Die Bedeutung der Hypoxie-induzierten Genexpression für die Ausbildung einer durch mechanische Last induzierten
Myokardhypertrophie
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Monique Silter
Nordhausen
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Gerhard Breves Physiologisches Institut
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. med. Dörthe M. Katschinski Zentrum für Physiologie und Pathophysiologie Abteilung Herz- und Kreislaufphysiologie Georg-August Universität Göttingen
1. Gutachter(in): Prof. Dr. med. vet. Gerhard Breves Prof. Dr. med. Dörthe M. Katschinski
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Rainhard Mischke
Tag der mündlichen Prüfung: 17. November 2009
Gefördert durch die Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG Ka 1269/9-1 DMK und HK )
Meinen Eltern und
Isabel
Teilergebnisse dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:
Abstract
SILTER M, KÖGLER H, KLEINSCHMIDT M, WILTING J, KATSCHINSKI DM (2009):
Hypoxia-inducible factor-1 affects cardiac function during chronic pressure overload.
Oral presentation, 88th Annual Meeting, Deutsche Physiologische Gesellschaft, Giessen, March 22-25, 2009; Volume 195, Supplement 669
Paper
SILTER M, KÖGLER H , ZIESENISS A, WILTING J, SCHÄFER K, TOISCHER K, ROKITA AG, BREVES G, MAIER LS, KATSCHINSKI DM (2009):
Impaired Ca2+ handling in HIF-1 +/- mice as a consequence of chronic pressure overload.
Pfluegers Archiv-European Journal of Physiology
V
1 Einleitung ... 1
1.1. Hypoxie ... 1
1.2 Hypoxie induzierbarer Faktor 1 ... 2
1.2.1 Struktur von HIF-1 ... 2
1.2.2 Regulation von HIF-1 ... 4
1.2.3 PHD - „Sauerstoffsensoren“ ... 5
1.2.4 Zielgene von HIF-1 ... 7
1.2.5 HIF-1 Knockout-Mäuse und die Bedeutung von HIF-1 während der Embryogenese ... 9
1.3 Der Herzmuskel ... 10
1.3.1 Aufbau und Struktur der Herzmuskelzelle ... 11
1.3.2 Die Rolle von Ca2+ für die Herzmuskelkontraktion ... 14
1.4 Die kardiale Anpassung an mechanische Last ... 16
1.4.1 Mechanische Last am Herzen ... 16
1.4.2 Physiologische und pathologische Myokardhypertrophie... 17
1.4.3 Die Auswirkungen von Myokardhypertrophie und -insuffizienz auf das Ca2+-Handling der Herzmuskelzelle ... 19
1.5 Die Bedeutung von Hypoxie für kardiovaskuläre Erkrankungen ... 21
1.6 Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit ... 22
2 Material und Methoden ... 24
2.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen ... 24
2.2 Versuchsablauf ... 25
2.3 Genotypisierung der Mäuse ... 26
2.3.1 Isolierung genomischer DNA aus Mausschwanzbiopsien ... 26
2.3.2 PCR Amplifikation ... 27
2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese ... 29
2.4 TAC – Transverse Aortic Constriction ... 29
2.5 Echokardiographie ... 32
2.5.1 B-Mode ... 33
2.5.2 TM-Mode ... 33
2.5.3 Echokardiographische Untersuchung ... 34
2.5.3.1Technische Ausrüstung ... 34
2.5.3.2Untersuchungsdurchführung ... 34
2.6 Die Entnahme von Organen ... 35
VI
2.6.1 Die Herzexplantation ... 35
2.6.2 Die Erhebung biometrischer Daten ... 36
2.7 Die Epifluoreszenzmikroskopie ... 37
2.7.1 Ca2+-Fluoreszenzmessungen in isolierten ventrikulären Kardiomyozyten ... 39
2.7.1.1Ca2+-Fluoreszenzfarbstoffe ... 39
2.7.1.2Isolierung und Aufbereitung ventrikulärer Kardiomyozyten ... 39
2.7.1.3Simultane Messung von intrazellulären Ca2+-Transienten und Myozyten-verkürzung in isolierten ventrikulären Kardiomyozyten ... 42
2.7.2 Immunfluoreszenzanalysen ... 48
2.8 Statistische Methoden ... 49
3 Ergebnisse ... 52
3.1 Genotypisierung ... 52
3.2 TAC – Transverse Aortic Constriction ... 53
3.3 Die Entwicklung der kardialen Hypertrophie nach TAC-Intervention in HIF-1 +/+- und HIF-1 +/--Mäusen ... 54
3.3.1 Die Entwicklung der linksventrikulären Masse nach TAC-Intervention ... 54
3.3.2 Immunfluoreszenzanalysen ... 55
3.3.3 Echokardiographie ... 58
3.3.3.1Weibliche Mäuse ... 58
3.3.3.2Männliche Mäuse ... 59
3.4 Die Entwicklung der kardialen Funktion nach TAC-Intervention in HIF-1 +/+-und HIF-1 +/--Mäusen ... 61
3.4.1.1Weibliche Mäuse ... 61
3.4.1.2Männliche Mäuse ... 63
3.4.2 Ca2+-Epifluoreszenz-Analysen ... 65
4 Diskussion ... 70
5 Zusammenfassung ... 82
6 Summary ... 85
7 Literaturverzeichnis ... 87
8 Danksagung ... 95
VII
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AK Antikörper
AM Azetoxymethylester ATP Adenosintriphosphat bHLH basic helix-loop-helix BSA Bovines Serumalbumin Ca2+ Calciumion
[Ca2+]i intrazelluläre Ca2+-Konzentration CBP CREB bindendes Protein
CD31 Cluster of differentiation 31
cm Zentimeter
DAPI 4',6'-Diamidino-2-phenylindol DMOG Dimethyloxalylglycin
DNA Deoxyribonucleic acid gDNA genomische DNA
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EPAS-1 Endotheliale Per/ARNT/Sim-Domäne Protein-1 EPO Erythropoietin
E x Tag x der Embronalentwicklung et al. et alii
Fe2+ Eisenion
FIH Factor inhibiting HIF FS fractional shortening
VIII
G Gauge
GLUT-1 Glukosetransporter-1
h hour
HBS HIF binding sites
HEPES 2-4-2-Hydroxyethyl-1-piperazinyl-ethansulfonsäure
HG Gesamtherzgewicht
HI Hypertrophie-Index
HIF Hypoxie-induzierbarer Faktor HRE Hypoxia response element HRF HIF-verwandter Faktor HWD Hinterwanddicke I.E. International Einheit
K+ Kaliumion
kDa kilo Dalton
KM Michaelis-Menten-Konstante
λ Wellenlänge
LTCC L-Typ-Ca2+-Kanal LV linker Ventrikel
LVEDD linksventrikulärer enddiastolischer Diameter LVESD linksventrikulärer endsystolischer Diameter LVH linksventrikuläre Hypertrophie
LVM linksventrikuläre Masse NCX Na+/Ca2+-Austauscher NLS Nuclear localization signals
nm Nanometer
IX
mm Millimeter
mRNA messenger RNA Na+ Natriumion
O2 Sauerstoff
ODDD Oxygen-dependent degradation domain PAS Per/ARNT/Sim
PCR Polymerase chain reaction PDK-1 Pyruvat-Dehydrogenase-
PECAM-1 Plateled endothelial cell adhesion molecule-1
pH pondus hydrogenii (negativer dekadischer Logarithmus der Hydroniumionenkonzentration)
PHD Prolyl-4-Hydroxylase-Domäne-Proteine
PLB Phospholamban
pO2 Sauerstoffpartialdruck
Pro Prolin
pVHL Von-Hippel-Lindau Tumorsuppressorprotein RNA Ribonucleic acid
RV rechter Ventrikel
RT Raumtemperatur
RyR Ryanodin-Rezeptor RZL Ruhezelllänge
RZx% Zeit bis zur x%igen Relaxation der Myozytenverkürzung
SD Septumdicke
SEM Standard error of the mean
SERCA Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums Sham Schein-Opeartion bzgl. Aortenbanding
X siRNA short interfering RNA
SR sarkoplasmatisches Retikulum TAC Transverse aortic constriction TAD Transaktivierungsdomäne
TE Tris-EDTA
Tris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan
U Unit
V Volt
vs. versus
VEGF Vascular endothelial growth factor
VEGFR Vascular endothelial growth factor receptor z. B. zum Beispiel
1 Einleitung
1.1. Hypoxie
Die Aufrechterhaltung der Sauerstoff-Homöostase ist entscheidend für die physiologischen Funktionen des Säugetierorganismus. Alle Zellen des Körpers sind auf ein ausreichendes Sauerstoffangebot angewiesen. Sinkt dieses unter jenen Wert des Sauerstoffbedarfs, so spricht man von Hypoxie. Sie bezeichnet demnach einen Sauerstoffmangel im Gewebe oder arteriellen Blut. Dieser Zustand lässt sich auf verschiedene Ursachen zurückführen. Die hypoxämische Hypoxie, charakterisiert durch einen verminderten Sauerstoffpartialdruck (pO2), zeigt sich bei respiratorischer Insuffizienz oder Aufenthalt in großen Höhen. Die ischämische Form ist auf eine verminderte Gewebeperfusion zurückzuführen, wie sie etwa in Folge einer Herzinsuffizienz auftritt. Weitere Formen der Hypoxie sind die anämische, einhergehend mit reduzierter Transportkapazität des Hämoglobins oder verminderter O2- Bindungskapazität sowie die zytotoxische, welche beispielsweise ausgelöst durch Zellgifte wie Cyanid zur Blockierung der Atmungskette führt. Der Abfall des Sauerstoffpartialdruckes wird von peripheren und zentralen Chemorezeptoren registriert und resultiert systemisch in einem gesteigerten Atemantrieb (PRABHAKAR und KLINE 2002). Auf molekularer Ebene führt Sauerstoffmangel der Zelle zur Stabilisierung und Aktivierung des Hypoxie- induzierbaren Faktors-1 (HIF-1) (WANG et al. 1995). HIF-1 ist ein Transkriptionsfaktor, der als Antwort auf einen vorliegenden Sauerstoffmangel die Expression verschiedener Gene induziert, welche die Sauerstoffverfügbarkeit im Organismus verbessern. Dies erstreckt sich auf Zielgene der Erythropoiese wie Erythropoietin (EPO), Vaskularisierung und Angiogenese wie den Vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), aber auch im
Energiemetabolismus relevante Gene wie den Glucose-Transporter-1 (GLUT-1) und die Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase-1 (PDK-1). Somit bewerkstelligt HIF-1 die Adaptation der Zelle an einen erniedrigten Sauerstoffpartialdruck.
