Analytische Chemie

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Thomas Schmid

HCI D323

schmid@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/

Literatur

K. Cammann,

Instrumentelle Analytische Chemie: Verfahren, Anwendungen, Qualitässicherung Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 2001

G. Schwedt,

Analytische Chemie: Grundlagen, Methoden und Praxis Verlag Wiley-VCH, Weinheim, 2008 (2. Auflage)

D. A. Skoog, J. J. Leary,

Instrumentelle Analytik, Grundlagen, Geräte, Anwendungen, Springer, Berlin, 1996

K. Robards, P. R. Haddad, P. E. Jackson,

Principles and practice of modern chromatographic methods, Academic Press, London, 1994

Internet: http://www.chemgapedia.de

Skript- und Folien-Download: http://www.analytik.ethz.ch/

Gedrucktes Skript im HCI-Shop erhältlich

Analytische Chemie

Die Analytische Chemie befasst sich mit der Untersuchung von Proben auf ihre chemische Zusammensetzung. Hierbei werden die Stoffe, die in der Probe nachgewiesen werden sollen, als „Analyten“ bezeichnet.

Analyten können sowohl Atome bzw. Ionen (Elementanalytik) als auch Moleküle sein (Molekülanalytik).

•  WAS liegt vor? bzw. Welcher Analyt liegt vor?

 qualitative Analyse

•  WIEVIEL eines Analyten liegt in der Probe vor?

 quantitative Analyse

•  WELCHE Anordnung oder Form des Analyten liegt vor?

 Struktur- und Speziationsanalyse

•  WO befindet sich der Analyt?

 Verteilungs- oder Oberflächenanalyse

Die Sprache der Analytiker

Analytische Chemiker lieben Abkürzungen

MfG

Anwendungsgebiete der

Analytischen Chemie

Beispiel 1: Forensische Analytik

Beispiel 2: Umweltanalytik

Dioxin

Beispiel 3: Landwirtschaft

Integrierter Obstbau Bio-Landwirtschaft

Beispiel 4: Lebensmittel

Beispiel 5: Doping

Beispiel 6: Drogen

Beispiel 7: Prozessanalytik

Beispiel 8: Pharmazeutische Analytik

Proben

Fest

Flüssig

Gasförmig

Der analytische Prozess

•  Fragestellung

•  Probenahme

•  Probenvorbereitung / Probenaufarbeitung

•  Messung (Anwendung analytischer Techniken)

•  Auswertung und Statistik

•  Berichterstattung und Beurteilung der Ergebnisse

Experiment: Papierchromatographie

Chromatographie verstehen

1) Experiment: Papierchromatographie

1) Experiment: Papierchromatographie

Probe: Filzschreiber

(schwarz, wasserlöslich)

Analyten: verschiedene

Farbstoffmoleküle

Stationäre Phase: Tempo-Taschentuch Mobile Phase: Ethanol

Transport der mobilen Phase nach oben aufgrund von Kapillarkräften.

2) Historisches

Der russische Botaniker Michail S.

Tswett führte 1903 erste Experi- mente zur Chromatographie von Pflanzenfarbstoffen durch.

Tswetts Experiment:

Probe: Extrakt von Pflanzenfarbstoffen in Lösungsmittel gelöst

Stationäre Phase: z.B. CaCO₃-Pulver Mobile Phase: ein Lösungsmittel

(Kohlenwasserstoff-Gemisch) Ergebnis: Verschiedene Farbstoffe

verlassen zeitlich getrennt unten die Säule.

2) Historisches

Film: Trennung von Pflanzenfarbstoffen mittels Säulenchromatographie

http://www.chemie.uni-regensburg.de/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-CC-d.htm"

3) Gedankenexperiment

Transport von Geröll in einem Fluss

Transportgeschwindigkeit: Sand > Kies > Steine Fluss = “mobile Phase”

Untergrund = “stationäre Phase”

4) Von der Extraktion zur Chromatographie

Flüssig-Flüssig-Extraktion: Trennung aufgrund der Verteilung von Analyten zwischen zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten.

Extraktion wird in der Analytischen Chemie häufig bei der Probenvorbereitung eingesetzt.

Flüssig-Flüssig-Extraktion wird im Scheidetrichter durchgeführt.

4) Von der Extraktion zur Chromatographie

Beispiel: In einer wässrigen Probe befinden sich ein organischer Analyt (gut löslich in org. Lösungsmitteln) und Salze bzw. Ionen. Durch Extraktion soll der org.

Analyt von den Salzen abgetrennt werden, welche die Analyse stören würden.

(1) Ursprünglich befinden sich ein organischer Analyt und Ionen in der Probe

(2) Durch Extraktion soll

der organische Analyt in ein org. Lösungsmittel überführt und so von den Ionen abgetrennt werden.

Es besteht ein Verteilungsgleichgewicht zwischen den beiden Phasen, welches im vorliegenden Fall auf der Seite der org. Phase liegt.

