Ca 2+ -Epifluoreszenz-Analysen

Die mittels echokardiographischer Befunde gezeigte funktionale kardiale Beeinträchtigung wurde auf Einzelzellebene überprüft. Dazu wurden ventrikuläre Kardiomyozyten männlicher Mäuse 3 Wochen nach TAC- bzw. Sham-Intervention isoliert und mittels Ca²⁺ -Epifluoreszenztechnik analysiert. Der Zeitpunkt wurde gewählt, da zu diesem Zeitpunkt eine signifikante Beeinträchtigung der Herzfunktion in den echokardiographischen

Untersuchungen aufgefallen war.

Untersucht wurde die Verkürzung der Kardiomyozyten nach elektrischer Stimulation als Marker der Kontraktilität, das Ausmaß (F/F₀) und der Verlauf (Relaxationsverhalten) der Ca²⁺-Transienten sowie der Ca²⁺-Gehalt des SR.

In ventrikulären Kardiomyozyten aus HIF-1 ^+/--Mäusen konnte drei Wochen nach TAC-Intervention (Abb. 23a) eine reduzierte Kontraktilität auf Einzelzellebene nachgewiesen werden. Die Unterschiede zur HIF-1 ^+/+-Population waren hinsichtlich jeder untersuchten Stimulationsfrequenz (1, 2 und 4 Hz) statistisch signifikant. Diese Daten sind mit dem eingeschränkten FS der echokardiographischen Funktionsuntersuchung vereinbar.

Der Vergleich der Amplituden intrazellulärer Ca²⁺-Transienten isolierter ventrikulärer Kardiomyozyten (Abb. 23b) von TAC- bzw. Sham-behandelten HIF-1 ^+/--Mäusen zeigte drei

Wochen postoperativ bei steigender Stimulationsfrequenz statistisch signifikant geringer ausgeprägte Amplituden in TAC-operierten HIF-1 ^+/--Mäusen. In den Kardiomyozyten der HIF-1 ^+/+-Mäuse, wurden keine signifikanten Unterschiede bezüglich der intrazellulären Ca²⁺-Transienten-Amplituden zwischen TAC- und Sham-Tieren beobachtet.

Das Relaxationsverhalten in TAC-operierten Tieren offenbarte sich gegenüber Sham-operierten Tieren generell als beeinträchtigt. Abb. 23c zeigt die erforderliche Zeit, um 50%

des intrazellulären Ca²⁺ (RZ_50% [Ca²⁺]_i) aus dem Zytosol via SERCA-2a in das SR zurück zu befördern. Diese war sowohl in den HIF-1 ^+/+-Mäusen als auch in den HIF-1 ^+/--Mäusen hinsichtlich der untersuchten Stimulationsfrequenzen von 1 Hz und 2 Hz nach TAC-Operation im Vergleich zu Sham-behandelten Tieren signifikant erhöht. Die Analyse bei einer Stimulationsfrequenz von 4 Hz verzeichnete eine höhere RZ50% [Ca²⁺]i in HIF-1 ^+/+- und HIF-1 ^+/--Mäusen nach TAC, eine signifikante Erhöhung ergab sich hierbei, verglichen mit den Sham-Tieren, nur in den HIF-1 ^+/+-Mäusen.

In Abb. 23d ist die RZ50 % TAC- bzw. Sham-intervenierter HIF-1 ^+/+- und HIF-1 ^+/--Mäuse dargestellt. Die RZ_50% beschreibt die erforderliche Zeit, nach erfolgter Kontraktion, bis zum Erreichen des 50%igen Relaxationszustandes eines Kardiomyozyten. Beide Genotypen wiesen nach TAC-Operation eine höhere RZ_50% gegenüber den isolierten ventrikulären Kardiomyozyten aus Sham-behandelten Tieren auf. Signifikante Unterschiede ergaben sich hierbei für Stimulationsfrequenzen unter 1 Hz und 2 Hz sowie für 4 Hz in HIF-1 ^+/+-Mäusen.

