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(1)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 1

Analytische Chemie

für Biologie Pharmazie Bewegungs- wissenschaften und Sport

Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren

Gaschromatographie

529-1041-00 G HS2008

Gaschromatographie

Mobile Phase: Gase als rein Träger

Stationäre Phase: entweder feste Adsorbentien oder flüssige Film Analyten:

•! ausreichenden Dampfdruck und

•! stabil bei Arbeitstemperatur Gekoppelt:

•! mit MS zur qualitativen Analysen

•! mit FID zur quantitativen Analysen GC:

am häufigsten verwendete analytische Technik im Labor oder in

der Industrie; 30,000 Geräte pro Jahr (1 Mrd US$ pro Jahr)

(2)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 3

Apparatur

Säule Temperatur Kontrolle

Injektor Detektor

Druck Kontrolle

Software

Trägergas

Methode Kontrolle Auswertung

Interface

Gaschromatographie

•! Mobile Phase

•! Stationäre Phase

–! Feste stationäre Phase –! Flüssig stationäre Phase

•! Säule

–! Gepackte Säule –! Kapillarsäule

•! Injektor

•! Temperatur-Kontroller

•! Detektor

•! Aspekte zur praktischen Anwendungen

(3)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 5

Mobile Phase

•! Kriterien als Mobile Phase

–! Hohe Reinheit (99.999%, O2-frei, trocken)

–! Keine Reaktivität gegenüber Analyten oder stationäre Phase –! Keine Wechselwirkung mit Analyten

–! Eine effektive Detektion erlaubt –! Nicht giftig

–! Nicht zu teuer

•! Helium, Stickstoff, Wasserstoff sind die meist benutzten Trägergase

van-Deemter-Kurve: Ideale u

!

H = 2 " # d

p

+ 2k

D

# D

M

u + u # f (d

p2

,d

c2

)

D

M

+ q # k # d

2f

(1 + k)

2

D

S

$

% & '

( )

Helium

Höchste Viskosität

!

2t

d

" k

(1+ k)

2 feste SP!

flüssige SP!

u

(4)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 7

GC Trennsäule

Gepackte Säulen

festes

Trägermaterial Wand

Kapillarsäule

Schutzschicht Wand aus Quarz Trennphase

Gepackte Säule

festes Trägermaterial Wand aus Metall oder Glas

Innerere Durchmesser und Länge Partikelgrösse, Porösität und

Packungsfaktor

Gepackt mit Adsorbentien

•! Anorganische: Kieselgel,

Aluminiumoxid, Molekularsiebe

•! Organische: Polystyrene,

Polyacrylate

(5)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 9

Kapillarsäule

Kapillarsäule

Schutzschicht Wand aus Quarz Trennphase

Quarzwand:

100% SiO2, 100!m Dicke mit grossen Flexibilität Schutzschicht:

mit organischen Polymerfilm (Polyimid) Trennphase:

feste oder flüssige Phase

Kapillarsäulen

SCOT

(support-coated open tubular)

flüssiger Film auf festem Träger!

Wand aus “fused silica” mit Polyimid- beschichtung!

WCOT

(wall-coated open tubular)

Wand aus “fused silica” mit Polyimid-

beschichtung! Flüssigkeitsfilm auf der Wand!

PLOT

(porous-layer open tubular)

festes Träger- material!

Wand aus “fused silica” mit Polyimid- beschichtung!

(6)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 11

Feste Stationären Phase

Adsorbentien

:

•! Anorganische: Kieselgel, Aluminiumoxid, Molekularsiebe

•! Organische: Polystyrene, Polyacrylate

Kieselgel

Trennung eines Gasgemisches (Ne, Ar, O2, N2, Kr und Xe) mit einer PLOT-Säule. Stationäre Phase: Molekularsieb, 5 µm dick, mit 5 Å Porengrösse, Säule: 30 m x I.D. 0.53 mm. !

(7)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 13

Flüssige stationäre Phase

Physikalisch adsorbiert auf poröse Kieselgur (diatomite) mit grossen Oberfläche!