4) Von der Extraktion zur Chromatographie

K

= c

c

c = m

V = Masse des Analyten

Volumen, in dem er sich befindet Nernstsches Verteilungsgesetz:

gilt für das Gleichgewicht

K_C ... Verteilungskonstante

c₁, c₂ ... Konzentrationen in den Phasen 1 und 2 A₁, A₂ ... Analyt in Phasen 1 und 2

Im Gleichgewichtsfall ist also das Verhältnis der Analytkonzentrationen in den beiden Phasen bei konstanter Temperatur eine Konstante.

Konzentration:

Einheiten: z.B. mg/L, µg/L, alternativ auch Stoffmengenkonz.: z.B. mol/L

Extraktionseffizienz:

Würde der Analyt vollständig in einem Schritt in die organische Phase überführt, ergäbe sich E_org = 1 bzw. 100%.

Da aber ein Verteilungsgleichgewicht besteht, wird eine vollständige Extraktion in einem Schritt selten erreicht.

4) Von der Extraktion zur Chromatographie

E_org := m_org

m_org + m_W = Analytmasse in organischer Phase

gesamte Analytmasse = K_CV_org K_CV_org +V_W

Beispiel 1:

100 mL wässrige Probe werden einmal mit 90 mL organischer Phase extrahiert. Der Verteilungskoeffizient des org. Analyten beträgt 50.

K_C = 50, d.h. c_org : c_W = 50:1

Volumen wässrige Phase V_W = 100 mL Volumen org. Phase V_org = 90 mL

Nach einmaliger Extraktion mit 90 mL Lösungsmittel befinden sich also 97.83% der Analytmasse in der organischen Phase.

4) Von der Extraktion zur Chromatographie

E

: = m

m

+ m

= K

V

K

V

+ V

= 4500

4600 = 97.83%

Beispiel 2:

Was geschieht, wenn anstelle von einmaliger Extraktion mit 90 mL org.

Lösungsmittel die Probe dreimal mit 30 mL extrahiert wird? Alle anderen Angaben bleiben gleich.

1. Extraktionsschritt:

93.75% der Analytmasse landen in der organischen Phase, 6.25%

verbleiben in der wässrigen Phase.

Im nächsten Schritt werden wieder 93.75% der verbleibenden 6.25%, also 6.25% × 0.9375 = 5.86% in die organische Phase überführt.

E_org

1. Schritt 93.75%

2. Schritt 99.61%

3. Schritt 99.98% Vergleich: 1 × 90 mL: 97.83%

4) Von der Extraktion zur Chromatographie

E_org := m_org

m_org +m_W = K_CV_org

K_CV_org+V_W = 1500

1600 = 93.75%

4) Von der Extraktion zur Chromatographie Ergebnis:

Je mehr Extraktionsschritte, umso höher die Effizienz.

Oder allgemeiner:

Je mehr Gleichgewichtseinstellungen, umso besser die Trennung.

(Gilt auch für die Chromatographie.)

4) Von der Extraktion zur Chromatographie

aus: http://www.chem.uoa.gr/applets/AppletCraig/Appl_Craig2.html

Extraktionsapparatur

nach Craig (1943)

4) Von der Extraktion zur Chromatographie

Die Chromatographie basiert auf einer kontinuierlichen Abfolge von

Einstellungen des

Verteilungsgleichgewichts

von Analyten zwischen zwei nicht

mischbaren Phasen.

Chromatographie

Definition:

Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem

die zu trennenden Substanzen zwischen einer mobilen und einer

stationären Phase verteilt werden. Die beiden Phasen sind nicht mischbar,

und die Trennung beruht auf unterschiedlichen Verteilungskonstanten der

verschiedenen Substanzen. Die Technik ist so konzipiert, dass sich das

Verteilungsgleichgewicht in einer kontinuierlichen Abfolge mehrmals

während des Trennprozesses einstellen kann.

„Chromatographie-Check“

Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein:

• 

•  Zwei nicht mischbare Phasen

•  Eine mobile und eine stationäre Phase

•  Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen

•  Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen

Chromatographie

Wichtige Begriffe:

(Werden im weiteren Verlauf der Vorlesung erklärt)

•  Analyten

•  Eluent

•  Inertsubstanz

•  Lineargeschwindigkeit

•  Chromatogramm

•  Peak

•  Retentionszeit

•  Peakfläche und Peakhöhe

•  Kalibrierung

Einteilung von Chromatographie-Techniken

1) Einteilung nach der mobilen Phase

•  FLÜSSIG

 Flüssigchromatographie

= Liquid Chromatography = LC

•  GASFÖRMIG

 Gaschromatographie

= Gas Chromatography = GC

2) Einteilung nach der stationären Phase

FEST

Häufigster Fall in der

Flüssigchromatographie

Oft pulverförmiger Feststoff bzw.

