Die Bedeutung des Hypoxie-induzierbaren Faktors – 1 im Muskeltrauma
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Elke Nigge, geb. Daßler
aus Meiningen
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. med. vet. Gerhard Breves, Physiologisches Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und
Prof. Dr. med. Joachim Fandrey, Institut für Physiologie der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen
1. Gutachter/in: Prof. Dr. med. vet. Gerhard Breves 2. Gutachter/in: Prof. Dr. rer. nat. Bernd Otto
Tag der mündlichen Prüfung: 14.11.2007
Gefördert durch die Deutsche Forschungsgesellschaft im Rahmen des SPP 1151
Für Walter
in Liebe
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis V
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Muskeltrauma und –regeneration 3
2.1.1 Tiermodelle des Muskeltraumas 3
2.1.2 Satellitenzellen als regenerativer Pool 4
2.1.3 Ablauf der Muskelfaserregeneration 7
2.1.4 Bedeutung inflammatorischer Prozesse 9
2.1.5 Regulierende Faktoren 12
2.2 Hypoxie-induzierbare Faktoren 15
2.2.1 Struktur von HIF-1 15
2.2.2 Sauerstoff-abhängige Regulation von HIF-1 16
2.2.3 Sauerstoff-unabhängige Regulation von HIF-1 19
2.2.4 Funktion von HIF-1 20
2.3 HIF-1α – Knockout - Mäuse 21
2.3.1 Methodik des konditionellen Knockouts 22
3 Fragestellung 24
4 Material und Methoden 25
4.1 Versuchstiere 25
4.1.1 Tierhaltung und -zucht 25
4.1.2 Transgene Mäusestämme 25
4.1.3 Genotypisierung 26
4.2 Organentnahmen ohne Tierversuch 28
4.2.1 Testreihen 28
4.2.2 Präparation der Muskeln 29
4.2.3 Präparation der Peritonealmakrophagen 29
4.3 Tierversuche 30
4.3.1 Versuchsreihen 30
4.3.2 Applikation des Traumas 32
4.3.3 Blut- und Muskelprobengewinnung 33
4.4 Chemische Blutplasma - Analyse 34
4.4.1 Myoglobin - Bestimmung 35
4.4.2 Laktatdehydrogenase - Bestimmung 35
4.4.3 Creatinkinase - Bestimmung 35
4.5 Magnetresonanztomographie (MRT) 36
4.5.1 Messung 36
4.5.2 Auswertung 37
4.6 Histologie 38
4.6.1 Paraffinschnitte 38
4.6.2 Hämatoxylin-Eosin - Färbung 38
4.6.3 Auswertung 39
4.7 Durchflusszytometrie (FACS) 39
4.7.1 Probenaufbereitung 40
4.7.2 Messung 41
4.7.3 Auswertung 41
4.7.4 TrucountTM- Messung 42
4.8 Nukleinsäure – Extraktion 43
4.8.1 RNA - Isolierung mittels saurer Phenol-Chloroform-Extraktion 43 4.8.2 RNA - Isolierung mittels Säulen-Affinitätschromatographie 44
4.8.3 DNA - Isolierung 45
4.8.4 Konzentrationsbestimmung 45
4.8.5 RNA - Gelelektrophorese 46
4.9 Polymerase – Kettenreaktion (PCR) 46
4.9.1 cDNA – Synthese 47
4.9.2 Spezifische Oligonukleotid – Primerpaare 48
4.9.3 Semiquantitative PCR 48
4.9.4 Gelelektrophorese von PCR - Produkten 49
4.9.5 Herstellung von Standardreihen 50
4.9.6 Quantitative real-time PCR 51
4.10 Statistische Auswertung 53
5 Ergebnisse 54
5.1 Ermittlung der geeigneten RNA-Extraktionsmethode bei Trauma 54
5.2 Ermittlung eines geeigneten internen Standards für die Expressionsanalyse 55
5.3 Ermittlung der Knockout – Effizienz 58 5.3.1 Wahl eines geeigneten internen Standards für die gDNA - Analyse 58 5.3.2 Bestimmung der HIF-1α –Deletionseffizienz auf gDNA-Ebene 59 5.3.3 Bestimmung der HIF-1α –Deletionseffizienz auf mRNA-Ebene 59
5.4 Charakterisierung phänotypischer Gemeinsamkeiten und Unterschiede 60
5.4.1 Muskel- und Körpergewichtsentwicklung 60
5.4.2 Expression von HIF- α und Enzymen des Energiestoffwechsels im Muskel 62 5.4.3 Expression von HIF- α und Zielgenen in Peritonealmakrophagen 64
5.5 Feststellung der geschlechtsspezifischen Unterschiede 66
5.6 Untersuchungen zu Ausmaß und weiterer Entwicklung des Muskeltraumas in Abhängigkeit vom Genotyp 67
5.6.1 Marker der Gewebeschädigung im Blutplasma 67
5.6.2 Ausmaß von Wundödem und Erguss 70
5.6.3 Histologische Beurteilung der Gewebeschädigung und -regeneration 72 5.6.4 Histologische Beurteilung der Leukozyteninfiltration 74 5.6.5 FACS – Analyse der Leukozyteninfiltration 77
5.7 Untersuchung der Genexpression nach Trauma in Abhängigkeit vom
Genotyp 79
5.7.1 Genotypspezifische Expression von HIF-α im Zeitverlauf 80 5.7.2 Genotypspezifische Expression von Zielgenen / Wachstumsfaktoren im Zeitverlauf 82
6 Diskussion 87
6.1 Probanden 87
6.1.1 Effizienz des Cre-vermittelten HIF1-α – Knockouts 88
6.1.2 Geschlechtsspezifische Unterschiede 89
6.2 Methodik 90
6.2.1 Erzeugung eines Weichteiltraumas mittels Fallgewicht-Apparatur 90 6.2.2 Aussagekraft der Methoden und Problematik des Tiermodells 91
6.2.3 RNA-Extraktion aus Muskeltraumagewebe 93
6.2.4 Interne Standards bei Muskeltrauma 94
6.3 Bedeutung von HIF im Skelettmuskel 97
6.4 Bedeutung von HIF in myeloiden Zellen 99
6.5 Bedeutung von HIF im Muskeltrauma 101
6.5.1 Post-traumatischer Verlauf im WT 101
6.5.2 Auswirkungen eines HIF-1α–Mangels im Muskelgewebe auf den post–traumatischen Verlauf 104
6.5.3 Auswirkungen eines HIF-1α–Mangels in myeloiden Zellen auf den post–traumatischen Verlauf 106
6.6 Schlussbetrachtung 108
7 Zusammenfassung 109
8 Summary 111
9 Literaturverzeichnis 113
10 Anhang 133
10.1 Materialübersicht 133
10.1.1 Allgemeiner Bedarf 133
10.1.2 Tierzucht/-versuch 134
10.1.3 Zellkultur 135
10.1.4 Blutchemie 135
10.1.5 MRT 135
10.1.6 FACS 136
10.1.7 Histologie 136
10.1.8 RNA/DNA 137
10.1.9 Diverse Lösungen 138
Abkürzungsverzeichnis
DF = HIF-1αflox/flox – Mäuse Æ als WT - HIF-1α bzw. Kontrolle
LDF = LysMcre HIF-1αflox/flox – Mäuse Æ myeloidzell-spezifischer HIF-1α – K.O.
MDF = MCKcre HIF-1αflox/flox - Mäuse Æ muskelzell-spezifischer HIF-1α – K.O.