In Abb. 23e sind die Ca²⁺-Transienten-Amplituden bei einer Stimulationsfrequenz von 1 Hz nach Koffeininduktion aufgezeigt. Die Koffeinstimulation bewirkt das reversible Öffnen des RyR2, wodurch das gesamte im SR enthaltene Ca²⁺ schlagartig ausgeschüttet wird und in der

Folge eine Kontraktion des Kardiomyozyten auslöst. Hierbei war eine signifikant geringer ausgeprägte F/F0-Amplitude in den TAC operierten HIF-1 ^+/--Mäusen im Vergleich zu Sham-behandelten Tieren selbiger Population (HIF-1 ^+/-) zu erkennen.

Die Zeit, in der diese koffeininduzierte Ca²⁺-Transienten-Amplitude F/F₀ auf einen bestimmten prozentualen Wert der maximalen Amplitude abfällt, wurde erfasst und als Maß der NCX-Funktion herangezogen. Als geeigneter Indikator hat sich hierbei die RZ80%[Ca²⁺]i

der koffeininduzierten Amplitude erwiesen. Dabei gilt: Je kürzer die Relaxationszeit ist, desto höher ist die Funktion/Aktivität des NCX ausgeprägt. Die RZ80%[Ca²⁺]i zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen HIF-1 ^+/+- und HIF-1 ^+/--Mäusen nach TAC, so dass von einer gleichartigen NCX-Funktion ausgegangen werden kann. Die Auswertung der RZ_80%[Ca²⁺]_i ist in Abb. 23 f dargestellt.

Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass im Gegensatz zur kardialen Hypertrophie für die kardiale Funktion nach erhöhter mechanischer Last ein Einfluss von HIF-1 sowohl im Gesamtherz als auch auf Einzelzellebene beobachtet werden konnte. Dieser wurde anhand echokardiographischer Befunde und mit Hilfe von Ca²⁺-Epifluoreszenz-Analysen ausfindig gemacht. Dabei konnte erstmals ein signifikanter Einfluss von HIF-1 auf das kardiale Ca²⁺ -Handling beschrieben werden.

Abb. 23: Ergebnisse aus den Ca²⁺-Epifluoreszenz-Messungen isolierter ventrikulärer Kardiomyozyten männlicher Mäuse drei Wochen nach erfolgter Intervention (TAC oder Sham). Angegeben ist das arithmetische Mittel mit dem zugehörigen Standardfehler einer jeweiligen Untersuchungsgruppe (^*p<0,05 HIF-1 ^+/- TAC-behandelte vs. HIF-1 ^+/- Sham-behandelte, ^#p<0,05 HIF-1 ^+/+ TAC-behandelte vs. HIF-1 ^+/+ Sham-behandelte).

a: Myozytenverkürzung bei steigender Stimulationsfrequenz (1, 2 und 4 Hz) in TAC-behandelten HIF-1 ^+/+- vs.

HIF-1 ^+/--Mäusen; RZL = Ruhezelllänge.

b: Intrazelluläre Ca²⁺-Transienten-Amplitude (F/F₀) nach Stimulation mit einer Frequenz von 1, 2 und 4 Hz in TAC bzw. Sham-behandelten HIF-1 ^+/+- und HIF-1 ^+/--Mäusen.

c: Intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration [Ca²⁺]_i zum Zeitpunkt der 50%igen Relaxation (RZ_50%) in TAC bzw.

Sham-behandelten HIF-1 ^+/+- und HIF-1 ^+/--Mäusen.

d: Zeit bis zum Erreichen der 50%igen Relaxation (RZ_50%) in TAC bzw. Sham-behandelten HIF-1 ^+/+- und

HIF-1 ^+/--Mäusen.

e: Intrazelluläre Ca²⁺-Transienten-Amplitude (F/F₀) nach Koffeininduktion und einer Stimulationsfrequenz von

1 Hz.

f: Intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration [Ca²⁺]_i zum Zeitpunkt der 80%igen Relaxation (RZ_80%) nach Koffeininduktion in TAC bzw. Sham-behandelten HIF-1 ^+/+- und HIF-1 ^+/--Mäusen.

4 Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von HIF-1 auf die Entwicklung und Ausprägung einer LVH sowie nachfolgender Herzinsuffizienz nach induzierter mechanischer Last untersucht. Hierfür wurden HIF-1 ^+/+- und HIF-1 ^+/--Mäuse nach TAC-Operation sowohl auf morphologischer als auch auf molekularer Ebene miteinander verglichen. Als Kontrolle wurden sogenannte Sham-Tiere herangezogen. Sie unterliefen die gleiche Prozedur wie TAC-operierte Tiere mit Ausnahme der Aortenkonstriktion.