Chemikalische Modifizierung von OH-Gruppen durch organische Seitengruppen!

SCOT

(support-coated open tubular)

flüssiger Film auf festem Träger!

Wand aus “fused silica” mit Polyimid- beschichtung!

WCOT

(wall-coated open tubular)

Wand aus “fused silica” mit Polyimid-

beschichtung! Flüssigkeitsfilm auf der Wand!

WCOT-Kapillarsäule

(Wall-Coated Open Tubular)!

Wand aus fused silica mit Polyimid- Beschichtung

Flüssigkeitsfilm SiO

2

Si O OH

O Si

Si

O OH

O Si O OH

OH

Si

Si O O

O Si

OH

OH OH

(8)

Siedpunkt und Polarität

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 15

! Polysiloxan (apolare bis mittel-polare Phase)

In apolaren stationären Phasen findet eine Trennung hauptsächlich aufgrund des Siedepunktes statt (tief siedende Substanzen eluieren früh).

! Polyethylenglykole (Carbowax, polare Phase)

Zusätzlich zum Siedepunkt spielen hier auch Wechselwirkungen zwischen polaren Gruppen eine gewisse Rolle.

Si CH3 CH3

O n

Si CH3 CH3

O n

Si Ph Ph

O m

Si CH3 CH3

O n

Si Ph

O m CN Polysiloxan

unpolar polar

mit Phenylgruppe mit Cyanogruppe

Si O

n O

O

COOH O O

OOC

n

Ethylenglycol Ethylenglycol, Phenyl, und Ester-Gruppen

Polarer Flüssigkeitsfilm

Polarität und Stabilität

Polarität

–60 bis 360°C

–60 bis 360°C

20 bis 280°C

10 bis 250°C

Methyl

Phenyl

Cyano

Si CH3 CH3

O n

Si CH3 CH3

O n

Si Ph Ph

O m

Si CH3 CH3

O n

Si Ph

O m CN

Si O

n

O

O

COOH O O

OOC

n

Ethylenglycol

(9)

Säulenbluten

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 17

Nach langem Einsatz!

und unter zu hoher!

Säulentemperatur!

GC Apparatur

Injektor! Detektor!

Säule Druck Kontrolle

Software

Trägergas

Methode Kontrolle Auswertung Interface

Temperatur Kontrolle!

(10)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 19

Injektor

zur Kapillarsäule!

Einwandfreies Einspritzen:!

•! Injektor ist dicht!

•! Injektor ist richtig beheizt!

•! Liner ist sauber und genau eingebaut!

•! Passender Liner gewählt!

•! Säule ist richtig installiert!

1 2

3

1)! Die Analyten in Lösung mit Spritze in Röhrchen (Liner) bringen;!

2)! Durch beheiztes “Röhrchen” wird die Lösung verdampft;!

3)! Der Dampf wird mithilfe des Trägergases zur Säule transportiert.!

Injektorart: Splitless/ Split

Splitless/Split: !

Die Probe wird zunächst splitlos injiziert, und nach einer im Voraus einprogrammierten Zeit, wenn der erwünschte Teil der Probe auf die Säule gelangt ist, wird der Split über ein Schaltventil elektronisch geöffnet und der Injektor leer gespült. !

Split Liner Splitless Liner

!

Splitverhältnis = Splitfluss Säulenfluss

!

= 40

2 = 20

(11)

Temperatur-Kontrolle

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 21

!! Injektorbereich

!! Ofen – Trennsäule

"! Isotherme Bedingung

"! T–Gradienten-Programm

!! Detektorschnittstelle

Detektoren

Ideale Eigenschaften:

•! Empfindlich

•! Linear Ansprech (Siganl/Konzentration)

•! Grosser dynamischer Bereich

•! Probe nicht zerstört

•! Sehr selektiv // völlig unselektiv

•! Stabil

•! Reproduzierbar

•! Kurze Ansprechzeit

(12)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 23

Übersicht Detektoren

Flammenionisationsdetektor (FID)

•! 1 von 100,000 C-Atomen erzeugt ein Ion.