* * * ADM Adrenomedullin
ADP Adenosindiphosphat
AK Antikörper
APC Allophycocyanin Aq. bidest. Aqua bidestillata
ARNT Arylhydrocarbon nukleärer Translokator ATP Adenosintriphosphat
bHLH basische Helix-Schleife-Helix(-Domäne)
bp Basenpaare
cAMP 3,5-cyclo-Adenosinmonophosphat CBP CREB bindendes Protein
cDNA copy DNA, zur mRNA komplementäre DNA cran. cranialis
Cre Rekombinase des Bakteriophagen P1 ("cyclization recombination“) CREB cAMP-responsives Element bindendes Protein
CS Citratsynthase
cyc Zyklen
DC dendritische Zellen DEPC Diethylpyrocarbonat DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Desoxynukleotid-5’-triphosphat (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) dsDNA doppelsträngige DNA
EDTA Ethylendiamintetraacetat
FACS Fluorescence-Activated Cell Sorting FAD+ Flavin-Adenin-Dinukleotid
FGF Fibroblasten-Wachstumsfaktor FITC Fluorescein Isothiocyanat G6P Glucose-6-Phosphat
GAPDH Glyceral-3-Phosphat-Dehydrogenase gDNA genomische DNA
Grc Granulozyten H.E. Hämatoxylin-Eosin
HAD Hydroxy-AcylCoA-Dehydrogenase HGF Hepatozyten - Wachstumsfaktor HIF Hypoxie-induzierbarer Faktor
HPRT Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase HRE Hypoxie-responsives Element
i.p. intra-peritoneal
IGF Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor IL Interleukin
K.O. Knockout
kB kiloBasen
LDH Laktatdehydrogenase
LIF Leukämie-inhibierender Faktor loxP locus of crossing over of P1 LPS Lipopolysaccharid
LysM Lysozym M M Mittelwert M(m). Musculus (Musculi)
MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase MHC Major histocompatibility complex MOPS 3-N-[morpholino]propansulfonsäure MRF Myogenic regulatory factor
mRNA messenger RNA
MRT Magnetresonanztomographie
MØ Makrophagen
NAD(P)+ Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid–(Phosphat) NF-κB Nukleärer Faktor- κB
NLS Nukleäre Lokalisationssequenz
nm Nanometer
OD Einheit der optischen Dichte (Extinktion) ODD Sauerstoff-abhängige Degradationsdomäne p.m. post mortem
PAS PER-ARNT-SIM (Period, ARNT, Single-minded) Pax Paired box
PCR Polymerasekettenreaktion PDH Pyruvatdehydrogenase
PDK Pyruvatdehydrogenase-Kinase PE R- Phycoerythrin
PerCP Peridiniumchlorophyll-Protein PFA Paraformaldehyd
PHD Prolylhydroxylase
PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase
pVHL von Hippel-Lindau - Tumorsupressorprotein Q.25| Q.75 25 % - und 75 % - Quartil
resp. respective
RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease ROI region of interest
ROS reaktive Sauerstoffspezies rRNA ribosomale RNA
rProtein ribosomales Protein Scrgr Secretogranin
SD Standardabweichung SDF Stromal cell-derived factor
SE Standardfehler
SN Secretoneurin
STIR Short Tau Inversion Recovery (eine MRT-Sequenz) TAD Transaktivierungsdomäne
TAE Tris-Acetat-EDTA
TE Tris-EDTA
TGF Transformierender Wachstumsfaktor TNF Tumornekrose-Faktor
Tris Tris[hydroxymethyl]aminomethan VEGF Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor
WT Wildtyp
ZK Zellkultur
β2-M β2-Microglobulin
1 Einleitung
Die Skelettmuskulatur der Säugetiere ist im intakten Zustand ein Gewebe mit äußerst geringer Umsatzrate. Verletzt infolge Überbelastung, chemischer oder physikalischer Schädigung, entwickelt sie jedoch die bemerkenswerte Fähigkeit, mittels rascher und feinabgestimmter Reparaturprozesse einem Verlust von Muskelmasse umfassend entgegenzuwirken. Einer Phase des nekrotischen Zerfalls geschädigter Fasern und parallel einsetzender Entzündungsreaktion folgt die Phase der Regeneration durch myogene Zellen, die in der Neubildung von Muskelfasern und schließlich der Wiederherstellung der Muskelfunktion gipfelt. Neben einem funktionsfähigen kontraktilen Muskelapparat ist hierfür auch eine ausreichende Vaskularisierung und die Anbindung an das neuronale Netzwerk erforderlich.
Nachdem die Forschung auf dem Gebiet der Muskelphysiologie und –pathologie lange Zeit ein Schattendasein führte, ist in jüngster Zeit das Interesse an einer Aufklärung der zeitlichen Abläufe sowie der beteiligten Zellen und Faktoren insbesondere im Bereich der Sportmedizin rapide gewachsen. Trotz allem verstehen wir bis heute nur einen Bruchteil der komplexen regulatorischen Mechanismen, die sich im Zuge der Muskelregeneration entfalten. Ein Versagen dieser Mechanismen aufgrund zu weitreichender Schädigung oder aber chronischer Überbeanspruchung mit allmählicher Erschöpfung, wie sie bspw. im Rahmen der Duchenne–
Muskeldystrophie beobachtet wird, kann neben der Beeinträchtigung lokomotorischer Fähigkeiten auch lebenswichtige Funktionen wie die Atmung in Mitleidenschaft ziehen und im schlimmsten Fall tödlich enden. In diesem Zusammenhang rückt auch die begleitende inflammatorische Reaktion sowohl wegen ihrer lokalen als auch ihrer systemischen Folgen, welche beim Polytrauma als Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS) lebensbedrohliche Ausmaße annehmen können, zunehmend ins Blickfeld.
Untersuchungen haben gezeigt, dass ein Teil der Muskelfaserschädigung nicht in direkter Folge der traumatischen Einwirkung entsteht, sondern sich aufgrund von Mangel- und Reperfusion sowie der lytischen Aktivität phagozytärer Zellen
entwickelt. Dieser Umstand impliziert eine in diesem Geschehen potentiell wichtige Rolle für die Schlüsselfigur der Sauerstoff–Homöostase, den Hypoxie-induzierbaren Faktor–1 (HIF-1). Mit Hilfe von Knockout-Mäusen, bei denen entweder Skelettmuskelzellen oder myeloide Zellen einem HIF-1 – Mangel unterliegen, wird in der vorliegenden Arbeit die Bedeutung dieses Faktors für den post-traumatischen Verlauf untersucht.
2 Literaturübersicht
2.1 Muskeltrauma und –regeneration
Die Skelettmuskulatur als kontraktiles Gewebe ermöglicht gezielte Bewegung und Stabilität. Für ihre volle Funktionsfähigkeit benötigt sie eine gut strukturierte und ausgeprägte Vaskularisierung zur Nährstoffversorgung sowie stabilisierendes Bindegewebe. Darüber hinaus erlangt jede Muskelfaser als kontraktile Grundeinheit des Muskels erst durch die Verbindung mit einem Motoneuron die Fähigkeit, ihren Beitrag zum koordinierten Zusammenspiel aller Muskelfasern zu leisten. Nach einer Verletzung des Muskelgewebes sind daher neben der Muskelfaserregeneration, auf die im Folgenden näher eingegangen werden soll, natürlich auch die Revaskularisation, Reinnervation und Rekonstitution der extrazellulären Matrix wichtige Bestandteile des Regenerationsprozesses.
2.1.1 Tiermodelle des Muskeltraumas
Unsere heutigen Erkenntnisse zu Ablauf und Regulation der Muskelregeneration basieren zum größten Teil auf in vitro - Studien. Die Vorteile von Zellkulturversuchen liegen auf der Hand: zum einen der Verzicht auf Tierversuche, zum anderen ihre hohe Standardisierbarkeit. Letztere erlaubt eine Einschränkung der Einflussfaktoren auf ein Minimum und vereinfacht somit erheblich das Testen von Hypothesen. Doch genau hierin liegt auch der Nachteil: selbst Co-Kulturversuche sind nicht in der Lage, das komplexe Zusammenspiel aller beteiligten Zelltypen oder gar die systemischen Zusammenhänge nachzuahmen. Viele Beobachtungen der in vitro - Forschung konnten daher im Tierversuch nicht bestätigt werden (HAWKE und GARRY, 2001).
Tatsächlich unterscheiden sich sogar Umfang und Kinetik der post-traumatischen Abläufe je nach Ausmaß und Art der Schädigung sowie dem betroffenen Muskelgewebe (LEFAUCHEUR und SEBILLE, 1995b; MITCHELL et al., 1992).
Dementsprechend existieren verschiedene Tiermodelle.
Die vielleicht einfachste und am besten reproduzierbare Art der Schädigung besteht in der Injektion von Myotoxinen. Neben Bupivacain werden v.a. die aus Schlangengift isolierten Peptide Notexin (HARRIS et al., 1975), ein Neurotoxin, und Cardiotoxin (D'ALBIS et al., 1988; HALL-CRAGGS, 1974) eingesetzt. Die umfangreiche biologische Aktivität dieser Toxine ist jedoch nicht vollständig aufgeklärt. Bisher unbekannte potentielle Effekte auf verschiedene Muskelzelltypen einschließlich der Satellitenzellen sprechen daher gegen einen vorbehaltlosen Einsatz dieser Noxen.
Physiologisch relevanter sind Muskelbelastungsstudien, wobei sich exzentrische Kontraktionen als besonders potent im Hinblick auf die Induktion von Muskelschäden erwiesen haben (ARMSTRONG et al., 1991).
Zur Untersuchung schwerwiegenderer Schädigungen stehen das Vereisungsmodell und das Muskelkontusionsmodell zur Wahl (CREUZET et al., 1998; KUREK et al., 1997), wobei letzteres die in den hiesigen Breiten wohl häufigste Form des Muskeltraumas simuliert.