Bei Planung des Versuchsvorhabens wurde von der Hypothese ausgegangen, dass HIF-1 bei einer Anpassung des Herzens an erhöhte mechanische Last die Ausprägung der Last-induzierten Hypertrophie beeinflusst. Für eine Zunahme der LVM ist parallel eine nährstoffliefernde Zunahme der kardialen Gefäßdichte notwendig. Unterbleibt diese, resultiert eine eingeschränkte Hypertrophie bzw. ein Übergang ins Herzversagen. HIF-1 ist mittels seiner Zielgene, wie z.B. VEGF an der Neubildung von Gefäßen entscheidend beteiligt.

Entgegen der ursprünglichen Hypothese konnte interessanterweise kein Unterschied in der Ausprägung der kardialen Hypertrophie sowie der kardialen Gefäßdichte bei dem Vergleich von HIF-1 ^+/+- mit HIF-1 ^+/--Mäusen nach TAC beobachtet werden. Jedoch wurde ein signifikanter Funktionsverlust in den HIF-1 ^+/--Mäusen gefunden. Daher scheint HIF-1 die kardiale Funktion auch unabhängig von Angiogenese und Hypertrophie zu beeinflussen.

Dieses Resultat wurde durch Untersuchungen an Einzelkardiomyozyten unterstützt.

In vorangegangenen Studien konnte für HIF-1 im ischämischen adulten Herzen bereits ein protektiver Effekt in HIF-1 ^+/--Mäusen nachgewiesen werden. Die HIF-1 ^+/--Mäuse zeigen

eine Reduktion von 30-50% in der HIF-1 -Proteinexpression und haben unter Ruhebedingungen keinen spontanen kardiovaskulären Phänotyp. Lediglich unter akuten ischämischen Bedingungen zeigten sie einen kompletten Verlust der Fähigkeit einer kardialen Protektion nach myokardialer Präkonditionierung (CAI et al. 2008).

Durch Untersuchung dieser Mäuse im TAC-Modell, konnte in der vorliegenden Arbeit ein schützender Einfluss von HIF-1 für die kardiale Funktion unter anhaltender Druckbelastung

aufgezeigt werden.

Die Daten der Studie belegen, dass HIF-1 ^+/--Mäuse im Gegensatz zu ihren Wildtypgeschwistern (HIF-1 ^+/+) nach TAC-Intervention eine Beeinträchtigung des FS entwickelten. Hierbei zeigte sich jedoch kein Unterschied in der Ausprägung der Hypertrophie: Sowohl HIF-1 ^+/-- als auch HIF-1 ^+/+-Mäuse verzeichneten eine Zunahme in der HWD und SD, die jedoch im Vergleich der Genotypen keine signifikanten Unterschiede hervorbrachte. Zwischen männlichen und weiblichen Tieren wiederum war ein unterschiedlicher Ausprägungsgrad in der Hypertrophie erkennbar. So war anhand der Echokardiographie-Daten (HWD, SD) aber auch in Form des HI, resultierend aus der biometrischen Datenerhebung, in den weiblichen Tieren eine stärkere Ausprägung der Hypertrophie ersichtlich. Der leichte Abfall der HWD in den männlichen Tieren, welcher 11 Wochen nach TAC-Intervention im Vergleich zum 8-Wochen-Wert zu beobachten war, könnte ein Hinweis auf eventuell beginnende oder bereits vorliegende Dilatation der Herzen sein. Das FS, als Indikator der kardialen Funktion, war bei männlichen Tieren bereits 3 Wochen postoperativ reduziert und hielt sich über den gesamten Untersuchungszeitraum bis 11 Wochen postoperativ auf diesem Level. Die Weibchen zeigten eine kontinuierliche, aber langsamere Reduktion des FS, welche im Gegensatz zu den Männchen erst 8 Wochen nach

der TAC-Operation signifikant war. Dieser Datensatz steht im Einklang mit geschlechterspezifischen Forschungsarbeiten von REGITZ-ZAGROSEK et al. (2008) die Frauen bzw. weiblichen Versuchstieren (Maus) eher eine konzentrische Hypertrophie mit Wandverdickung und relativ guter Funktion, Männern bzw. männlichen Versuchstieren (Maus) hingegen eher eine Dilatation mit eingeschränkter Pumpleistung als Folge einer erhöhten mechanischen Last zusprechen. Hierbei waren die klinischen Befunde im Tiermodell reproduzierbar und auf Modulationen enzymatischer Myosinstoffwechselwege und myokardialer Mechanismen durch Sexualhormone zurückzuführen.