Feststoffpartikel in gepackter Säule

 Flüssig-Fest-Chromatographie = Liquid Solid Chromatography = LSC

FLÜSSIG

Häufigster Fall in der Gaschromatographie

Immobilisierte Flüssigkeit an der Innenwand einer Kapillarsäule.

 Gas-Flüssig-Chromatographie = Gas Liquid Chromatography = GLC

2) Einteilung nach der stationären Phase

Form der

stationären Phase:

Gepackte Säulen (v.a. LC)

Kapillarsäulen

(v.a. GC)

2) Einteilung nach der stationären Phase

Form der

stationären Phase:

Platten

(planare Materialien)

(Papierchromatographie und

Dünnschichtchromatographie = DC

= Thin Layer Chromatography = TLC)

3) Einteilung nach dem Anwendungsziel

Analytische Chromatographie Ergebnis: Chromatogramm

(Detektorsignal vs. Zeit)

Präparative Chromatographie Ergebnis: Lösungen aufgereinigter

Substanzen

4) Bezeichnungen für die mobile Phase

LC: Eluent

GC: Trägergas

DC/TLC: Laufmittel

Grundlegende Formeln

zur Chromatographie

Grundlegende Formeln

•  Verteilungskonstante (Verteilungskoeffizient) K

:

Gleichgewichtsverteilung von Analytmolekülen in der mobilen (A

) und stationären (A

) Phase.

Nernstsches Verteilungsgesetz

Bei gegebener stationärer und mobiler Phase ist K

für einen Analyten bei konstanter Temperatur eine Konstante.

A_M A_S

K

= c

c

= Analytkonzentration in der stationären Phase

Analytkonzentration in der mobilen Phase

Grundlegende Formeln

•  Phasenverhältnis β:

! = V

V

= Volumen der mobilen Phase

Volumen der stationären Phase

Das Chromatogramm

Qualitative Information: Retentionszeiten Q u an ti ta ti ve In fo rm ati o n : Pe ak fl äc h en b zw . Pe ak h ö h en

Qualitative Analyse: Vergleich der Retentionszeiten mit Reinsubstanzen Quantitative Analyse: Detektorsignal ∝ Konzentration oder Stoffmenge

Das Chromatogramm

•  Durchflusszeit (Totzeit) t

:

Retentionszeit einer Inertsubstanz, die der Probe zugegeben werden kann.

Eine Inertsubstanz fliesst gleich schnell wie die mobile Phase durch bzw.

über die stationäre Phase. Sie erfährt also keine Retention.

Das Chromatogramm

47

•  Lineargeschwindigkeit u:

u = L

t

= Säulenlänge

Durchflusszeit

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Das Chromatogramm

48

•  Retentionszeit t

•  Reduzierte Retentionszeit t’

:

!

t

= t

" t

= Retentionszeit - Durchflusszeit

Das Chromatogramm

•  Retentionsfaktor (Kapazitätsfaktor) k:

k ist ein Mass dafür, um wieviel länger sich ein Analyt in der stationären im Vergleich k = t_R !t_M

t_M = t _R"

t_M =K_C V_S

V_M = K_C

#

Das Chromatogramm

•  Trennfaktor (“Selektivität”) α :

α beschreibt die relative Retention zweier benachbarter Peaks.

Per Definition gilt α > 1; bei α = 1 koeluieren zwei Substanzen.

! = t_R2 " t_M

t_R1" t_M = t _R2#

#

t _R1 = k₂

k₁ = K_C2 K_C1

Die ideale Peakform

Gauss-Funktion:

Im Idealfall lässt sich ein Peak in der Chromatographie mit einer Gauss-Funktion beschreiben.

y₀ ... Peakhöhe

σ ... Standardabweichung (Mass für die Peakbreite)

y = y

e

x²

2" ²

Die ideale Peakform

Peakbreite zwischen den Wendepunkten w

:

Breite bei e^-1/2 = 0.607 bzw.

60.7% der Peakhöhe.

w

= 2 !

Die ideale Peakform

Basisbreite w

:

Breite zwischen den Schnitt- punkten der Wendetangenten mit der x-Achse (Zeitachse).

w

= 4 !

Die ideale Peakform

Peakbreite in halber Höhe (full width at half maximum

= FWHM) w

:

Breite bei 50% der Peakhöhe.

w

= 2 ! 2 ln2 " 2.354 !

Eine erste Formelsammlung ...

•  Trennfaktor α :

!= t_R2 " t_M

t_R1" t_M = t _R2#

#

t _R1 = k₂

k₁ = K_C2 K_C1

•  Verteilungskonstante K

:

•  Retentionszeit t

, Durchflusszeit t

, reduzierte

Retentionszeit t’

:

•  Phasenverhältnis β :

!

t

= t

" t

^• geschwindigkeit u: ^Linear- u = L

t

•  Retentionsfaktor k:

k = t_R !t_M

t_M = t " _R

t_M =K_C V_S

V_M = K_C

#

!

t_R = t_M

" K_C; t_R = f K

( )

Retention eines Peaks Relative Retention zweier

benachbarter Peaks

Zusammenfassung: Peakbreite

Peakbreite zwischen den Wendepunkten w

:

Breite bei e^-1/2 = 0.607 bzw. 60.7%

der Peakhöhe.

w

= 2!