2.1.2 Satellitenzellen als regenerativer Pool
Da sich das Muskelgewebe ausgewachsener Säugetiere aus postmitotischen Muskelfasern zusammensetzt, wird die beachtliche Fähigkeit der Muskulatur zur Regeneration hauptsächlich einer kleinen Population residenter Zellen zugeschrieben. Seit ihrer Entdeckung durch KATZ (1961) und deskriptiven Namensgebung durch MAURO (1961) wurden die Satellitenzellen klassischerweise über ihre Morphologie in Verbindung mit ihrer Fähigkeit zur myogenen Differenzierung identifiziert (BEAUCHAMP et al., 2000). Diese undifferenzierten, mononukleären und myogenen Zellen wurden in Amphibien (MAURO, 1961), Reptilien (KAHN und SIMPSON, 1974), Vögeln (HARTLEY et al., 1992) und letztlich Säugetieren (CAMPION et al., 1981; GAMBLE et al., 1978) nachgewiesen. Ruhende Satellitenzellen findet man anhand ihrer charakteristischen Position zwischen Sarkolemm und Basalmembran reifer Muskelfasern (MUIR et al., 1965). Sie besitzen ein hohes Kern-Plasma-Verhältnis bei deutlich reduziertem Gehalt an
Zellorganellen. Mitotisch inaktiv und nur wenig transkriptionell aktiv haben sie einen im Vergleich zu Muskelzellkernen kleineren Nukleus mit einem höheren Anteil an Heterochromatin (SCHULTZ et al., 1978; SNOW, 1983). Verschiedentliche Versuche einer Charakterisierung anhand von zellspezifischen Markern offenbarten die Heterogenität der Satellitenzellpopulation. Während die meisten Satellitenzellen das Oberflächenprotein CD34 exprimieren (BEAUCHAMP et al., 2000; CONBOY und RANDO, 2002; SHERWOOD et al., 2004) sind andere Oberflächenmarker sowie myogene Transkriptionsfaktoren wie Pax-7 unterschiedlich vorhanden nachgewiesen worden (BEAUCHAMP et al., 2000; CORNELISON und WOLD, 1997; SHERWOOD et al., 2004). Ob es sich hierbei um funktionelle Unterschiede, verschiedene Stadien myogener Determination oder das Vorhandensein nicht-myogener Zelltypen innerhalb des Muskelfaserkompartiments handelt, ist ungeklärt. CD34+ und Pax-7low lautet jedoch die überwiegend gültige Definition ruhender Satellitenzellen. Die Abkürzung Pax kennzeichnet die Zugehörigkeit zu den Paired box Genen, einer Familie von Transkriptionsfaktoren, die u.a. für die Entwicklung der Skelettmuskulatur von Bedeutung sind (MANSOURI et al., 1999). Verschiedene Untersuchungen an Pax-7-Mutanten weisen auf eine Schlüsselrolle für diesen Faktor in der myogenen Determinierung von Satellitenzellen hin (MANSOURI et al., 1996; SEALE et al., 2000).
Satellitenzellen kommen in allen Skelettmuskeln vor, wobei Typ I – Muskelfasern (slow - oxidative) erheblich größere Mengen enthalten (GIBSON und SCHULTZ, 1982). Außerdem wurde eine besondere Affinität zur Umgebung von Kapillaren und Motoneuronen beobachtet (SCHMALBRUCH und HELLHAMMER, 1977; WOKKE et al., 1989). Die zugrundeliegenden Mechanismen und ihre Bedeutung für die Funktion und Regulation der Satellitenzellen obliegen derzeit noch der Spekulation. Der Gehalt der Muskelfasern an Satellitenzellen nimmt darüber hinaus mit zunehmendem Alter ab (GIBSON und SCHULTZ, 1983).
Die Aktivierung von Satellitenzellen infolge einer Faserschädigung spiegelt sich sowohl in einer veränderten Morphologie als auch in der Expression bestimmter Oberflächenmarker und myogener Faktoren wider. Der Gehalt an Zellorganellen und Zytoplasma nimmt zu, wodurch die Zelle als "Schwellung" an der Muskelfaser
erscheint. Zusätzlich bildet die aktivierte Zelle zytoplasmatische Fortsätze, die die Chemotaxis entlang der Muskelfaser ermöglichen sollen. Die Abnahme des Heterochromatingehalts kennzeichnet den Beginn der mitotischen Aktivität (SCHULTZ und MCCORMICK, 1994). Die erhöhte Expression von Pax-7, M-Cadherin sowie der myogenen Marker MyoD und Myf-5 kennzeichnet schließlich den Übergang ins Myoblastenstadium (MORGAN und PARTRIDGE, 2003).
SCHULTZ (1996) konnte in wachsenden Ratten zeigen, dass die Zellpopulation der Satellitenzellen nur zu 80 % aus sich rasch teilenden Zellen besteht. Während diese für die Bildung der Muskelzellen verantwortlich zeichnen, dient die sich vergleichsweise langsam teilende Restpopulation sogenannter "Reserve – Zellen"
der Auffüllung des Satellitenzell-Pools. Gegenwärtig werden diesbezüglich zwei verschiedene Teilungsmechanismen diskutiert. Eine Theorie besagt, dass nach einer symmetrischen Teilung eine der Tochterzellen vom Differenzierungsprogramm zurücktritt und in den Ruhezustand übergeht. Die Beobachtungen von CONBOY und RANDO (2002) weisen jedoch in Richtung der zweiten Theorie, welche von einer asymmetrischen Teilung ausgeht, die jeweils eine Tochterzelle für die myogene Differenzierung bzw. den Verbleib als Stammzelle festlegt. CONBOY und RANDO (2002) stellten fest, dass Numb, ein mit der Plasmamembran assoziiertes zytoplasmatisches Protein, in vitro asymmetrisch in teilenden Satellitenzellen aufgeteilt wird. Numb unterdrückt den Notch – Signalweg, welcher in verschiedenen Systemen und Spezies die zelluläre Differenzierung reguliert (DELFINI et al., 2000).
Notch-1 fördert die Proliferation "primitiver" Satellitenzellen in vitro. Seine Inhibierung bedingt die Bildung von Myoblasten und nachfolgende myogene Differenzierung.
Die zur Stützung der erstgenannten Hypothese notwendige Möglichkeit der Entdifferenzierung wurde zumindest experimentell von ODELBERG et al. (2000) unter Einsatz von msx1, eines transkriptionellen Repressors, sogar für terminal differenzierte Säugetier-Myotuben gezeigt. Schließlich ist auch die Möglichkeit der Erneuerung des Satellitenzellpools durch multipotente Stammzellen zu nennen.
Diesbezüglich wäre eine Rolle für Pax-7 denkbar, indem es die Entwicklung zur Satellitenzelle fördert und gleichzeitig alternative Entwicklungsmöglichkeiten einschränkt (SEALE et al., 2000).
2.1.3 Ablauf der Muskelfaserregeneration
Die Abläufe im geschädigten Muskelgewebe lassen sich in eine degenerative und eine regenerative Phase untergliedern. Nach heutigem Verständnis spiegeln die Regenerationsprozesse in weitem Maße die embryonale Muskelentwicklung wider (CHARGE und RUDNICKI, 2004; WAGERS und CONBOY, 2005). Deutlich wird dies an der Aktivierung der an der Ontogenese beteiligten Signalwege von Notch, Sonic Hedgehog und Wnt (CONBOY und RANDO, 2002).
Die Nekrose wird mit der Ruptur des Sarkolemms und der daraus resultierenden Permeabilitätserhöhung der Muskelfaser eingeleitet. Dies schlägt sich in einem Anstieg muskelspezifischer Proteine im Blut nieder. In diesem Zusammenhang diskutieren ALDERTON und STEINHARDT (2000) sowie BELCASTRO et al. (1998) jeweils die Möglichkeit des resultierenden Calcium – Einstroms als treibende Kraft des Gewebeuntergangs. Denkbare Kandidaten für eine Calcium-mediierte Proteolyse sind Calpaine. Diese Calcium-aktivierten Proteasen sind in der Lage, Myofibrillen und Proteine des Zytoskeletts zu spalten (KWAK et al., 1993). Daneben ist die lytische und oxidative Wirkung der inflammatorischen Zellen von Bedeutung.
Der Beginn der regenerativen Phase ist durch die Aktivierung der Satellitenzellen und nachfolgenden Proliferation ihrer myogenen Tochterzellen, auch myogene Vorläuferzellen oder Myoblasten genannt, gekennzeichnet. Auslöser der Satellitenzell-Aktivierung sind Signale des umliegenden geschädigten Gewebes. In der Folge werden die sog. frühen Myogenic regulatory factors (MRFs) MyoD und Myf-5 in hohem Maße exprimiert (COOPER et al., 1999; SMITH et al., 1994;
YABLONKA-REUVENI et al., 1999). Die MRF sind myogene Transkriptionsfaktoren aus der Superfamilie der basic-helix-loop-helix (bHLH) – DNA-bindenden Proteine (s.
auch Abschn. 2.2.1). Gemeinsam mit ihrem ubiquitär exprimierten Dimerisations- partner bHLH E – Protein binden sie an die E-Box, eine spezifische DNA-Sequenz im Enhancer oder Promotor verschiedener Muskelgene. Als Co-Faktoren für die Transkriptionsregulation dieser Gene wirken Mitglieder der MEF2 (Myocyte enhancing factor 2) und SRF (Serum response factor) – Familien von MADS-Box – Transkriptionsfaktoren (BLAIS et al., 2005; LI, S. et al., 2005). Darüber hinaus
werden Interaktionen mit CREB, p300 und pCAF beschrieben (CHEN, A.E. et al., 2005; MAGENTA et al., 2003; ROTH et al., 2003).
