Myokardiale Hypertrophie kann als Folge mechanischer Last auftreten und stellt in Form der linksventrikulären Hypertrophie (LVH) einen Risikofaktor für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz dar. Die Bedeutung der Hypoxie-induzierten Genexpression für die Ausbildung einer durch mechanische Last induzierten Myokardhypertrophie ist weitgehend unklar. Ziel dieser Arbeit war es, die möglichen kardialen Effekte von HIF-1 im Rahmen einer LVH nach induzierter mechanischer Nachlast am Mausmodell zu untersuchen. Die LVH wird hierbei in Form eines Nachlastmodells induziert, dem sogenannten „Aorten-Banding“
(engl.: transverse aortic constriction, TAC). Dieses minimal invasive Operationsmodell soll anhand einer vergleichenden Studie von HIF-1 +/+- und HIF-1 +/--Mäusen Anwendung finden. Methodisch stehen hierbei echokardiographische Verlaufskontrollen, histologische
Untersuchungen sowie die Erhebung biometrischer/morphologischer Parameter im Fokus der Arbeit. Zusätzlich soll nach Isolierung ventrikulärer Kardiomyozyten mittels Epifluoreszenztechnik der Einfluss auf das Ca2+-Handling untersucht werden. Dabei werden verschiedene Zeitpunkte post operationem erfasst, um die Entwicklung der Hypertrophie sowie die mögliche Entstehung einer manifesten Herzinsuffizienz nachzuvollziehen. Im Wesentlichen lassen sich angesichts dieser Ausführungen folgende Fragestellungen ableiten:
1. Ergeben sich quantitative und qualitative Unterschiede in Bezug auf Art und Ausprägung der kardialen Hypertrophie zwischen HIF-1 +/+- und HIF-1 +/--Mäusen nach TAC?
2. Führt der Mangel an HIF-1 damit eine mögliche verminderte Expression seines Zielgens VEGF und folglich eine eingeschränkte Durchblutung der Herzmuskelmasse, zu schnellerer Dekompensation des Herzens? Finden sich in diesem Zusammenhang Unterschiede in der kardialen Gefäßdichte?
3. Welche tatsächlichen Differenzen sind bezüglich der kardialen Funktion zu ermitteln?
4. Spiegeln sich mögliche Unterschiede in der kardialen Funktion im Ca2+-Handling isolierter ventrikulärer Kardiomyozyten wieder?
2 Material und Methoden
2.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen
Die tierexperimentellen Versuche wurden gemäß §8 Absatz 1 Tierschutzgesetz vom Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Niedersachsen (LAVES) genehmigt.
Die Untersuchungen erfolgten vergleichend an HIF-1 +/-- vs. HIF-1 +/+-Mäusen. Hierbei wurden sowohl weibliche als auch männliche Geschwister miteinander verglichen. Die Bereitstellung der Mauslinie geschah freundlicherweise durch Prof. R. Johnson (University of California, USA). In den HIF-1 +/--Mäusen war das Exon zwei durch eine Neomycin-Kassette NeoR ersetzt worden.
Die Tiere wurden in der Zentralen Tierexperimentellen Einrichtung der Universitätsmedizin Göttingen gezüchtet und gehalten und in getrenntgeschlechtlichen Geschwistergruppen von bis zu fünf Tieren im IVC-Rack (Techniplast, TouchBlueLineTM) in Makrolonkäfigen vom Typ II lang untergebracht. Sie wurden auf entkeimtem sowie entstaubtem Weichholzgranulat (LIGNOCEL® FS-14, J. Rettenmaier & Söhne) gehalten und erhielten Holzwolle (TAPVEI®, PM90L/2R, Aspen Nesting Material) als Nestmaterial. Die Raumtemperatur betrug 22°C (+/-2°C), die Luftfeuchtigkeit belief sich auf einem Wert zwischen 45-65%. Die Lichtanlagen waren auf einen künstlichen Tag-/Nacht-Rhythmus im 12 h-Intervall reguliert, wobei die Käfige während der Lichtphase (6-18 Uhr) einer Beleuchtungsstärke von 30-100 LUX ausgesetzt waren. Futter (Alleinfutter V1534-000 ssniff R/M-H, 10mm Pelletgröße, Firma ssniff Spezialdiäten GmbH) und Trinkwasser (Leitungswasser), welches zweimal wöchentlich
gewechselt wurde, standen den Mäusen ad libitum zur Verfügung. Der Käfigwechsel erfolgte einmal wöchentlich.
