Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 1
Analytische Chemie
für Biologie Pharmazie Bewegungs- wissenschaften und Sport
Elektrophoretische Trennverfahren
!EOF
!EP
Das erste Versuch
1. In freier Lösung oder trägerfreie Pufferlösung
•! U-förmigen Glasrohr
•! Elektroden (Kathode / Anode)
•! Einfache Probenaufgabe Schwerwiegendster Nachteil:
Joule’schen–Wärme verzerrt bereits getrennte Banden.
2.
Verwendung von
stabilisierenden Medien, Um
Joule’schen–Wärmeeinzuschränken oder ganz
Arne Tiselius
The Nobel Prize in Chemistry 1948
"for his research on electro-
Ladung
Mobilität
Richtung Geschwindigkeit
+ Grösse
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 3
Erste U – Rohr Elektrophorese
the first results obtained by the new apparatus: serum gives a number of relatively distinct components, namely: albumin, ! , " , and # globulin.
It was subsequently found that further subdivision of some of these components could be made.
10.08.1902 – 29.10.1971!
Arne Tiselius
1926: U-Tube EP 1937: redesign see right picture First paper in Transactions of the Faraday Society
Elektrische Kraft
Transport von Ionen in einer Lösung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes, wobei die wirkende elektrische Kraft Fe definiert ist:
z Ladungszahl der Komponente e Elementarladung [C]
E elektrische Feldstärke [V/cm]
!
F
e= q " E = z " e " E
Gegenkraft: Reibungskraft
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 5
!
F
R= k " # " v = 6 $ " r " # " %
k Konstante [cm] (6$ r für sphärische Partikel – Stokesches Gesetz) r hydrodynamischer Radius des hydratisierten Ions (ungleich
Ionenadius)
% !Viskosität der Lösung [Pa s]
vi Wanderungsgeschwindigkeit der Komonente i [cm/s]
Reibungskraft:
Elektrophoretische Mobilität: µ EP
Die Geschwindigkeit einer Komponente in einem konstanten elektrischen Feld (F
e= F
R):
Die elektrophoretische Mobilität !EP:
!
v = z " e
6 # " $ " r " E
µ
EP= v
E = z " e
6 # " $ " r = q
6 # " $ " r
Reine Elektrophoretische Trennverfahren
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 7
1. Platten-Gelelektrophorese
2. Papierelektrophorese
Elektroosmotischer Fluss
!!
Eine Vielzahl von Materialien (Glas, Quarz, Teflon) bilden aufgrund von Oberflächenladungen•!
Quarz bzw. Glas => Dissoziation der Si-OH Gruppen bei Kontakt mit einer Elektrolytlösung eine elektrochemische Doppelschicht aus•!
Innenseite der Kapillare – negativ geladen; positiv geladene Flüssigkeitssäule"
Zetapotenzial
Doppelschicht pKa
5.3
Zeta-Potenzial ( ! )
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 9
"
beschreibt die Abnahme der Ladungsdichte von der Kapillarwandzum Innern der Kapillare
Elektro-Osmotischer Fluss (EOF)
Zetapotenzial
!
resultierender EOF!
Anode! Anode!
Kapillarwand!
Kathode
!!
Elektroosmose tritt auf, wenn ein elektrisches Feld an das flüssigeElektrolytsystem angelegt wird
!!
positiv geladene Flüssigkeitssäule bewegt sich im elektrischen Feld in Richtung Kathode => EOF!! Transport der Flüssigkeit ähnlich einer mechanischen Pumpe
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 11
Elektroosmotische Mobilität: µ EOF
Flaches Fliessprofil beim EOF hat vernachlässigbare Bandenverbreierung zur Folge ( => EOF trägt nicht zur Peakverbreiterung bei => N)
!