Die MyoD – Expression erfolgt innerhalb von 12 h nach der Aktivierung und wird von einer mehr oder weniger zeitgleich einsetzenden Myf-5 – Expression (CORNELISON und WOLD, 1997) begleitet. Beide Faktoren sind entscheidend für die Determinierung der Myoblasten. Daneben wird auch dem Myocyte nuclear factor - α (MNF- α) eine wichtige Rolle bei der Proliferation zugeschrieben (GARRY et al., 2000).
Nach mehrfacher mitotischer Teilung erfolgt die terminale Differenzierung zu Myozyten. Dieser Schritt wird durch die Expression der sog. späten MRFs, Myogenin und MRF-4 eingeleitet und von der Expression des Cyclin-abhängigen Kinase Inhibitors 1A (p21) begleitet (CORNELISON und WOLD, 1997; SMITH et al., 1994;
YABLONKA-REUVENI und RIVERA, 1994).
Für die anschließende Fusion der Myozyten zu Myotuben sind semistabile interzelluläre Verbindungsstrukturen, welche die Zell-Zell-Adhäsion vermitteln und die intrazelluläre Zytoskelettstruktur regulieren, erforderlich. Eine wichtige Rolle wird in diesem Zusammenhang den Cadherinen, allen voran dem M-Cadherin zugeschrieben (KAUFMANN et al., 1999). Diese Hypothese wird u.a. durch die Induktion der M-Cadherin – Expression in der Folge eines Muskeltraumas gestützt (IRINTCHEV et al., 1994; MOORE und WALSH, 1993). Untersuchungen an M-Cadherin-/- - Mäusen widerlegen jedoch zumindest die durch in vitro Studien gewonnene Vorstellung von einer essentiellen Funktion dieses Transmembran- Proteins für die Muskelregeneration (HOLLNAGEL et al., 2002). Als Erklärung kommt diesbezüglich eine Kompensation durch andere Cadherine in Betracht. Ebenfalls im Fokus befindet sich M-Calpain mit einer potentiellen Aufgabe bei der Reorganisation des Zytoskeletts (SORIMACHI et al., 1997).
Mit der Fusion einher geht die Expression der Myosin heavy chains und der Muskel- Creatinkinase (MCK). Das entstandene vielkernige Synzytium reift letztlich zur kontraktilen Muskelfaser aus. Neben der Bildung völlig neuer Muskelfasern ist auch die Einwanderung in sog. leere Muskelschläuche mit intakter Basalmembran zur Erneuerung einer geschädigten Muskelfaser möglich.
Abb. 1, Aspekte der Muskelfaserregeneration
2.1.4 Bedeutung inflammatorischer Prozesse
Die frühe Phase der Regenerationsprozesse wird durch die Aktivierung von inflammatorischen Zellen begleitet. Bisherige Erkenntnisse legen eine Aktivierung residenter Entzündungszellen durch die von den geschädigten Muskelfasern und aktivierten Satellitenzellen (CHAZAUD et al., 2003) freigesetzten Faktoren nahe. Ein potentieller Kandidat in diesem Zusammenhang ist das Monocyte-chemoattractant protein –1 (MCP-1). Derart aktivierte Entzündungszellen wiederum rekrutieren zirkulierende Entzündungszellen (TIDBALL, 1995). Als erste infiltrieren neutrophile Granulozyten mit einem Peak bei 1 – 6 h post-trauma das Gewebe. Nach ca. 48 h werden die Makrophagen (MØ) zur vorherrschenden inflammatorischen Zellart (ORIMO et al., 1991; TIDBALL, 1995).
Aufgrund der zeitlichen Koinzidenz zwischen der Anwesenheit von Entzündungszellen und der Geweberegeneration wurde gemeinhin angenommen, dass den inflammatorischen Zellen eine wichtige Funktion im Rahmen der Reparaturmechanismen innewohnt. Neuere Erkenntnisse zeigen jedoch, dass die Interaktionen zwischen den beteiligten Zelltypen viel komplexer und v.a. nicht in jeder Hinsicht vorteilhaft sind (TIDBALL, 2005). Von entscheidender Bedeutung in diesem Zusammenhang ist die Vorgeschichte des betroffenen Gewebes, die Art der Schädigung sowie das Ausmaß der Immunantwort.
Insbesondere die neutrophilen Granulozyten stehen im Verdacht, lediglich die Gewebeschädigung durch Freisetzung zytolytischer und zytotoxischer Moleküle voranzutreiben und auszudehnen. Forschungsarbeiten auf dem Gebiet der Ischämie/Reperfusion lieferten hierfür verschiedenste Hinweise (JOLLY et al., 1986;
KORTHUIS et al., 1988; KYRIAKIDES et al., 1999). Konträre Ergebnisse aus dem Bereich der training-induzierten Muskelschädigungen (BRICKSON et al., 2003;
LOWE et al., 1995) weisen auf eine schädigungsabhängige Freisetzung dieser Moleküle hin. Während moderates Training eine diesbezügliche Aktivierung begünstigt, wird dem intensiven Training eine suppressive Wirkung zugeschrieben (NIEMAN, 1997; PYNE, 1994).
In Untersuchungen wurde vielfach gezeigt, dass aus einer eingeschränkten oder gehemmten Phagozytoseleistung eine Verzögerung der Regeneration resultiert (ALMEKINDERS und GILBERT, 1986; GROUNDS, 1987; TEIXEIRA et al., 2003;
ZACKS und SHEFF, 1982). TOUMI und BEST (2003) sehen daher in der gezielten Unterdrückung der Produktion und Freisetzung freier Radikale bei erhaltener Fähigkeit zur Phagozytose eine Möglichkeit zur pharmakologischen Intervention.
Neben ihrer hydrolytischen und zytotoxischen Granula sind aktivierte Neutrophile und MØ dank der Expression von Myeloperoxidase und NADPH-Oxidase in der Lage, verschiedenste mehr oder weniger stark gewebeschädigende Oxidantien wie O2–
, H2O2, *OHund HOCl zu bilden (HAMPTON et al., 1998; WINTERBOURN, 1986). Im Gegenzug verfügt das Muskelgewebe über einen NO-mediierten Schutzmechanismus. Aus Muskeln stammendes NO inhibiert nachweislich die Muskelfaserlyse durch neutrophile Granulozyten (NGUYEN und TIDBALL, 2003).
Zusätzlich hemmt es die Expression verschiedener Adhäsionsmoleküle, welche die Interaktion der Leukozyten mit dem Gefäßendothel vermitteln und somit die Aggregation und Extravasation ermöglichen (ALJADA et al., 2000; KOSONEN et al., 2000; LIU et al., 1998). Darüber hinaus wird unter in vitro –Bedingungen u.a. die Inhibierung der NADPH-Oxidase (CLANCY et al., 1992; FUJII et al., 1997) sowie eine pro-apoptotische Wirkung auf Entzündungszellen (ALBINA et al., 1993;
BLAYLOCK et al., 1998; WARD et al., 2000) beobachtet.
Verglichen mit den neutrophilen Granulozyten ist die Rolle der MØ im traumatisierten Gewebe deutlich komplexer, nicht zuletzt da sie eine reichhaltige Quelle diverser Wachstumsfaktoren und Chemokine, wie bspw. IL–4 und –6, LIF, TGF- β und TNF- α sind (s. Abschn. 2.1.5). In vivo und in vitro –Versuche haben mehrfach die mitogene Wirkung bisher nicht eindeutig identifizierter Makrophagen–sezernierter Faktoren auf Myoblasten gezeigt (CANTINI und CARRARO, 1995; CANTINI et al., 2002;
MASSIMINO et al., 1997; MERLY et al., 1999). Es ist seit längerem bekannt, dass funktionell verschiedene Monozyten/Makrophagen-Populationen das geschädigte Gewebe zu unterschiedlichen Zeitpunkten bevölkern. Nicht-phagozytierende lösen dabei die zunächst vorherrschenden phagozytären MØ ab und reichern sich bevorzugt in regenerativen Zonen an (KRIPPENDORF und RILEY, 1993;
MCLENNAN, 1993). Die Clodronat-induzierte Apoptose der phagozytären Subpopulation resultiert in einer verzögerten Debris-Entfernung ohne erkennbar negative Auswirkungen auf die Regenerationsfähigkeit (SUMMAN et al., 2006). Die gezielte Depletion der späteren, nicht-phagozytären Subpopulation verhindert hingegen eine regelrechte Faserregeneration (TIDBALL und WEHLING-HENRICKS, 2007). Die jüngsten Beobachtungen von ARNOLD et al. (2007) weisen nun darauf hin, dass nur proinflammatorische, die Myoblasten-Proliferation fördernde Monozyten aus dem Blutkreislauf rekrutiert werden. Die Phagozytose von Muskelzelldebris induziert ihre Umwandlung in antiinflammatorische, teilungsfähige MØ, welche wiederum die Differenzierung zu Myotuben begünstigen.