Die Operationen sowie die echokardiographischen Verlaufskontrollen wurden in den Operationsräumen der ZTE, die Organentnahmen in Laborräumen der Abteilung Kardiologie und Pneumologie der Universitätsmedizin Göttingen durchgeführt.
2.2 Versuchsablauf
Der Versuchsablauf gliedert sich in verschiedene Serien, in denen die Mäuse einer TAC-bzw.
Sham-Operation unterzogen wurden. Im Anschluss wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten Echokardiographien durchgeführt oder für weiterführende Untersuchungen Organe (Herz, Lunge, Leber) entnommen. Einen Überblick hierzu gibt Abb. 6.
-Epifluoreszenz; 5 = Histologie; 6 = Erhebung biometrischer Daten
Die Operation wurde bei männlichen Tieren im Alter von 8-10 Wochen, bei weiblichen im
männliche und vier weibliche Gruppen unter Beachtung der verschiedenen Genotypen und Bedingungen (Operation) gebildet worden, die jeweils zum Vergleich herangezogen wurden.
2.3 Genotypisierung der Mäuse
Zur Genotypisierung der HIF-1 +/+- und HIF-1 +/--Mäuse dienten Mausschwanzbiopsien, welche den Mäusen im Absatzalter von drei Wochenentnommen wurden. Dazu wurden mit einer sterilen Schere etwa 3-5 mm der Schwanzspitze abgeschnitten. Aus den Schwanzbiopsien wurde genomische DNA (gDNA) isoliert. Diese konnte im Anschluss mittels Polymerase-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction – PCR) amplifiziert und anschließend durch Agarose-Gelelektrophorese dargestellt werden.
2.3.1 Isolierung genomischer DNA aus Mausschwanzbiopsien
Die Mäuseschwänze wurden in autoklavierte 1,5 ml-Reaktionsgefäße verbracht und mit 600 µl Tail Lysis Buffer sowie 15 µl Proteinase K (20 mg/ml) versetzt, gut verschlossen und für 30 sec gevortext. Dieser Ansatz wurde bei 60° C im Hybridizations-Ofen über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden 200 µl NaCl (200 mM) zu dem Ansatz gegeben und nach erneutem Vortexen bei 16100 x g für 30 min bei 4° C zentrifugiert. 750 µl des gebildeten Überstandes wurden in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt, mit 450 µl Isopropanol (70%ig) versetzt, gevortext und anschließend erneut bei 16100 x g für 30 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 0,5 ml Ethanol (70%) gewaschen (Zentrifugation mit 16100 x g für 10 min bei 4° C), danach bei Raumtemperatur für 15 min luftgetrocknet, in 100 µl TE-Puffer resuspendiert und für 30 min bei 56° C erhitzt.
Die erhaltene DNA wurde in einer Verdünnung von 1:100 mit Aqua bidest. vermischt und die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm photometrisch bestimmt (Smart
SpecTM Plus Spectrophotometer, Bio Rad, München Deutschland). Die errechnete Konzentration der DNA diente als Grundlage für das Anlegen einer Stocklösung mit einer DNA-Konzentration von 40 ng/l.
