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Academic year: 2021

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Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Thomas Schmid

HCI D323

schmid@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/

(2)

Elektrophorese

(3)

Elektrophorese

Allgemein:

Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld Analytische Chemie:

Trennung von Ionen im elektrischen Feld

Elektrophoretische Trenntechniken zählen

im Allgemeinen nicht zur Chromatographie

(4)

„Chromatographie-Check“

Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein:

• 

Trenntechnik

•  Zwei nicht mischbare Phasen

•  Eine mobile und eine stationäre Phase

•  Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen

•  Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen

(5)

Elektrophorese

•  Gel-Elektrophorese

•  Agarose-Gelelektrophorese,

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

•  Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)

•  Kapillarelektrophorese (CE)

•  Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

•  Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

(6)

Gel-Elektrophorese

(7)

Gel-Elektrophorese

Gel-Elektrophorese: http://www.youtube.com/watch?v=qMxQ-65qYDk

„Genetischer Fingerabdruck“: http://www.youtube.com/watch?v=W5HeXufSFE4

(8)

Agarose-Gelelektrophorese,

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

•  Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung im elektrischen Feld

•  Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung

•  Kleine Moleküle wandern schneller als grosse

•  Detektion: chemische Anfärbemethoden (z.B. Fluoreszenz)

•  Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse

•  z.B. Auftrennung von DNA-Fragmenten (z.B. „Genetischer Fingerabdruck)

+

Standard Probe

Probe: DNA-Fragment mit 522 Basenpaaren (bp)

(9)

Agarose-Gelelektrophorese,

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

•  Trennung nach

Ladung und Grösse

•  Grösse:

hydrodynamischer Durchmesser

•  d.h.: Proteine werden nach Ladung,

Molekulargewicht und Faltung getrennt

•  Bei Proteinen wird häufig die SDS-PAGE angewandt

(10)

SDS-PAGE

SDS = sodium dodecyl sulfate Natriumdodecylsulfat Natriumlaurylsulfat C12H25NaO4S

Tensid

SDS bildet Mizellen

SDS denaturiert Proteine SDS bildet negativ geladene

Komplexe mit Proteinen

(11)

SDS-PAGE

•  Trennung von negativ geladenen Komplexen

von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen

•  Faltung beeinflusst nicht die Trennung

•  Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom

Molekulargewicht ab,

Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle

•  Trennung von Proteinen nur aufgrund des

Molekulargewichts

(12)

SDS-PAGE

•  Trennung von negativ geladenen Komplexen

von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen

•  Faltung beeinflusst nicht die Trennung

•  Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom

Molekulargewicht ab,

Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle

•  Trennung von Proteinen nur aufgrund des

Molekulargewichts

SDS-PAGE-Trennung verschiedener Proteine (1-8) gemäss ihres Molekulargewichts.

Links: Gemisch von Proteinen bekannter Grösse als Molekulargewichtsstandard (14–97 kDa)

(13)

Kapillarelektrophorese

(capillary electrophoresis = CE)

(14)

CE: Theoretische Grundlagen

µ

EP

= v

E = Geschwindigkeit eines Ions

Elektrische Feldstärke = e 6 ! "

1

# "

z r

e ... Elementarladung

η ... Viskosität der Pufferlösung z ... Ladung des Ions

r ... Hydrodynamischer Durchmesser des Ions

Elektrophoretische Mobilität µ

EP

eines Ions im elektrischen Feld E

K o n sta n te Pu ffe rl ö su n g Io n (A n al yt)

Trennung

aufgrund von Ladung und

Grösse der Ionen

(15)

CE: Theoretische Grundlagen

Elektroosmotischer Fluss (EOF)

+

Anode Kathode

EOF

Aufgrund der negativ geladenen Innenwand der Quarzkapillare bildet sich ein Fluss der Pufferlösung in Richtung Kathode aus, der elektroosmotische Fluss (EOF).

Quarzkapillare (SiO2)

Quarzkapillare (SiO2)

(16)

Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

Kationen Neutrale Molele (ungetrennt) Anionen

•  Trennung von

Kationen und Anionen

•  Neutrale Moleküle verlassen ungetrennt mit dem EOF die Kapillare

•  Detektor wegen EOF

kathodenseitig angebracht

•  Nur Anionen, die schneller als der EOF wandern, erreichen den Detektor nicht

(17)

Herbstsemester 2011 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | schmid@org.chem.ethz.ch

Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

17

Dem Puffer wird ein Tensid (z.B. SDS) zugegeben, welches Mizellen bildet.

Abhängig von ihrer Polarität halten sich die Analyten v.a.

in der Pufferlösung (polar) oder in den Mizellen (unpolar) auf.

•  Trennung ungeladener Analyten (keine Ionen)

•  Chromatographie

•  Mobile Phase: Pufferlösung (polar)

•  Pseudo-stationäre Phase: Mizellen (unpolar)

(18)

Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

•  Trennung von

ungeladenen Analyten

•  Pufferlösung (mobile Phase) bewegt sich wegen EOF in Richtung Kathode

•  Mizellen (pseudo-stationäre

Phase) bewegen sich langsamer

•  Elutionsreihenfolge wie in RP-HPLC: polare Moleküle eluieren vor unpolaren

•  Detektor wegen EOF

kathodenseitig angebracht Polarität der Analyten

hoch gering

(19)

Zusammenfassung: Elektrophorese

•  Gel-Elektrophorese

•  Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

•  Trennung geladener Makromoleküle (z.B. DNA-Fragmente)

•  Trennung aufgrund von Ladung und Grösse (Faltungszustand)

•  Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)

•  Trennung von Proteinen (als SDS-Protein-Komplex)

•  Trennung nur aufgrund des Molekulargewichts

•  Kapillarelektrophorese (CE)

•  Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

•  Trennung geladener, kleiner Moleküle (z.B. Aminosäuren, Ionen)

•  Trennung von Kationen und Anionen (wegen EOF)

•  Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

•  Trennung ungeladener, kleiner Moleküle

•  Trennung aufgrund der Polarität (Elutionsreihenfolge analog RP-HPLC)

Referenzen

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