Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie und

Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren

Markus Kalberer HCI, E330 Tel. 632 29 29

kalberer@org.chem.ethz.ch

Selektivität einer Trennmethode Quantitative Methoden

Kapitel 2: Gas-Chromatographie (GC)

Trennung von eher flüchtigen Substanzen

Überblick über die für GC üblichen Trennsysteme

Aufbau und Funktion eines Gaschromatographen und der gebräuchlichsten Detektoren

Kapitel 3: Flüssig-Chromatographie (LC)

Trennung von eher polaren, weniger flüchtigen Substanzen

Aufbau und Funktion einer Flüssigchromatographie-Apparatur und der gebräuchlichen Detektoren

Überblick über verschiedene Varianten der LC

Kapitel 4: Elektrophoretische Trennverfahren

Kurzer theoretischer Überblick – Unterschiede zur Chromatographie Aufbau und Funktion einer Messapparatur

Kapitel 5: Probenaufarbeitung

Extraktions-, Aufkonzentrations-, Reinigungsmethoden

Bücher

D.A. Skoog, J.J. Leary,

Instrumentelle Analytik, Grundlagen, Geräte, Anwendungen, Springer, Berlin, 1996

K. Cammann,

Instrumentelle Analytische Chemie, Verfahren, Anwendungen, Qualitätssicherung,

Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 2001

R. Kellner, J.-M. Mermet, M. Otto, H.M. Widmer, Analytical Chemistry,

Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 1998

K. Robards, P.R.Haddad, P.E. Jackson,

Principles and practice of modern chromatographic methods, Academic Press, London, 1994

... und viele mehr, siehe u.a. Chemie Bibliothek !

1. Theoretische Grundlagen 1.1 Typen von Trennmethoden

Trennung verschiedener Komponenten in der chemischen Analytik beruht im allgemeinen auf Unterschieden in der Verteilung zwischen zwei Phasen und/oder in der Beweglichkeit innerhalb einer Phase der zu trennenden Substanzen. Es werden bevorzugt eindimensionale Trennverfahren eingesetzt, bei denen eine Bewegung aller Komponenten in der gleichen Richtung erfolgt. Die folgenden Bewegungstypen sind relevant:

Typ 1 Typ 2 Typ 3

1 2

1

2 1

2

Elektrophorese (Kap. 4) Gas Chromatographie Membrantrenn-

Isoelektrische Fokussierung GC (Kap. 2) verfahren

Isotachophorese Flüssig Chromatographie Dialyse

Kapillarzonenelektrophorese HPLC (Kap. 3) Elektrodialyse (CZE)

Mischformen:

Gelpermeationschromatographie

Elektrokinetische Micellarchromatographie SDS-PAGE (Trägerelektrophorese)

Zweidimensionale Trennmethoden sind meist zwei zeitlich hintereinander geschaltete eindimensionale Trennungen. In der Polypeptidanalytik kommen z.B. häufig 2D- Elektrophoresemethoden zur Anwendung (Trennung nach Molmasse und isoelektrischem Punkt).

Trennkriterien:

a) Kinetische Eigenschaften

b) Gleichgewichtseigenschaften (Phasengleichgewichte, Verteilungsgleichgewichte) Oft liegt eine Kombination von a) und b) vor.

a) Trennmethoden unter Ausnutzung von kinetischen Eigenschaften:

Massenspektrometrie Elektrophorese Ultrazentrifuge Enzymatischer Abbau

Trennverfahren mit porösen Membranen (Dialyse, Elektrodialyse, Gasdiffusion)

b) Trennmethoden unter Ausnutzung von Gleichgewichtseigenschaften

- Phasengleichgewichte: Phasen gebildet durch zu trennende Komponenten (z.B. Destillation)

- Verteilungsgleichgewichte: Phasen enthalten zum grossen Teil Spezies, die nicht zum zu trennenden Gemisch gehören (z.B. GC, HPLC)