1.2 Hypoxie induzierbarer Faktor 1 1.2.1 Struktur von HIF-1
HIF-1 ist ein heterodimerer Transkriptionsfaktor bestehend aus einer - (120 kDa) und β -(91- 94 kDa) Untereinheit (WANG und SEMENZA 1993 und 1995). Die HIF-1β-Untereinheit ist ein ubiquitäres, nicht sauerstoffabhängiges Protein. Es wird gemäß seiner Entdeckung auch aryl-hydrocarbon-receptor-nuclear-translocator (ARNT) genannt und konstitutiv exprimiert.
HIF-1 hingegen ist streng sauerstoffreguliert (WENGER 2002). Beide Untereinheiten gehören zur Gruppe der basic helix-loop-helix (bHLH) PAS Proteine (WANG et al. 1995).
Die bHLH-Domäne am N-Terminus des Proteins ermöglicht die Bindung von HIF-1 an die hypoxia responsive elements (HRE) seiner Zielgene. Die sich anschließende PAS-Domäne dient der Dimerisierung beider Untereinheiten. PAS bezeichnet die Proteine Per, ARNT, und Sim, die initial entdeckten Vertreter dieser Proteinfamilie. Es folgen die N- und C-terminale oxygen-dependent degradation domain (ODDD). Sie beinhalten die Proline 402 und 564, welche unter normoxischen Bedingungen der Hydroxylierung zugänglich sind und somit die Instabilität der HIF-1 -Untereinheit bedingen. Die C-terminale transaktivierende Domäne (C- TAD), welche eigens der -Untereinheit angehört, ermöglicht die Bindung der Koaktivatoren p300 und CBP (CREB bindendes Protein) an den HIF-1 Komplex. Die N-terminale transaktivierende Domäne der -Untereinheit überschneidet sich teilweise mit der ODDD.
Zudem wurden für HIF-1 zwei nuclear localization signals (NLS) identifiziert. Zum einen
NLS-N in der bHLH Domäne gelegen, zum anderen NLS-C, welches sich in der C-terminalen regulierenden Domäne findet (KALLIO et al. 1998). Der strukturelle Aufbau von HIF-1 ist in Abb. 1 dargestellt.
Abb. 1: Domänenstruktur von HIF-1 . Das sauerstoffabhängige Protein HIF-1 beinhaltet verschiedene Domänen. Die bHLH-(bascic-helix-loop-helix) Domäne ermöglicht die Bindung von HIF-1 an die HREs (hypoxia responsive elements) seiner Zielgene. Die sich anschließende PAS-(Per, ARNT, Sim) Domäne dient der Dimerisierung mit HIF-1β. Die Prolinreste 402 und 564 (P402 und P564) die durch Prolyl-4-Hydroxylase- Domäne-Enzyme hydrxoyliert werden, befinden sich in der ODDD (oxygen-dependent degradation domain).
Die C-terminale transaktivierende Domäne (C-TAD) erlaubt die Bindung der Koaktivatoren p300 und CBP (CREB bindendes Protein). Die N-terminale transaktivierende Domäne (N-TAD) überschneidet sich zum Teil mit der ODDD.
Neben HIF-1 existieren noch zwei weitere Orthologe: HIF-2 und HIF-3 . Beide gehören den bHLH-PAS-Proteinen an. HIF-2 zeigt strukturelle Ähnlichkeit zu HIF-1 . Ursprünglich wurde es auch Endotheliales PAS-Domäne Protein-1 (EPAS-1) genannt, da es zuerst in Endothelzellen beschrieben wurde (TIAN et al. 1997) sowie HIF-ähnlicher Faktor (HLF) (EMA et al. 1997) oder auch HIF-verwandter Faktor (HRF) (FLAMME et al. 1997). HIF-2 wird in den meisten Geweben des Säugetierorganismus exprimiert mit höchstem Proteinlevel in Plazenta, Lunge und Herz. HIF-2 dimerisiert ebenfalls mit der HIF-1β-Untereinheit und wirkt in der adaptiven hypoxischen Genregulation mit (EMA et al. 1997, FLAMME et al.
1997, TIAN et al. 1997) In einer Studie von HU und Mitarbeitern (1997) konnten gemeinsame Zielgene von HIF-1 und HIF-2 ausfindig gemacht werden. Die Rolle von HIF-3 ist bisher weitgehend unklar. Es gibt Hinweise, dass es sich um einen Negativ- Regulator der hypoxisch-induzierten Genexpression handeln könnte (MAKINO et al. 2001).
1.2.2 Regulation von HIF-1
Die Regulation von HIF-1 erfolgt anhand seiner -Untereinheit in Abhängigkeit vom pO2 der Zelle. Unter normoxischen Bedingungen ist die -Untereinheit instabil und wird umgehend durch proteasomale Degradation beseitigt (WANG et al. 1995, HUANG et al. 1998, YU et al.
1998). Dieser Vorgang wird über die Prolyl-4-Hydroxylase-Domäne-Enzyme (PHD1-3) vermittelt. Nach Hydroxylierung der Prolinreste Pro-402 und Pro-564 kann HIF-1 an den Tumorsupressor von-Hippel-Lindau-Protein (pVHL) binden (MAXWELL et al. 1999). Dies ist ein Bestandteil des E3-Ubiquitin-Protein-Ligase-Komplexes, welcher HIF-1 poly- ubiquitiniert (COCKMAN et al. 2000, KAMURA et al. 2000, OOH et al. 2000), wodurch es für die Degradation im Proteasom zugänglich gemacht wird und somit unter normoxischen Bedingungen kaum detektierbar ist (MAXWELL et al. 1999). Zudem wird die HIF-1 Aktivität durch den sauerstoffabhängigen factor inhibiting HIF-1 (FIH-1) kontrolliert. Diese Asparaginylhydroxylase bewerkstelligt die Hydroxylierung des Asparaginrestes in der C- TAD von HIF-1 , wodurch der transkriptionelle Koaktivator p300 nicht mehr an HIF-1 gebunden werden kann (MAHON et al. 2001, HEWITSON et al. 2002, LANDO et al. 2002).
Unter hypoxischen Bedingungen hingegen kommt es zu einer Stabilisierung und Aktivierung von HIF-1 JEWELL et al. 2001). Hierbei wird die Hydroxylierung durch die PHD`s infolge des Mangels an molekularem Sauerstoff geblockt. Die HIF-1 -Untereinheiten akkumulieren und gelangen in den Zellkern, wo sie mit der HIF-1β-Untereinheit dimerisieren. Nach Rekrutierung der Koaktivatoren CBP/p300, kann HIF-1 in seiner komplexen Form an HREsbinden und die Transkription der Zielgene induzieren. Die Regulation von HIF-1 ist schematisch in Abb. 2 dargestellt.
Abb. 2: Regulation von HIF-1 unter Hypoxie und Normoxie, modifiziert nach WENGER, FASEB J. 2002 Unter hypoxischen Bedingungen erfolgt eine Stabilisierung und Aktivierung von HIF-1 . Es akkumuliert, gelangt in den Zellkern und heterodimerisiert mit der HIF-1β-Untereinheit. Durch Bindung der Koaktivatoren CBP (CREB bindendes Protein) und p300 wird die Expression verschiedener Gene ausgelöst, wie z. B.
Erythropoietin (EPO), der Vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF), der Glukosetransporter-1 (GLUT- 1) und glykolytische Enzyme. Normoxische Bedingungen führen zur Hydroxylierung von HIF-1 mittels spezifischer PHD (Prolyl-4-Hydroxylase-Domäne-Enzyme). Dies ermöglicht die Bindung von HIF-1 das pVHL (von-Hippel-Lindau-Protein), ein Bestandteil des E3-Ubiquitin-Protein-Ligase-Komplexes, welcher HIF- 1 poly-ubiquitiniert und es damit der Degradation im Proteasom zugänglich macht.