In der Diskussion zur verschiedenartig ausgeprägten Hypertrophie zwischen männlichen und weiblichen Tieren stellt sich aber die Frage, ob dies nicht ein logisches Resultat des divergent angelegten Stenosegrades beider Geschlechter ist. Wie in Kapitel 2.4 beschrieben, erfolgte die Standardisierung des Stenosegrades in männlichen Tieren mittels einer 25G-Kanüle, in den Weibchen durch eine 26G-Kanüle. Hintergrund dieser Konfiguration war die Adaptation an ein unterschiedliches Körpergewicht von männlichen und weiblichen Tieren zum Zeitpunkt der Operation, wodurch einem heterogenen Belastungsgrad Einhalt geboten werden sollte.

Darüber hinaus wurden männliche und weibliche Tiere ungleichen Alters operiert, so dass auch dieser Aspekt bei der Vergleichbarkeit jener Daten Beachtung finden muss und hinterfragt werden sollte, ob die Möglichkeit der Vergleichbarkeit beider Geschlechter hinsichtlich der Hypertrophieentwicklung überhaupt möglich ist. Aus diesen Gründen erfolgte die Auswertung und Bewertung der übrigen Daten geschlechterdifferenziert. Zusätzlich erlaubt die differenzierte Betrachtung, Rückschlüsse auf einen möglichen geschlechterspezifischen Effekt einer HIF-1 -abhängigen Hypertrophieantwort zu ziehen.

Der kardiale Funktionsverlust war anhand der echokardiographischen Befunde auf eine systolische Dysfunktion zurückzuführen. Das FS errechnet sich aus den beiden Parametern LVEDD und LVESD und erlaubt daher in diesem Zusammenhang eine Aussage bezüglich der systolischen bzw. diastolischen Funktion zu treffen. Der LVESD stieg in den HIF-1 ^+/- -Männchen 3 Wochen nach TAC an, zeitgleich war das FS signifikant reduziert. In den HIF-1 ^+/--Weibchen verzögerte sich diese Veränderung im Vergleich zu den HIF-1 ^+/--Männchen und zeigte den Anstieg des LVESD erst 11 Wochen post operationem. Dennoch war bereits 8 Wochen nach der TAC-Operation eine Einschränkung im FS zu erfassen. Gleichwohl gibt das FS einen Hinweis auf die Möglichkeit des Auftretens von kardialem Herzversagen, welches in verschiedenen Studien an transgenen Tieren im LVH-Modell bei weiblichen Tieren später auftrat als bei männlichen (CZUBRYT et al. 2003, LEINWAND et al. 2003, DU 2004). Diese Beobachtung lässt sich, basierend auf den echokardiographischen Befunden, auf die HIF-1 +/--Tiere übertragen. Einen Hinweis auf mögliche diastolische Dysfunktionen in den HIF-1 ^+/- -Tieren ergaben die Daten der vorliegenden Studie nicht.

Zusammenfassend lässt sich im Hinblick auf die echokardiographischen Befunde, der Rückschluss ziehen, dass HIF-1 keinen Einfluss auf die Art und Ausprägung der LVH hatte, aber das Herz hinsichtlich der Entwicklung und des Auftretens von kardialem Herzversagen zu schützen vermag, belegt durch die signifikant stabilere kardiale Funktion in HIF-1 ^+/+ -Tieren sowohl männlichen als auch weiblichen Geschlechts.