Reagenzien:
Tail Lysis Buffer 200 mM NaCl
50 mM Tris/HCl pH 8,0
Proteinase K 20 mg/ml; in 50 mM Tris/Cl pH 8,0; 1 nM CaCl2
(Roth, Proteinase K ≥ 30 U/mg)
TE-Puffer 10 mM Tris/HCl pH 8,0
1 mM EDTA pH 8,0
2.3.2 PCR Amplifikation
Die PCR ist eine Methode zur zyklischen Vervielfältigung von DNA. Hierbei wird zunächst der DNA-Doppelstrang mit einer Temperatur von 95°C durch Lösung der Wasserstoffbrückenbindungen denaturiert. Die folgende Phase der Primerhydridiserung (Annealing) ermöglicht, den spezifisch ausgewählten Primern komplementär an die jeweiligen Abschnitte der nun einsträngig vorliegenden DNA zu binden. Dann werden mittels der DNA-Polymerase Nucleotide (dNTP`s) am Einzelstrang synthetisiert (Elongation), so dass am Ende der Prozedur zwei identische DNA-Doppelstänge vorliegen. Durch zyklische Wiederholung von Denaturierung, Annealing und Elongation wird die DNA exponentiell amplifiziert.
In dieser Arbeit wurde die PCR-Amplifikation mit dem Taq-Polymerase-Kit*: TITANIUMTM DNA Taq-Polymerase der Firma Clontech durchgeführt. Zur Kontrolle der Spezifität der PCR wurden jeweils eine Positiv- und Negativkontrolle mitgeführt. Nach Abschluss der PCR-Amplifikation wurde die DNA sofort weiterverarbeitet oder auf 4°C runter gekühlt.
Reagenzien und Reaktionsablauf:
PCR-Ansatz (25 µl) 19,65 µl Aqua bidest.
2,5 µl 10x Puffer*
0,5 µl dNTP`s*
0,5 µl forward Primer 0,5 µl reverse Primer 0,35 µl Taq-Polymerase*
1 µl gDNA-Template (40 ng/µl)
PCR Amplifikation Denaturierung (initial) 95°C – 2 min Denaturierung 95°C – 30 sec
Annealing 58°C – 30 sec Elongation 68°C – 40 sec Inkubation 68°C – 10 min
Primersequenzen forward Primer: 5` CCTCATGGTCACATGGATGA 3´
reverse Primer: 5´ GGAGAGGCTTTTTGCTTCCT 3`
30x
2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese
Durch die Agarose-Gelelektrophorese kann das PCR-Produkt anhand seiner Größe dargestellt werden. Hierbei bewegt sich die negativ geladene DNA in einem angelegten Spannungsfeld zum Pluspol. Entsprechend ihrer Fragmentgröße rücken kürzere Stränge in der netzartigen Struktur des Agarosegels schneller vor als längere, die DNA-Fragmente ordnen sich entsprechend ihre Größe an.
Die DNA-Fragmente wurden in dem Agarosegel (2 % in TBE-Puffer, Agarose Broad Range, Roth) unter einer Spannung von 10 V/cm in einer horizontalen Gel-Elektrophorese-Apparatur (Peqlab) aufgetrennt (TBE-Puffer). Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel in ein Wasserbad mit Ethidiumbromid (Ethidiumbromidlösung 1% (10 mg/ml), Roth) gegeben.
Ethidiumbromid interkaliert in die DNA und kann mittels UV-Licht (InGenius, Syngene, Camebridge, UK) detektiert werden. Die Größe der elektrophoretisch aufgetrennten PCR-Amplifikate kann nun durch Vergleich mit einem Marker (O’RangeRuler™, Fermentas) abgeglichen werden.