1.2.3 PHD - „Sauerstoffsensoren“
Die proteasomale Degradation der HIF-1 Untereinheit wird durch die verschiedenen Isoformen der Prolyl-4-Hydroxylase-Domäne-Enzyme (PHD) vorbereitet. Dies umfasst die Isoformen PHD1, PHD2 und PHD3, welche auch HIF-Prolyl-Hydroxylasen (HPH1-3) genannt werden (BRUICK et al. 2001, EPSTEIN et al. 2001). Sie gehören zur Enzymklasse der 2-Oxoglutarat-Dioxygenasen und benötigen als Substrat Fe2+, 2-Oxoglutarat sowie
Ascorbat (SCHOFIELD und RATCLIFFE 2004) und werden in den meisten Geweben des Organismus differentiell exprimiert. Es zeigen sich zum Beispiel explizit hohe PHD1-Level im Hoden, auffallend hohe PHD3-Level hingegen einzig im Herzen (LIEB et al. 2002, ROHRBACH et al. 2005, STIEHL et al. 2006). METZEN et al. beschreiben unterschiedliche Zellkompartimente für das Vorkommen der PHD. Während PHD1 vorwiegend im Kern zu finden ist, sind PHD2 und PHD3 überwiegend im Zytoplasma lokalisiert. Eine Schlüsselrolle unter den HIF-1 degradierenden PHD´s wird der PHD2 zugesprochen (BERRA et al. 2003).
Während systemische PHD2 Knockout-Mäuse in der Embryonalentwicklung sterben, sind jene des PHD1- und PHD3-Knockouts überlebensfähig (TAKEDA et al. 2006). PHD1 und PHD3 Knockout-Mäuse sind eher durch phänotypische Veränderungen auf organspezifischer Ebene charakterisiert. Mäuse mit PHD1-Knockout zeigen einen verminderten O2-Verbrauch im Skelettmuskel durch Umschaltung im Glucosemetabolismus von oxidativer auf anaerobe ATP-Gewinnung (ARAGONÉS et al. 2008). In PHD3 Knockout-Mäusen finden sich Anomalitäten in der sympathoadrenalen Entwicklung sowie ein reduzierter systemischer Blutdruck (BISHOP et al. 2008). Studien an induzierbaren PHD2-Knockout-Mäusen belegen Veränderungen in Bezug auf Angiogenese und Erythropoiese und geben Hinweise zur Ausprägung einer dilatativen Kardiomyopathie sowie vorzeitigem Tod der adulten Mäuse (TAKEDA et al. 2007 und 2008, MINAMISHIMA et al. 2008).
PHD1 und PHD2 hydroxylieren HIF-1 sowohl am Pro-402 als auch am Pro-564. PHD3 hingegen vermag einzig Pro-564 zu hydroxylieren. Ein weiterer Vertreter der Prolyl-4- Hydroxylase-Enzyme-Domäne mit letztlich ungeklärter physiologischer Bedeutsamkeit ist die PHD 4. OEHME et al. (2002) konnten in vitro eine Senkung der HIF-Aktivität nachweisen
einhergehend mit Hydroxylierung an den Prolinresten 402 und 561. Im Gegensatz zu den übrigen PHD ist die PHD4 dem endoplasmatischen Retikulum assoziiert.
Die Eignung der PHD als „Sauerstoffsensoren“ wird durch ihre Enzymkinetik deutlich. Der KM-Wert dieser Enzyme für O2 liegt nur geringfügig über jener O2-Konzentration der Luft auf Meereshöhe (HIRSILÄ et al. 2003). Somit wird bereits durch geringe Abweichungen in der Sauerstoff-Homöostase eine transkriptionelle HIF-1-Antwort auf das hypoxische Geschehen eingeleitet, da die PHD in ihrer enzymatischen Wirkung beeinträchtigt sind. Die im endoplasmatischen Retikulum lokalisierten und ebenfalls von HIRSILÄ et al. (2003) untersuchten Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylasen weisen einen viel geringeren KM-Wert für O2
auf und sind demnach nicht als ideale „Sauerstoffsensoren“ anzusehen. Der bereits oben erwähnte FIH-1 zählt ebenso wie die PHD1-3 zur Gruppe der 2-Oxoglutarat-Dioxygenasen und benötigt Sauerstoff und Fe2+. Sein KM-Wert für O2 liegt jedoch unterhalb jenem KM-Wert der Prolyl-4-Hydroxylasen (KOIVUNEN et al. 2004). Somit resultiert eine Verminderung der O2-Konzentration zunächst in einer Absenkung der PHD-Aktivität und erst im Folgenden, bei weiterer Abnahme der O2-Verügbarkeit, kommt es zum Erliegen der FIH-1 Aktivität.
1.2.4 Zielgene von HIF-1
HIF-1 induziert mehr als einhundert Zielgene (WENGER et al. 2005). Ihnen gemein sind die Interaktionen im Sauerstoffhaushalt und Zellmetabolismus, sowie die Beteiligung an Apoptosevorgängen zur Adaptation an einen erniedrigten pO2. Zwei sollen an dieser Stelle beschrieben werden, um die zentrale Rolle von HIF-1 im hypoxischen Geschehen aufzuzeigen. HIF-1 wird unter Hypoxie in allen kernhaltigen Zellen exprimiert und bindet unter diesen Umständen in seiner komplexen Form an die HBS (HIF-1 binding sites) der HREs (hypoxia responsive element) seiner Zielgene.
HIF-1 wurde 1992 im Rahmen von EPO-Studien entdeckt. In diesen Studien am EPO-Gen wurde ein Transkriptionsfaktor-Komplex, der unter Hypoxie vermehrt an regulatorische Elemente der DNA bindet und die Transkription des EPO-Gens einleitete, identifiziert (WANG und SEMENZA 1992 und 1995). EPO ist ein Glykoprotein-Hormon, welches beim Erwachsenen nach Abfall des intrarenalen pO2 hauptsächlich in den peritubulären Fibroblasten der Niere (MAXWELL et al. 1993) und bei starker Anämie auch in den Hepatozyten sowie in den perisinusoidalen Ito-Zellen exprimiert wird (MAXWELL et al.
1994, ECKHARDT et al. 1996). Via Blutbahn gelangt es ins Knochenmark, bindet dort an seine Rezeptoren und stimuliert die Proliferation und Differenzierung von erythroiden Progenitorzellen (JELKMANN 2004). Dies führt letztlich zur Erhöhung der peripheren Erythrozytenzahl, was wiederum zur Steigerung der Sauerstofftransportkapazität führt und damit langfristig die Sauerstoffversorgung im Gewebe verbessert. Zudem konnte in Studien an kardialem und neuronalem Gewebe eine antiinflammatorische, antiapoptotische sowie antioxidative Wirkung von EPO nachgewiesen werden (CALVILLO et al. 2003, EHRENREICH et al. 2004). Der therapeutische Einsatz von rekombinantem EPO findet sich vor allem in der Versorgung von niereninsuffizienten Patienten, bei denen die Erythropoiese beeinträchtigt ist.
VEGF, als ein wichtiges Zielgen von HIF-1, spielt eine zentrale Rolle für die Angiogenese und Neovaskularisation. Der Wirkungskreis von VEGF erstreckt sich dabei eher auf lokale hypoxische Zustände, nicht auf systemische wie im Falle der EPO-Synthese. Angiogenese kommt in gesundem Gewebe jedoch nur während der Embryogenese vor bzw. beim Erwachsenen im Endometrium (FOLKMAN und SHING 1992, GARGETT und ROGERS 2001) und während der Wundheilung (FOLKMAN 1995, ROSEN 2002). Pathologisch
kommt der Angiogenese eine entscheidende Rolle bei der Tumorentstehung zu, da erst mit dem Anschluss an das Gefäßsystem der Transport für Nährstoffe in dem Tumorgewebe bewerkstelligt ist und auch die Möglichkeit zur Ausbreitung gegeben ist (FOLKMAN 1995).
Im Gegensatz zu EPO steigert VEGF nicht nur die Sauerstoffverfügbarkeit im Organismus, sondern gleichzeitig die Bereitstellung von Nährstoffen. FORSYTHE et al. (1996) konnten in hypoxischen Zellen eine gesteigerte VEGF-Expression in Abhängigkeit von HIF-1 nachweisen. Auf einen hypoxischen oder hypoglykämischen Stimulus hin wird, vermittelt über HIF-1, die VEGF-Expression gesteigert. VEGF agiert dabei über seine Rezeptoren VEGFR-1 und VEGFR-2 in den Endothelzellen (JAKEMAN et al. 1992). Darüber hinaus steigert VEGF die Gefäßpermeabilität, wodurch ihm eine wichtige Rolle im Zuge inflammatorischer Prozesse zukommt (LEUNG et al. 1989, DVORAK et al. 1995).