In Übereinstimmung mit den zuvor erläuterten Daten bezüglich Art und Ausprägung der kardialen Hypertrophie geben auch die immunhistologischen Daten keinen Anhaltspunkt für Unterschiede im Hypertrophiemuster. VEGF, als Zielgen von HIF-1, spielt eine zentrale Rolle

im Zuge von Angiogenese und Neovaskularisation. Es agiert dabei über seine Rezeptoren VEGFR-1 und VEGFR-2 in den Endothelzellen (JAKEMAN et al. 1992). FORSYTHE et al.

wiesen 1996 in hypoxischen Zellen eine gesteigerte VEGF-Expression in Abhängigkeit von HIF-1 nach. Demnach würde ein Mangel an HIF-1, wie er auch in HIF-1 ^+/--Tieren auftritt, eine verringerte VEGF-Expression nach sich ziehen und die Möglichkeit der Gefäßausbreitung- und neuentstehung limitieren. Zwischen den HIF-1 ^+/+- und HIF-1 ^+/- -Tieren konnten eineinhalb Wochen nach induzierter mechanischer Last keine Differenzen in der Dichte und Verteilung bezüglich des VEGFR-2, welcher einen Marker für angiogenes Endothel darstellt, erfasst werden. Dies legt die Vermutung nahe, dass die HIF-1 -Expression auch in den heterozygoten Tieren noch hinreichend ist, um die angiogene Antwort nach TAC zu bewerkstelligen. Dieses Resultat steht im Kontrast zu einer früheren Studie, in der kardiomyozyten-spezifische HIF-1 -Knockout-Mäuse, mit einer Gendeletion von ca. 90%, nach TAC eine verringerte VEGF-Expression, verbunden mit einer reduzierten Kapillardichte aufwiesen (SANO et al. 2007). Die konträren Ergebnisse sind möglicherweise in der unterschiedlichen Totalexpression von HIF-1 der verschiedenen Mauslinien zu begründen.

Ein 90%iger Verlust des Transkriptionsfaktors HIF-1 und demnach lediglich eine 10%ige Expressionsaktivität desselben scheint nicht ausreichend, um die VEGF-Expression unter mechanischer Belastung des Herzens in adäquatem Maße aufrechtzuerhalten, eine Reduktion um 30-50% und damit einer 50-70%igen Totalexpression in HIF-1 ^+/--Mäusen hingegen vermag dies noch zu tun.

Im Gegensatz zur kardialen Hypertrophie konnte für die kardiale Funktion ein Einfluss von HIF-1 nachgewiesen werden. Dieser wurde anhand echokardiographischer Befunde

ausfindig gemacht und war in weiteren Untersuchungen auf Einzelzellebene näher charakterisiert worden.

HASENFUSS et al. (1994) sahen einen wesentlichen Faktor für systolische und diastolische Funktionsstörungen des hypertrophierten und insuffizienten Herzens in einer Dysregulation des Ca²⁺-Handlings der Kardiomyozyten begründet. Auch LEHNART et al. (2009) sahen zur Aufrechterhaltung einer stabilen Herzfunktion ein intaktes Ca²⁺-Handling in Herzmuskelzellen sowohl unter Ruhebedingungen als auch unter fortwährender erhöhter mechanischer Last als entscheidende Voraussetzung an.

In der vorliegenden Arbeit wurde die kardiale Funktion schließlich im Falle männlicher Mäuse mit Hilfe von Ca²⁺-Epifluoreszenz-Analysen an isolierten Einzelkardiomyozyten charakterisiert. Zu einem Zeitpunkt von 3 Wochen nach TAC-Intervention war echokardiographisch in männlichen HIF-1 ^+/--Mäusen ein signifikanter Abfall im FS zu beobachten, welcher sich zusätzlich signifikant vom FS der männlichen Wildtypgeschwister unterschied. Aus dieser Tatsache heraus und der Annahme, dass die Kontraktilität des Herzens im Wesentlichen durch Ca²⁺-Ionen vermittelt wird, erfolgten die Ca²⁺ -Epifluoreszenz-Analysen. Die weiblichen Mäuse zeigten zum genannten Zeitpunkt keine signifikanten Veränderungen im FS, so dass hier nicht von einer Funktionseinschränkung auszugehen war.