Reagenzien:
TBE-Buffer 890 mM Tris
890 mM Borsäure 20 mM EDTA, pH 8,0
2.4 TAC – Transverse Aortic Constriction
Die TAC-Operation ist ein minimal-invasiver operativer Eingriff zur Reduktion des Aortendurchmessers. Der Terminus TAC leitet sich aus dem Englischen transverse aortic
constriction ab und bezeichnet eine Verengung der Aorta transversa. Hierbei handelt es sich um ein sogenanntes Nachlastmodell, welches durch die Aortenstenose, einhergehend mit einer Drucküberlastung, der Erzeugung einer LVH dient. Die Mäuse wurden für den operativen Eingriff mit einer Kombination aus Ketamin (100 mg/kg, Ketamin 10%, medistar) und Xylazin (5 mg/kg, Xylazin 2%, Riemser) anästhesiert. Nach Erreichen des Toleranzstadiums wurde die Maus in Rückenlage auf dem Operationstisch fixiert. Die Augen wurden mit einer Salbe (Oculotect mono A Augengel®, Novartis) bedeckt, um das Austrocknen der Cornea zu verhindern. Ein Faden, hinter den Schneidezähnen des Oberkiefers befestigt, diente der Streckung des Halses. Der Operationsbereich wurde mittels Enthaarungscreme (elca® med creme, ASID BONZ) enthaart, gesäubert und anschließend mit einer Jodtinktur (Braunol®, BRAUN) versehen. Die Operation erfolgte zur besseren Darstellung der Strukturen unter stereomikroskopischer Sicht. Im Folgenden soll der Ablauf einer solchen Operation detailliert beschrieben werden.
Zunächst wurde die Haut unmittelbar kranial des Sternums ca. 0,5 cm quer zur Körpermedianen inzisiert. Die Trachea wurde durch stumpfe Präparation der distal gelegenen Muskulatur freigelegt. Entlang der Trachea, als Leitstruktur, wurden die Arteria carotis communis sowie der Truncus brachiocephalicus dargestellt. Hierbei ist es nötig das Operationsfeld durch einen ca. 3-5 mm langen Schnitt in die Oberkante des Sternums zu erweitern. Nach Erreichen der Aorta transversa wurde diese unter Verwendung einer stumpfen gebogenen Kanüle vorsichtig mobilisiert und ein nicht resorbierbarer Faden (Polyvioline®, white braided, non-absorbal, non-sterile, surgical suture, 5-0 USP, Havard Apparatus) zwischen Truncus brachiocephalicus und Arteria carotis communis unter der Aorta transversa hindurchgeführt. Im Anschluss wurde die Ligatur gesetzt, wobei eine
abgestumpfte, gebogene Injektionskanüle („Platzhalter“) zur Limitierung der Stenose in die Ligaturschlinge eingeführt wurde. Nach dem Anziehen der Ligatur wurde der „Platzhalter“
entfernt, wodurch ein standardisierter Stenosegrad erreicht worden war. Für männliche Tiere wurde eine 25G-Kanüle, für weibliche Tiere eine 26G-Kanüle in Anlehnung an den Geschlechtsunterschied bezüglich des Körpergewichtes, verwendet. Die Position für das Aortenbanding ist in Abb. 7 gezeigt. Abschließend wurde der Thorax mit Einzelheften verschlossen und die Haut ebenfalls durch Einzelhefte adaptiert (resorbierbarer Faden;
PROLENE*, Polypropylen, 6-0 USP, Ethicon INC.). Sham-operierte Tiere wurden in der gleichen Art und Weise anästhesiert und behandelt wie die TAC-operierten mit Ausnahme der Ligatur. Jeder Maus wurde postoperativ 1 ml Flüssigkeit (NaCl 0,9%, BRAUN) subkutan appliziert. Die Tiere wurden bis zum vollständigen Erwachen aus der Narkose auf einer Wärmeplatte gehalten, um ein Auskühlen zu verhindern. Für die Analgesie erhielten die Mäuse peri- und postoperativ 1,33 mg/ml Metamizol (Novalgin® ratiopharm) oral mit dem Trinkwasser. In den folgenden 2 Wochen post operationem wurden die Mäuse täglich klinisch kontrolliert und gewogen. Ergaben sich Anhaltspunkte, dass die Tiere leiden (z.B.
