In Kontrollmäusen (HIF-1α+f/+f) und Knock-out Mäusen ohne funktionelles HIF-1α in DCs (CD11cCre/ HIF-1α+f/+f) wurde durch siebentägige Gabe von 3 % DSS eine Colitis induziert. Die Knock-out Mäuse zeigten im Vergleich zu den Kontrollmäusen einen signifikant größeren Gewichtsverlust an Tag 6 und 7 des Experiments (s. Fig.
3.2 A), wohingegen sich im Disease Activity Index (DAI) (s. Abb. 3.13), in der Colonlänge und –gewicht (s. Abb. 3.14), sowie in der Histologie (s. Abb. 3.16) keine Unterschiede zwischen den Gruppen feststellen ließen. Karhausen et al., welche
einen protektiven Effekt von epithelialem HIF-1α darstellten, konnten in ihren Untersuchungen einen Unterschied in der Colonlänge zwischen den untersuchten Gruppen feststellen. Hierbei handelte es sich jedoch um ein TNBS Colitismodell, bei welchem TNBS rektal appliziert wurde (Karhausen et al. 2004). Dies könnte eventuell zu deutlicheren Auswirkungen auf die Colonlänge geführt haben. Auch in weiteren Studien, die sich mit der Rolle von epithelialem HIF während einer Colitis beschäftigten, konnten Unterschiede zwischen den betreffenden Gruppen sowohl im DAI, in der Colonlänge und –gewicht als auch in der Histologie festgestellt werden.
Allerdings wurden in diesen Studien sowohl andere DSS Konzentrationen für geringere Zeiträume als auch Mäuse mit einem unterschiedlichen genetischen Hintergrund benutzt (Cummins et al. 2008; Tambuwala et al. 2010). Die Gabe von 3 % DSS über 7 Tage ist für Mäuse mit C57BL/6J Hintergrund ein zuverlässiges Modell der Colitis Induktion (Vowinkel et al. 2004). Wie man in der Histologie erkennen kann, lag in den DSS behandelten Tieren eine äußerst hochgradige Entzündung vor. Dies könnte dazu geführt haben, dass mögliche Unterschiede von dem Schweregrad der Colitis überdeckt worden sind.
Auf mRNA Ebene ließ sich jedoch ein deutlicher Unterschied zwischen DSS behandelten HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren feststellen. Die Expression der proinflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-23 zeigte eine deutliche Erhöhung in den Knock-out Tieren (s. Fig. 3.2 B-C). Diese Zytokine haben dabei eine große Bedeutung in murinen Colitismodellen und in der Pathogenese von CED. IL-6 wird durch viele verschiedene Immunzellen produziert, unter anderem durch DCs, Makrophagen und Th17-Zellen. In CED Patienten konnten erhöhte Werte von IL-6 in der intestinalen Mukosa und im Serum sowie eine erhöhte dendritische IL-6 Produktion festgestellt werden (Gross et al. 1992; Hart et al. 2005; Eastaff-Leung et al. 2010). Des Weiteren konnte durch Gabe eines anti-IL-6-Antikörpers die Ausprägung einer Colitis in SCID Mäusen unterdrückt werden. Die Behandlung führte zudem zu verringerten Expressionen von IFN-γ, TNF-α und IL-1β. Dies lässt darauf schließen, dass auch für die Entwicklung einer proinflammatorischen Th1-Immunantwort die Wirkung von IL-6 benötigt wird (Yamamoto et al. 2000). Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Neutralisation des membrangebundenen
IL-6 Rezeptors (IL-6R) den Ausbruch einer Colitis in verschiedenen Modellen verhinderte (Atreya et al. 2000). IL-6 kann zudem an den löslichen IL-6 Rezeptor binden (sIL-6R, engl. soluble IL-6R), was zur Entstehung des IL-6/sIL-6R-Komplex führt. Dieser kann über Bindung an das ubiquitär vorkommende Glykoprotein gp130 proinflammatorische Immunantworten auslösen. Dieser Vorgang wird als IL-6-trans-signaling bezeichnet. Unter anderem wird dadurch die Apoptose mukosaler T-Zellen inhibiert und die Aufrechterhaltung einer chronischen Darmerkrankung ermöglicht. Die Neutralisation des sIL-6R in Patienten mit MC führte zu einer deutlichen Unterdrückung der Aktivität im Rahmen einer Colitis und zu einer gesteigerten Apoptose von T-Zellen (Atreya et al. 2000). IL-6-trans-signaling führte außerdem zu einer erhöhten Expression des TGF-β Inhibitors SMAD7. Durch Überexpression von SMAD7 in transgenen Mäusen waren diese nicht mehr in der Lage Foxp3+ Tregs zu induzieren und eine Colitis durch die Aktivierung von Tregs zu unterdrücken (Dominitzki et al. 2007). Fujimoto et al. bewiesen, dass die Überproduktion von IL-6 die Induktion von Tregs hemmte (Fujimoto et al. 2011). Die deutlich erhöhte IL-6 Produktion in den DSS behandelten Knock-out Tieren (s. Fig.