Basisbreite w

:

Breite zwischen den Schnittpunkten der Wendetangenten mit der

x-Achse (Zeitachse).

w

= 4 !

Peakbreite in halber Höhe w

:

Breite bei 50% der Peakhöhe.

w

= 2 ! 2 ln2 " 2.354 !

σ ... Standardabweichung der Gauss-Funktion

Abweichungen von der idealen Peakform

Zeit t

Symmetrische Peakverbreiterung

Einflüsse auf die Peakbreite

Im Fall der idealen Peakform entspricht die

Retentionszeit der mittleren Aufenthaltszeit der Moleküle eines Analyten in der Säule.

Betrachtet man einzelne Moleküle, können diese Aufenthaltszeiten aufgrund zufälliger Prozesse voneinander abweichen.

Einflüsse auf die Peakbreite

Damit sich das Gleichgewicht einstellen kann, muss ein Molekül mehrmals z.B. ...

•  ... innerhalb der mobilen Phase diffundieren,

•  die Phasengrenze erreichen,

•  die Phasengrenze überqueren,

•  in der stationären Phase diffundieren (GC),

•  die Phasengrenze erreichen,

•  die Phasengrenze durchqueren, usw.

Die Geschwindigkeiten der einzelnen Prozesse sind für jedes Molekül zufällig verschieden.

Einflüsse auf die Peakbreite

Manche Moleküle sind also “zufällig schneller”, manche “zufällig langsamer” als die Moleküle, welche exakt bei der für den Analyten typischen Retentionszeit die Säule verlassen.

Positive und negative Abweichungen von der Retentionszeit mitteln sich im Idealfall heraus.

Die Aufenthaltszeiten der einzelnen Moleküle sind symmetrisch um die Retentionszeit verteilt.

Es ergibt sich ein Gauss-Peak.

Einflüsse auf die Peakbreite

Peaks verbreitern sich während des Transports der Analyten durch die Säule aufgrund der Abweichungen der Aufenthaltszeiten individueller Moleküle von der mittleren Retentionszeit.

http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/basics/saulen_chr/anschaul/saulenchr3di0300.swf

aus: chemgapedia -- Grundlagen der Chromatographie

Einflüsse auf die Peakbreite

Peakverbreiternde Prozesse sind:

•  Eddy-Diffusion

•  Longitudinaldiffusion

•  Massentransport-Effekte

(Stofftransport-Effekte)

Eddy-Diffusion

Peakverbreiterung aufgrund von Weglängenunterschieden einzelner Moleküle in gepackten Säulen

http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/basics/saulen_chr/deemter/anschaul/eddydiff000di0300_neu.swf

aus: chemgapedia -- Grundlagen der Chromatographie

Longitudinaldiffusion

Peakverbreiterung durch Diffusion der Analytmokeküle in der mobilen Phase

Nur der longitudinale Anteil (entlang oder entgegen der Strömungsrichtung) ist von Bedeutung

http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/basics/saulen_chr/deemter/anschaul/diffusion000di0300_neu.swf

Massentransport-Effekte

Peakverbreiterung aufgrund von Geschwindigkeitsunterschieden im Stofftransport von individuellen Molekülen

(z.B. Diffusion der Analyten in der mobilen Phase, Übergang zwischen mobiler und stationärer Phase)

http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/basics/saulen_chr/deemter/anschaul/stoffaus000di0300_neu.swf

aus: chemgapedia -- Grundlagen der Chromatographie

Theorie: Symmetrische Peakverbreiterung Konzept der theoretischen Böden

Effizienz einer Trennung

Konzept der theoretischen Böden

Je mehr theoretische Böden, umso mehr Gleichgewichtseinstellungen

Theoretische Böden

Je mehr theoretische Böden, umso höher die Effizienz der Trennung

•  Anzahl der theoretischen Böden N:

Die Bodenzahl N hängt von der Retentionszeit eines Peaks und dessen Breite ab. Je breiter ein Peak, umso ineffizienter die Trennung.

•  Bodenhöhe H:

H ist besser geeignet als N, um Säulen verschiedener Länge L miteinander zu vergleichen.

N = t_R

!

"

# $ %

&

'

2

=16 ( t_R w_b

"

# $ %

&

'

2

= 5.54( t_R

w_{1/ 2}

"

# $ %

&

'

2

H = L N

Die van-Deemter-Gleichung

H = A + B

u + C u

Beiträge von

A: Eddy-Diffusion

B: Longitudinaldiffusion C: Massentransport-Effekte

Die van-Deemter-Gleichung beschreibt die Effizienz einer Trennung bzw. die Bodenhöhe H als Funktion der Lineargeschwindigkeit u.