Gewichtsverlust, Apathie, struppiges Fell), wurden sie aus tierschutzrelevanten Gründen durch zervikale Dislokation getötet.
2.5 Echokardiographie
Die Echokardiographie ist ein nicht-invasives, schmerzloses Untersuchungsverfahren in der kardiologischen Diagnostik, welches Informationen hinsichtlich Morphologie, Größe und Funktion des Herzens vermittelt. Hierbei bedient sich die Technik den physikalischen Gegebenheiten des Ultraschalls. Seine Wellen liegen in einem Frequenzbereich von 20 kHz bis 1 GHz, somit oberhalb der menschlichen Hörgrenze. Gebräuchliche Ultraschallgeräte arbeiten mit Frequenzen von 1 bis 40 MHz. Grundsätzlich gilt, je höher die Frequenz, desto größer die Auflösung des gescannten Bereiches, aber umso niedriger die erreichbare Eindringtiefe. Die Ultraschallwellen werden über einen Schallkopf in den Körper gesandt.
Hierfür wandeln im Schallkopf angeordnete piezoelektrische Kristalle elektrische Energie in mechanische um, welche dann in Form von Schallwellen in den Körper gelangt. Die Ultraschallwellen unterliegen hierbei den physikalischen Gesetzen der Transmission, Streuung, Brechung und Beugung an Grenzoberflächen. In Abhängigkeit von der Gewebeart werden diese Ultraschallwellen an den Grenzflächen unterschiedlich reflektiert und absorbiert. Je tiefer eine Schallwelle in ein Gewebe eindringt, desto stärker wird sie abgeschwächt. Im Körper reflektierte und gestreute Wellen werden vom Schallkopf
Abb. 7: Veranschaulichung der TAC-Operation in einem Ausguss-Präparat. Modifiziert nach LAUFS, MAACK und BÖHM (2008).
Dargestellt ist der Aortenbogen einer Maus mit der Ligatur zwischen dem Truncus brachiocephalicus (Tb) und der Arteria carotis communis (Acc); TAC = Transverse aortic constriction.
Tb Acc
schließlich wieder registriert (Echo), in elektrische Impulse umgewandelt und verstärkt. Der Schallkopf agiert somit gleichzeitig als Sender und Empfänger. Die empfangenen Ultraschallwellen kommen in Form von Lichtpunkten unterschiedlicher Intensität auf dem Monitor zur Darstellung.
2.5.1 B-Mode
Im zweidimensionalen B-Bild-Verfahren werden die im Körper reflektierten und vom Schallkopf empfangenen Echos als Leuchtpunkte auf dem Monitor dargestellt. Die Bezeichnung B-Mode leitet sich aus dem Englischen (B = brightness; Helligkeit) ab. Eine unterschiedliche Reflexionsintensität der Schallwellen zeichnet sich in diversen Graustufen auf dem Monitorbild ab und repräsentiert eine zweidimensionale in vivo-Aufnahme der untersuchten Organe und Strukturen.
2.5.2 TM-Mode
Der Begriff TM-Mode ist ebenfalls aus dem Englischen abgeleitet, wobei T für time (Zeit) und M für motion (Bewegung) steht. Diese Technik wird vereinfacht weitläufig auch nur als M-Mode bezeichnet. Es handelt sich um ein eindimensionales Darstellungsverfahren der Echokardiographie. Das Gewebe wird nur von einem einzigen Ultraschallstrahl abgetastet.
Die dabei entstehenden Echos werden entlang einer Zeitachse erfasst und ausgewertet. Dies ermöglicht die Darstellung und Beurteilung beweglicher, zum Beispiel kardialer Strukturen.
2.5.3 Echokardiographische Untersuchung 2.5.3.1 Technische Ausrüstung
Für die echokardiographischen Untersuchungen stand ein Ultraschallgerät der Firma Visual Sonics vom Typ Vevo 660TM, VS-0M-VE660, Version 3.1 zur Verfügung. Der Schallkopf des Gerätes arbeitet mit einer Sendefrequenz von 30 MHz. Die Datenerhebung erfolgte durch ein im Ultraschallgerät integriertes Programm.