3.2 B) lässt somit auf eine verstärkt proinflammatorische Immunantwort schließen, welche zudem direkt in der Lage sein könnte, regulatorische Antworten zu unterdrücken.
Viele Studien beschäftigten sich des Weiteren mit der Bedeutung des proinflammatorischen Zytokins IL-23 in entzündlichen Darmerkrankungen. IL-23 besteht aus den Untereinheiten IL-23p19 und IL-12p40, welches die gemeinsame Untereinheit mit IL-12 darstellt (Oppmann et al. 2000). IL-23 sowie IL-12 werden von APCs, vornehmlich DCs, gebildet. IL-12 fördert dabei in Anwesenheit von IFN-γ die Differenzierung naiver T-Zellen zu Th1-Zellen, wohingegen IL-23 in Verbindung mit TGF-β und IL-6 die Differenzierung zu Th17-Zellen einleitet (Kikly et al. 2006). Es konnte gezeigt werden, dass IL-23 in die Pathogenese von Autoimmunerkrankungen, wie der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) und der Kollagen-induzierten Arthritis (CIA, engl. collagen-induced arthritis), involviert ist. Die Produktion von IL-23 steht zudem in engem Zusammenhang mit der Entwicklung entzündlicher Darmerkrankungen. In CED Patienten konnten sowohl erhöhte IL-23
Konzentrationen in intestinalen Geweben als auch eine erhöhte IL-23 Produktion durch mukosale DCs festgestellt werden (Stallmach et al. 2004; Schmidt et al. 2005;
Sakuraba et al. 2009). In RAG-/- Mäusen, welche auf Grund einer Defizienz reifer B- und T-Lymphozyten nach T-Zell Transfer eine Colitis entwickeln, führte die Deletion von IL-23p19 oder IL-12p40 zur Unterdrückung der Colitis. Mäuse mit einer zusätzlichen Deletion von IL-12p35 hingegen entwickelten eine deutliche Colitis (Hue et al. 2006b). Die Deletionen von IL-23p19 und IL-12p40 führten zu einer Inhibierung der IL-23 Produktion, wohingegen durch die Deletion von IL-12p35 die IL-12 Produktion gehemmt wurde. Es wird daher vermutet, dass IL-23 als entscheidendes Zytokin für eine intestinale Erkrankung gilt. Studien von Elson et al.
bestätigten diese Vermutung, indem sie zeigten, dass die Neutralisation von IL-23p19 durch einen monoklonalen Antikörper den Ausbruch einer Colitis verhindern sowie eine bestehende Colitis abschwächen konnte (Elson et al. 2007). Yen et al.
zeigten des Weiteren, dass die Gabe von IL-23 Protein zu einem deutlich früheren Ausbruch der Colitis in RAG-/- Mäusen sowie zu einer erhöhten Produktion von IL-6 und IL-17 führte. Zudem konnte eine erhöhte Rekrutierung von Makrophagen und Granulozyten festgestellt werden (Yen et al. 2006). Izcue et al. konnten eine weitere Wirkung von IL-23 darstellen. Sie zeigten, dass IL-23 die Funktion regulatorischer T-Zellen im Darm behindern und dass die Aufhebung immunsupprimierender und regulatorischer Antworten die Entstehung intestinaler Entzündungen begünstigen kann (Izcue et al. 2008). Diese Daten stehen im Einklang mit den erhobenen Ergebnissen dieser Arbeit. Die DSS behandelten Knock-out Tiere zeigten eine stärkere Entzündung mit einer erhöhten IL-23 Produktion (s. Fig. 3.2 C), einer erhöhten Anzahl an Makrophagen (s. Fig. 3.2 E) und einer eingeschränkten regulatorischen T-Zellantwort (s. Fig. 3.6 C-E). Es kann vermutet werden, dass die HIF-1α Defizienz in DCs vornehmlich zu einer eingeschränkten Induktion regulatorischer T-Zellen führte. Dies resultierte in einer verstärkten Entzündung mit erhöhter Produktion proinflammatorischer Zytokine, welche wiederum die Funktion der Tregs unterdrücken konnten.