•! Signal ist proportional zur Anzahl reaktionsfähiger C-Atome

+

C H

CH

4

CH

4

O

CHO

(13)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 25

Massenspektrometer

Hochvakuumsystem

Ionenquellen Massenanalyzer Detektor EI

CI FAB

FD ESI MALDI

Time of flight (TOF) Linear Quadrapole Quadrapole Iontrap Magnet Sector FT-Ion Cyclotron Resonance

Ion Detector

M

+

/MH

+

m/z Raum/Zeit

Massenspektrometer (MS)

The general operation of a mass spectrometer is:

#!

create gas-phase ions and transfer them to MS

#!

separate the ions in space or time based on their mass-to-charge ratio

#!

measure the quantity of ions of each mass-to-charge ratio

Electron impact (EI)!

An EI source uses an electron beam, usually generated from a tungsten filament, to ionize gas-phase atoms or molecules. An electron from the beam knocks an electron off of analyte atoms or molecules to create ions

Chemical ionization (CI)!

Fast atom bombardment (FAB)!

Electrospray ionization (ESI)!

Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)!

(14)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 27 Strukturinformationen

aus Massenspektrum

Elektroneneinfangdetektor

(electron capture detector, ECD)

e! Anode!

Auslass!

Radioaktive !– !

Stromsignal!

Analytmoleküle aus Säule!

Kathode!

Wasser und Sauerstoff!

63Ni

Emissionsquelle

Sehr empfindlich (als FID, aber klein dynamisch Bereich)

Spezifisch für Anaylten-moleküle mit hoher Elektronenaffinität: N, O, Cl.

(15)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 29

Wärmeleitfähigkeits-Detektor (TCD)

Leicht gekoppelt mit gepackten Säulen oder wide-bore Kapillarsäule Referenzzelle

Messzelle

Trägergas mit Probe

Trägergas

Atomemissions-Detektor (AED)

•! Element-selektive Detektion

•! Spezifisch für Halogenverbindungen und metallorganische Verbindungen

Array-Detektor!

Gitter

Spiegel RF Spule

Säule

Ar

(16)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 31

Flammenphotometrischer Detektor (FPD)

•! Anregung von Molekülemissionen, z.B. HPO und S

2

•! Selektiv und empfindlich für S, P, und Sn

Wichtige Aspekte zur GC–Analyse

(17)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 33

GC Ungeeignet?

!!

Thermoempfindlich:

#!

LC // HPLC

!!

Zu polar und zu hohe Siedpunkt (wenig flüchtig)

#!

HPLC oder derivatisieren

!!

Chemische reaktiv zur stationären Phase

#!

Oder Zersetzungsprodukte: reaktiv zur stationären Phase

!!

Thermostabil bei GC, aber problematisch bei Detektion (Fragmentation)

!!

Zu viel Analyten in der Probe

Derivatisierung

F

F F

F F

O NH2

R2 R1 F

F F

F F

O N R2

R1

+ O

N

Si(CH3)3

F3C O (H3C)3Si

R OH R O

Si(CH3)3

+ + Rest

(18)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 35

Erster Schritt

Eigenschaften der Analyten:

#!

Polarität, Siedpunkt, und Stabilität Säulentypen:

#!

Gepackte Säule oder Kapillarsäule (analytisch oder präparativ) Säulenparameter:

#!

Innere Durchmesser, Säulenlänge, Partekelgrösse und Porösität

#!

Polarität der Film und Filmdicke Trägergase

#!

Flussgeschwindigkeit Temperatur-Programm

#!

Isothermes T-Programm

#!

Gradienten-T-Programm

Wahl einer Säule

Säulentypen

Innere Durchmesser, Länge und Kapazität Stationäre Phase: polarität und Filmdicke

Kurze Retentionszeit

Hohe Auflösung

Gaussförmig Peaksform

(19)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 37

Gepackte / Kapillar-säule

Bodenzahl

Kapazität

GSC/GLC 20%

Gasanalyse

GLC

Polysiloxan

Polyethyleneglykol

Gepackte Säule vs Kapillarsäule

(1) n-Pentan; (2) n-Hexan; (3) Benzol; (4) n-Heptan; (5) Toluol; ! (6) n-Octan; (7) Ethylbenzol; (8) m-Xylol; (9) p-Xylol; (10) n-Nonan.!

