primären Antikörpern bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Membranen dreimal für 5 min mit TBS-T gewaschen und danach für mindestens eine Stunde mit dem sekundären Antikörper inkubiert. Die Detektion von Antigenen erfolgte indirekt über die Reaktion der an den Zweitantikörper gekoppelten Meerrettichperoxidase durch das ECL-Detektionssystem. Dafür wurden die Membranen dreimal für 5 min mit TBS-T gewaschen und danach für 5 min mit 600 µl des ECL-Reagenzes inkubiert. Das Chemilumineszenz-Signal wurde im Fusion FX7-Detektionssystem aufgenommen.
2.2.3.9 Kompetitiver Enzymgekoppelter Immunabsorptionsassay (ELISA)
Der ELISA wurde mit dem jeweiligen Mouse ELISA MAX™ Deluxe Kit von BioLegend und Proben von Gesamtcolon durchgeführt. Dazu wurde das Colon in
400 µl PBS homogenisiert, 1 min bei 13200 rpm zentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorfreaktionsgefäß gegeben. Davon wurden 5 µl für die Proteinbestimmung verwendet (s. Abschnitt 2.2.3.6). Es wurden jeweils 200 µg der Proben eingesetzt und mit Assay Diluent A auf 100 µl aufgefüllt. Zur Durchführung des ELISA wurde die beigefügte 96-Well-Platte zunächst mit 100 µl Capture Antibody Lösung über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde viermal mit 300 µl PBS-T gewaschen. Anschließend wurde die Platte mit 200 µl Assay Diluent A für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 4 Waschschritten mit 300 µl PBS-T wurden je 100 µl der Standardreihe (500, 250, 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,8 pg/ml), ein Leerwert und die Proben als Doppelbestimmung aufgetragen. Die Inkubation erfolgte für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wurde viermal mit 300 µl PBS-T gewaschen und die Platte mit 100 µl Detection Antibody für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 4 weiteren Waschschritten erfolgte die Inkubation mit 100 µl Avidin-HRP für 30 min bei Raumtemperatur. Danach wurde fünfmal für je 1 min gewaschen und die Platte daraufhin mit 100 µl TMB Lösung im Dunklen inkubiert. Nach 20 min wurden 100 µl Stopp Lösung hinzugegeben und die Absorption photometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm und 570 nm gemessen.
Der Leerwert und die Werte der Messung bei 570 nm wurden von den Werten der Messung bei 450 nm abgezogen und die Konzentration der Proben anhand der Standardreihe berechnet.