Tierexperimentelle Methoden

Alle Mäuse wurden im Zentralen Tierlaboratorium des Universitätsklinikums Essen unter speziell pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten. Bis zu fünf Tiere lebten zusammen in Makrolon©-Filterkäfigen Typ III bei einer Umgebungstemperatur von 20 °C und einem konstanten 12 h-Tag-Nacht-Rhythmus. Die Tiere erhielten pelletiertes Alleinfuttermittel und Trinkwasser ad libitum.

Die Genehmigung des Tierversuchs wurde vom Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen unter dem Aktenzeichen 84-02.04.2011.A098 erteilt.

2.2.1.2 Transgene Mausstämme

Für die vorliegenden Studien wurden transgene Mausstämme mit einem C57BL/6J Hintergrund verwendet. Es handelte sich bei den verwendeten Tieren um Mäuse mit einem konditionellen Knock-out von HIF-1α in CD11c⁺ dendritischen Zellen. Die genetische Inaktivierung erfolgte mithilfe des Cre/loxP-Systems. In Zielmäusen ist hierbei das Exon 2 des HIF-1α Gens auf beiden Allelen von loxP-sites flankiert (HIF-1α^f+/f+). Um einen konditionellen Knock-out von HIF-1α zu generieren, wurden diese homozygot-gefloxten Mäuse mit Mäusen gepaart, bei denen die Sequenz für die Cre-Rekombinase der Kontrolle des murinen Integrin α X (CD11c) Promoters unterliegt. Die Expression der Cre-Rekombinase führt zu einem Verlust des Exons 2 des HIF-1α Gens. Die daraus resultierende mRNA führt zur Bildung eines verkürzten, nicht funktionellen HIF-1α Proteins. Die so generierten Knock-out Mäuse (CD11cCre/HIF-1α^f+/f+) exprimierten das Cre heterozygot in den CD11c⁺, also vornehmlich dendritischen Zellen. Geschwistertiere ohne Cre-Rekombinase Aktivität (HIF-1α^f+/f+) dienten als sogenannte Wild-typ Kontrollen.

Die HIF-1α^f+/f+ Mäuse wurden ursprünglich von Prof. Dr. Randall Johnson (University of California, San Diego) und die CD11cCre Mäuse von Prof. Dr. Boris Reizis (Columbia University Medical Centre, New York) generiert.

Alle verwendeten Mäuse zeigten unter physiologischen Umständen einen ungestörten Habitus und züchten normal.

Abb. 2.1: Schematische Darstellung des Cre/loxP-Knockout-Systems.

Durch die Kreuzung von Mäusen mit einem doppelt gefloxten Exon 2 auf dem HIF-1α Gen mit Mäusen, die eine Expression von Cre unter der Kontrolle des Integrin α X Promoters aufweisen, entstehen Mäuse mit einem um das Exon 2 verkürzten HIF-1α Gen und funktionslosem Protein in CD11c⁺ Zellen.

2.2.1.3 Genotypisierung

Die Mäuse wurden im Alter von etwa vier Wochen abgesetzt und durch das Ausstanzen eines oder mehrerer Ohrlöcher markiert. Das Ohrgewebe wurde mit 300 µl 50 mM NaOH versetzt und mindestens für eine Stunde bei 100 °C unter leichten Schüttelbewegungen erhitzt. Anschließend wurden 30 µl 1 M Tris-HCl zu den Proben gegeben, gevortext und die Gewebereste abzentrifugiert. Es wurden 2,5 µl freigesetzte genomische DNA und 22,5 µl des Mastermixes für die Genotypisierungs-PCR eingesetzt.

loxP – Maus (HIF-1α^+f/+f) HIF-1α Gen

Ex.1 Ex.2 Ex.3Ex.4

Cre-loxP – Maus (CD11cCre/HIF-1α^+f/+f)

Ex.1 Ex.3Ex.4

CD11cCre - Maus Integrin α X Gen

Promoter

x

Tabelle 2.9: Mastermix für die Genotypisierung

Volumen (µl)

PCR-Puffer (5x) 5

dNTP 2

je Primer (20 pmol/µl) 0,5

H2O 14,5

Taq-Polymerase 0,05

Tabelle 2.10: Exemplarisches PCR-Programm für die Genotypisierung

Die Annealing-Temperatur und die Zyklenzahl wurden der zu amplifizierenden DNA entsprechend angepasst.

Temperatur (°C) Dauer (min) Zyklen

Initiale Denaturierung 96 3 1

Denaturierung 96 1

Annealing 60 1 x 30

Elongation 72 3

Finale Elongation 72 10 1

2.2.1.4 DSS Modell

Zur Induktion einer Colitis wurde Dextrannatriumsulfat (DSS, engl. dextran sodium sulfate) in einer 3%igen Konzentration verwendet (Okayasu et al. 1990; Vowinkel et al. 2004). Es handelt sich bei DSS um ein sulfatiertes Polysaccharid, welches die Tiere peroral für 7 Tage via Trinkwasser ad libitum erhielten und aufgrund dessen an einer Colitis erkrankten. Durch die Gabe von 3 % DSS über 7 Tage wird laut Vowinkel et al. bei Mäusen des C57BL/6J Stammes die erforderliche Schwellendosis von 30 mg DSS pro Gramm Körpergewicht vollständig erreicht, um zuverlässig eine Colitis zu induzieren (Vowinkel et al. 2004). Geringe Trinkmengenunterschiede im Verlauf des Versuches sind somit vernachlässigbar. Die Tiere waren zu Beginn des