Zumindest in Bezug auf Makrophagen ist daher von einer über das bloße Beseitigen von Debris hinausgehenden Schlüsselrolle (LESCAUDRON et al., 1999) bei der Wiederherstellung der Muskelfunktion auszugehen.
2.1.5 Regulierende Faktoren
Die Aktivierung der Satellitenzellen erfordert die zeitlich gut koordinierte Expression verschiedenster muskelspezifischer Gene und Transkriptionsfaktoren. Der Balance- Akt zwischen Proliferation und Differenzierung mit dem Ziel einer funktionsfähigen Muskelarchitektur wird sowohl durch Zell-Zell– und Zell-Matrix– Interaktionen als auch eine Reihe sezernierter Faktoren bewerkstelligt. BISCHOFF (1986), CHEN und QUINN (1992) konnten zeigen, dass der Extrakt gequetschten Muskelgewebes Satellitenzellen-stimulierende Mitogene enthält. Neben den zuvor erwähnten Makrophagen-sezernierten Faktoren ist auch das umgebende Bindegewebe als eine mögliche Quelle regulatorischer Faktoren anzusehen (EL FAHIME et al., 2002;
SUELVES et al., 2002).
In vitro – Untersuchungen haben eine große Zahl potentieller Kandidaten identifiziert.
Allerdings konnte bisher für die wenigsten von ihnen eine physiologische Implikation bei der Muskelregeneration in vivo bestätigt werden. Im Folgenden soll insbesondere auf jene Faktoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht wurden, näher eingegangen werden.
FGF–2 (Fibroblasten–Wachstumsfaktor–2) ist Mitglied einer Familie potenter Promotoren der Proliferation und Inhibitoren der Differenzierung von Myoblasten (KASTNER et al., 2000; LEFAUCHEUR und SEBILLE, 1995a; YABLONKA- REUVENI et al., 1999). CORNELISON et al. (2001) räumen ihnen im Vergleich mit HGF sogar eine größere Chance auf die Schlüsselrolle bei der Regulation der frühen Satellitenzell-Aktivierung ein. Obwohl FGF-2 in vitro ein deutliches Potential in Bezug auf die Myoblastenaktivierung erkennen lässt, scheint es im Tierversuch zumindest kein limitierender Faktor der Muskelregeneration zu sein (MITCHELL et al., 1996).
Unbestritten ist jedoch die Bedeutung dieser Wachstumsfaktoren für die Revaskularisierung (LEFAUCHEUR et al., 1996). Von besonderem Interesse im Rahmen dieser Arbeit ist die Fähigkeit von FGF-2 zur normoxischen Induktion von HIF-1α (RICHARD et al., 2000; SHI et al., 2005).
Den IGF (Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren) –1 und –2, kommt eine anerkannte Position bei der Regulation des Muskelstoffwechsels zu. IGF-1 fördert die
Muskelhypertrophie durch Vermehrung der Kernzahl unter Zunahme des zytoplasmatischen Anteils (ADAMS und MCCUE, 1998; MUSARO et al., 2001).
Unter seinem Einfluss kommt es infolge gesteigerter Translation bei gleichzeitiger Hemmung proteasomaler Aktivitäten zu einem Zuwachs an Muskelprotein (BARK et al., 1998). Für eine funktionelle Bedeutung bei der Muskelregeneration sprechen zum einen in vitro – Beobachtungen, die den Wachstumsfaktoren proliferations- und differenzierungsfördernde Eigenschaften bescheinigen (ALLEN und BOXHORN, 1989; COLEMAN et al., 1995; FLORINI et al., 1991). Zum anderen liegt in regenerierendem Gewebe eine deutlich erhöhte Expression beider Faktoren vor (EDWALL et al., 1989; KRISHAN und DHOOT, 1996; LEVINOVITZ et al., 1992), wobei ihre zeitlich versetzte Expressionsinduktion eine unterschiedliche Aufgabenverteilung nahe legt. Diese Annahme wird gestützt durch die Beobachtung von KIRK et al. (2003), nach der eine IGF-2 – Applikation während der frühen Phase kontraproduktiv, später jedoch förderlich ist. MEHIRI et al. (2005) vermuten eine Rolle für IGF-2 bei der Ausbildung des kontraktilen Apparats, da es kurz vor und während der Expression der Strukturproteine exprimiert wird und einen Einfluss auf die spätere Kraftentwicklung zeigt (MCLOON und CHRISTIANSEN, 2003). Des Weiteren fördern IGF-1 und –2 die Induktion von HIF-1α unter Normoxie. Für IGF-2 ist zusätzlich die reziproke Beziehung in Form einer HIF-1 stimulierten Induktion belegt (FELDSER et al., 1999).
Darüber hinaus wären als wichtige Regulatoren noch zu nennen:
• HGF (Hepatozyten–Wachstumsfaktor) – wird als der primäre Faktor bei der Satellitenzell-Aktivierung angesehen (TATSUMI et al., 1998).
• Angehörige der TGF-β (Transformierende Wachstumsfaktoren - β)– Familie sind Inhibitoren von Proliferation und Differenzierung der Myoblasten (ALLEN und BOXHORN, 1987; 1989; LEFAUCHEUR et al., 1996; LEFAUCHEUR und SEBILLE, 1995c), sowie Regulatoren der Immunantwort und in den Erhalt von Motoneuronen involviert (MCLENNAN und KOISHI, 2002). Hierzu gehört auch Myostatin, dessen Mutation Ursache des "Doppellender"-Phänotyps verschiedener
europäischer Rinderrassen ist (GROBET et al., 1997; KAMBADUR et al., 1997;
MCPHERRON und LEE, 1997).
• LIF (Leukämie-inhibierender Faktor) aus der IL-6 (Interleukin-6) – Familie gilt als proliferationsfördernder Faktor (BARNARD et al., 1994; KUREK et al., 1997;
WHITE et al., 2001).
• TNF-α (Tumornekrose-Faktor–α), welcher NF-κB (Nukleärer Faktor–κB) – vermittelten Muskelschwund hervorrufen kann (LI, Y.P. et al., 1998) und v.a. im späteren Regenerationsstadium insbesondere für die funktionelle Wiederherstellung des Muskelgewebes von Bedeutung zu sein scheint (GOSSELIN et al., 2003; WARREN et al., 2002).
Speziell im Hinblick auf die ebenso erforderliche Revaskularisierung wurden für diese Arbeit außerdem die nachfolgenden Faktoren untersucht:
SDF–1 (Stromal cell-derived factor – 1), auch CXCL12 (Chemokin CXC Ligand 12) genannt, besitzt 2 alternative Spleißvarianten (DE LA LUZ SIERRA et al., 2004) und bindet im Gegensatz zu anderen Chemokinen fast ausschließlich an einen Rezeptor, CXCR4. Es wirkt stark positiv chemotaktisch auf Lymphozyten (BLEUL et al., 1996) und wird als wichtiger Koordinator im Rahmen der Gewebebildung und –regeneration diskutiert (ASKARI et al., 2003). SDF-1 vermittelt das homing von zirkulierenden CXCR4+ - Stammzellen zum Knochenmark (PELED, GRABOVSKY et al., 1999;
PELED, PETIT et al., 1999). Unter Hypoxie durch HIF-1 induziert, mediiert es die Rekrutierung von vaskulären Vorläuferzellen und deren Migration in das ischämische Gewebe (CERADINI und GURTNER, 2005; CERADINI et al., 2004).
Secretogranin–2 (sog. Pro-Secretoneurin) ist der Vorläufer von Secretoneurin (SN) und gehört zur Gruppe der Chromogranine. SN ist spezifisch für endokrines, neurokrines und neuronales Gewebe. Unter hypoxischen Bedingungen auch in anderen Gewebe exprimiert, wirkt SN durch Mobilisation von Monozyten und Eosinophilen pro-inflammatorisch und hat außerdem vaskularisierungsförderndes Potential (FISCHER-COLBRIE et al., 2005). Die genaue Wirkungsweise und Regulation ist jedoch noch nicht erforscht.
2.2 Hypoxie-induzierbare Faktoren
Die Verfügbarkeit von Sauerstoff als einer treibenden Kraft verschiedenster Stoffwechselvorgänge bedarf einer strikten Regulation. Sauerstoffmangel erfordert die rasche Adaptation des betroffenen Gewebes wie auch der einzelnen Zelle. Die Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) übernehmen diesbezüglich eine Schlüsselrolle (SEMENZA, 2000). Sie regulieren auf transkriptioneller Ebene entscheidende Parameter, wie Durchblutung und ATP-Gewinnung, zum Erhalt der Sauerstoff- Homöostase.