Je grösser A, B und C, umso ineffizienter die Trennung.

Die Trenneffizienz hat bei der Lineargeschwindigkeit u ein Optimum, bei der H minimal wird.

Die van-Deemter-Gleichung

H = A + B

u + C u

Beiträge von

A: Eddy-Diffusion

B: Longitudinaldiffusion

C: Massentransport-Effekte

A-Term: Eddy-Diffusion

Verringerung der Effizienz aufgrund unterschiedlicher Weglängen der Analyten in einer gepackten Säule.

Unabhängig von der Lineargeschwindigkeit u. Als Funktion von u ergibt der A-Term eine zur x-Achse parallele Gerade.

LC: arbeitet mit gepackten Säulen, der A-Term ist hier also von Bedeutung.

GC: ist nur bei gepackten Säulen von Bedeutung, kann bei den meistens eingesetzten

Kapillarsäulen vernachlässigt werden.

Je grösser der Diffusionskoeffizient des Analyten in der mobilen Phase (D_M), umso grösser B:

LC: Kleine Diffusionskoeffizienten (D_M < 10^‑5 cm² s^-1) in Flüssig- keiten, deshalb geringer Einfluss von B.

GC: Grosse Diffusionskoeffizienten (D_M ≈ 10^‑1 cm² s^-1) in Gasen, deshalb starker Beitrag von B an der Peakverbreiterung.

B-Term: Longitudinaldiffusion

Verringerung der Effizienz aufgrund der Diffusion der Analyten in der mobilen Phase (nur der longitudinale Anteil hat einen Einfluss).

B ! D

B-Term = B/u  Hyperbel

Indirekte Proportionalität da bei langer Aufenthaltszeit der Moleküle in der Säule die

C-Term: Massentransport-Effekte

Verringerung der Effizienz aufgrund von Unterschieden in der Stofftransport- geschwindigkeit

C-Term = Cu  Gerade

Direkte Proportionalität, da bei geringerer Geschwindigkeit u, mehr Zeit für den Ablauf der Stofftransportprozesse bzw. zur Gleichgewichtseinstellung zur Verfügung steht.

C u = C

u + C

u

C_S, C_M: Beiträge von stationärer und mobiler Phase

LC: C_S spielt bei gepackten Säulen keine Rolle

GC: bei Kapillarsäulen sind C_S und C_M von Bedeutung C u ! C_M u C_M ! 1

D_M

C_S ! d_S

D_S = Schichtdicke stat. Phase

Diffusionskoeffizient in stat. Phase C_M ! 1 D_M

Van-Deemter-Gleichung

75

Typische Verläufe für LC und GC

LC GC

A = const. A = 0

B ! D

B ! D

D_M ^{CS !}

d_S

D_S C_M ! 1 D_M schmales

Optimum

breites Optimum

Gase mit grossem D_M bevorzugt (H₂, He)

Anzahl theoret. Böden N, Bodenhöhe H

Tab. 1: Typische Bodenzahlen N und Bodenhöhen H gängiger Säulen in der Gas- chromatographie (GC) und Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) sowie typische Säulenparameter.

Säulen t y p N (pro Säu l e ) H (mm )

GC

Kapillarsäulen (25 m)

0.1 mm Innendurchmesser 0.5 mm Innendurchmesser gepackte Säulen (1-3 m)

30’000-100’000 20’000-50’000 500-2’000

0.2-0.6 0.5-1.3 1 - 6 HPLC

gepackte Säulen (25 cm) 10 !m-Partikel

3 !m-Partikel

2’500-5’000 8’000-18’0 0 0

0.05-0.1 0.02-0. 0 5

Anzahl theoret. Böden N, Bodenhöhe H

Tab. 2: Optimale und in der Praxis eingesetzte Lineargeschwindigkeiten und Fluss- raten in der Gaschromatographie (GC) und Hochleistungs-Flüssig-

chromatographie (HPLC)

Technik / Säu l e Lineargeschwindigkeit [cm s^-1]

Flussrate (Volumenstrom) [mL min^-1]

Optimum In der Praxi s Optimum In der Praxi s GC

Kapillarsäule

(0.25 mm Innendurchmesser) gepackte Säule

(4 mm Innendurchmesser)

30-40 2 - 4

60-80 4 - 8

1-2 40-50

1-4

40-80 H P L C

gepackte Säule

(4.6 mm Innendurchmesser) 0.05-0. 1 0.1-0. 2 0.2-0. 5 1 - 2

I) Asymmetrische Peakverbreiterung

Abweichungen von der idealen Peakform

Zeit t

Abweichungen von der idealen Peakform

Unsymmetrische Peaks sind meist auf Überladungseffekte zurückzuführen.