µ
EOF= " # $ 4 % # &
& die Dielektrizitätskonstante
% die Viskosität der Pufferlösung ' das Zeta-Potential (in Volt)
parabelförmig stempelförmig
parabelförmig stempelförmig
Hydrodynamisches Fliessprofil
Das Profil des EOF
pH-Abhängigkeit des EOF
Bei hohen pH-Werten ist der EOF deutlich grösser als bei niedrigen, da der Dissoziationsgrad der Silanol-gruppen zunimmt (bei pH > 9 => ! = 1)
Fused-silica-Kapillare
Einfachste Methode zur Änderung des EOFs
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 13
Parameter Ergebnis Kommentar
pH-Wert EOF-Abnahme bei niedrigerem pH Einfachste Methode zur Änderung des EOF Puffer/Ionenstärke Grössere Ionenstärke ! Abnahme
des Zetapotentials
Temperatur Viskositätsänderung um 2-3 % pro °C
Organische Lösungsmittel
Veränderung des Zetapotentials
Tensid-Zusätze zum Puffer
Unterhalb der Mizellenbildungs- konzentration Adsorption an Kapillaroberfläche
Kationische Tenside:
Abnahme oder
Umkehrung des EOF Anionische Tenside:
Zunahme des EOF Hydrophobe Polymere Adsorption an Kapillaroberfläche Abnahme des EOF
Kovalente Beschichtung
Kovalente Beschichtung an Kapillaroberfläche
Vielzahl von
Modifikationen des EOF möglich
Elektrische Feldstärke EOF ist proportional zur Feldstärke
Kleineres E ! kleinere Auflösung, Effizienz
!
!
µ
EOF= " # $ 4 % # &
Gesamte beobachtete Bewegung
µ
app =µ
EP +µ
EOFµ
EOFµ
EOF –µ
EPfür die neutrale Spezies für die Kationen
für die Anionen
Migrationszeit, Böden und Auflösung
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 15
!
t
M= L
dµ
app" E
!
µ
app= L
dt
M" E
!
N
max= L
2d2Dt
M!
R = N 4
" µ µ
appBöden und Auflösung
Apparatur – Kapillarelektrophorese
•! L: 10-100 cm
•! ID 10-100 !m Probenaufgabe (1-10 nl) durch
•! Hydrostatische Injektion (Siphoneffekt)
•! Druck/Vakuum Injektion (Druckdifferenz)
•! Elektrokinetische Injektion (!EOF, !EP)
•! UV – 10–6 mol/L
•! Fluoreszenz – Attomol
•! Kopplung an MS
On-column (durchsichtlich)
Fused silica mit Polyimidbeschichtung
bis 30 kV
Kapillare
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 17
GC: L 25 m, ID 0.5 mm CE: L 50 cm, ID 50 µm (HPLC: gepackte Säule:
20 cm, 0.5 cm, Druckantrieb)
•! Gute Wärmeabstrahlung
•! Für EOF als Antriebskraft nötig
•! Flachfliessprofil erlaubt kleine Kapillare
•! L: 10-100 cm
•! ID 10-100 !m Fused silica mit Polyimidbeschichtung
Probenaufgabe
Einfach
Hohe Reproduzierbarkeit
Diskriminierung (Kationen, Anionen und Neutrale)
Siphon-, Vakuum- oder Druck-Injektion
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 19
Varianten der Elektrophorese
!! Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
!! Gelelektrophorese (GE) oder Kapillargelelektrophorese (CGE)
!! Isoelektrische Fokussierung (IEF)
!! Isotachophorese (ITP)
!! Mizellare elektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC)
!! Kapillarelektrochromatographie
Trennleistung: Kapillarinnenwand; Bufferlösung und pH-Werte (Additive); Spannung; Methode
Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
!
µ
EOF> µ
EP!
µ
EOF!
µ
EP!
µ
EPDec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 21
Schema von CZE
!
µ
app= µ
EOF± µ
EPKationen: additive Neutral: nur !eof Anionen: subtractive Geeignet für kleine und mittelgrosse M (Aminosäuren, Peptiden)
Elutionsreihe:
Kationen < Neutral <
Anionen
Kapillar-Gelelektrophorese (CGE)
1. Grösse
2. Ladung
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 23
Isoelektrische Fokussierung (IEF)
Aufgrund des H+ und OH–-flusses entsprechend ihrer pI-Werte ordnen sich die Ampholyte an, und es bildet sich ein stabiler pH-Gradient über die gesamte Trennstrecke aus nach Anlegen einer Spannung.
Die aufgegebenen amphoteren Probenbestandteile wandern im el. Feld entsprechend ihrer Ladung bis zu dem Punkt, an dem der sich einstellende pH-Werte ihrem isoelektrischen Punkt entspricht, dann bleiben still wegen ihrer null Nettoladung.