Als heterodimere Transkriptionsfaktoren bestehen sie aus einer konstitutiv exprimierten β – und einer regulierten α – Untereinheit. Von letzterer sind derzeit 3 Orthologe, HIF-1α (WANG, G.L. und SEMENZA, 1993b), HIF-2α (EMA et al., 1997;
FLAMME et al., 1997; TIAN et al., 1997) und HIF-3α (GU, Y.Z. et al., 1998), bekannt, wobei HIF-2α ursprünglich Endotheliales PAS – Domäne Protein - 1 (EPAS 1), HIF- ähnlicher Faktor (HLF) oder auch HIF-verwandter Faktor (HRF) genannt wurde. Die resultierenden Heterodimere erweisen sich in Bezug auf ihre Funktion als nicht- redundant. Am besten erforscht ist HIF-1, dessen Struktur, Funktion und Regulation nachfolgend näher beleuchtet werden soll.
2.2.1 Struktur von HIF-1
HIF-1 besteht aus einer 120 kDa umfassenden α-Untereinheit und der je nach Spleißvariante 91 bzw. 94 kDa großen β-Untereinheit, die auch als Aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT) bezeichnet wird. Sie gehören zur Klasse der basischen Helix-Schleife-Helix (bHLH)/PAS – Proteine. Die bHLH – Domäne kennzeichnet eine Protein-Superfamilie eukaryontischer Transkriptionsfaktoren. Während die HLH- Domäne zur Regulation der Dimerisierung dient, vermittelt die basische Domäne den DNA-Kontakt. Die PAS-Domäne stellt einen zusätzlichen Vermittler der Dimerisierung dar (SEMENZA, 1999), wobei PAS ein Akronym ist, das sich aus den ersten Mitgliedern dieser Proteinfamilie: Per (Period), ARNT und Sim (Single minded) zusammensetzt (TAYLOR und ZHULIN, 1999).
HIF-1α besitzt N- und C-terminal jeweils eine nukleäre Lokalisationssequenz (NLS) sowie zwei Transaktivierungsdomänen (TAD) für die Interaktion mit Co-Aktivatoren.
Diese werden durch die inhibitorische Domäne (ID), welche unter normoxischen Bedingungen die TAD-Aktivität unterdrückt, voneinander getrennt. Die N-terminale TAD wird von einer sauerstoffabhängigen Degradationsdomäne (oxygen dependent degradation domain, ODD) überlagert, welche für die normoxische Instabilität von HIF-1α verantwortlich ist (JIANG et al., 1997; PUGH et al., 1997).
Abb. 2, Struktur des HIF-1-Proteins
HIF1-α umfasst 826 Aminosäuren, HIF-1β besteht je nach Spleißvariante aus 774 oder 789.
Beide enthalten jeweils eine bHLH– und PAS– Domäne sowie eine C-terminale TAD (C- TAD). HIF1-α verfügt zusätzlich über eine N-terminale TAD (N-TAD) innerhalb der ODD, eine transkriptionshemmende Domäne (ID) sowie terminale Kernlokalisierungssequenzen (N-NLS bzw. C-NLS).
2.2.2 Sauerstoff-abhängige Regulation von HIF-1
Die Regulation von HIF-1 erfolgt hauptsächlich auf post-translationaler Ebene anhand der α-Untereinheit. Diese ist unter normoxischen Bedingungen instabil und wird rasch abgebaut (HUANG, L.E. et al., 1998; WANG, G.L. et al., 1995; YU et al., 1998). Ursache hierfür ist eine O2–abhängige Hydroxylierung der Prolinreste Pro-402 und Pro-564 innerhalb der ODD (IVAN et al., 2001; JAAKKOLA et al., 2001;
MASSON et al., 2001). Diese Reaktion wird durch die HIF-1α-spezifischen Prolylhydroxylase-Domäne enthaltenden Enzyme (PHDs) katalysiert. PHDs gehören zur Enzymklasse der 2-Oxoglutarat– und Fe2+–abhängigen Dioxygenasen (EPSTEIN et al., 2001). Bisher sind bei Säugetieren 3 verschiedene bekannt, wobei die PHD-1
ausschließlich im Zellkern, die PHD-2 überwiegend im Zytoplasma und die PHD-3 in beiden Kompartimenten anzutreffen ist (HUANG, J. et al., 2002; METZEN et al., 2003). Des Weiteren unterscheidet sich die PHD-3 von den anderen durch ihre auf Pro-564 beschränkte Affinität. Bei der Reaktion bindet Sauerstoff zunächst an Fe2+
im aktiven Zentrum der Enzyme und wird gespalten. Ein Sauerstoffatom wird in die neu entstehende Hydroxy-Gruppe eingebaut, das zweite wird an das Cosubstrat 2-Oxoglutarat angelagert, welches daraufhin unter CO2-Abspaltung zum Succinat reagiert. Die spontane Oxidation des zweiwertigen Eisens wird durch Ascorbat verhindert (KNOWLES et al., 2003). Da die PHDs für ihre Enzymaktivität Sauerstoff benötigen, werden sie auch als physiologische O2 -Sensoren bezeichnet (EPSTEIN et al., 2001). Die Hydroxylierung vermittelt die Erkennung durch das von Hippel- Lindau Tumorsuppressorprotein (pVHL) (IVAN et al., 2001; JAAKKOLA et al., 2001), welches an die Aminosäuren 557-571 oder 380-417 im Bereich der ODD bindet (TANIMOTO et al., 2000) und als Substrat für die E3-Ubiquitinligase dient (MAXWELL et al., 1999; OHH et al., 2000). Diese markiert HIF-1α durch Polyubiquitinylierung für den proteasomalen Abbau (HUANG, L.E. et al., 1998;
SALCEDA und CARO, 1997).
Daneben wird in Gegenwart von Sauerstoff auch der Asparaginrest Asn-803 hydroxyliert, vermittelt durch die HIF-1α Asparaginyl-Hydroxylase, auch als HIF-inhibierender Faktor (FIH) bezeichnet (MAHON et al., 2001). Dies schwächt die Bindungsfähigkeit von HIF-1α an den transkriptionellen Co-Aktivator CREB–
bindendes Protein (CBP) bzw. p300 (LANDO et al., 2002; MCNEILL et al., 2002).
Unter hypoxischen Bedingungen jedoch akkumuliert HIF-1α im Zytosol, wird phosphoryliert und transloziert in den Zellkern. Nach der Dimerisierung mit ARNT kann HIF-1 als Transkriptionsfaktor an die Hypoxie-responsiven Elemente (HREs) der Promotor- oder Enhancerregion von O2–abhängigen Genen binden (CAMENISCH et al., 2001; SEMENZA et al., 1996). Hierbei kann HIF-1 mit zahlreichen transkriptionellen Co-Faktoren, die im Bereich der Transaktivierungs- domänen binden, interagieren. Am bedeutendsten sind in diesem Zusammenhang CBP/p300, Histon-Acetyl-Transferasen (ARANY et al., 1996), die über ihre Cystein-
und Histidin-reiche Domäne mit der C-TAD in Wechselwirkung treten (MASSON und RATCLIFFE, 2003). Durch Acetylierung und Umlagerung von Histonproteinen modulieren p300 und das verwandte CBP die Chromatinstruktur der DNA und machen den jeweiligen Genabschnitt zugänglich für eine gesteigerte transkriptionelle Aktivität (GU, J. et al., 2001). Zusätzlich entsteht durch diese Bindung ein Gerüst für die Anlagerung weiterer Transkriptionsfaktoren.
Sowohl an der hypoxischen als auch an der im Folgenden beschriebenen Liganden- induzierten HIF-1-Aktivierung sind zwei Phosphorylierungswege beteiligt: der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K/Akt)-Weg und der Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Weg (HELLWIG-BURGEL et al., 2005).
Abb. 3, Schema der Regulation der HIF-1α-Aktivität (Nach FANDREY et al., 2006)
2.2.3 Sauerstoff-unabhängige Regulation von HIF-1
Von verschiedensten Substanzen weiß man inzwischen, dass sie HIF-1 auch unter Normoxie aktivieren können. Darunter sind einzelne Wachstumshormone, insbesondere inflammatorische Zytokine, ebenso wie ein potenter Induktor der Immunantwort bei bakterieller Infektion, Lipopolysaccharid (LPS).
LPS, ein Membranbestandteil gram-negativer Bakterien, steigert die Expression von HIF-1α auf transkriptionaler Ebene über einen NF-κB – p44/42 MAPK – abhängigen Signalweg (BLOUIN et al., 2004; FREDE et al., 2006).
Die HIF-1α-Proteinsynthese wird außerdem durch hormonelle Liganden wie Insulin und die IGFs (FELDSER et al., 1999; ZELZER et al., 1998) über den PI3K/Akt- Signalweg induziert (FUKUDA et al., 2002; TREINS et al., 2002). In der Folge übersteigt die Translationsrate die O2–abhängige Degradation und führt zu einem Mehrangebot von HIF-1α. Auch andere bei der Muskelregeneration implizierte Wachstumsfaktoren wie HGF (TACCHINI et al., 2001) und FGF-2 (RICHARD et al., 2000; SHI et al., 2005) steigern die HIF-1α – Expression und – DNA-Bindung.
