Analytische Chemie

(1)

HS 2008 Xiangyang Zhang 1

Analytische Chemie

für Biologie Pharmazie Bewegungs- wissenschaften und Sport

Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren

Zusammenfassung

Überblick Trennmethoden

Beweblichkeit

in Einzelphase Gleichgewicht Beweblichkeit 1 + 2 + +

1 2 m S

Verteilung Adsorption/Desorption

Beruht auf

Unterschied in Gleichgewicht / Kinetische Eigenschaften

(2)

Ein Chromatogramm

normierte Signalhöhe h

t

_M

t

_A

t

_B

w

_A

w

_B Zeit

B A

Klassische Grundlage

!

K =

[ ]

A S

[ ]

A M

!

v = L t

_R

!

u = L t

_M

!

k = K V

_s

V

_M

!

k = t

_R

" t

_M

t

_M

= t

_R^'

t

_M

" = K

_B

K

_A

" = k

_B

k

_A

" = (t

_R^'

)

_B

(t

_R^'

)

_A

!

N =N_eff " k+1 k

#

$ % &

' (

2

= t_R^'

)

#

$ % &

' (

2

" k+1 k

#

$ % &

' (

! 2

N= L H = t_R²

"² =16 t_R w

#

$ % &

' (

2

!

t

_R^'

= t

_R

" t

_M

Trennfaktor / Selektivätsfaktor Retentionsfaktor / Kapazitätsfaktor Retentionszeit / Geschwindigkeit Verteilungskoeffizient

Auflösung

!

H= L 16

w t_R

"

# $ %

&

'

2

Bodenzahl und Bodenhöhe

!

R = t

_B

" t

_A

w

_B

+ w

_A

2 = 2(t

_B

" t

_A

) w

_B

+ w

_A

R = " # 1

"

$

% & ' ( ) * k

_B

1 + k

_B

* N

4

(3)

Kinetischer Bodenhöhe

Minimaler H-Wert

Theoretische Bodenhöhe H

!

H = 2 " # d

_p

+ 2k

_D

# D

_M

u + u # f (d

_p²

, d

_c²

)

D

_M

+ q # k # d

²_f

(1 + k)

²

D

_S

oder 2t

_d

# k (1+ k)

²

$

% & '

( )

optimale u Minimum H

1.! Kapillarsäulen A = 0 2.! Optimale u => minimum

von Terme B und C 3.! Dünne L-Filmdicke

Gaschromatographie (GC)

Mobile Phase: He, N

₂ und H₂ als Träger

Stationäre Phase: entweder feste Adsorbentien oder flüssige Film Analyten:

•! ausreichenden Dampfdruck und

•! stabil bei Arbeitstemperatur

•! Kleine, neutral und nicht-zu polare Moleküle Gekoppelt:

•! mit MS zur qualitativen Analysen (Strukturaufklärung)

•! mit FID (und TCD, unselektiv) und ECD (Cl-), FPD (P-/S-) (selektiv) zur quantitativen Analysen

Zur Anwendungen:

•! Säulenparameter, T–Gradient und u

•! Derivatisierung

(4)

Flüssige Stationäre Phase in GC

Physikalisch adsorbiert auf poröse Kieselgur (diatomite) mit grossen Oberfläche Chemikalische Modifizierung von OH-gruppen durch organische Seitengruppen

Si CH₃ CH₃

O n

Si CH₃ CH₃

O n

Si Ph Ph

O m

Si CH₃ CH3

O n

Si Ph

O

m CN

Si O

n O

O

COOH O O

OOC

n Polysiloxan

unpolar polar

mit Phenylgruppe mit Cyanogruppe

Ethyleneglycol Ethyleneglycol, Phenyl, und Ester-gruppen

Polare Flüssigkeitsfilm

k N

Säulenparameter

und Bedingung Kapazität Geschwindigkeit

R

! ! !

L

! ! " !

" ! "

ID

! ! " "

! ! "

d

f

! ! " ! "

"

!

T

! ! !

" !

! !

^opt

u ! ! !

_opt

Optimierung zur GC

Polarität und Flimdicke der SP, u der MP, T und Säulenparameter

(5)

HPLC: Apparatur, Typen und MP

300 – 400 bar LM 10 ml/min He/Ar

LM Behälter

Detektor

Vorsäule Pumpe

Injektorvalve LM Aufteilungsvalve

Trennsäule

!! Adsorptions-Chromatographie

!! Verteilungs-Chromatographie

!! Umkehrphasen-Chromatographie

"! Ionenaustausch-Chromatographie (IEC)

"! Ionenpaaren-Chromatographie

"! Grössenausschluss-Chromatographie (GPC)

#! Affinitäts-Chromatographie

#! Komplexierungschromatographie

#! Chirale Chromatographie Mobile Phase:

Reinheit, Siedepunkt, Preis, Inert, Korrosions-beständigkeit,

Toxizität, UV–Durchlässigkeit, Brechungsindex, Mischbarkeit, Puffer, Haltbarkeit

"! Viskosität

"! Elutionsstärke

"! Selektivität

Normalphase (NP) und Umkehrphase (RP)

Si O OH

O Si

Si

O OH

O Si O OH

OH

Si

Si O O

O Si

OH

OH OH single

silanol group

two silanol group

three silanol group

Si OH

Si R₂

Cl R

R₁

Modifikation:

Si R₁

R₂ R Si

O

NP: SiO₂, Al₂O₃undmodifizierte polare Gruppen

O Si R₁

R₂

CN O Si

R₁

R₂

NH₂

O Si R₁

R₂

O OH

OH

RP: unpolare straight-chain hydrocarbons (C₁₈, C₁₂, C₈, C₆, C₄, C₃, C₂, C₁) und cyclohexyl, phenyl, alkylphenyl

O Si R₁

R₂ R

R = C₁ – C₁₈ _O _Si

R₁

R₂ O Si

R1

R₂

O Si R₁

R2

(6)

HPLC: Ionenchromatographie

Ionenaustauschchromatographie: um ionische Verbindunen zu trennen

•! SO₃^–H⁺ (Sulfonsäure): stark saurer Kationenaustauscher, pH 2 – 14

•! COO^–H⁺ (Carbonsäure): schwach saurer Kationenaustauscher, pH 8 – 14

•! NR₃⁺OH^– (quaternäres Amin): stark basischer Anionenaustauscher, pH 0 – 10

•! NR₂ (tertiäres Amin): schwach basischer Anionenaustauscher, nur bei niedrigem, pH 0 – 6.

Ionenpaar: um die organische grösse Ionen zu trennen

ein Ionenpaarbildner (sogenanntes Gegenion) als Hilfskomponente wird der mobilen Phase zugesetzt, um neutral Ionenpaar zu bilden, dann kann man die Umkehrphasen-Säule benutzen.

$!das Anion der Heptansulfonsäure für kationische Proben

$!das Tetrabutylammoniumion (Phosphat) für anionische Proben

HPLC: Größenausschlusschromatographie

!

t

_R

" 1 log

₁₀

MW

CH₃(CH₂)_nCOOH SP: 5 nm – 0.1 mm Ausschluss-/Eindringen-grenze, Kein Wechselwirkung

Geeignet für 10% Unterschied in MW; Biopolymer, Polymer, Organische Moleküle Mechanismus: Grösse / Mol Radius

Ausschluss Eindringen

(7)

Dünnschichtchromatographie (HP–TLC)

Normal Silica / Alumina TLC, HPTLC plates C18-50 (50% silanization) and C18-100 (100%

silanization) with fluorescent indicator

!

R

_f

= S

_x

S

_f

Selektivität und Trennleistung

Wahl des Laufmittels (Rein oder Gemisch)

für HPLC und Reaktionsablauf

Elektrophorese (EP): Apparatur

•! L: 10-100 cm

•! ID 10-100 !m Probenaufgabe (1-10 nl) durch

•! Hydrostatische Injektion (Siphoneffekt)

•! Druck/Vakuum Injektion (Druckdifferenz)

•! Elektrokinetische Injektion (!_EOF, !_EP)

•! UV – 10^–6 mol/L

•! Fluoreszenz – Attomol

•! Kopplung an MS

On-column (durchsichtlich)

Fused silica mit Polyimidbeschichtung

bis 30 kV

(8)

Grundlage zur Elektrophorese

!

N = µ " V

2 " D

!

µ = µ

_EP

± µ

_EOF

!

µ

_EO

= " # $ 4 % # &

!

µ

_EP

= v

_i

E = z

_i

" e

₀

6 # " $ " r = q

6 # " $ " r

Elektrophoretische Mobilität

Elektroosmotische Mobilität

– N +

Kapillare

Kathode

–

Stempelförmig elektrochemische Doppelschicht

Totalmobilität:

Elektrophoretische Trennverfahren

"! keine oder geringe Bandenverbreiterung (flaches EOF Strömungsprofil)

"! keine feste stationäre Phase, extrem wenig Lösungsmittelverbrauch

"! nur kleine Probenmengen nötig schnelles Verfahren (10 - 20 Minuten)

"! hohe Trennleistung

(9)

Zusammenfassung

GC LC EP

MP He, H2, N2 LM (elutionsmittel) Pufferlösung SP Film-d_f/Polarität NP, RP, IC, SEC, … –––––(Mizelle/RP) Säule (Kapillar) ID, L, Kapizität ID, L, d_f(kompakt) ID, L

Parameters Flussrate (u), T Flussrate (u) pH, Spannung (V)

Gradient- T- Elutions-, (T-) pH-, V-

Prinzip G/L Verteilung L/L Verteilung EP und EOF Detektor FID (ECD) / MS UV, RI, ELSD / MS UV, Fl / MS

Anwendungen Klein, neutral, thermostabil, nicht-zu-polare

Alle (auch polare bei RP, Polymere bei SEC)

Ionische (auch Neutrale bei MEKC)

(10)

Aufgabe der Analytischen Chemie

Die Art (qualitativ) und Anzahl (quantitativ) der Atome allein

(Elementanalytik) oder zusammen mit ihrer Anordnung oder

Verbindung untereinander als Molekül (Molekülanalytik) im 3- dimensionalen Raum (Strukturanalytik), die alle die Eigenschaften

eines Stoffes bestimmen

"

Was liegt vor?"