Isoelektrischer Punkt (pI)
pH > pI: netto (–) pH < pI: netto (+)
H3N CH C H
O O
H2N CH C H
O O H3N CH C
H
OH O
pH-Gradient
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 25
pH 3 #pH 0.01 pH 10
pH 6.0
H3N CH C H
OH
O H3N CH C H
O
O H2N CH C H
O O
Isoelektrische Fokussierung (IEF)
Zwitterionische oder amphotere Proben wie Proteine and Peptide, die
sich in ihrem isoelektrischen Punkt (pI–Wert) unterscheiden.
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 27
Isotachophorese (ITP)
Ionen bewegen mit variierten ! und werden geordnet.
Dann die geordnete Ionen (Ionenband) bewegen mit gleichen ! durch Detektor nach Kathode
!
v
i= q
i6 " # $ # r
i# E
iPotenzialgradient
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 29
Isotachophorese (ITP)
Kationen mit einer höheren Mobilität als alle Probenkationen (H+, H3O+) Kationen mit niedrigerer Mobilität
als alle Probenkationen
Kathodenseite Anodenseite
1. Ionenband zu ordnen; 2. Alle Ionenband bewegen mit gleichen !
Isotachophorese (ITP)
Ionen bewegen mit variierten ! und werden geordnet.
Dann die geordnete Ionen (Ionenband) bewegen mit gleichen ! durch Detektor nach Kathode
v
i= q
i6 " # $ # r # E
iDec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 31
Micellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
Ein Hydrid zweier Trenntechniken (CE und HPLC), aber viel günstiger als HPLC
Terabe in 1984: CE an ungeladenen Substanzen unpolaren Verbindungen Nachteile von CZE:
unmöglich an mehrere Neutralverbindungen und unpolare
Substanzen
Pseudo-stationäre Phase
Die Pufferlösung als mobile Phase MEKC
Mizelle-Bildung
Natriumdodecylsulfat, SDS !
•! Kinetische Gleichgewicht (Hydrophoben Innen / Hydrophilen Aussen)
•! Neutrale und unpolare Verbindungen: Gleichgewicht in Micelle und in Pufferlösung
Mizelle als stationäre Phase
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 33
!
EP Negativ geladen"!
EOF•! !EP (Negativ geladen Mizelle) entgegensetzt !EOF (Puffenlösung) => Mizelle bewegt sich fast nicht oder gar leicht umzukehren, wie stationäre Phase
•! unpolar Innenraum von Mizellen wie RP-flüssigfilm bei HPLC
•! Pufferlösung als mobile Phase
•! Neutral CyD (Hydrophobenraum) und Kronenether (Polarzentrum) als Zusatz
Trennung der neutralen Moleküle
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 35
Kapillarelektrochromatographie (CEC)
1.! Stationäre Phase: RP-Kieselgele wie HPLC
2.! Mobile Phase: Methanol – Puffer // Acetonitril – Puffer 3.! Mobilität durch Vorantreiben der EOF anstatt durch Pump
Vorteil durch EOF:
1.! Flache Strömungsprofil mit 2.! Selektivitäten von HPLC 3.! Kiegel < 3 !m ohne Problem 4.!Polare und unpolare sowie 5.!geladene und ungeladene
Verbindungen gleichzeitig nebeneinander analysieren werden
SDS-PAGE und 2D-PAGE
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 37
Für Trennung der Proteinen:
Trennung auf pI (Masse/Ladung) und MW, ohne SDS => Native PAGE Trennung auf nur Grösse der Proteinen, mit SDS => SDS PAGE
SDS (Natriumdodecylsulfat), PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis)
2D-PAGE (Platten-elektrophorese) 1.! Native PAGE (durch IEF) 2.! Senkrecht SDS PAGE
Vorteile und Charakteristika
"!
sehr gute Abstrahlung der überschüssigen Hitze und damit
keine Bandenverbreiterung durch Konvektion
"!
flaches Strömungsprofil bei Ausnutzung des EOF
"!
keine feste stationäre Phase
"!
hohe Trennleistung (wegen geringer Bandenverbreiterung)
"!
extrem wenig Lösungsmittelverbrauch (Kosten, Abfall)
"!
nur kleine Probenmengen nötig
"!
hohe Bodenzahl, kleine reduzierte Bodenhöhe
"!
schonende Technik (wichtig für Biopolymere)
Zusammenfassung
Dec. 03, 2008 AC – BPBS HS08 39