Übersicht über verschiedene Trennmethoden

zweite Phase

gasförmig fluid flüssig fest

gasförmig thermische Diffusion

Gas-Flüssigkeits- Chromatographie

Gas-Adsorptions- Chromatographie

fluid Fluid-Flüssigkeits-

Chromatographie

Fluid-Adsorptions- Chromatographie

flüssig Destillation

Flotation

Flüssigkeits- Flüssigkeits- Chromatographie Dialyse

Flüssig-Flüssig- Extraktion Ultrafiltration

Flüssigkeits- Adsorptions- Chromatographie Ionenaustausch Ausfällen Kristallisieren Abscheiden

(Zonenelektrophorese) Erste

Phase

fest Sublimation Fluid- Fest- Extraktion

Flüssig-Fest- Extraktion

Übersicht über Chromatographische Methoden

mobile Phase

flüssig fluid gasförmig

fest Flüssigkeits-Adsorptions- Chromatographie

Tswett, 1906

Kuhn, Winterstein, Lederer, 1931

Superkritische Fluid-

Adsorptions- Chromatographie Klesper, 1962 Rijnders, 1966 Novotny, 1981

Gas- Adsorptions- Chromatographie Ramsay, 1905 Cremer, 1951 Janak, 1953 stationäre

Phase

flüssig Flüssigkeits-Flüssigkeits- Chromatographie

Martin, Synge, 1941

Superkritische Fluid-

Flüssigkeits - Chromatographie Klesper, 1962

Gas- Flüssigkeits - Chromatographie James, Martin, 1952

1.2 Anschauliches Konzept für das Funktionsprinzips der Chromatographie:

Gedanklich kann man sich eine chromatographische Trennung als eine Reihe von diskreten Extraktionen vorstellen, bei denen sich die Analyten entsprechend ihrem Verteilungsgleichgewicht (Stoffkonstante) zwischen zwei Phasen verteilen. Vorraussetzung ist, dass sich die zwei Phasen nicht ineinander mischen.

Phase 1 (z.B. Wasser)

Phase 2 (z.B.

organisches Lösungsmittel)

Analyt zuerst 100% in dieser Phase

weniger Analyt

mehr Analyt

Zeit

Sind zwei Analyten A und B (mit unterschiedlichem Verteilungsgleichgewicht) in unserem System, haben wir eine Trennung der beiden Analyten erreicht.

Phase 1

Phase 2

A nd B zuerst 100% in dieser Phase

weniger A

,

mehr B

mehr A ,

weniger B

Zeit

Eine vollständige Trennung von A und B kann mit einer einmaligen Extraktion nicht erreicht werden. Um eine bessere Trennung zu erreichen, können mehrere Extraktionen hintereinander durchgeführt werden.

beliebige Wiederholungen neue Phase 2

neue Phase 1

Dieses Konzept kann man sich nun kontinuierlich vorstellen:

Phase 1 Phase 2

Die Phasen müssen gegen einander fliessen, sonst wird das System zu einer einzigen grossen Extraktionsstufestufe. Sie dürfen aber nicht zu schnell fliessen, sodass lokal jeweils Gleichgewichte etabliert werden können. Diese Methode heisst Gegenfluss-Extraktion (Countercurrent Extraction).

Da experimentell sehr aufwändig, wird die Gegenfluss-Extraktion jedoch nur selten angewendet.

Viel praktikabler ist es, wenn Phase 2 fest statt flüssig ist. In einer solchen Anordnung fliesst eine Flüssigkeit (Phase 1) über die feste Phase 2, was technisch sehr leicht zu machen ist.

Definition der Chromatographie:

• Physikalische Trennmethode, bei der die zu trennenden Komponenten zwischen einer feststehenden (stationären) und einer beweglichen (mobilen) Phase verteilt werden.

• Im Idealfall verteilen sich alle zu trennenden Substanzen unterschiedlich zwischen den zwei Phasen.