2.5.3.2 Untersuchungsdurchführung
Zu Beginn wurden die Mäuse mittels 2,2,2-Tribromethanol (2,5% Avertin®, Sigma Aldrich, Steinheim) geringfügig anästhesiert. Nach intraperitonealer Injektion zeigten die Mäuse eine verlangsamte Reaktion, wurden kurzeitig in einer Glasglocke mittels Isofluran (FORENE®, ABBOTT) betäubt und konnten auf einer Wärmeplatte in Rückenlage für die Untersuchung an den Extremitäten fixiert werden. Das thorakale Schallfeld (Kontaktfläche) wurde enthaart und mit 70% Ethanol entfettet sowie befeuchtet. Die Kontaktfläche wurde großzügig mit Ultraschallgel benetzt, welches zur Verminderung von Artefakten durch Lufteinschlüsse zentrifugiert wurde. Die sonographische Untersuchung des Herzens erfolgte parasternal von der linken Thoraxseite. Im B-Mode wurde die Längsachse des Herzens auf Höhe der Mm.
pappillares eingestellt. Anschließend wurde im M-Mode dieser Bereich während Systole und Diastole alternierend dargestellt. In diesem Aufnahmemodus wurden verschiedene Parameter ermittelt: Zum einen die linksventrikuläre Hinterwanddicke (HWD) und Septumdicke (SD) zur Bestimmung des hypertrophischen Ausmaßes. Zum anderen konnte aus linksventrikulärem enddisatolischen Diameter (LVEDD) und linksventrikulärem endsystolischen Diameter (LVESD) die Verkürzungsfraktion (engl. fractional shortening, FS) des Herzens errechnet werden, welche eine Aussage über die kardiale Funktion erlaubt:
FS (%) = 𝐿𝑉𝐸𝐷𝐷−𝐿𝑉𝐸𝑆𝐷
𝐿𝑉𝐸𝐷𝐷 ∙ 100%
Formel 2
Es wurden pro Maus je 3 Messungen erhoben, die abschließend im arithmetischen Mittel in den Datensatz eingeflossen sind. Die erhobenen Parameter sind in Abb. 8 dargestellt. Nach Beendigung der Untersuchung wurden die Mäuse bis zur vollständigen Regeneration auf einer Wärmeplatte gehalten.
Abb 8: Echokardiographie: Beispielhafte M-Mode-Aufnahme einer C57Bl/6J-Wildtypmaus. Die Abbildung stellt farblich die im M-Mode erfassten Parameter dar: Septumdicke (1), Hinterwanddicke (2), Linksventrikulärer enddiastolischer Diameter (3), Linksventrikulärer endsystolischer Diameter (4). Es wurden je Maus 3 Herzaktionen ausgemessen, arithmetisch gemittelt und statistisch ausgewertet.
2.6 Die Entnahme von Organen 2.6.1 Die Herzexplantation
Zur weiterführenden Untersuchung bezüglich der Ausprägung und Auswirkungen der induzierten LVH, war es nötig den Mäusen zu definierten Zeitpunkten die Herzen zu
explantieren.