Parallel zu den Ca²⁺-Epifluoreszenz-Analysen wurde mit einer Myozytenkamera die fraktionelle Verkürzung einzelner Sarkomere des ausgewählten Kardiomyozyten optisch gemessen. Die eingeschränkte Kontraktilität des Herzens als Gesamteinheit bzw. als funktionale Einheit, konnte somit auf Einzelzellebene bestätigt werden, denn auch in den isolierten ventrikulären Kardiomyozyten war in Form einer schwächeren Myozytenverkürzung die eingeschränkte Kontraktilität der HIF-1 ^+/--Mäuse im Vergleich zu

HIF-1 ^+/+-Mäusen zu beobachten. Dieses Ergebnis bekräftigt die in der Echokardiographie erhobenen Messungen zum FS, sollte natürlich vor dem Hintergrund der Methodik aber kritisch betrachtet werden: Zum einen war ein Einfluss durch, wenn auch standardisierte, Isolation der Kardiomyozyten auf die Messergebnisse nicht völlig auszuschließen. Diesem Kriterium wurde insofern Einhalt geboten, als dass nur Zellen dem Messprotokoll unterzogen wurden, welche unter Grundstimulation von 1 Hz bezüglich der Myozytenverkürzung mehr als 1,5 % RZL aufwiesen. Ein weiterer Aspekt, bezüglich der Messung auf Einzelzellebene, bezieht sich auf Diskrepanzen zwischen der Untersuchung von ganzen Organsystemen, wie dem Herzen als solches und isolierter Einzelzellen. Ergebnisse einer Untersuchung auf Zellebene lassen sich nicht unbedingt auf das gesamte zugehörige Organ extrapolieren. Daher sollte zur genauen wissenschaftlichen Identifizierung von biologischen Effekten idealerweise eine Kombination geeigneter Methoden erfolgen. In der vorliegenden Arbeit konnte die Einschränkung in der kardialen Funktion von HIF-1 ^+/--Mäusen auf zweierlei methodischen Wegen identifiziert werden, somit bekräftigen sich die Resultate der Messungen einander.

Im Rahmen der Ca²⁺-Epifluoreszenz-Messungen wurde die intrazelluläre Ca²⁺ -Transienten-Amplitude (F/F0) einzelner Kardiomyozyten bestimmt. Hierbei konnte im TAC-Sham-Vergleich der HIF-1 -defizienten Mäuse ein signifikant geringeres F/F₀ in den TAC-Mäusen detektiert werden. In HIF-1 ^+/+-Mäusen waren keine signifikanten Unterschiede zwischen TAC- und Sham-Tieren ersichtlich. Die vergleichsweise geringere Amplitude steht im Einklang mit der ermittelten verminderten Kontraktilität in den HIF-1 -^+/--Mäusen nach TAC.

Dieser unter allen Stimulationsfrequenzen beobachtete negativ inotrope Effekt zeigt, dass in HIF-1 -^+/--Mäusen weniger intrazelluläres Ca²⁺ für die Besetzung des Troponin C der kontraktilen Myofilamente und damit zum Auslösen der Kontraktion zur Verfügung stand.

Ein möglicher Hintergrund dieser Beobachtung mag ein generell erniedrigter Ca²⁺-Gehalt im SR der Kardiomyozyten HIF-1 defizienter Mäuse sein. Nach erfolgter Depolarisierung der sarkolemmalen Membran gelangt das Ca²⁺ via spannungsabhängigem LTCC in die Zelle.

Getriggert über diesen Ca²⁺-Einstrom, wird über den RyR2 das im SR gespeicherte Ca²⁺

freigesetzt, welches nun die Bindungsstellen am Troponin C besetzt. Der SR-Ca²⁺-Gehalt kann in Form koffeininduzierter Ca²⁺-Transienten ermittelt werden, da infolge des Koffeins die RyR2 geöffnet werden und sich das gesamte im SR gespeicherte Ca²⁺ schlagartig entleert.

Die signifikant erniedrigten Ca²⁺-Transienten-Amplituden nach Koffeininduktion in HIF-1 +/--Mäusen erlauben es, die verminderte Kontraktilität und die damit einhergehende Beeinträchtigung der kardialen Funktion HIF-1 defizienter Mäuse auf einen geringeren

SR-Ca²⁺-Gehalt zurückzuführen.

Der verminderte SR-Ca²⁺-Gehalt könnte auf eine unzureichende Wiederaufnahme des Ca²⁺ in das SR während der Relaxationsphase der Kardiomyozyten hindeuten. Dies hätte einerseits zur Folge, dass nicht genügend Ca²⁺ für erneute Kontraktionen zur Verfügung stände, andererseits führt die nicht adäquat ablaufende Relaxation zu mangelnder diastolischer Ventrikelfüllung sowie verminderter Myokardperfusion. In diesem Zusammenhang wäre (eine unzureichende SERCA-2a-Expression oder aber) eine eingeschränkte Tätigkeit der SERCA-2a, welche diese Wiederaufnahme des Ca²⁺ in das SR bewerkstelligt, als Ursache in Erwägung zu ziehen. Die Tatsache, dass sowohl der diastolische Ca²⁺-Abfall (RZ50% [Ca²⁺]i) als auch die RZ_50% der Kardiomyozyten sich als rein TAC-abhängiger Effekt signifikant erhöht darstellte und dabei kein Einfluss des Genotyps identifizierte werden konnte, macht die Annahme der eingeschränkten SERCA-2a-Funktion als Ursache jedoch eher unwahrscheinlich.