Wieviel davon liegt vor?"

Welche Anordnung oder Form liegt vor?"

Wo befindet sich der Analyt?" Verteilungs- oder "

Oberflächenanalyse"

Qualitative Analyse!

Quantitative Analyse!

Strukturanalyse"

Trennstrategie

Qualitativ Quantitativ

Strukturaufklärung Identifizierung mit Bekanntem Stoff

Kalibrieren Kopplung mit IR,

UV/Vis, NMR, MS

Peakzuordnung Fragmentierung Spektrendatenbank

Retentionszeiten Retentionsindizes

Selektiv Detektor

mit externem Standard mit internem Standard

Standardaddition Mengenbestimmung

Analysenzweck

Frage- stellung

Probe- nahme

Probe- Vorbe- reitung

Aus-

wertung Statistik Report Messung

(11)

Probenaufbereitung

Feststoff

Aerosol

Emulsion

Suspension

Flüssigkeitstropfen feste Teilchen

Gas

Flüssigkeit

(unlöslich Feststoff)

Homo- und Heterogenes Stoffgemisch

(2 unmischbar Flüssigkeiten)

LLE, SPE, SPM, SPME Extraktion

Batch-E Soxhlet-E Soxtec-E Ultraschall-E MAE, ASE SPE, SWE Adsorption

Filtration GC

HPLC EP

mit MS NMR IR UV Löslich oder unlöslich

Aufkonzentrierung Aufreinigung Vortrennung und Anreicherung

Probenarten

Messung

Analytmoleküle

!!

Analysenzweck: Qualitativ / Quantitativ

!!

Kleine, neutral, und thermostabil => GC

!!

Kleine, ionische => IC und EP

!!

GC nicht-geeignet => HPLC

!!

Thermoempfindlich

!!

zu polar und zu hohe Siedpunkt (wenig flüchtig)

"!

derivatisieren

!!

Grosse Biopolymere: HPLC, EP und IC

!!

Polymere: SEC

(12)

Auswahl einer Flüssig-chromatographie

$!

Polarität

$!

Löslichkeit

$!

Ionenisch

$!

Molekulare Masse

NP RP

Ausschluss

•! Geeignet für Sehr polare und thermisch labile Substanzen

•! Geeignet für Ionische Verbindungen, Biopolymere und Polymere

•! Analytische, Präparative und Produktive

•! Grosse Auswahl und Hohe Trennleistung Selektivität

Optimierungsfaktoren

•! System – Säule (stationäre Phase) und mobile Phase (Polarität)

•! Analyteneigenschaften

•! Operationsbedingungen (Fliessrate, Temperatur und LM-Gradientenelution)

!

" = K

_B

K

_A

k = K V

_s

V

_M _!

N = L H

H = A + B

u + C " u

SP und Analyten Ideal: k = 5 - 10 Analyten SP und MP Temperatur

Säulenlänge Bodenhöhe

stark beinflusst durch u, D, d_f und d_p

!

R = " # 1

"

$

% & ' ( ) * k

₂

1 + k

₂

* N 4

!

t

_R

= 16R

_S²

H

u " #

# $ 1

%

&

' (

) * " ( 1 + k

₂

)

³

k

₂² Kurze Retentionszeit t_R’ genuge Auflösung R

idealer Peakform (schmal w_b und symmetrisch)

(13)

Derivatisierung

$!

Online: Vor- (für höhe Trennleistung) und Nach- (mit UV/Fl Marker für selektive und empfindliche Detektion )

$!

Offline: bei der GC für flüchtig und zu schwer

$!

Schnell, sauber, Reagenzien mischbar mit MP, Produkte löslich in MP

-NH₂ (Amine, Aminosäuren) ! "5-(N,N-Dimethylamino)- "

! ! ! ! naphthalin-1-sulphonylchlorid "

! ! ! ! 2,4-dinitrofluorbenzol "

-OH (Alkohole) ! ! !3,5-Dinitrobenzochlorid "

! ! ! ! Silylierungsreagenzien "

-CHO (Aldehyde) ! ! !2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) "

-C(O)R (Ketone) ! ! !4-Hydroazino-7-nitrobenzofurazan "

-COOH (Säuren) ! ! !4-Brommethyl-7-methoxycoumarin "

-SH (Thiole) ! ! !Dansylaziridin !