Hierfür wurden den Tieren zunächst 250 I.E. Heparin (entsprechend 0,05 ml Heparin-Natrium-25000-ratiopharm, ratiopharm) intraperitoneal appliziert, um die Koagulation des
1
2
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Blutes im Herzen zu unterbinden. Mittels Isofluran (FORENE®, ABBOTT) wurden die Mäuse in einer Glasglocke betäubt. Bei Erreichen einer ausreichenden Narkosetiefe (deutlich reduzierte Atemfrequenz) wurden die Tiere durch zervikale Dislokation getötet. Direkt im Anschluss wurde die Maus abdominal eröffnet, von kaudal das Zwerchfell durchtrennt, der Thorax eröffnet und der Processus xiphoideus des Sternums mit einer chirurgischen Klemme nach kranial verlegt, um das Herz zugänglich zu machen. Im nächsten Schritt wurde das Perikard eröffnet und entfernt. Nun wurde mit einer Schere das Herz nach kaudal verschoben, um ein- sowie abgehende Gefäße des Herzens darzustellen. Die Gefäße an der Herzbasis wurden mit einer Pinzette gefasst und kranial jener konnte das Herz mit einer Schere abgesetzt werden. Es wurde in eine Petrischale überführt, welche für gewöhnlich mit NaCl (NaCl 0,9% BRAUN) gefüllt war. Das Herz wurde unter stereomikroskopischer Sicht mittels einer modifizierten Injektionskanüle (20 Gauge) via Aorta mit NaCl (NaCl 0,9% BRAUN) retrograd perfundiert, bis ein vollständiges Verblassen der Koronargefäße zu verzeichnen war.
Ausgehend von diesem Zustand konnten die Herzen weiter aufgearbeitet werden. Es wurden die Gefäß- und Ventilebene des Herzens entfernt, anschließend der rechte Ventrikel (RV) und der linke Ventrikel (LV) durch Feinpräparation mit einer Federschere voneinander getrennt.
2.6.2 Die Erhebung biometrischer Daten
Nach Explantation des Herzens, wie in 2.6.1 beschrieben, wurde das Herzgesamtgewicht (HG) sowie die Masse des linken Ventrikels (LVM) bestimmt. Daraus ließ sich der Massenanteil des LV vom HG errechnen (Hypertrophie-Index, HI) und konnte als Maß für die Hypertrophie herangezogen werden:
𝐿𝑉𝑀 𝑚𝑔
𝐻𝐺 (𝑚𝑔) = 𝐻𝐼
Formel 3
Im Rahmen des Langzeitversuches (echokardiographische Verlaufskontrollen) wurden die genannten Parameter 15 Wochen post operationem erfasst. Zusätzlich wurden hierbei das Körpergewicht sowie die Masse von Lunge und Leber ermittelt, um einen Hinweis auf eventuelle Stauungserscheinungen als Folge einer Herzinsuffizienz zu erhalten. Alle explantierten Organe wurden unmittelbar nach dem Wiegen in 1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und später bei -80°C aufbewahrt.
2.7 Die Epifluoreszenzmikroskopie
Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht das Visualisieren und Lokalisieren von intrazellulären Molekülen. Hierfür bedient man sich der Kombination aus herkömmlicher Lichtmikroskopie und der Fluoreszenztechnik. Die Epifluoreszenzmikroskopie bezeichnet dabei die sogenannte Auflicht-Mikroskopie (griech.: epi = auf). Ein fluoreszierendes Molekül wird mit dem Licht einer definierten Wellenlänge (λ1) angeregt (Exzitation). Unmittelbar darauf emittiert dieses Molekül Licht einer längeren, das heißt energieärmeren Wellenlänge (λ2). Dies geschieht, da ein Elektron nach Anregung mit einem Photon (griech.: photos = Licht) in einen höheren Energiezustand versetzt wird und nach Rückfall in seinen energetischen Grundzustand (innerhalb 10-8 Sekunden) die zuvor aufgenommene Energie in Form eines Fluoreszenzphotons wieder freisetzt. Diese kann mithilfe einer angegliederten Messvorrichtung detektiert werden. Die Wellenlängendifferenz zwischen Exzitationslicht (λ1) und Emissionslicht (λ2) (Stokes-Differenz) beträgt in der Regel 20 bis 50 nm und resultiert
aus der Tatsache, dass die Energie nicht einzig in Form von Licht, sondern auch Wärme freigesetzt wird. Ihre genaue Kenntnis, bezüglich eines Fluoreszenzfarbstoffes, erlaubt durch Einsatz eines entsprechenden Emissionsfilters, die Trennung von Exzitations- und Emissionslicht. Demnach kann das emittierte Licht sichtbar gemacht werden und für eine Auswertung herangezogen werden. Der Aufbau sowie der Strahlengang im Epifluoreszenzmikroskop sind in Abb. 9 schematisch dargestellt.