(a)! (b)! (c)!

0 1 2 3 0 1 2 3 0 8 16 24

(a) 2 m, 2 mm ID, gepackte Säule, 8% SE-30 auf 80/100-mesh Chromosorb W- HP; He 20 ml/min, 90°C; (b) 25 m, 0.53 mm ID, 5-!m Film Methylsilicon „fused- silica“ Säule, 20 ml/min, 90°C; (c) gleich wie (b), ausser He mit 1.4 ml/min, 110°C.

(20)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 39

GSC!– Al 2 O 3 vs SiO 2

Verunreinigungen in Propen Feste SP: Al2O3

50-m, 0.53 mm, 40°C (3min) 10°C/min, 120°C (5min) FID als Detektor

He 37.5 cm/s, Splitinjektion Schlecht bei SiO2

Säulenlänge

50-m 25-m

12-m 5-m 2.5-m

(a) n-nonane (b) 2-octanone (c) n-decane (d) 1-octanol (e) 2,6- dimethylphenol (f) n-undecane (g) 2,4-dimethylanaline (h) Naphthalene (i) n-dodecane.

! "

(0.25-mm ID 0.25-µm dimethylpolysilicone)

!

R= "#1

"

$

% & ' ( ) * kB

1+kB * N 4

(21)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 41

Innerer Säulendurchmesser

Bodenhöhe vs u / Säulendurchmesser ID

(22)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 43

Auflösung R vs Säulendurchmesser

ID 0.1 mm R = 4.00

ID 0.25 mm R = 1.63

!

R = " #1

"

$

% & ' ( ) * k

B

1 + k

B

* N

! 4

k = K V

s

V

M

Auflösung R vs Filmdicke d f

Je dicker der Film, desto besser die Auflösung, tR länger

df = 0.25 !m R = 3.14

df = 0.50 !m R = 3.60

df = 1.0 !m R = 4.95

!

k = K V

s

V

M

!

R = " # 1

"

$

% & ' ( ) * k

B

1 + k

B

* N

4

(23)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 45

P0larität der Säulen

1 – p-Xylol 2 – m-Xylol 3 – Decan 4 – Undecan apolarer Poly(dimethylsiloxan)film

polarer Polyethylenglycolfilm

Si CH3 CH3

O n

Si O

n

Polarität: Säulen vs Analyten

Polysiloxane 100% dimethyl-

alkaloids, amines, drugs, FAME, hydrocarbons, petroleum products, phenols, ethanol, essential oils solvents, PCBs, simulated distillation, waxes, general purposes

5% diphenyl- 95% dimethyl-

alcohols, alkaloids, aromatic hydrocarbons, drugs, FAMEs, flavors, fuels, halogenates, herbicides, pesticides, petroleum products, solvents, waxes, general purposes

50% dimethyl- 50% diphenyl-

alcohols, drugs, herbicides, pesticides, phenols, steroids, antidepressants, suga r s

14% cyanopropylphenyl- 86% dimethyl-

alcohols, pesticides, herbicides, aroclors, PAHs, phenols, steroids, alcohol acetates, drugs, fragrances, pesticides

50% cyanopropylmethyl- 50% diphenyl-

carbohydrates, FAME,

trifluoropropyl- drugs, environmental samples, ketones, nitroaromatics

Polyethylene glycol alcohols, aromatics, aldehydes, essential oils, glycols, pharmaceuticals, flavors, fragrances,

(24)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 47

Lineargeschwindigkeit Trägergas (1)

11 cm/s 30 cm/s

A = n-nonane, B = n-decane, C = 1-octanol, D = n-undecane, E = 2, 6-dimethylphenol, F = 2, 4-dimethylaniline, G = n-dodecane, H = naphthalene

Column: 25-m " 0.53-mm-i.d. 3-µm film thickness 5% phenylmethylsilicone, He carrier at 125°C, inlet at 200#C; flame ionization detector at 200°C

" !