Aus der Gruppe der Zytokine sind bspw. IL-1β, TGF-β und TNF-α in der Lage, über Protein-Stabilisierung und/oder Transaktivierungsvermögen die zelluläre HIF-1 – Antwort zu modulieren (HADDAD und LAND, 2001; HELLWIG-BURGEL et al., 1999;
SHIH und CLAFFEY, 2001; THORNTON et al., 2000).
Eine O2–unabhängige Hemmung der PHDs durch Eisenchelatoren, kompetitive Verdrängung des Fe(II)-Ions durch andere zweiwertige Kationen wie Co2+ oder Mn2+
oder aber die Verdrängung von O2 durch konkurrierendes NO aus dem aktiven Zentrum führt ebenso zu einer HIF-1α – Akkumulation (SANDAU et al., 2001;
WANG, G.L. und SEMENZA, 1993a).
Nicht zuletzt wird die HIF-1 – Aktivität auch durch physikalische Stimuli, wie mechanische Belastung, beeinflusst (CHANG et al., 2003).
2.2.4 Funktion von HIF-1
Inzwischen ist eine Vielzahl von HIF-1–Zielgenen in Säugetieren bekannt, denen allen die Kernsequenz der HRE, (A/G)CGTG, gemeinsam ist. Diese Gene sind in die Regulation verschiedenster die O2-Homöostase betreffende Zellfunktionen involviert.
Dazu gehören Gene, die die Sauerstoffversorgung modulieren, wie Erythropoietin (WANG und SEMENZA, 1993b), Transferrin (ROLFS et al., 1997), Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) (FORSYTHE et al., 1996; LEVY et al., 1995) oder Adrenomedullin (ADM) (CORMIER-REGARD et al., 1998; NGUYEN und CLAYCOMB, 1999). Andere wiederum regulieren den Zellstoffwechsel und ermöglichen bspw. die Glucose-Aufnahme und Umstellung von der oxidativen zur glykolytischen Energiegewinnung. Hierzu zählen der Glucosetransporter – 1 (EBERT et al., 1995), die Pyruvatkinase M (SEMENZA et al., 1994), die Laktatdehydrogenase A (LDH A) (FIRTH et al., 1995) und die Pyruvatdehydrogenase–Kinase –1 (PDK-1) (KIM et al., 2006; PAPANDREOU et al., 2006). Des Weiteren befinden sich unter den HIF-1–Zielgenen Faktoren des Zellwachstums und der Apoptose, wie das IGF- bindende Protein–1 (TAZUKE et al., 1998) oder auch SDF-1 und sein Rezeptor CXCR4 (CERADINI et al., 2004; STALLER et al., 2003).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden neben den bereits im Abschnitt 2.1.5 näher erläuterten Zielgenen folgende Gene bezüglich ihrer Expression untersucht:
ADM senkt den Gefäßtonus und gewährleistet hierüber eine bessere Blutversorgung.
Pyruvatkinase M stellt als Katalysator der letzten Teilreaktion der Glykolyse einen entscheidenden Regulationspunkt in der Bereitstellung von ATP und Pyruvat dar.
PDK-1 inaktiviert durch Phosphorylierung ein Schlüsselenzym des Citratzykluses, die Pyruvatdehydrogenase (PDH). Als großer Multienzymkomplex in der mitochondrialen Matrix katalysiert die PDH die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA und CO2. Damit stellt sie die katabole Verbindung zwischen Glykolyse und Citratzyklus her. Durch Induktion der PDK-1 – Transkription unterdrückt HIF-1 daher eine Verstoffwechselung von Pyruvat über den Citratzyklus und verringert so die für den Elektronentransport in der Atmungskette zur Verfügung stehenden Mengen an
NADH und FADH2. Nach neuesten Erkenntnissen liegt hierin ein Schlüssel für die Verhinderung eines deregulierten Elektronentransfers, welcher eine vermehrte Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zur Folge hätte (KIM et al., 2006;
SEMENZA, 2007). Auf diese Weise kann u.a. die hypoxische Induktion der Apoptose abgewendet werden.
Die Bindung von HIF-1 an die HRE führt jeweils zu einer Steigerung der Genexpression (KVIETIKOVA et al., 1995; SEMENZA und WANG, 1992; WENGER et al., 1998). HIF-1 reguliert hierüber den O2- und Energiehaushalt betreffende Parameter wie Blutsauerstoff-Kapazität, Gefäßtonus und vaskuläre Permeabilität, Angiogenese, Glukoseaufnahme und Glykolyse. Eine derartige Modulation der Expression erscheint auch bei einer Entzündung sinnvoll, um den gesteigerten Nährstoffbedarf der entzündeten Gewebe zu decken (BILTON und BOOKER, 2003).
Dementsprechend detektieren SCHEID et al. (2002) an künstlich erzeugten Wundenrändern signifikant erhöhte HIF-1α-Spiegel während der inflammatorischen Phase der Wundheilung.
2.3 HIF-1α – Knockout - Mäuse
Mäuse, in denen das HIF-1α Gen generell ausgeschaltet ist, sind nicht lebensfähig.
HIF-1–/– –Embryonen entwickeln einen spezifischen Phänotyp, der mit defekter Gefäßbildung, kardiovaskulären Fehlbildungen und Neuralrohrdefekten infolge mesenchymalen Zelltods einhergeht, und sterben bereits an Tag 11 der Embryonalentwicklung (KOTCH et al., 1999; SEMENZA et al., 1999). Heterozygote entwickeln sich normal, allerdings sind einige physiologische Funktionen verglichen mit Wildtyp (WT)-Tieren verändert. Bei andauernder Hypoxie reagieren sie mit einem verminderten Anstieg der Erythrozytenzahl, zeigen eine anormale vaskuläre Gefäßumbildung und entwickeln eine Rechtsherz-Hypertrophie mit pulmonalem Hochdruck (KLINE et al., 2002; YU et al., 1999). Um die Funktion von HIF-1 unter bestimmten Bedingungen untersuchen zu können, ist daher eine gezielte zeit–
und/oder gewebe–abhängige Ausschaltung der regulierten α – Untereinheit nötig.
2.3.1 Methodik des konditionellen Knockouts
Seit den Anfängen gezielter Genmanipulation wurden verschiedenste Methoden zur Erstellung konditioneller Knockout – Mauslinien entwickelt. Neben der auch in der Zellkultur gern genutzten pharmakologischen An- bzw. Ausschaltung entsprechend markierter Gene bspw. mit Tetracyclin (sog. Tet-on oder –off) (GOSSEN und BUJARD, 1992), existieren 2 gängige Systeme, die durch eine ortsspezifische Rekombinase-Aktivität den gewünschten Knockout bedingen. Dies ist auf der einen Seite das FLP/FRT – System, welches mit der FLP–Rekombinase von Saccharomyces cerevisiae und ihrer spezifischen Erkennungssequenz FRT arbeitet (DYMECKI, 1996). Auf der anderen Seite steht das Cre/lox-System zur Verfügung, welches auch bei den in dieser Studie verwendeten Tieren zum Einsatz kam (GU, H.
et al., 1994). Die jüngere Entwicklung geht in Richtung einer medikamentösen Induktion der Cre – Aktivität (ST-ONGE et al., 1996) und vereint somit die Vorteile beider o.g. Grundprinzipien in sich. Des Weiteren existieren die Variante des adenoviral-mediierten Cre-Gentransfers sowie die topische Applikation (ANTON und GRAHAM, 1995; WANG, Y. et al., 1996).
Cre (cyclization recombination) ist eine vom Bakteriophagen P1 exprimierte 38 kDa große ortspezifische DNA-Rekombinase der Int – Familie (ARGOS et al., 1986;
STERNBERG et al., 1986). Sie katalysiert die Rekombination einer mit spezifischen Erkennungssequenzen, den sog. loxP (locus of crossing over of P1) –Elementen, markierten DNA-Zielsequenz (HOESS et al., 1990). Die flankierten DNA-Abschnitte werden entsprechend als gefloxt (floxed) bezeichnet. Ist ein Gen auf beiden Allelen derart markiert, spricht man von double–floxed. Ein loxP-Element besteht aus zwei gegengleichen Sequenzabschnitten (inverted repeats) von je 13 bp für die Cre- Bindung, die ein 8 bp umfassendes asymmetrisches Zwischenelement (sog. spacer region) flankieren. Letzteres bestimmt die Ausrichtung und damit den Effekt der Rekombinase-Aktivität. Bei gleicher Ausrichtung (sog. in cis) beider loxP-Elemente wird der flankierte Genabschnitt herausgeschnitten. Dafür werden 4 Rekombinasen – je eine pro Bindungssequenz – benötigt (MACK et al., 1992).
Um diesen Effekt auf bestimmte Zellen oder Zeiträume zu begrenzen, wird das Gen für Cre an einer Stelle im Genom eingebracht, die es unter die Kontrolle eines dafür geeigneten Promotors stellt. Entscheidende Kriterien bei der Wahl des Promotors sind die Gewebespezifität und sein zeitliches Aktivitätsmuster (SAUER, 1998). Die jeweiligen Knockout-Stämme werden durch Anpaaren von Tieren mit gefloxtem K.O.- Zielgen an andere, welche transgen für cre im gewünschten Zielgewebe sind, erzeugt (s. Abb. 4).