1.2.5 HIF-1 Knockout-Mäuse und die Bedeutung von HIF-1 während der Embryogenese
Zur Erhaltung der Sauerstoff-Homöostase im Organismus bedarf es eines komplexen Systems, welches die adäquate Sauerstoffverfügbarkeit stetig gewährleistet. HIF-1 gilt als Schlüsselregulator der adaptiven hypoxischen Genregulation sowohl aus physiologischer als auch aus pathophysiologischer Sicht (SEMENZA 2000).
Bereits während der Embryonalentwicklung ist HIF-1 essentiell. Homozygote HIF-1 Knockout-Mäuse sterben während der Embryonalentwicklung infolge vaskulärer Defekte (IYER et al. 1998, RYAN et al. 1998). Diese HIF-1 -/--Mäuse zeigen nach anfänglich normaler Vaskulogenese eine Regression selbiger ab dem Tag 9 der Embryonalentwicklung (IYER et al. 1998). Zudem weisen sie kardiovaskuläre Fehlbildungen sowie
Neuralrohrdefekte auf und sterben schließlich am Tag 11 der Embryonalentwicklung (IYER et al. 1998, KOTCH et al. 1999). HIF-1 +/+ Mäuse zeigen eine gesteigerte HIF-1 -Expression zwischen E8.5 und E9.5, zeitlich einhergehend mit den beginnenden Fehlentwicklungen in den HIF-1 -/- (IYER et al. 1998). Diese Darlegungen demonstrieren die essentielle Bedeutung von HIF-1 während der Embryogenese. HIF-1 +/--Mäuse sind lebensfähig, entwickeln sich normal und sind unter Ruhebedingungen nicht von ihren HIF-1 +/+ Wurfgeschwistern zu unterscheiden (YU et al. 1999). KRISHNAN et al. (2008) konnten in HIF-1 - kardiomyozyten-spezifischen Knockout-Mäusen eine embryonale Letalität nachweisen, die sich zwischen E11 und E12 zeigte und die Notwendigkeit von HIF-1 für die kardiale Entwicklung aufzeigt.
Neben den existentiellen Aufgaben von HIF-1 in der embryonalen Entwicklung erstreckt sich das Wirkungsfeld auf postnatale generelle physiologische und pathophysiologische Regulationen hinsichtlich der Adaption an hypoxische Zustände. So zeigen sich seine zytoprotektiven Effekte über die Regulation seiner Zielgene, indem es einerseits den Sauerstoffverbrauch senkt und andererseits die Sauerstoffzufuhr steigert (WENGER 2002).
HIF-1 stimuliert dabei sowohl die Erythropoiese zur Erhöhung der Sauerstofftransportkapazität im Blut als auch Angiogenese und Vaskularisierung, was sich hinsichtlich lokaler Sauerstoff- und Nährstoffversorgung positiv auswirkt, als auch einen Einfluss auf das Zellwachstum ausübt.
1.3 Der Herzmuskel
Der Herzmuskel befördert als „zentrale Pumpe“ unseres Körpers das Blut in alle Gewebe und Areale des Körpers. Dadurch ist im gesunden Organismus die ausreichende Versorgung aller
Zellen mit Sauerstoff und Nährstoffen sowie der Abtransport von Stoffwechselprodukten gewährleistet. Die quergestreifte Herzmuskulatur ist durch ein sogenanntes funktionelles Synzytium charakterisiert. Die einzelnen Kardiomyozyten stellen als Zellverband und im Hinblick auf die Kontraktion des gesamten Herzens eine funktionelle Einheit dar. Die Herzmuskelzellen verlaufen parallel und sind über die Disci intercalares an ihren Enden sowohl mechanisch (Desmosomen) als auch kommunikativ (Gap Junctions) verknüpft. Diese Strukturen dienen zum einen der elektrischen Erregungsleitung (Gap Junctions) und zum anderen der mechanischen Kraft-Übertragung (Desmosomen) von Zelle zu Zelle.
1.3.1 Aufbau und Struktur der Herzmuskelzelle
Die Herzmuskelzellen enthalten typischerweise einen Kern, seltener auch zwei Zellkerne und sind von einer sarkolemmalen Membran (Sarkolemm) umgeben. Das Sarkolemm trennt den Intrazellular- vom Extrazellularraum. Es ist eine Lipiddoppelschicht-Membran, in die verschiedene Proteine integriert sind, welche für die Zellkommunikation, explizit bei der elektromechanischen Kopplung, aber auch für Signaltransduktionswege und Elektrolytausgleiche, von Bedeutung sind. Dabei handelt es sich um Proteine, wie den L-Typ- Ca2+-Kanal (LTCC), den Natrium-Calcium-Austauscher (NCX), aber auch Na+/K+-Pumpen, auf die später im Rahmen der elektromechanischen Kopplung noch eingegangen wird. Das Sarkolemm bildet in die Zelle vordringende transversale Einstülpungen (T-Tubuli), welche nahe dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) der Zelle lokalisiert und diesem funktionell assoziiert sind. Das sarkoplasmatische Retikulum ist ein spezialisiertes endoplasmatisches Retikulum der Muskelzellen. Es wird aufgrund seiner Längsausrichtung in der Herzmuskelzelle, auch als Longitudinal (L-)Tubuli bezeichnet, endet blind und läuft in die sogenannten Terminalzisternen aus. Diese räumliche Assoziation der Terminalzisternen an
die T-Tubuli bezeichnet man auch gemäß ihrer funktionalen Einheit als Diadenstruktur (BERS 2001). Dem SR kommen als Hauptaufgaben die Speicherung und Freisetzung von Calciumionen (Ca2+) zu, welche eine zentrale Rolle im Verlauf der Kontraktion spielen. In der Membran des SR sind zwei funktionelle Proteine integriert: Der Ryanodin-Rezeptor (RyR), ein Ca2+-Ausschüttungskanal erhielt seine Bezeichnung basierend auf seiner hohen Affinität zu dem Alkaloid Ryanodin. RyR finden sich auch im Skelettmuskel und Gehirn. Man unterscheidet drei Isoformen. Die im Herzen am häufigsten vorkommende ist der RyR vom Typ 2 (RyR2). RyR1 ist vor allem im Skelettmuskel exprimiert, RyR3 ist nicht sonderlich gewebespezifisch, aber vermehrt im Gehirn zu finden. Die RyR2 sind vorrangig im Bereich der Terminalzisternen lokalisiert (FRANZINI-ARMSTRONG et al. 1999). Dort sind sie in Gruppen arrangiert, wo etwa 100 RyR 10 bis 25 L-Typ-Ca2+-Kanälen gegenüberstehen.
Durch diese funktionelle Einheit erhielten diese Gruppierungen die Bezeichnung „Couplon“
(MAIER UND BERS 2007). Das zweite membranständige Protein im SR ist eine Ca2+- ATPase (SERCA-2a). Die SERCA-2a bewerkstelligt die diastolische Ca2+-Wiederaufnahme aus dem Zytosol in das SR, wodurch die Relaxation ermöglicht wird. Es gibt verschiedene Isoformen mit gewebespezifischer Expression. Im Herzmuskel wird ausschließlich die SERCA-2a exprimiert. Der SERCA-2a ist räumlich das Phospholamban (PLB) assoziiert, ihr reversibel phosphorylierbares Regulatorprotein. Weitere Strukturelemente der Herzmuskelzelle sind ihre kontraktilen Proteine, die Myofilamente, welche aufgrund ihre Anordnung bzw. Verteilung der Herzmuskulatur ihre Querstreifung verleihen. Die kleinste funktionale kontraktile Einheit der Herzmuskelzelle ist das Sarkomer. Die Sarkomere sind untereinander durch die sogenannten Z-Scheiben voneinander abzugrenzen. Sie messen in Ruhelänge etwa 2 µm und beinhalten die dicken und dünnen Myofilamente, welche während der Kontraktion ineinander gleiten und eine Sarkomerverkürzung hervorrufen. Die Länge der
Myofilamente selbst bleibt, unabhängig von Kontraktion oder Relaxation, stets unverändert, lediglich das Sarkomer verkürzt oder verlängert sich. Das sogenannte dicke Filament, welches die A-Bande ausmacht, besteht hauptsächlich aus Myosin sowie dem Protein C und Titin.
Myosin besteht aus vielen aneinander gelagerten Myosinmolekülen mit den Myosinköpfchen als interagierende Querverbindungen zum dünnen Filament. Das „Riesenmolekül“ Titin funktioniert dabei als elastische Feder. Es stellt die Verbindung zur Z-Scheibe dar, verbindet die Aktin- und Myosinfilamente und vermittelt somit einen strukturellen Zusammenhalt ohne ein Ineinandergleiten der Filamente zu behindern. Die Verankerung von Titin in der Z- Scheibe verhindert ein Zerfallen der Sarkomere in der Dehnungsphase, wodurch ihm stabilisierende Funktionen zugesprochen werden. Die Anordnung der Myofilamente ruft unterschiedliche Brechungsmodi im polarisierten Licht hervor, es entstehen Einfach- und Doppelbrechungseffekte. Gemäß ihrer Eigenschaft im polarisierten Licht werden sie als A (anisotropisch)- oder I (isotropisch)-Banden bezeichnet. Die I-Banden repräsentieren die dünnen Filamente und bestehen aus doppelsträngigen Aktinpolymeren, welche das Tropomyosin und den Troponin-Komplex enthalten. In der Z-Bande sind die dünnen Filamente mit verschiedenen Cytoskelett-Proteinen ( -Actinin, β-Actinin, Nebulett, Desmin) verbunden. Eine visuelle Darstellung der beschriebenen Strukturen zeigt Abb. 3.