Versuches mindestens zehn Wochen alt. Wild-typ Tiere (HIF-1α^f+/f+) und Knock-out Tiere (CD11cCre/HIF-1α^f+/f+) wurden getrennt voneinander jeweils zu zweit zwei Tage vor Gabe des DSS in einem Käfig zusammengesetzt. Es wurde ausschließlich DSS der Firma MP Biomedicals aus ein und derselben Charge verwendet, damit Schwankungen des Schwefelgehaltes ausgeschlossen werden konnten. Des Weiteren betrug das Molekulargewicht des DSS hierdurch konstant 36000 – 50000 Dalton, was sehr entscheidend ist, da dieses großen Einfluss auf die Ausprägung der Colitis hat (Kitajima et al. 2000). Das DSS wurde in unbehandeltem Leitungswasser gelöst und an Tag 3 des Versuches erneuert. Das Körpergewicht der Tiere wurde täglich kontrolliert und die prozentuale Veränderung des Gewichtes errechnet. Die klinische Einstufung der Erkrankung erfolgte mithilfe eines Disease Activity Index (DAI) (Cooper et al. 1993; Williams et al. 2001; Cummins et al. 2008). Der DAI setzt sich aus den jeweiligen Punktzahlen für den prozentualen Verlust an Körpergewicht, die Beschaffenheit des Stuhles und das Ergebnis eines Tests auf okkultes Blut im Stuhl zusammen. Es handelt sich hierbei um einen Haemoccult-Test, bei welchem durch Kontakt des Stuhles mit einer Indikatorlösung okkultes Blut durch einen Farbumschlag detektiert werden kann. Die Einzelpunktzahlen wurden addiert, woraus ein maximaler Score von 12 resultierte. Die genaue Zusammensetzung des DAI ist in Tabelle 2.11 dargestellt. Der DAI wurde täglich für jedes einzelne Tier bestimmt.

Tabelle 2.11: Disease Activity Index

Score Beschreibung

Gewichtsverlust 0 0 %

1 1-5 %

2 6-10 %

3 11-20 %

4 > 20 % Stuhlbeschaffenheit 0 geformt

2 breiig

4 flüssig

Blut im Stuhl 0 Hema-Screen negativ 2 Hema-Screen positiv 4 sichtbare Blutung

2.2.1.5 Pimonidazol-Injektion

Zur immunhistochemischen Darstellung von hypoxischem Gewebe wurde den Mäusen eine Stunde vor Versuchsende 60 mg Pimonidazol pro kg, gelöst in 100 µl 0,9 % NaCl, intraperitoneal injiziert. Pimonidazol (Hydroxyprobe™-1) stellt ein substituiertes 2-Nitroimidazol dar, welches unter normoxischen Bedingungen leicht oxidativ metabolisiert und als N-Oxid, Sulfat und Gluconat eliminiert wird. Unter hypoxischen Bedingungen (pO2 < 10 mm Hg) wird es reduktiv aktiviert und bildet kovalente Bindungen mit Sulfhydrylgruppen umgebender Protein, Peptide und Aminosäuren (Arteel et al. 1998; Gross et al. 1995). Die entstanden Produkte können in Gewebeschnitten anschließend durch spezifische Antikörper detektiert werden, so dass das hypoxische Gewebe sichtbar gemacht wird (Samoszuk et al. 2004).

2.2.1.6 Organentnahme

Zur Organentnahme wurden die Tiere an Tag 7 des DSS Versuches durch Genickbruch getötet und in Rückenlage fixiert. Sowohl die Haut als auch das Peritoneum wurde durch Längsschnitt durchtrennt. Als erstes wurden die mesenterialen Lymphknoten entfernt und für die RNA-Isolation bis zur weiteren Verwendung erst in flüssigem Stickstoff und dann in einem -80 °C Gefrierschrank gelagert. Das Colon wurde in seiner gesamten Länge freipräpariert, am Übergang zum Caecum und Rektum durchtrennt und entnommen. Anschließend wurde es vorsichtig mit PBS gespült, gewogen und die Länge gemessen. 0,5 cm des distalen Colonendes wurden für die RNA-Isolation verwendet und bis zur Homogenisierung des Gewebes zunächst in flüssigem Stickstoff und dann in einem -80 °C Gefrierschrank gelagert. Die nächsten 1 cm des distalen Colons wurden für histologische Arbeiten in 4 % PFA fixiert. Von einigen Tieren wurde auch das restliche Colon für die Erstellung sogenannter Swiss Rolls in 4 % PFA fixiert (s.

Abschnitt 2.2.4.1). Für die Durchführung des ELISA wurde von den dafür verwendeten Tieren die komplette distale Hälfte des Colons zunächst in flüssigem Stickstoff und anschließend bis zur weiteren Verarbeitung in einem -80 °C Gefrierschrank gelagert. Für die Gewinnung des Knochenmarks wurden die Hinterbeine der Tiere präpariert. Dazu wurde die Haut entlang des Hinterbeins eröffnet und von der darunter liegenden Muskulatur abgelöst. Die Knochen wurden vollständig von Muskeln und Sehnen befreit und nach dem Durchtrennen des Fußgelenkes und des Beckens entnommen. Ober- und Unterschenkelknochen wurden daraufhin in einer 6-Well-Zellkulturplatte mit PBS auf Eis gelegt.