Überladung der mobilen Phase:

Der Analyt kondensiert auf der stationären Phase und wird erst nach und nach von der mobilen Phase abtransportiert. Es kommt also in der Form zu einer

unsymmetrischen Verteilung, dass ein grosser Anteil der Moleküle später als im Idealfall die Säule verlässt.

Überladung der stationären Phase:

Die Bindungsstellen auf der stationären Phase sind mit Analyt belegt.

Analytmoleküle aus der mobilen Phase können nicht mehr binden und werden

schlechter retendiert. Ein wesentlicher Anteil der Analytmoleküle verlässt die Säule also früher als bei idealer Retention.

1) Leichte Abweichungen von der

Nernst-Verteilung

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Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

82

Nernst-Gesetz:

ist bei konstanter Temperatur eine Konstante.

Daraus folgt: c_S = K_C × c_M

Bei Abweichungen vom Nernst-Gesetz ist c_S = f(c_M) keine lineare Funktion mehr, bzw. K_C ist keine Konstante.

Retentionsfaktor:

Daraus folgt:

K

= c

c

k = t_R !t_M

t_M = t _R"

t_M =K_C V_S

V_M = K_C

#

!

t _R = t_M

" ^{KC bzw. t ! R #KC}

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Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

83

Tailing:

Bei hoher Konzentration:

K_C sinkt

Überladung der stationären Phase

Peak-Maximum verschiebt sich zu kleinerer t_R

Bei hoher Konzentration:

t_R sinkt

wegen

!

t _R = t_M

" ^{KC bzw. t ! R #KC} Fronting:

Bei hoher Konzentration:

K_C steigt

Überladung der mobilen Phase

Peak-Maximum verschiebt sich zu höherer t_R

Bei hoher Konzentration:

t_R steigt

wegen

Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

Beispiel: Fronting mit Verschiebung des Peakmaximums zu höherer t_R Peakformen Integrale

Peakformen und insbesondere Integrale zeigen:

Ein wesentlicher Anteil der Moleküle verlässt beim Frontig später die Säule als im Fall des Gauss-Peaks  Überladung der mobilen Phase

2) Starke Abweichungen vom Nernst-Gesetz und

Nicht-Gleichgewichtsbedingungen

Nicht-Gleichgewichtsbedingungen

•  In der Praxis sind stärkere Abweichungen vom Nernst-Gesetz möglich

•  In der Chromatographie wird praktisch nie der Endpunkt der Gleichgewichtseinstellung erreicht

Gründe, z.B.:

•  Langsame Gleichgewichtseinstellung z.B. wegen langsamer Stofftransportprozesse

•  Bedingungen ändern sich dauernd (Transport der mobilen Phase)

Wie sich Peakformen unter diesen Bedingungen ändern, lässt sich kaum vorhersagen. Asymmetrische Peaks sind aber auch hier eine Folge von Überladungseffekten.

Fragen: Was geschieht auf der Ebene der Moleküle?

Verlässt ein wesentlicher Anteil der Moleküle früher oder später die

Säule?

Nicht-Gleichgewichtsbedingungen

Beispiel: Fronting ohne Verschiebung des Peakmaximums Peakformen Integrale

Peakformen und insbesondere Integrale zeigen:

Ein wesentlicher Anteil der Moleküle verlässt beim Frontig früher die Säule als im Fall

Abhilfe bei Fronting / Tailing

•  Asymmetrische Peaks sind meist eine Folge von Überladungseffekten.

•  Einschränkung sowohl von qualitativer als auch von quantitativer Analyse

Abhilfe:

Verringerung des Probenvolumens bzw. der Probenkonzentration (weniger Analytmoleküle auf der Säule)

Erst, wenn das nichts bringt:

Änderung der betroffenen Phase (z.B. Wechsel des Eluenten, Wechsel der Säule, andere Gradienten)

Wechsel von mobiler und insbesondere stationärer Phase sind aber mit

Zeitaufwand und Kosten verbunden.

3) Überlagerung von Peaks und

Koelution

Koelution

Zwei Analyten haben annähernd die gleiche Retentionszeit.

Ein für beide Substanzen sensitiver Detektor erfasst nicht die Einzelpeaks (gestrichelte Linien), sondern die

Summe aus beiden (durchgezogene Linie).

Abhilfe:

•  Optimieren der Trennbedingungen (Lineargeschwindigkeit, mobile Phase, stationäre Phase, Temperatur, Gradienten)

•  Verwendung verschiedener Detektoren mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten für die beiden Substanzen (oder: verschiedene Wellenlängen bei spektroskop. Detektor)

•  MS-Detektion (jede Masse erzeugt ein eigenes Detektorsignal)

II) Auflösung und

Optimierung einer Trennung

Definition der Auflösung einer Trennung

R

= t

! t

w

+ w

2

"

# $ %

&

'

= 2 ( t

! t

)

w

+ w

= Differenz der Retentionszeiten

Mittelwert der Basisbreiten

Auflösung R

zweier benachbarter Peaks:

Auflösung

R_S < 0.75

Überlagerung bzw. Koelution

R_S > 0.75

Zwei Peaks erkennbar

R_S > 1.5

Grundlinien- getrennte

Peaks

Auflösung

R_S = 2

(

)

w_b1 +w_b2 " t_R2 !t_R1

w_b = t_R2 !t_R1 4#

Aus der Näherung kann man folgende Gleichung

herleiten:

R

= !" 1

!