Neben den genannten strukturellen Elementen darf ein Funktionsträger der kardialen Kontraktilität nicht unerwähnt bleiben - das Ca2+, welches eine Schlüsselrolle im Kontraktionsverlauf einnimmt. Diese zentrale Rolle der Ca2+-Ionen soll im folgenden Kapitel näher beschrieben und erläutert werden.
Abb. 3: Ultrastruktur einer kontrahierenden Herzmuskelzelle. KATZ (2006): Physiology of the heart.
1.3.2 Die Rolle von Ca2+ für die Herzmuskelkontraktion
Ca2+ spielt eine zentrale Rolle im Verlauf der Kontraktion und im Rahmen der elektromechanischen Kopplung (engl. excitation-contraction coupling – ECC). Diese dient der Umwandlung elektrischer Energie eines Aktionspotentials in mechanische Energie, welche vermittelt durch Ca2+ in einer Kontraktion der Herzmuskelzelle resultiert. Dazu im Folgenden nähere Erläuterungen.
Die Depolarisation des Sarkolemms führt zur Öffnung der spannungsabhängigen L-Typ Ca2+- Kanäle. Hierbei strömt extrazelluläres Ca2+ in die Herzmuskelzelle, welches für die typische Plateauphase des myokardialen Aktionspotentials verantwortlich ist. Getriggert durch diesen Ca2+-Influx öffnet sich der RyR2 des SR und zusätzliches Ca2+ strömt aus dem terminalen SR
in das Zytosol (Ca2+ getriggerte Ca2+-Freisetzung) (BERS 2002). Die Ca2+-Ionen können nun mit den kontraktilen Elementen der Herzmuskelzelle interagieren und die Kontraktion herbeiführen. Dieser Ca2+-Anstieg induziert die Aktin-Myosin-Verbindung in den Myofibrillen und löst die Kontraktion des Herzmuskels aus. Ca2+ bindet dabei an die Ca2+- Bindungsstelle des Troponin C. Dies resultiert in einer Konformationsänderung am Troponinmolekül und einer Lageänderung des Tropomyosins im Aktinfilament. Somit sind die Bindungsstellen für die Myosinköpfchen freigelegt und die Filamente können ineinander gleiten. Das Gleiten der Filamente ist durch die Querbrückenbildung des Myosinköpfchens und dem Aktin charkterisiert. Die Myosinköpfchen vollführen unter ATP-Verbrauch eine krafterzeugende Rotationsbewegung und durch wiederholte Querbrückenbildung verkürzt sich das Sarkomer. Dieser Querbrückenzyklus wiederholt sich bis zur Erschöpfung der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Nach Abdiffundieren der Ca2+-Ionenstellt sich wieder der inhibitorische Effekt des Troponin-Tropomyosin-Komplexes ein. Das Myosinköpchen löst sich unter ATP-Verbrauch vom Aktinstrang, die Zelle relaxiert. Das freigewordene Ca2+ muss nun aus dem Zytosol befördert werden. Dies erfolgt zu einem geringen Teil über den NCX.
Im Wesentlichen wird die Ca2+-Extrusion jedoch über die SERCA-2a moduliert. Diese verliert durch Phosphorylierung ihres Regulatorproteins PLB ihre inhibitorische Funktion aus der Kontraktionsphase und kann nun in der Relaxationsphase die Ca2+-Wiederaufnahme in das SR bewerkstelligen. Das wiederaufgenommene Ca2+ steht in der Folge für eine erneute Kontraktion zu Verfügung. Die geschilderten Abläufe sind in Abb. 4 veranschaulicht.
Abb. 4: Ca2+-Transport in ventrikulären Kardiomyozyten. Modifiziert nach BERS: Cardiac excitation- contraction coupling (2002)
Nach Depolarisation der Membran kommt es zum Ca2+-Einstrom (ICa), welcher die Ca2+ getriggerte Ca2+- Freisetzung aus dem SR (rote Pfeile) über den RyR bewirkt. Ca2+ bindet an die Myofilamente und löst die Kontraktion des Kardiomyozyten aus. Während der Relaxation wird das vom Troponin C abdiffundierte Ca2+ im Wesentlichen über die SR-Ca2+-ATPase in das SR befördert, zusätzlich über den NCX aus der Zelle extrudiert und zu einem geringsten Teil in das Mitochondrium transportiert (grüne Pfeile). SR = sarkoplasmatisches Retikulum, RyR = Ryanodin-Rezeptor, NCX = Na+-Ca2+-Austauscher, ATP = Ca2+-ATPase des SR, PLB = Phospholamban. Im Kasten ist die Beziehung von Aktionspotential (AP, schwarz), intrazellulärer Ca2+- Konzentration ([Ca]i, blau) und Kontraktion veranschaulicht.
1.4 Die kardiale Anpassung an mechanische Last 1.4.1 Mechanische Last am Herzen
Grundsätzlich werden zwei Formen der mechanischen Last am Herzen unterschieden. Die sogenannte Vorlast führt durch eine gesteigerte diastolische Füllung zu einer erhöhten Volumenbelastung des rechten Ventrikels. Dies resultiert in einer verstärkten Vordehnung des Myokards, die Wandspannung steigt und reguliert über den Frank-Starling-Mechanismus, erfolgt eine Zunahme des Schlagvolumens.
Die Nachlast bezeichnet den Auswurfwiderstand gegen den das Herz anpumpen muss.
Hierbei steigt z. B. infolge einer Aortenstenose die Druckbelastung für den linken Ventrikel.
Während der Systole muss das Blut gegen einen erhöhten Widerstand in den Kreislauf gepumpt werden. Die hierfür zusätzlich erforderliche Kontraktionskraft geht vorerst zu Lasten des Schlagvolumens, wodurch das Restvolumen im Ventrikel ansteigt. Im weiteren Verlauf ergibt sich durch das erhöhte Residualvolumen, im Sinne einer Vorlast, eine Zunahme des enddiastolischen Füllungsdruckes, der wiederrum das Schlagvolumen anhebt, jedoch dem Herzen eine Leistung auf höherem Druckniveau abverlangt.
Anhaltende Volumen- bzw. Druckzunahmen des Herzen veranlassen jenes sich den geänderten Bedingungen anzupassen. In beiden Fällen der mechanischen Belastung kommt es daher als Antwort auf die chronische Mehrbelastung zu makroskopischen und mikroskopischen Umbauvorgängen der kardialen Strukturen (Remodeling).
1.4.2 Physiologische und pathologische Myokardhypertrophie
Die Myokardhypertrophie ist das Resultat einer Leistungssteigerung des Herzmuskels und durch eine Volumenzunahme der Kardiomyozyten charakterisiert. Die „physiologische“
Myokardhypertrophie unterscheidet sich von der „pathologischen“ durch eine adaptierte kardiale Gefäßdichte und somit einer optimalen Sauerstoffversorgung des Herzmuskels.
Dieser Zustand findet sich im physiologischem postnatalem Herzwachstum wieder, als auch beim sogenannten „Leistungs“- oder „Sportlerherz“, ausgelöst durch körperliches Training:
Das beanspruchte Herz wird mit einer Form der Hypertrophie reagieren, die in Anlehnung an die gesteigerte Belastung eine Vergrößerung der Kardiomyozyten forciert und im gleichen Zuge die Vaskularisierung adaptiert (physiologische Hypertrophie). Bei der pathologischen Myokardhypertrophie hingegen, wie sie im Rahmen einer anhaltenden gesteigerten
mechanischen Last auftritt, beispielsweise durch Aortenstenose oder Hypertonie hervorgerufen (Nachlast), bleibt die Anpassung der Gefäßdichte aus. Das Herz ist bestrebt die Versorgung des Organismus auf einem konstanten Niveau zu halten und bewerkstelligt die Mehrbelastung zunächst über eine gesteigerte Muskelmasse. Hierbei greift der Mechanismus des LAPLACE-Gesetzes, durch welches sich der transmurale Druck (p) in Abhängigkeit von Wandspannung (k), Wanddicke (d) und Radius (r) eines Hohlorgans beschreiben lässt.