Neben der SERCA-2a wird die Ca²⁺-Extrusion aus dem Zytosol auch über den NCX bewerkstelligt. Dieser schleust Ca²⁺ im Austausch gegenNa⁺ aus der Zelle, jedoch zu einem wesentlich geringeren Anteil als die SERCA-2a. Dennoch ist denkbar, dass langfristig eine erhöhte Aktivität des NCX und damit eine vermehrte Ca²⁺-Extrusion den SR-Ca²⁺-Gehalt der Zelle absenkt. Eine Aussage über die NCX-Funktion ist über die Relaxationszeit der koffeininduzierten Ca²⁺-Transienten F/F₀ zu treffen. Für die Dauer der Koffeinapplikation ist zum einen der RyR2 geöffnet, zum anderen die SERCA-2a inaktiv. Das bedeutet jeglicher Abfall in der Ca²⁺-Transienten-Amplitude F/F₀ nach Koffeininduktion ist zu diesem Zeitpunkt dem NCX zuzuschreiben. Als geeignetes Maß hierfür hatte sich diejenige Relaxationszeit erwiesen, die benötigt wird, um die koffeininduzierte Ca²⁺-Transienten-Amplitude um 80%

zu reduzieren (RZ_80%[Ca²⁺]_i). Die RZ_80%[Ca²⁺]_i der koffeininduzierten Amplitude zeigte keinen Unterschied zwischen HIF-1 ^+/+- und HIF-1 ^+/--Mäusen nach TAC. Daher ist davon auszugehen, dass sich die NCX-Aktivität nach TAC unabhängig von HIF-1 verhält.

Eine andere Erklärung für den geringeren SR-Ca²⁺-Gehalt in HIF-1 ^+/--Mäusen wäre in einem RyR2-Leck zu begründen. Hierdurch würde unabhängig von der koordinierten Herzmuskelaktion je nach Schwere fortwährend eine bestimmte Menge Ca²⁺ verloren gehen und den Gehalt im SR senken. Resultat sind zum einen der ständige Ca²⁺-Verlust, der die Kontraktionskraft des Herzens mindert, zum anderen Herzarrhythmien durch die unkoordinierten Ca²⁺-Ausschüttungen. RyR2-Lecks können mittels sogenannter Ca²⁺ -Sparks-Analysen (spark, engl: Funke) detektiert werden. Ein Ca²⁺-Spark bezeichnet prinzipiell einfach die Ca²⁺-Freisetzung aus dem SR, sowohl im Ruhezustand als auch während der elektromechanischen Kopplung, mit dem Unterschied, dass während der elektromechanischen Kopplung mehrere 1000 Ca²⁺-Sparks in jeder Zelle durch das eintreffende Aktionspotential

synchronisiert werden und eine koordinierte Kontraktion ausgelöst wird (BERS 2002). Die RyR2-Lecks würden somit unter Ruhebedingungen neben der eigentlichen Kontraktion spontane lokale Ca²⁺-Transienten auslösen, bedingt durch die zufällige Öffnung der RyR2.

Diese zufälligen Ca²⁺-Ausschüttungen können mit Hilfe von Ca²⁺-Fluoreszenzfarbstoffen und konfokaler Laser-Mikroskopie erfasst und ausgewertet werden. Somit wäre die Möglichkeit gegeben den geringeren SR-Ca²⁺-Gehalt in den Kardiomyozyten der HIF-1 defizienten Mäuse eingehender zu charakterisieren.

Eine weitere Komponente, die sich auf den SR Ca²⁺-Gehalt von Kardiomyozyten auswirkt ist

Eine weitere Komponente, die sich auf den SR Ca²⁺-Gehalt von Kardiomyozyten auswirkt ist