Hauptanwendungen für chromatographische Methoden:

• Analytische Anwendungen

• Präparative Anwendungen Grundarten der Chromatographie:

• Säulenchromatographie

• Planare Chromatographie

Fluss- richtung

Trennung eines Gemisches von A und B in einer Säulenchromatographie und das zeitabhängige Detektorsignal.

mobile Phase

A+B

A B

A B

Zeit

Zeit

t

t

1.3 Einflussfaktoren der Wandergeschwindigkeit einer Verbindung in einem Chromatographischen System

1. Verteilungskoeffizient K beschreibt das Verhältnis der Konzentrationen der Substanz A in der mobilen und der stationären Phase im thermodynamischen Gleichgewicht.

!

A_mobil thermodynamischesGleichgewicht

" $ $ $ $ $ $ $ $ # A_stationär

!

K =

[ ]

[ ]

(1.1)

Falls verschiedene Substanzen in einem gegebenen chromatographischen System verschiedene K’s aufweisen, kann eine Trennung erreicht werden.

2. Retentionszeit tR beschreibt die Zeit die eine Substanz braucht um ein chromatographisches System zu durchlaufen.

Der erste Peak mit der Retentionszeit tM stellt eine Substanz dar, die von der stationären Phase nicht zurückgehalten wird. tM wird häufig als dead time oder solvent delay bezeichnet.

Zeit t R,1

t M

M 1

Detektorsignal

3. Kapazitätsfaktor k’ (auch Retentionsfaktor) beschreibt die Wanderungsgeschwindigkeit von einer Substanz in einer Säule.

!

k_A^' =K_A V_S

V_M (1.2)

wobei KA der Verteilungskoeffizient von A, Vs der Volumen der stationären Phase und VM

das Volumen der mobilen Phase Durch Umformungen erhält man

!

k_A^' =t_R "t_M

t_M (1.3)

4. Selektivitätsfaktor α beschreibt die Wanderungsgeschwindigkeit zweier Substanzen A und B relativ zueinander. α ist definiert als

!

"=K_B

K_A (1.4)

wobei per Definition A immer jene Substanz ist, die schwächer zurückgehalten wird, sodass α immer grösser 1 ist.

Ersetzen von K_A und K_B in Gleichung (1.4) durch k’ (Gleichung (1.2) und (1.3)) erhält man eine Gleichung, die den Selektivitätsfaktor als Funktion der Retentionszeiten ausdrückt,

!

"=t_R,B #t_M

t_R,A #t_M (1.5)

wobei t_R,B die Retentionszeit der Substenz B ist und t_R,A die Retentionszeit der Substanz A.

Später in diesem Kapitel sehen wir, dass man α und k’ benutzen kann um die Trennleistung einer chromatographischen Säule zu optimieren.

1.4 Effizienz einer chromatographischen Säule

Wir können das zu Beginn verwendete Bild der hintereinander geschalteten Extraktionen wieder verwenden, bei denen sich für jede Substanz jeweils das Verteilungsgleichgewicht zwischen den Phasen einstellt. Entsprechend diesem Konzept ist es erstrebenswert, wenn möglichst viele Extraktionen hintereinander durchgeführt werden, um eine möglichst vollständige Trennung zu erhalten. Diese theoretischen Extraktionen werden theoretische Böden N genannt, wobei die Effizienz einer Säule mit der Anzahl der theoretischen Böden N zunimmt.

Um N experimentell aus einem Chromatogramm zu bestimmen, müssen wir uns zuerst die Form eines typischen (idealen) Elutionspeaks in einem Chromatogramm ansehen.

tr ist die Retentionszeit, w die Basispeakbreite, und σ die Standardabweichung der Peakbreite.

Für einen idealen Peak gilt

!

w=4" (1.6)

!

"² =w²

16 (1.7)

σ² nennt man Varianz und stellt ein Mass für die Breite des Peaks dar.

Die Effizienz einer chromatographischen Säule, ausgedrückt als Anzahl theoretischen Böden N, kann man definieren als

!

N = t_R²

"² (1.8)

Zeit

Detektorsignal

t R

w σ

Da es oft nicht sehr praktisch ist σ² aus einem Chromatogramm herauszulesen kann man Gleichung (1.7) in (1.8) einsetzten und erhält

!

