Analytische Chemie
(für Biol. / Pharm. Wiss.)
Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)
Dr. Thomas Schmid
HCI D323
schmid@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/
Elektrophorese
Elektrophorese
Allgemein:
Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld Analytische Chemie:
Trennung von Ionen im elektrischen Feld
Elektrophoretische Trenntechniken zählen
im Allgemeinen nicht zur Chromatographie
„Chromatographie-Check“
Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein:
•
Trenntechnik• Zwei nicht mischbare Phasen
• Eine mobile und eine stationäre Phase
• Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen
• Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen
Elektrophorese
• Gel-Elektrophorese
• Agarose-Gelelektrophorese,
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
• Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)
• Kapillarelektrophorese (CE)
• Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
• Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
Gel-Elektrophorese
Gel-Elektrophorese
Gel-Elektrophorese: http://www.youtube.com/watch?v=qMxQ-65qYDk
„Genetischer Fingerabdruck“: http://www.youtube.com/watch?v=W5HeXufSFE4
Agarose-Gelelektrophorese,
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
• Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung im elektrischen Feld
• Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung
• Kleine Moleküle wandern schneller als grosse
• Detektion: chemische Anfärbemethoden (z.B. Fluoreszenz)
• Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse
• z.B. Auftrennung von DNA-Fragmenten (z.B. „Genetischer Fingerabdruck)
–
+
Standard Probe
Probe: DNA-Fragment mit 522 Basenpaaren (bp)
Agarose-Gelelektrophorese,
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
• Trennung nach
Ladung und Grösse
• Grösse:
hydrodynamischer Durchmesser
• d.h.: Proteine werden nach Ladung,
Molekulargewicht und Faltung getrennt
• Bei Proteinen wird häufig die SDS-PAGE angewandt
SDS-PAGE
SDS = sodium dodecyl sulfate Natriumdodecylsulfat Natriumlaurylsulfat C12H25NaO4S
Tensid
SDS bildet Mizellen
SDS denaturiert Proteine SDS bildet negativ geladene
Komplexe mit Proteinen
SDS-PAGE
• Trennung von negativ geladenen Komplexen
von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen
• Faltung beeinflusst nicht die Trennung
• Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom
Molekulargewicht ab,
Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle
• Trennung von Proteinen nur aufgrund des
Molekulargewichts
SDS-PAGE
• Trennung von negativ geladenen Komplexen
von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen
• Faltung beeinflusst nicht die Trennung
• Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom
Molekulargewicht ab,
Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle
• Trennung von Proteinen nur aufgrund des
Molekulargewichts
SDS-PAGE-Trennung verschiedener Proteine (1-8) gemäss ihres Molekulargewichts.
Links: Gemisch von Proteinen bekannter Grösse als Molekulargewichtsstandard (14–97 kDa)
Kapillarelektrophorese
(capillary electrophoresis = CE)
CE: Theoretische Grundlagen
µ
EP= v
E = Geschwindigkeit eines Ions
Elektrische Feldstärke = e 6 ! "
1
# "
z r
e ... Elementarladung
η ... Viskosität der Pufferlösung z ... Ladung des Ions
r ... Hydrodynamischer Durchmesser des Ions
Elektrophoretische Mobilität µ
EPeines Ions im elektrischen Feld E
K o n sta n te Pu ffe rl ö su n g Io n (A n al yt)
Trennung
aufgrund von Ladung und
Grösse der Ionen
CE: Theoretische Grundlagen
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
+ –
Anode Kathode
EOF
Aufgrund der negativ geladenen Innenwand der Quarzkapillare bildet sich ein Fluss der Pufferlösung in Richtung Kathode aus, der elektroosmotische Fluss (EOF).
Quarzkapillare (SiO2)
Quarzkapillare (SiO2)
Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
Kationen Neutrale Moleküle (ungetrennt) Anionen
• Trennung von
Kationen und Anionen
• Neutrale Moleküle verlassen ungetrennt mit dem EOF die Kapillare
• Detektor wegen EOF
kathodenseitig angebracht
• Nur Anionen, die schneller als der EOF wandern, erreichen den Detektor nicht
Herbstsemester 2011 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | schmid@org.chem.ethz.ch
Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
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Dem Puffer wird ein Tensid (z.B. SDS) zugegeben, welches Mizellen bildet.
Abhängig von ihrer Polarität halten sich die Analyten v.a.
in der Pufferlösung (polar) oder in den Mizellen (unpolar) auf.
• Trennung ungeladener Analyten (keine Ionen)
• Chromatographie
• Mobile Phase: Pufferlösung (polar)
• Pseudo-stationäre Phase: Mizellen (unpolar)
Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
• Trennung von
ungeladenen Analyten
• Pufferlösung (mobile Phase) bewegt sich wegen EOF in Richtung Kathode
• Mizellen (pseudo-stationäre
Phase) bewegen sich langsamer
• Elutionsreihenfolge wie in RP-HPLC: polare Moleküle eluieren vor unpolaren
• Detektor wegen EOF
kathodenseitig angebracht Polarität der Analyten
hoch gering
Zusammenfassung: Elektrophorese
• Gel-Elektrophorese
• Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
• Trennung geladener Makromoleküle (z.B. DNA-Fragmente)
• Trennung aufgrund von Ladung und Grösse (Faltungszustand)
• Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)
• Trennung von Proteinen (als SDS-Protein-Komplex)
• Trennung nur aufgrund des Molekulargewichts
• Kapillarelektrophorese (CE)
• Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
• Trennung geladener, kleiner Moleküle (z.B. Aminosäuren, Ionen)
• Trennung von Kationen und Anionen (wegen EOF)
• Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
• Trennung ungeladener, kleiner Moleküle
• Trennung aufgrund der Polarität (Elutionsreihenfolge analog RP-HPLC)