#

$ % &

' ( k

1 + k

#

$ % &

' ( N 4

#

$ % &

' (

α : Trennfaktor

k: Retentionsfaktor

N: Anzahl theoretischer Böden

α , k und N sind die “Schrauben”, an denen man zur Optimierung einer

Trennung drehen kann.

Auflösung

R

= !" 1

!

#

$ % &

' ( k

1 + k

#

$ % &

' ( N 4

#

$ % &

' (

α : Trennfaktor

k: Retentionsfaktor

N: Anzahl theoretischer Böden

k ! t

N ! 1

"

! = t

"

"

t

Auflösung _R

₌ ^{! " 1}

# !

$% &

'(

k 1 + k

# $% &

'(

N 4

#

$%

&

'(

k

k 1+ k

α N

! "1

!

N 4

k ! K

k kann verändert werden, indem man K_C ändert:

•  Temperatur

•  mobile Phase ändern

•  stationäre Phase ändern

N erhöhen:

längere Säule (aber:

Kosten, Analysezeit) Lineargeschwindigkeit optimieren (van-Deemter) N oft erst dann optimiert, wenn Optimieren von k und α nicht zum Ziel führt α von vielen Parametern abhängig:

•  Temperatur

•  mobile Phase

•  stationäre Phase

α in diesem Zusammenhang auch

“Selektivität” genannt

! = K_{C 2} K_C1

Meistens können α, k und N nicht unabhängig voneinander geändert werden

Auflösung _R

₌ ^{! " 1}

# !

$% &

'(

k 1 + k

# $% &

'(

N 4

#

$%

&

'(

k

k 1+ k

α N

! "1

!

N 4

Erhöhung von k:

bessere Auflösung, aber höhere Retentionszeiten

  längere Analysenzeiten

  breitere Peaks

Erhöhung auf k > 10 bringt

Erhöhung von N:

geringere Peakbreite (Standardabweichung σ⁾ Wurzelfunktion,

d.h. viermal höheres N bewirkt nur Verdopplung Erhöhung von α:

grösserer Abstand der Peaks im Chromatogramm

α knapp über 1: kleine Änderungen von α bewirken eine starke

Änderung der Auflösung

t

! k

Gradientenelution

Oft findet man mehrere ungenügend getrennte Peaks in einem Chromatogramm.

Optimieren eines Parameters kann gegenläufige Effekte auf verschiedene Peaks haben.

Abhilfe: Gradientenelution: Stufenweise oder graduelle Änderung von Trennparametern

GC:

Temperatur-

gradient

Gradientenelution

Oft findet man mehrere ungenügend getrennte Peaks in einem Chromatogramm.

Optimieren eines Parameters kann gegenläufige Effekte auf verschiedene Peaks haben.

Abhilfe: Gradientenelution: Stufenweise oder graduelle Änderung von Trennparametern

LC:

Lösungsmittel- gradient

Isokratische Trennung:

Lösungsmittelzusammensetzung konstant während der Trennung

Gradiententrennung:

Änderung des Eluenten

(z.B. Acetonitril-Wasser-Gemisch in verschiedenen Konzentrationen)

t

Häufig: Erhöhung der Elutionskraft während der Trennung

Optimierung einer Trennung

Ziel der Optimierung ist,

eine effektive Peakauflösung (R _S > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit

zu erreichen.

Quantitative Analyse mittels

Chromatographie

Quantitative Analyse

Ein kleiner Ausflug in die Statistik

Statistische und systematische Fehler

Genauigkeit = Präzision + Richtigkeit

Statistische und systematische Fehler

Schüsse 1–3

Schuss 4 nach Korrektur der Zieloptik

MNSP Workshop 2009 in Merlischachen

Statistische und systematische Fehler

Genauigkeit = Präzision + Richtigkeit

Mittelwert und Standardabweichung

Häufigkeit eines Messwertes

x

Mittelwert :

Standardabweichung σ_x:

relative Standardabweichung σ_rel,x:

x

x = 1

n x_i

i=1

!

Messwerte x_i

!_x = 1

n"1

(

)

i=1

#

!

= !

x

Herbstsemester 2011 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | schmid@org.chem.ethz.ch

Angabe eines Analysenergebnisses

108

Häufigkeit eines Messwertes

x

Messwerte x_i In einem Analysenbericht muss ein

Messergebnis immer mit einer Fehler- angabe versehen werden.