LAPLACE-Gesetz:
𝑝 =
2dkrFormel 1
Es verdeutlicht den Zusammenhang von Wandspannung und Hypertrophie des Herzens als Antwort auf einen erhöhten transmuralen Druck: Steigt der Druck im Herzen (p) an, tut dies auch die Wandspannung (k), folglich reagiert das Herz mit einer zunehmenden Wanddicke (d) (Hypertrophie) um diesen Bedingungen gerecht zu werden bzw. der steigenden Druckbelastung entgegenzusteuern, indem es diese auf eine größere Fläche des Myokards verteilt. In späteren Stadien schließlich, mit Erreichen des sogenannten „kritischen Herzgewichtes“, kann diese zunächst kompensatorische Hypertrophie nicht mehr unterhalten werden und geht mit dem Anhalten der chronischen Belastung in die Dekompensation über, da eine angemessene Sauerstoff- und Nährstoffversorgung durch adäquate Kapillarisierung des Myokards nicht gewährleistet werden kann. Zum einen geht die Zunahme der Herzmuskelmasse mit einem gesteigerten Sauerstoffbedarf einher, zusätzlich entstehen durch Ausdehnung des Zellvolumens verlängerte Diffusionsstrecken, die das Sauerstoffangebot ebenfalls limitieren. Dies führt, basierend auf Minderdurchblutung und -versorgung der
Kardiomyozyten, zur Myokardischämie. Schlussendlich kommt es zur Ausprägung einer manifesten Herzinsuffizienz mit kontraktiler Dysfunktion, Arrhythmien und final zum Herzversagen. Die Entwicklung der Hypertrophie ist in Abb. 5 schematisch dargestellt.
Mechanische Belastung normales
Myokard
Zunahme der Wanddicke
Dilatation und kontraktile Dysfunktion
finales Herzversagen LV
Abb. 5: Schematische Darstellung der kardialen Hypertrophie-Entwicklung. Modifiziert nach REGITZ-
ZAGROSEK V, LEHMKUHL E, LEHMKUHL HB, aus Internist 2008.
Durch anhaltende mechanische Belastung am Herzen kommt es infolge des erhöhten Auswurfwiderstandes zu einer Zunahme der Wanddicke, um die steigende Druckbelastung zu kompensieren. Mit Erreichen des kritischen Herzgewichtes dilatiert das Herz zunehmend, was mit kontraktiler Dysfunktion und final mit dem Versagen des Herzens einhergeht.
1.4.3 Die Auswirkungen von Myokardhypertrophie und -insuffizienz auf das Ca2+-Handling der Herzmuskelzelle
Das Fortschreiten der Myokardhypertrophie führt durch Erschöpfung der kardialen Funktionsreserven zu nachhaltigen Veränderungen am Herzen und damit im chronischen Verlauf zur Herzinsuffizienz. Dies geht mit transkriptionellen und translationalen Modifikationen einher, die ihrerseits eine Beeinträchtigung der kardialen Funktion
hervorrufen. So weisen verschiedene Studien an insuffizienten Herzen unterschiedlichen Ursprungs auf eine verringerte SERCA-2a-Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene hin (FELDMANN et al. 1993, HASENFUSS et al. 1994, KISS et al. 1995, ZARAIN-HERZBERG et al. 1996, Überblick Review HASENFUSS 1998). Studien zum β- adrenerg stimulierten Phospholamban, dem Regulatorprotein der SERCA-2a, geben differente Hinweise zu dessen Expression von unveränderter bis hin zu leicht gesteigerter Expression (Überblick Review HASENFUSS 1998). Die verminderte SERCA-2a-Expression bewirkt eine unzureichende Ca2+-Elimination während der Diastole. Der Kardiomyozyt kann nicht adäquat relaxieren, demnach ist die diastolische Ventrikelfüllung eingeschränkt und die Myokardperfusion behindert. Darüber hinaus stehen in der Folge nicht genügend Ca2+-Ionen für erneute Kontraktionen bereit: In Ermangelung an Ca2+-Ionen können die Troponin C- Moleküle der kontraktilen Myofilamente nicht ausreichend besetzt werden, was in einem Verlust an Kontraktionsvermögens resultiert. Zusätzlich akkumulieren die Ca2+-Ionen im Zytoplasma, da eigens die im Zusammenhang mit der Herzinsuffizienz stehende Erhöhung der NCX-Expression (REINECKE et al. 1996, POGWIZD et al. 1999, BERS et al. 2002,) den massiv gesteigerten Anfall von Ca2+-Ionen nicht bewerkstelligen kann. Final bedingen die Ca2+-Regulationsstörungen sowohl eine diastolische als auch eine systolische Funktionsstörung. Desweiteren zieht eine intrazelluläre Ca2+-Akkumulation über das physiologische Maß hinaus toxische Wirkungen für den gesamten Zellapparat nach sich, welche je nach Ca2+-Konzentration [Ca2+] von tachy- oder bradykarden Arrhythmien, atrioventrikulären Überleitungsstörungen über Extrasystolen bis hin zu Kammerflimmern reichen. Ein weiterer die Kontraktionskraft limitierender Faktor ist die zunehmende funktionelle Entkopplung von L-Typ-Ca2+-Kanälen und deren assoziierten RyR2 (GOMEZ et al. 1997). Hierbei ist der Mechanismus der Ca2+ getriggerten Ca2+-Freisetzung behindert, was
sich in einer Kontraktilitätsabnahme wiederspiegelt. Im Weiteren kommt es durch β- adrenerge Stimulation zur Hyperphosphorylierung verschiedener Zellkomponenten, welche die kardiale Funktion nicht zwingend verbessern: Die Hyperphosphorylierung der RyR2 etwa geht mit einer veränderten Öffnungswahrscheinlichkeit dieser einher und bewirkt diastolische Ca2+-Freisetzungen aus dem SR (MARKS 2001). Dieses Phänomen trägt zur Entstehung verzögerter Nachdepolarisationen und ventrikulärer Arrhythmien aber auch zu akutem Herzversagen bei (MARKS et al. 2002a, b).
1.5 Die Bedeutung von Hypoxie für kardiovaskuläre Erkrankungen
Wie in vorangehenden Kapiteln erwähnt, bedingt eine anhaltende mechanische Belastung des Herzens kardiales Remodeling, welches seinerseits Veränderungen im Sauerstoffbedarf und - angebot nach sich zieht und auf diese Art und Weise hypoxische Zustände induziert. Auf molekularer Ebene führt Sauerstoffmangel der Zelle zur Stabilisierung und Aktivierung von HIF-1 (WANG et al. 1995). Es wird hierbei ab einer Gewebekonzentration < 4% O2 aktiviert (YU et al. 1998). Der physiologische O2-Gehaltim Myokard beträgt ca. 2%. Das bedeutet, sowohl bei geringsten Abweichungen der O2-Homöostase als auch unter normoxischen Bedingungen kommt es zu graduellen Veränderungen der transkriptionellen Antwort auf Hypoxie durch Induktion sauerstoffabhängiger Gene (SEMENZA 1999). Desweiteren kann allein durch die mechanische Belastung, als physikalischer Stimulus, eine HIF-1-Aktivierung im Herzen erfolgen (CHANG et al. 2003). Prinzipiell erfolgt die Anpassung an chronischen O2-Mangel über die Regulation von HIF-1 (SCHOFIELD und RATCLIFFE 2004). Die HIF- 1 -Expression ist im ischämischen Myokard gesteigert, was auf eine zentrale Rolle von HIF- 1 in der kardialen Anpassung an chronisch ischämische Zustände schließen lässt (LEE et al.
2000). In verschiedenen Studien wurden HIF-1 protektive Effekte im Rahmen der
Myokardischämie zugesprochen. Eine durch siRNA gegen PHD2 ausgelöste HIF-1 - Stabilisierung begrenzte im Mausmodell den Reperfusionsschaden nach Myokardischämie (NATARAJAN et al. 2006). ECKLE et al. (2008) zeigen myokardschützende Effekte nach HIF-1 -Stabilisierung mittels Dimethyloxalgycin (DMOG) sowie eine Verringerung der myokardialen Infarktgröße nach HIF-1 -Aktivierung durch PHD2-Repression via siRNA.
Reduzierte myokardiale Infarzierung konnte ebenso von KIDO et al. (2005) neben postischämisch verbesserter kardialer Funktion in HIF-1 überexprimierenden Mäusen nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen eine entscheidende Rolle für HIF-1 im Rahmen kardiovaskulärer Erkrankungen auf. Die Bedeutung von HIF-1 für die kardiale Anpassung an erhöhte mechanische Last ist in der Literatur bisher noch nicht beschrieben worden.
1.6 Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit
Myokardiale Hypertrophie kann als Folge mechanischer Last auftreten und stellt in Form der linksventrikulären Hypertrophie (LVH) einen Risikofaktor für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz dar. Die Bedeutung der Hypoxie-induzierten Genexpression für die Ausbildung einer durch mechanische Last induzierten Myokardhypertrophie ist weitgehend unklar. Ziel dieser Arbeit war es, die möglichen kardialen Effekte von HIF-1 im Rahmen einer LVH nach induzierter mechanischer Nachlast am Mausmodell zu untersuchen. Die LVH wird hierbei in Form eines Nachlastmodells induziert, dem sogenannten „Aorten-Banding“
(engl.: transverse aortic constriction, TAC). Dieses minimal invasive Operationsmodell soll anhand einer vergleichenden Studie von HIF-1 +/+- und HIF-1 +/--Mäusen Anwendung finden. Methodisch stehen hierbei echokardiographische Verlaufskontrollen, histologische
Untersuchungen sowie die Erhebung biometrischer/morphologischer Parameter im Fokus der Arbeit. Zusätzlich soll nach Isolierung ventrikulärer Kardiomyozyten mittels Epifluoreszenztechnik der Einfluss auf das Ca2+-Handling untersucht werden. Dabei werden verschiedene Zeitpunkte post operationem erfasst, um die Entwicklung der Hypertrophie sowie die mögliche Entstehung einer manifesten Herzinsuffizienz nachzuvollziehen. Im Wesentlichen lassen sich angesichts dieser Ausführungen folgende Fragestellungen ableiten:
1. Ergeben sich quantitative und qualitative Unterschiede in Bezug auf Art und Ausprägung der kardialen Hypertrophie zwischen HIF-1 +/+- und HIF-1 +/--Mäusen nach TAC?