Epifluoreszenz-Beleuchtung
A
E
Dichromatischer Spiegel
Mikroskop-Objektiv
Zelle Emissionsfilter
Anregungsfilter
Abb. 9: Aufbau und Strahlengang in einem Epifluoreszenzmikroskop. Die Epifluoreszenz-Beleuchtung (weißes Licht) erfolgt mittels einer Lichtquelle. Die erforderliche Wellenlänge wird durch den Anregungsfilter (A) herausgefiltert und auf einen dichromatischen Spiegel gelenkt. Dieser reflektiert das Licht der entsprechenden Wellenlänge (λ1) durch das Objektiv auf das Präparat. Die fluoreszierenden Moleküle emittieren daraufhin das energieärmere Licht der Wellenlänge λ2, welches erneut durch den Emissionsfilter (E) gefiltert wird und über das Okular zum Auge gelenkt wird.
2.7.1 Ca2+-Fluoreszenzmessungen in isolierten ventrikulären Kardiomyozyten 2.7.1.1 Ca2+-Fluoreszenzfarbstoffe
Der Einsatz von Ca2+-bindenden Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht das Visualisieren der systolischen und diastolischen Ca2+-Verschiebungen während der Herzmuskelkontraktion.
Der Fluoreszenzfarbstoff bildet einen Chelat-Komplex mit den Ca2+-Ionen der Zelle und kann nach Anregung mit einer definierten Wellenlänge detektiert werden. Die daraufhin emittierten Fluoreszenzsignale lassen sich mit der Ca2+-Konzentration [Ca2+] der jeweiligen Zelle korrelieren. Je nach Fluoreszenzfarbstoff lassen sich so die systolischen und diastolischen Differenzen in der [Ca2+] erfassen. Es werden zwei Arten Ca2+-bindender Fluoreszenzfarbstoffe unterschieden: Die nicht ratiometrischen, wie Fluo-3 Azetoxymethylester (AM), besitzen feste Absorbtions- und Emissionsmaxima und erlauben damit nur eine indirekte Kalkulation der [Ca2+]. Die ratiometrischen Fluoreszenzfarbstoffe, wie Fura-2 AM oder Indo-1 AM, deren Verschiebung der Absorbtions- und Emissionsmaxima allein von den gebundenen Ca2+-Ionen abhängig ist, machen die [Ca2+]
direkt messbar.
Für die Ca2+-Fluoreszenzmessungen in dieser Arbeit kam der nicht ratiometrische Fluoreszenzfarbstoff Fluo-3 AM zur Anwendung. Ein entscheidender Vorteil gegenüber den ratiometrischen Fluoreszenzfarbstoffen ist in dem deutlich besseren Verhältnis von Fluoreszenzsignal zu Hintergrundrauschen begründet.
2.7.1.2 Isolierung und Aufbereitung ventrikulärer Kardiomyozyten
Für die Ca2+-Fluoreszenzmessungen wurde den Mäusen 3 Wochen post operationem das Herz, wie in 2.5.1 beschrieben, explantiert. Das Herz wurde über die kanülierte Aorta mittels
Seidenfaden und Gefäßklemme an der Kanüle fixiert sowie in eine modifizierte Langendorff-Perfusions-Anlage überführt (Abb. 10 und 11), welche in ihrer ursprünglichen Form erstmals
Seidenfaden und Gefäßklemme an der Kanüle fixiert sowie in eine modifizierte Langendorff-Perfusions-Anlage überführt (Abb. 10 und 11), welche in ihrer ursprünglichen Form erstmals