Lineargeschwindigkeit Trägergas (2)

53 cm/s 105 cm/s

Column: 25-m " 0.53-mm-i.d. 3-µm film thickness 5% phenylmethylsilicone, He carrier at 125°C, inlet at 200#C; flame ionization detector at 200°C

! "

(25)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 49

Isothermes T-Programm

90°C 100°C

110°C 120°C

A = n-nonane; B = n-decane; C = 1-octanol;

D = n-undecane; E = 2, 6-DMP; F = 2, 4- DMA; G = naphthalene; H = n-dodecane

! "

!

"

T-Grandienten-Programm

Temperatur-Gradienten-Programm!

isotherme Bedingungen!

70°C

70°C 5 min

10°C/min 15 min

220°C (10min)

Analysenzeit: 30 min

(26)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 51

Programmierte T-Gradienten (1)

1.5°C/min 4.0°C/min

"

"

Programmierte T-Gradienten (2)

8.0°C/min 16°C/min

! "

(27)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 53

Zusammenfassung

k N

Säulenparameter

und Bedingung Kapazität Geschwindigkeit

R

! ! !

L ! ! " !

" ! "

ID ! ! " "

! ! "

d

f

! ! " ! "

" ! !

T ! ! !

" !

! ! opt

u ! ! ! opt

Probenmenge & Injektionstechnik

1% Gewicht in Lösung; 1!l einzuspritzen

(28)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 55

Problem ???

#!

GC/Detektor Kontrollieren

#!

Kein / Schlechtes Signal

#!

Alte Peaks

#!

Schlecht Peakform

#!

Säulenblüten

Fehlerbehebung – Kein / Schlecht Signal

#!

GC/Detektor Kontrollieren

#!

Kein Signal

#!

Alte Peaks

#!

Schlecht Peakform

#!

Säulenblüten

Septum

Interface-T

Nur Basislinie sichtbar:

1.! Filament verbrannt

2.! Säulenblockieren

3.! Anschlussleak

(29)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 57

Kontamination

#!

GC/Detektor Kontrollieren

#!

Kein Signal

#!

Alte Peaks

#!

Schlecht Peakform

#!

Säulenblüten

1.! Zu viel Probemenge eingespritzen 2.! Substanzen mit zu hohem Siedepunkt 3.! Zu polare Substanzen

Kontaminierung am Septum, Liner und Säulenanfang

"!

Septum wechseln

"!

Liner reinigen

"!

Säulen abschneiden

Probenüberlastung

#!

GC/Detektor Kontrollieren

#!

Kein Signal

#!

Alte Peaks

#!

Schlecht Peakform

#!

Säulenblüten

(30)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 59

Säulenermüdung

Nach Spülung mit 30 ml n-Pentan

#!

GC/Detektor Kontrollieren

#!

Kein Signal

#!

Alte Peaks

#!

Schlecht Peakform

#!

Säulenblüten

Säulenblüten

#!

GC/Detektor Kontrollieren

#!

Kein Signal

#!

Alte Peaks

#!

Schlecht Peakform

#!

Säulenblüten

Nach langem Einsatz!

und unter zu hoher!

Säulentemperatur!

(31)

22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 61

Jetzt können Sie sie Erledigen!!!

1. Isobutan 2. n-Butan 3. Isopentan 4. n-Pentan

13. 2,2,4-Trimethylpentan 14. n-Heptan

15. 2,5-Dimethylhexan 16. 2,4-Dimethylhexan

17. 2,3,4-Trimethylpentan 18. Toluene

19. 2,3-Dimethylhexan 20. Ethylbenzen 21. m-Xylen 22. p-Xylen 23. o-Xylen

5. 2,3-Dimethylbutan 6. 2-Methylpentan 7. 3-Methylpentan 8. n-Hexan

9. 2,4-Dimethylpentan 10. Benzen

11. 2-Methylhexan 12. 3-Methylhexan

ENDE

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