2. Führt der Mangel an HIF-1 damit eine mögliche verminderte Expression seines Zielgens VEGF und folglich eine eingeschränkte Durchblutung der Herzmuskelmasse, zu schnellerer Dekompensation des Herzens? Finden sich in diesem Zusammenhang Unterschiede in der kardialen Gefäßdichte?
3. Welche tatsächlichen Differenzen sind bezüglich der kardialen Funktion zu ermitteln?
4. Spiegeln sich mögliche Unterschiede in der kardialen Funktion im Ca2+-Handling isolierter ventrikulärer Kardiomyozyten wieder?
2 Material und Methoden
2.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen
Die tierexperimentellen Versuche wurden gemäß §8 Absatz 1 Tierschutzgesetz vom Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Niedersachsen (LAVES) genehmigt.
Die Untersuchungen erfolgten vergleichend an HIF-1 +/-- vs. HIF-1 +/+-Mäusen. Hierbei wurden sowohl weibliche als auch männliche Geschwister miteinander verglichen. Die Bereitstellung der Mauslinie geschah freundlicherweise durch Prof. R. Johnson (University of California, USA). In den HIF-1 +/--Mäusen war das Exon zwei durch eine Neomycin- Kassette NeoR ersetzt worden.
Die Tiere wurden in der Zentralen Tierexperimentellen Einrichtung der Universitätsmedizin Göttingen gezüchtet und gehalten und in getrenntgeschlechtlichen Geschwistergruppen von bis zu fünf Tieren im IVC-Rack (Techniplast, TouchBlueLineTM) in Makrolonkäfigen vom Typ II lang untergebracht. Sie wurden auf entkeimtem sowie entstaubtem Weichholzgranulat (LIGNOCEL® FS-14, J. Rettenmaier & Söhne) gehalten und erhielten Holzwolle (TAPVEI®, PM90L/2R, Aspen Nesting Material) als Nestmaterial. Die Raumtemperatur betrug 22°C (+/- 2°C), die Luftfeuchtigkeit belief sich auf einem Wert zwischen 45-65%. Die Lichtanlagen waren auf einen künstlichen Tag-/Nacht-Rhythmus im 12 h-Intervall reguliert, wobei die Käfige während der Lichtphase (6-18 Uhr) einer Beleuchtungsstärke von 30-100 LUX ausgesetzt waren. Futter (Alleinfutter V1534-000 ssniff R/M-H, 10mm Pelletgröße, Firma ssniff Spezialdiäten GmbH) und Trinkwasser (Leitungswasser), welches zweimal wöchentlich
gewechselt wurde, standen den Mäusen ad libitum zur Verfügung. Der Käfigwechsel erfolgte einmal wöchentlich.
Die Operationen sowie die echokardiographischen Verlaufskontrollen wurden in den Operationsräumen der ZTE, die Organentnahmen in Laborräumen der Abteilung Kardiologie und Pneumologie der Universitätsmedizin Göttingen durchgeführt.
2.2 Versuchsablauf
Der Versuchsablauf gliedert sich in verschiedene Serien, in denen die Mäuse einer TAC-bzw.
Sham-Operation unterzogen wurden. Im Anschluss wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten Echokardiographien durchgeführt oder für weiterführende Untersuchungen Organe (Herz, Lunge, Leber) entnommen. Einen Überblick hierzu gibt Abb. 6.
TAC/
Sham 1
0h 1,5 Wo 3 Wo 8 Wo 11 Wo 15 Wo
Abb. 6: Verlaufsdarstellung der durchgeführten Untersuchungen
1 = Echokardiographie; 2 = Immunofluoreszenz VEGFR-2; 3 = Immunfluoreszenz CD31; 4 = Ca2+- Epifluoreszenz; 5 = Histologie; 6 = Erhebung biometrischer Daten
Die Operation wurde bei männlichen Tieren im Alter von 8-10 Wochen, bei weiblichen im Alter von 12-14 Wochen durchgeführt. Für alle Untersuchungen sind insgesamt je vier
2 3
1
5 1 6
1 4
männliche und vier weibliche Gruppen unter Beachtung der verschiedenen Genotypen und Bedingungen (Operation) gebildet worden, die jeweils zum Vergleich herangezogen wurden.
2.3 Genotypisierung der Mäuse
Zur Genotypisierung der HIF-1 +/+- und HIF-1 +/--Mäuse dienten Mausschwanzbiopsien, welche den Mäusen im Absatzalter von drei Wochenentnommen wurden. Dazu wurden mit einer sterilen Schere etwa 3-5 mm der Schwanzspitze abgeschnitten. Aus den Schwanzbiopsien wurde genomische DNA (gDNA) isoliert. Diese konnte im Anschluss mittels Polymerase-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction – PCR) amplifiziert und anschließend durch Agarose-Gelelektrophorese dargestellt werden.
2.3.1 Isolierung genomischer DNA aus Mausschwanzbiopsien
Die Mäuseschwänze wurden in autoklavierte 1,5 ml-Reaktionsgefäße verbracht und mit 600 µl Tail Lysis Buffer sowie 15 µl Proteinase K (20 mg/ml) versetzt, gut verschlossen und für 30 sec gevortext. Dieser Ansatz wurde bei 60° C im Hybridizations-Ofen über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden 200 µl NaCl (200 mM) zu dem Ansatz gegeben und nach erneutem Vortexen bei 16100 x g für 30 min bei 4° C zentrifugiert. 750 µl des gebildeten Überstandes wurden in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt, mit 450 µl Isopropanol (70%ig) versetzt, gevortext und anschließend erneut bei 16100 x g für 30 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 0,5 ml Ethanol (70%) gewaschen (Zentrifugation mit 16100 x g für 10 min bei 4° C), danach bei Raumtemperatur für 15 min luftgetrocknet, in 100 µl TE-Puffer resuspendiert und für 30 min bei 56° C erhitzt.
Die erhaltene DNA wurde in einer Verdünnung von 1:100 mit Aqua bidest. vermischt und die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm photometrisch bestimmt (Smart
SpecTM Plus Spectrophotometer, Bio Rad, München Deutschland). Die errechnete Konzentration der DNA diente als Grundlage für das Anlegen einer Stocklösung mit einer DNA-Konzentration von 40 ng/l.
Reagenzien:
Tail Lysis Buffer 200 mM NaCl
50 mM Tris/HCl pH 8,0
Proteinase K 20 mg/ml; in 50 mM Tris/Cl pH 8,0; 1 nM CaCl2
(Roth, Proteinase K ≥ 30 U/mg)
TE-Puffer 10 mM Tris/HCl pH 8,0
1 mM EDTA pH 8,0
2.3.2 PCR Amplifikation
Die PCR ist eine Methode zur zyklischen Vervielfältigung von DNA. Hierbei wird zunächst der DNA-Doppelstrang mit einer Temperatur von 95°C durch Lösung der Wasserstoffbrückenbindungen denaturiert. Die folgende Phase der Primerhydridiserung (Annealing) ermöglicht, den spezifisch ausgewählten Primern komplementär an die jeweiligen Abschnitte der nun einsträngig vorliegenden DNA zu binden. Dann werden mittels der DNA-Polymerase Nucleotide (dNTP`s) am Einzelstrang synthetisiert (Elongation), so dass am Ende der Prozedur zwei identische DNA-Doppelstänge vorliegen. Durch zyklische Wiederholung von Denaturierung, Annealing und Elongation wird die DNA exponentiell amplifiziert.
In dieser Arbeit wurde die PCR-Amplifikation mit dem Taq-Polymerase-Kit*: TITANIUMTM DNA Taq-Polymerase der Firma Clontech durchgeführt. Zur Kontrolle der Spezifität der PCR wurden jeweils eine Positiv- und Negativkontrolle mitgeführt. Nach Abschluss der PCR- Amplifikation wurde die DNA sofort weiterverarbeitet oder auf 4°C runter gekühlt.
Reagenzien und Reaktionsablauf:
PCR-Ansatz (25 µl) 19,65 µl Aqua bidest.