N =16 t_R w

"

#

$ $

%

&

' '

2

(1.9)

Die Anzahl der theoretischen Böden nimmt mit zunehmender Säulenlänge zu. Um unterschiedlich lange Säulen dennoch miteinander vergleichen zu können, wurde ein weiterer Parameter definiert, die Bodenhöhe H

!

H= L

N (1.10)

wobei L die Länge der Säule ist, die oft in mm angegeben wird.

Typische Werte von H und N für verschiedene chromatographische Methoden sind in Tabelle 1.1 zusammengestellt.

Tabelle 1.1. Bodenzahl und Bodenhöhe für typische Gaschromatographie (GC)- und Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC)-Säulen

Säulentyp N (pro Säule) H (mm)

GC, Kapillarsäulen, 25m

0,5 mm Innendurchmesser 20’000 – 50’000 0,5 – 1,3 0,1mm Innendurchmesser 30'000 - 100’000 0,2 – 0,6 HPLC, 25cm

10µm Partikel 2’500 – 5’000 0,05 – 0,1

3µm Partikel 8’000 – 18’000 0,02 – 0,05

1.5 Einfluss von kinetischen Säulenvariablen auf die Bodenhöhe H

In einem chromatographischen System fliesst die mobile Phase fortlaufend über die stationären Phase, wodurch die Analyten von der mobile Phase stets weiter getragen werden, bevor sich ein tatsächliches thermodynamisches Verteilungsgleichgewicht einstellen kann.

Die Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase hat daher einen entscheidenden Einfluss auf die Trenneffizienz einer Säule.

Mit der folgenden Gleichung kann die Änderung der Effizienz (ausgedrückt als H) in Abhängigkeit der Fliessgeschwindigkeit beschrieben werden (Van-Deemter-Gleichung, hier die modifizierte Form nach Hawkes). Die Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase wird mit u bezeichnet.

!

H= B

u +c_su+c_mu (1.11)

!

B

u beschreibt die longitudinale Diffusion des Analyten von Bandenzentrum weg. Dieser Term ist proportional zur Zeit, welche die Substanzen in der Säule verbringen, also umgekehrt proportional zur Strömungsgeschwindigkeit in der Säule (vor allem wichtig in der Gaschromatographie).

Massentransfer-Effekte:

!

c_su +

!

c_mu

Die Einstellung des Gleichgewichts zwischen mobiler und stationärer Phase wird vom Massentransfer der Analytmoleküle zwischen den zwei Phasen bestimmt. Man unterscheidet dabei den Anteil in der stationären und in der mobilen Phase.

!

c_su beschreibt die Verzögerung des Massentransfers aufgrund von Eigenschaften der stationären Phase. Die Dicke der stationären Phase hat den weitaus wichtigsten Einfluss auf diesen Term, aber auch der Diffusionskoeffizient des Analyten in der stationären Phase spielt eine Rolle.

Flussgeschwindigeit Diffusion

!

c_mu beschreibt den Massentransfer der mobilen Phase, auch Wirbel-Diffusion genannt und beschreibt u. a. die unterschiedlichen Weglängen, welche die Analytmoleküle in der Säule zurückzulegen. Dieser Faktor ist weitgehend von der Strömungsgeschwindigkeit unabhängig (v.a. wichtig in der Flüssigchromatographie).

Graphische Darstellung der Van-Deemter-Gleichung

16 14 12 10 8 6 4 2 0

Bodenhöhe (H)

8 6

4 2

Flussgeschwindigkeit, cm/s

H

c_su

c_mu

B/u

1.6 Auflösung einer Säule

Die Auflösung einer Säule R_s beschreibt wie gut die Peaks von zwei Substanzen voneinander getrennt werden und kann direkt aus einem Chromatogramm berechnet werden. Eine hohe Auflösung erreicht man, wenn zwei Peaks möglichst gut voneinander getrennt sind und wenn sie eine scharfe Peakform aufweisen.

!