Auf der anderen Seite muss jedoch erwähnt werden, dass die durch IL-23 ausgelöste Th17-Antwort auch positiven Einfluss auf eine Darmentzündung nehmen kann.
Sugimoto et al. zeigten, dass das von Th17-Zellen produzierte Zytokin IL-22 zur Verbesserung einer intestinalen Entzündung führte (Sugimoto et al. 2008). IL-22 aktiviert die Mucinproduktion der IECs und fördert die Restitution geschädigter Mucin produzierender Becherzellen. Durch Gabe eines IL-22 bindenden Antikörpers wurde die Wiederherstellung der Becherzellen in der Erholungsphase eines DSS Colitismodells gehemmt. In den behandelten Knock-out Mäusen dieser Arbeit konnte eine deutlich erhöhte Mucinproduktion festgestellt werden (s. Fig. 3.7 A-D). Es ist also möglich, dass der Knock-out von HIF-1α in DCs über ausgelöste proinflammatorische Th17-Antworten Effekte auf das intestinale Epithel aufwies, welche kompensatorische Schutzmechanismen und die Restitution des geschädigten Epithels einleiteten.
Ein weiterer Parameter für die verstärkte Erkrankung der Knock-out Tiere war die erhöhte Expression von Lipocalin 2 (Lcn2) (s. Fig. 3.2 D). Lcn2 ist ein Mitglied der Lipocalin Protein Familie und wird unter anderem von neutrophilen Granulozyten und IECs exprimiert (Cowland & Borregaard 1997; Raffatellu et al. 2009). Es stellt einen wichtigen Regulator der Immunantwort dar (Berger et al. 2006). Chassing et al.
maßen den fäkalen Lcn2 Gehalt in einem DSS Colitismodell mittels ELISA und konnten einen kontinuierlichen Anstieg während der Entwicklung der Erkrankung nachweisen (Chassaing et al. 2012). Dies stellt eine relativ kostengünstige und vor allem nicht-invasive Methode dar, um den Verlauf der Colitis zu dokumentieren und könnte in nächsten Versuchen verwendet werden.
Es zeigte sich des Weiteren eine signifikant erhöhte IL-1β Expression in den DSS behandelten Knock-out Tieren (s. Fig. 3.9 A). Makrophagen stellen die Hauptproduzenten von IL-1β dar, welches unter anderem Lymphozyten aktiviert und die Freisetzung von Akute-Phase-Proteinen (APPs) induziert (Murphy et al. 2009).
Serum Amyloid A (SAA) stellt ein wichtiges APP dar, welches zudem mit dem Schweregrad einer Colitis in Mensch und Maus korreliert (Chambers et al. 1987; de Villiers et al. 2000). Auch für SAA wiesen die Knock-out Mäuse höhere Werte durch die DSS Colitis auf (s. Fig. 3.9 B). Verschiedene Studien zeigten zudem, dass CED Patienten deutlich erhöhte IL-1β Werte aufwiesen (Stallmach et al. 2004; Eastaff-Leung et al. 2010). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass IL-1β Einfluss auf das
intestinale Epithel hat. Zum einen kann es bei einer Shigellen Infektion die tight junctions der Epithelzellen so stark lockern, dass weitere Mikroorganismen aus dem Darmlumen in das Gewebe eindringen können und die Infektion sich ausbreitet (Sansonetti 2004). Zum anderen kann es IECs zur vermehrten Produktion von IL-6 anregen (McGee et al. 1993). Eine erhöhte IL-6 Expression konnte auch in den DSS behandelten Knock-out Mäusen festgestellt werden (s. Fig. 3.2 B). Es erscheint also möglich, dass die einzelnen Zytokine sich untereinander beeinflussen und zur vermehrten Produktion anregen. Da DCs eine entscheidende Bedeutung im Zusammenspiel der intestinalen Immunität aufweisen, führte der Verlust von dendritischem HIF-1α somit zu weitgreifenden Veränderungen im Zytokinexpressionsmuster der lokalen Immunzellen. Dies wiederum könnte das Ausbilden immunregulatorischer Tregs unterdrückt haben, was sich in einer verschlechterten Kontrolle der Darminfektion äußerte.