2,5 µl 10x Puffer*
0,5 µl dNTP`s*
0,5 µl forward Primer 0,5 µl reverse Primer 0,35 µl Taq-Polymerase*
1 µl gDNA-Template (40 ng/µl)
PCR Amplifikation Denaturierung (initial) 95°C – 2 min Denaturierung 95°C – 30 sec
Annealing 58°C – 30 sec Elongation 68°C – 40 sec Inkubation 68°C – 10 min
Primersequenzen forward Primer: 5` CCTCATGGTCACATGGATGA 3´
reverse Primer: 5´ GGAGAGGCTTTTTGCTTCCT 3`
30x
2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese
Durch die Agarose-Gelelektrophorese kann das PCR-Produkt anhand seiner Größe dargestellt werden. Hierbei bewegt sich die negativ geladene DNA in einem angelegten Spannungsfeld zum Pluspol. Entsprechend ihrer Fragmentgröße rücken kürzere Stränge in der netzartigen Struktur des Agarosegels schneller vor als längere, die DNA-Fragmente ordnen sich entsprechend ihre Größe an.
Die DNA-Fragmente wurden in dem Agarosegel (2 % in TBE-Puffer, Agarose Broad Range, Roth) unter einer Spannung von 10 V/cm in einer horizontalen Gel-Elektrophorese-Apparatur (Peqlab) aufgetrennt (TBE-Puffer). Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel in ein Wasserbad mit Ethidiumbromid (Ethidiumbromidlösung 1% (10 mg/ml), Roth) gegeben.
Ethidiumbromid interkaliert in die DNA und kann mittels UV-Licht (InGenius, Syngene, Camebridge, UK) detektiert werden. Die Größe der elektrophoretisch aufgetrennten PCR- Amplifikate kann nun durch Vergleich mit einem Marker (O’RangeRuler™, Fermentas) abgeglichen werden.
Reagenzien:
TBE-Buffer 890 mM Tris
890 mM Borsäure 20 mM EDTA, pH 8,0
2.4 TAC – Transverse Aortic Constriction
Die TAC-Operation ist ein minimal-invasiver operativer Eingriff zur Reduktion des Aortendurchmessers. Der Terminus TAC leitet sich aus dem Englischen transverse aortic
constriction ab und bezeichnet eine Verengung der Aorta transversa. Hierbei handelt es sich um ein sogenanntes Nachlastmodell, welches durch die Aortenstenose, einhergehend mit einer Drucküberlastung, der Erzeugung einer LVH dient. Die Mäuse wurden für den operativen Eingriff mit einer Kombination aus Ketamin (100 mg/kg, Ketamin 10%, medistar) und Xylazin (5 mg/kg, Xylazin 2%, Riemser) anästhesiert. Nach Erreichen des Toleranzstadiums wurde die Maus in Rückenlage auf dem Operationstisch fixiert. Die Augen wurden mit einer Salbe (Oculotect mono A Augengel®, Novartis) bedeckt, um das Austrocknen der Cornea zu verhindern. Ein Faden, hinter den Schneidezähnen des Oberkiefers befestigt, diente der Streckung des Halses. Der Operationsbereich wurde mittels Enthaarungscreme (elca® med creme, ASID BONZ) enthaart, gesäubert und anschließend mit einer Jodtinktur (Braunol®, BRAUN) versehen. Die Operation erfolgte zur besseren Darstellung der Strukturen unter stereomikroskopischer Sicht. Im Folgenden soll der Ablauf einer solchen Operation detailliert beschrieben werden.
Zunächst wurde die Haut unmittelbar kranial des Sternums ca. 0,5 cm quer zur Körpermedianen inzisiert. Die Trachea wurde durch stumpfe Präparation der distal gelegenen Muskulatur freigelegt. Entlang der Trachea, als Leitstruktur, wurden die Arteria carotis communis sowie der Truncus brachiocephalicus dargestellt. Hierbei ist es nötig das Operationsfeld durch einen ca. 3-5 mm langen Schnitt in die Oberkante des Sternums zu erweitern. Nach Erreichen der Aorta transversa wurde diese unter Verwendung einer stumpfen gebogenen Kanüle vorsichtig mobilisiert und ein nicht resorbierbarer Faden (Polyvioline®, white braided, non-absorbal, non-sterile, surgical suture, 5-0 USP, Havard Apparatus) zwischen Truncus brachiocephalicus und Arteria carotis communis unter der Aorta transversa hindurchgeführt. Im Anschluss wurde die Ligatur gesetzt, wobei eine
abgestumpfte, gebogene Injektionskanüle („Platzhalter“) zur Limitierung der Stenose in die Ligaturschlinge eingeführt wurde. Nach dem Anziehen der Ligatur wurde der „Platzhalter“
entfernt, wodurch ein standardisierter Stenosegrad erreicht worden war. Für männliche Tiere wurde eine 25G-Kanüle, für weibliche Tiere eine 26G-Kanüle in Anlehnung an den Geschlechtsunterschied bezüglich des Körpergewichtes, verwendet. Die Position für das Aortenbanding ist in Abb. 7 gezeigt. Abschließend wurde der Thorax mit Einzelheften verschlossen und die Haut ebenfalls durch Einzelhefte adaptiert (resorbierbarer Faden;
PROLENE*, Polypropylen, 6-0 USP, Ethicon INC.). Sham-operierte Tiere wurden in der gleichen Art und Weise anästhesiert und behandelt wie die TAC-operierten mit Ausnahme der Ligatur. Jeder Maus wurde postoperativ 1 ml Flüssigkeit (NaCl 0,9%, BRAUN) subkutan appliziert. Die Tiere wurden bis zum vollständigen Erwachen aus der Narkose auf einer Wärmeplatte gehalten, um ein Auskühlen zu verhindern. Für die Analgesie erhielten die Mäuse peri- und postoperativ 1,33 mg/ml Metamizol (Novalgin® ratiopharm) oral mit dem Trinkwasser. In den folgenden 2 Wochen post operationem wurden die Mäuse täglich klinisch kontrolliert und gewogen. Ergaben sich Anhaltspunkte, dass die Tiere leiden (z.B.
Gewichtsverlust, Apathie, struppiges Fell), wurden sie aus tierschutzrelevanten Gründen durch zervikale Dislokation getötet.
2.5 Echokardiographie
Die Echokardiographie ist ein nicht-invasives, schmerzloses Untersuchungsverfahren in der kardiologischen Diagnostik, welches Informationen hinsichtlich Morphologie, Größe und Funktion des Herzens vermittelt. Hierbei bedient sich die Technik den physikalischen Gegebenheiten des Ultraschalls. Seine Wellen liegen in einem Frequenzbereich von 20 kHz bis 1 GHz, somit oberhalb der menschlichen Hörgrenze. Gebräuchliche Ultraschallgeräte arbeiten mit Frequenzen von 1 bis 40 MHz. Grundsätzlich gilt, je höher die Frequenz, desto größer die Auflösung des gescannten Bereiches, aber umso niedriger die erreichbare Eindringtiefe. Die Ultraschallwellen werden über einen Schallkopf in den Körper gesandt.
Hierfür wandeln im Schallkopf angeordnete piezoelektrische Kristalle elektrische Energie in mechanische um, welche dann in Form von Schallwellen in den Körper gelangt. Die Ultraschallwellen unterliegen hierbei den physikalischen Gesetzen der Transmission, Streuung, Brechung und Beugung an Grenzoberflächen. In Abhängigkeit von der Gewebeart werden diese Ultraschallwellen an den Grenzflächen unterschiedlich reflektiert und absorbiert. Je tiefer eine Schallwelle in ein Gewebe eindringt, desto stärker wird sie abgeschwächt. Im Körper reflektierte und gestreute Wellen werden vom Schallkopf
Abb. 7: Veranschaulichung der TAC-Operation in einem Ausguss-Präparat. Modifiziert nach LAUFS, MAACK und BÖHM (2008).
Dargestellt ist der Aortenbogen einer Maus mit der Ligatur zwischen dem Truncus brachiocephalicus (Tb) und der Arteria carotis communis (Acc); TAC = Transverse aortic constriction.
Tb Acc
schließlich wieder registriert (Echo), in elektrische Impulse umgewandelt und verstärkt. Der Schallkopf agiert somit gleichzeitig als Sender und Empfänger. Die empfangenen Ultraschallwellen kommen in Form von Lichtpunkten unterschiedlicher Intensität auf dem Monitor zur Darstellung.
2.5.1 B-Mode
Im zweidimensionalen B-Bild-Verfahren werden die im Körper reflektierten und vom Schallkopf empfangenen Echos als Leuchtpunkte auf dem Monitor dargestellt. Die Bezeichnung B-Mode leitet sich aus dem Englischen (B = brightness; Helligkeit) ab. Eine unterschiedliche Reflexionsintensität der Schallwellen zeichnet sich in diversen Graustufen auf dem Monitorbild ab und repräsentiert eine zweidimensionale in vivo-Aufnahme der untersuchten Organe und Strukturen.
2.5.2 TM-Mode
Der Begriff TM-Mode ist ebenfalls aus dem Englischen abgeleitet, wobei T für time (Zeit) und M für motion (Bewegung) steht. Diese Technik wird vereinfacht weitläufig auch nur als M-Mode bezeichnet. Es handelt sich um ein eindimensionales Darstellungsverfahren der Echokardiographie. Das Gewebe wird nur von einem einzigen Ultraschallstrahl abgetastet.
Die dabei entstehenden Echos werden entlang einer Zeitachse erfasst und ausgewertet. Dies ermöglicht die Darstellung und Beurteilung beweglicher, zum Beispiel kardialer Strukturen.