R_s= t_R,B "t_R,A w_A

2 + w_B

2

Durch weitere Umformungen erhält man eine Beziehung, die Rs beschreibt als eine Funktion der Bodenzahl N, des Selektivitätsfaktors α und des Kapazitätsfaktors k’B.

!

R_s= N 4

" #1

"

$

% & ' ( ) k_B^'

1+k_B^'

$

%

&

&

' (

) ) (1.12)

Detektorsignal

t R, B

wA wB

t R, A

Zeit

1.7 Optimieren einer chromatographischen Methode

Bei praktischen Anwendungen ist es häufig wünschenswert, die Retentionszeiten zu verringern. Dabei muss jedoch geachtet werden, dass die Auflösung nicht zu klein wird.

Unter Zuhilfenahme obiger Definitionen kann man die Retentionszeit darstellen als

!

t_R =16R_s²H u

"

"#1

$

% & '

( )

(

)

k_B^'

( )

wobei u die Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase ist.

Aus den Gleichungen (1.12) und (1.13) ist ersichtlich, dass die beiden Parameter Rs und tR

von α^{, k’,} N, und im Falle von t_R auch noch von H abhängen. Alle diese Faktoren können optimiert werden.

α hängt von den Analyteigenschaften ab und kann u.a. verändert werden durch variieren der Säulentemperatur, der stationären Phase (z.B. Veränderung der Polarität) oder mobilen Phase (z.B. ändern des pH). Bei einer Veränderung der mobilen Phase kann oft eine bessere Selektivität erreicht werden, ohne dass die k’-Werte sich gross ändern.

k’ ist ein Parameter, der von der stationären Phase und dem Analyten abhängt. Oft erreicht man durch eine höhere Temperatur eine Erhöhung von k’ und damit eine bessere Auflösung. k’-Werte >10 erhöhen die Auflösung Rs meist kaum mehr und haben nur noch eine verlängerte Retentionszeit zur Folge.

10 8

6 4

2 0

Kapazitätsfaktor, k' Auflösung R_s

Retentionszeit t_R

Oft ist eine Auflösung bei Kapazitätsfaktoren zwischen 5-10 ideal.

N kann durch die Länge der Säule oder durch die Bodenhöhe verändert werden (siehe unten und Diskussion der Van-Deemter-Gleichung)

H wird stark beeinflusst durch die Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase, sowie den Parametern, die in die Van-Deemter-Gleichung einfliessen (Diffusionskoeffizient des Analyten in der mobilen und stationären Phase, Dicke der stationären Phase und Teilchengrösse der Packung (siehe Kap. 1.5)).

In der Praxis ist es oft üblich, die Bedingungen während eines chromatographischen Experiments zu ändern, da nicht alle Peaks bei den gleichen Bedingungen genügend getrennt werden können. So wird z.B. in der Gaschromatographie sehr häufig die Temperatur während eines Experiments laufend erhöht und in der Flüssigchromatographie die Zusammensetzung der mobilen Phase (sog. Gradientenelution).

Einfluss der verschiedenen Faktoren auf die Auflösung anhand eines Beispiels:

1.8 Nicht ideale Elutionspeaks

Symmetrische, gaussförmige Elutionspeaks werden in den praktischen Anwendungen leider oft genug nicht gemessen. Abweichungen von der Gleichgewichtsverteilung zwischen mobiler und stationärer Phase haben eine nicht ideale Peakform zur Folge, wie auf folgender Darstellung ersichtlich ist.

1 2 3

1 lineare Isotherme: Konzentrationsunabhängige Verteilung (Idealfall) zwischen mobiler und stationärer Phase.

Folgen: Symmetrisches Signal; Retentionszeit

nicht von injizierter Probenmenge beeinflusst

2 Tailing: Wegen Übersättigung der stationären Phase (häufig Normalfall) werden grosse Probenkonzentrationen

(überladene Säule zu wenig stark zurückgehalten.

mit Komponenten Folgen: Verschiebung des Peakmaximums in

relativ niedriger Retention) Richtung kleinerer Retention, asymmetrisches Signal und Verkürzung der Retentionszeit bei

hohen Probenkonzentrationen.