Abb. 4, Prinzip des Cre/lox – Systems am Beispiel der hier verwendeten K.O.-Mäuse
3 Fragestellung
Ziel dieser Arbeit ist es, die Folgen eines gewebespezifischen HIF-1α – Knockouts auf das Ausmaß der Schädigung und die beginnende Regeneration traumatisierten Muskelgewebes zu untersuchen. Insbesondere gilt es zu klären, inwiefern im Trauma
• ein HIF-1–Mangel der Skelettmuskelfasern deren Überleben oder Untergang fördert,
• ein HIF-1–Mangel die Funktion myeloider Zellen beeinflusst und
• welche Folgen dies jeweils für die Regenerationsfähigkeit des Muskelgewebes zeigt.
Als Grundlage dieser Evaluierung sind darüber hinaus
• mögliche phänotypische Unterschiede der Genotypen unter physiologischen Bedingungen und
• die Charakteristika der post-traumatischen Entwicklung eines stumpfen Weichteiltraumas herauszustellen.
4 Material und Methoden
Der Nachweis der verwendeten Instrumente, Geräte und Verbrauchsmaterialien sowie die Zusammensetzung der eingesetzten Lösungen erfolgt der Übersicht halber in einer gesonderten Aufstellung im Anhang (Kapitel 10).
4.1 Versuchstiere
4.1.1 Tierhaltung und -zucht
Die Mäuse wurden im Zentralen Tierlaboratorium des Universitätsklinikums Essen in Gruppengrößen von bis zu 5 Tieren in Makrolon®-Filterkäfigen Typ III unter kontrollierten Umweltbedingungen bei einer Raumtemperatur von 20°C und 12-h- Tages-Nacht-Rhythmus gehalten. Sie erhielten pelletiertes Alleinfuttermittel und Trinkwasser ad libitum.
Zur Aufrechterhaltung der Reproduktivität innerhalb jedes Knockout-Stammes wurden gezielt weit entfernt verwandte Tiere angepaart. Gegebenenfalls wurde zudem mit Aus- und Rückkreuzung eine Auffrischung der Blutlinien vorgenommen.
4.1.2 Transgene Mäusestämme
Die verwendeten Knockout-Stämme mit der dazugehörigen Kontrolle wurden freundlicherweise von Prof. Randall Johnson, University of California / San Diego, für die Bearbeitung dieses Themas zur Verfügung gestellt. Dabei handelt es sich um Tiere mit einem C57Bl/6-Hintergrund und konditionellem Cre/lox – Knockout. Bei allen Tieren ist das Exon 2 des hif-1α Gens auf beiden Allelen von loxP-Elementen flankiert (HIF-1α flox/flox). Exprimieren die Zellen Cre, führt das über den Verlust des Exons hinaus zur Leserasterverschiebung. Aus der resultierenden mRNA kann somit kein funktionelles HIF-1α - Protein mehr gebildet werden.
Der HIF-1α – K.O. in der quergestreiften Muskulatur wurde von der Promotor- Aktivität der dafür spezifischen Muskelcreatinkinase (MCK) abhängig gemacht, d.h.
diese Mäuse sind MCKcre HIF-1α flox/flox (nachfolgend mit MDF abgekürzt).
Um einen myeloidzell-spezifischen HIF-1α – K.O. zu erzeugen, wurden Tiere mit dem cre-Knockin unter der Kontrolle des Lysozym M (LysM) – Promotors (CLAUSEN et al., 1999) eingekreuzt. Die resultierenden LysMcre HIF-1α flox/flox
– Mäuse (kurz LDF) exprimieren Cre daher in Granulozyten und Makrophagen.
HIF-1α flox/flox – Mäuse (kurz DF für double-floxed), die nicht transgen für cre sind, dienten als Kontrollen.
Eine Übersicht der Genotypen, den jeweiligen Knockout und die hier verwendeten Kurzbezeichnungen liefert Tabelle 1.
Genotyp Kurzbezeichnung gewebespezifischer K.O.
MCKcre HIF-1α flox/flox MDF quergestreifte Muskulatur
LysMcre HIF-1α flox/flox LDF myeloide Zellen
HIF-1α flox/flox DF –
Tab. 1, Übersicht der Genotypen
4.1.3 Genotypisierung
Den Mäusen wurden nach dem Absetzen im Alter von etwa 1 Monat mittels Ohrstanzer die entsprechende Ohrmarkierung angebracht. Das hierbei anfallende Gewebematerial wurde für 12 h in 100µl Proteinase K – haltigem Lysepuffer bei 60°C inkubiert. Die anschließende Erhöhung der Temperatur auf 95°C für 15 min stoppte den Protein-Verdau und sorgte für eine sichere Inaktivierung der Proteinase K. Die Bestimmung des Genotyps erfolgte mittels PCR mit anschließender Gelelektrophorese. Dafür wurden 5 µl der Lösung mit der darin nun frei vorliegenden genomischen DNA (gDNA) amplifiziert (s. Abschnitt 4.9.3).
Die verwendeten Primer, PCR-Bedingungen und Unterscheidungskriterien zwischen mutierter und Wildtyp (WT) – Variante sind nachfolgend in Tabelle 2 dargestellt.
Alle Tiere der Zucht waren HIF-1αflox/flox (HIF DF), erkennbar an einem um die loxP- Sequenz verlängerten Produkt. Da die Primer zum Test auf cre innerhalb dieses Gens banden, konnten Cre-/-- Mäuse anhand der fehlenden Bande identifiziert werden.
Im Gegensatz zur MDF-Zucht stand für die LDF-Zucht hierfür alternativ eine Primerkombination aus einem 5' und zwei 3' –Primern zur Verfügung. Während der eine 3'-Primer (Mlys2) an eine Sequenz ca. 350 bp downstream des 5'-Primers auf der WT-Sequenz im lysm - Gen band, war der zweite 3'-Primer komplementär zu einem Abschnitt des cre – Gens. Läge nun ein cre-Knockin in das Gen für Lysozym M vor, wäre der Abstand zwischen beiden an lysm bindenden Primern zu groß für eine Amplifizierung. Stattdessen könnte der 3'-Primer für cre binden und zu einem Produkt von ca. 520 bp Länge führen. Diese Methode erlaubt die Diskriminierung zwischen Homozygoten und Heterozygoten.
Ein Primerverhältnis von 2:1:2 für Mlys1, Mlys2 und MlysCre resp. hat sich hierbei als günstig erwiesen. Es wurden daher abweichend vom PCR-Standardprotokoll lediglich 0,5 µl des Mlys2-Primer pro Ansatz pipettiert.
Gen Primer Sequenz PCR Produkt 5’ HIF-DF gga gct atc tct cta gac c
hif-1α
3’ HIF-DF gca gtt aag agc act agt tg
WT: ~ 200 bp DF: ~ 250 bp 5' CRE tgc aag ttg aat aac cgg aaa
cre
3' CRE cta gag cct gtt ttg cac gtt c
57 °C 34 cyc
WT: kein Produkt cre: ~ 250 bp
5' Mlys1 ctt ggg ctg cca gaa ttt ctc 3' Mlys2 tta cag tcg gcc agg ctg ac lysm
3’ MlysCre tta gct ggc cca aat gtt gct g
58°C 35 cyc
WT: ~ 350 bp LysMcre: ~ 520 bp
Tab. 2, Übersicht der für die Genotypisierung verwendeten Primer und ihrer PCR-Produkte
4.2 Organentnahmen ohne Tierversuch
Bevor eine Beurteilung der Bedeutung von HIF-1α für die post-traumatischen Abläufe im Muskelgewebe möglich war, war zunächst eine Charakterisierung knockout- spezifischer Unterschiede und Eigenheiten der verwendeten Genotypen erforderlich.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen lieferten darüber hinaus insbesondere für die Genexpressionsanalyse wichtige Hinweise auf geeignete Testparameter.
4.2.1 Testreihen
Folgende Untersuchungsgruppen wurden gebildet:
• WT vs. myeloidzell-spezifischem K.O.: "Peritonealmakrophagen":
Untersuchung der Genexpression nativ und mit LPS-Stimulation (als WT fungierten MDF -Tiere)
• WT vs. muskel-spezifischem K.O.: "Muskeltypen":
Untersuchung der Genexpression in den Mm. soleus, gastrocnemius und tibialis cranialis
(als WT fungierten DF -Tiere) Einen Überblick hierzu vermittelt die Tabelle 3.
Untersuchungsgruppe Proben Untersuchung Tiere Genexpression
ohne Kultivierung Peritonealmakrophagen murine Peritoneal-
makrophagen Genexpression nach Kultivierung mit LPS-Stimulation
je 2 MDF– und LDF– Männchen
M. soleus
M. gastrocnemius Muskeltypen
M. tibialis cran.
Genexpression je 5 DF– und MDF– Weibchen
Tab. 3, Übersicht zu den Organentnahmegruppen ohne Trauma