Messergebnis mit absolutem Fehler:

± σx z.B. 12.3 µg/L ± 0.8 µg/L

Messergebnis mit relativem Fehler:

± σ_rel,x z.B. 12.3 µg/L ± 7%

x

x

Kalibrierung

Kalibrierung

y-Achse: Detektorsignal z.B. in Volt oder Ampere (Peakfläche oder –höhe)

A_Analyt

x-Achse: Probenkonzentration z.B. in mg/L, µg/L, mol/L, ...

c_Analyt

A_Analyt = a+ b c_Analyt

Empfindlichkeit und Nachweisgrenze

Empfindlichkeit:

b = Steigung der Kalibriergeraden = Empfindlichkeit = Responsefaktor

Nachweisgrenze NG (limit of detection = LOD):

Minimale Konzentration, dessen Signal, sich gerade noch also solches erkennen lässt, bzw. welches sich signifikant vom Grundrauschen

unterscheidet.

σ_A0 = Standardabweichung des Blindwerts

3σ-Kriterium: Die NG ist die Konzentration, bei der eine Signalintensität erhalten wird, die 3 σ_A0 über dem Grundrauschen liegt.

Bestimmungsgrenze BG (limit of quantification = LOQ):

Minimale Konzentration, die sicher bestimmt (quantifiziert) werden kann.

Die BG lässt sich nach dem 6σ-Kriterium ermitteln. Das Signal bei der BG liegt also 6 σ_A0 über dem Grundrauschen.

Ab der BG überlappen die Gauss-Verteilungen von Signal und Rauschen nicht mehr.

A_Analyt = a+b c_Analyt

NG =

(

)

b

BG =

(

)

b

Kalibrierung

•  Kalibrierung mit externem Standard

•  Kalibrierung mit internem Standard

•  Kalibrierung mittels Standardaddition

Kalibrierung mit externem Standard

A_Analyt = a+ b c_Analyt c_Analyt = A_Analyt ! a

b

Bevorzugt eingesetzt, wenn:

•  viele Proben mit ähnlicher Matrix gemessen werden sollen,

•  systematische Fehler wie Verflüchtigung, Filtrationsverluste, Eintrag, Volumenfehler etc. vernachlässigbar klein sind.

Limitierungen:

Kalibrierung mit internem Standard

Bei der Kalibrierung werden Standardlösungen bekannter Analytkonzentration hergestellt, denen eine bekannte Konzentration an internem Standard zugesetzt wird.

Wird eingesetzt, wenn systematische Fehler z.B. während der Probenaufarbeitung nicht zu vernachlässigen sind (z.B. Aufkonzentrieren der Probe durch Verdunstung des Lösungsmittels, Verluste an Analytmolekülen bei der Filtration, ...).

interner Standard

Kalibrierung mit internem Standard

Ein interner Standard soll:

•  Dem Analyten ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften haben

•  Nicht in der Probe vorkommen

•  Neben dem Analyten in der Probe bestimmbar sein

Beispiel:

Analyt Interner Standard

Coffein Theophyllin

Ideal:

Stabilisotopen-markierte (z.B. D, ¹³C) Analytmoleküle als interner Standard und MS-Detektion.

Kalibrierung mit internem Standard

A_Analyt Ainterner Standard

= a+b c_Analyt

cinternerStandard

c_Analyt = cinterner Standard

A_Analyt Ainterner Standard

! a

"

# $

$

%

&

' ' b

Bei der eigentlichen Analyse wird der Probe vor der Aufarbeitung eine bekannte Konzentration an internem Standard zugesetzt und bei der Messung das Verhältnis der Peakflächen bestimmt.

Vorteil: Der interne Standard durchläuft die gleiche Probenaufarbeitung wie der Analyt  Systematische Fehler können ausgeglichen werden.

Limitierung: Der interne Standard hat nicht die exakt gleichen Eigenschaften wie der Analyt.

Kalibrierung mittels Standardaddition

Für die Kalibrierung werden keine Standardlösungen hergestellt, die Kalibrierung erfolgt in der Probe selbst.

1) Messung der Probe

2) Messung der Probe nach Zugabe einer bekannten Analytkonzentration (Standard)

c_Analyt

c_Standard = A_Analyt

A_{Analyt+Standard} ! A_Analyt

Herbstsemester 2011 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | schmid@org.chem.ethz.ch

Kalibrierung mittels Standardaddition

118

A

= a + b c

Kalibrierung

•  Kalibrierung mit externem Standard:

•  einfachstes Kalibrierverfahren

•  Kalibrierung mit internem Standard:

•  Kompensation systematischer Fehler

•  Interner Standard hat nicht exakt die gleichen Eigenschaften wie der Analyt

•  Matrixeffekte werden nicht kompensiert

•  Kalibrierung mittels Standardaddition

•  Kalibrierung in der Probe mit dem Analyten als Standard

•  Matrixeffekte können kompensiert werden