3 Fronting (leading): Tritt z.B. dann auf, wenn grosse Mengen von (überladene Säule mit Probekomponenten in der stationären Phase

Komponenten kondensieren.

relativ hoher Retention) Folgen: Asymmetrisches Signal und eine

Zunahme der Retentionszeit bei grossen

Probenkonzentrationen.

1.9 Quantitative Methoden

Chromatographische Methoden hätten in den letzten Jahrzehnten wohl nicht die Wichtigkeit erlangt, wenn nicht sehr präzise quantitative Aussagen möglich wären. Man unterscheidet im wesentlichen drei Quantifizierungsmethoden: die Quantifizierung mittels externem Standard und mittels internem Standard und die Standardaddition.

Externer Standard

In den Analyseproben werden die Peakhöhen oder Peakflächen der zu quantifizierenden Substanzen ermittelt, die dann anhand der Kalibrationsgerade (Konzentration- Signalintensitäts-Beziehung) in Konzentrationen umgerechnet werden.

Ein Nachteil dieser Methode ist, dass die aufgetragenen Probemengen für die Standardproben und die Analyseproben genau übereinstimmen müssen. Da oft sehr kleine Mengen (µl) eingesetzt werden, kann dies zu grossen Fehlern führen.

Konzentration der Analyten

In den eigentlichen Proben können unter Umständen Störungen auftreten, welche die Elution, oder Detektion des Analyten beeinträchtigen, die aber in den Standardproben nicht vorhanden waren und somit auch in der Kalibrationsgerade nicht berücksichtigt werden konnten.

Interner Standard

Bei dieser Methode werden den Standardproben eine oder mehrere zusätzliche Substanzen beigegeben, die man nicht in den Analyseproben erwartet (oft verwendet man markierte Verbindungen z.B. mit ¹³C- oder ²H-Atomen). Diese Substanzen nennt man Interne Standards.

Konzentration der Analyten Peakhöhe des AnalytenPeakhöhe des Analyten Peakhöhe des internen Standards

Für die Kalibrationsgerade wird nun das Verhältnis der Peakhöhen von Analyt und Internem Standard gegen die Konzentration des Analyten aufgetragen, wobei für alle Messungen der Kalibrationsgerade die Konzentration des Internen Standards gleich gross ist und die Konzentration der zu quantifizierenden Substanzen variiert wird.

Zu den Analyseproben wird nun dieselbe Menge an Internem Standards zugegeben. Aus dem Verhältnis von Analyt und Internem Standard kann die gesuchte Konzentration des Analyten mit Hilfe der Kalibrationsgerade ermittelt werden. Diese Methode ist viel weniger anfällig auf Änderungen der Analysemengen.

Standardaddition

Bei der Standardaddition werden mehrmals immer gleiche Probemengen von bekannten Konzentrationen des Analyten der Probe beigegeben. Durch Extrapolation der Messkurve auf den Schnittpunkt der Konzentrationsachse kann die Konzentration der Probelösung bestimmt werden.

Konzentration der Analyten

-10 -5 0 5 10 15 Konzentration

in der Probe

Blindwert

Zu jeder quantitativen Bestimmung gehört neben der Konzentrationsbestimmung der Probe auch eine Bestimmung des Blindwertes, womit Spuren des Analyten im Lösungsmittel und weiteren Reagenzien (z.B. Puffer) bezeichnet werden, sowie Verunreinigungen, die durch die Aufbereitung in die Probe gelangen. Zur Bestimmung des Blindwertes wird die Konzentration des Analyten in einer sogenannten Blindprobe bestimmt, die genau gleich zusammengesetzt ist (Lösungsmittel, Standards, ev. weiter Zusätze) und aufgearbeitet wird wie eine echte Probe, jedoch keine Probelösung enthält.

Die Analytkonzentration in der Blindprobe muss von der Konzentration der Probelösung abgezogen werden um ein korrektes Messergebnis zu erhalten.

Peakhöhe des Analyten