22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 1
Analytische Chemie
für Biologie Pharmazie Bewegungs- wissenschaften und Sport
Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren
Gaschromatographie
529-1041-00 G HS2008
Gaschromatographie
Mobile Phase: Gase als rein Träger
Stationäre Phase: entweder feste Adsorbentien oder flüssige Film Analyten:
•! ausreichenden Dampfdruck und
•! stabil bei Arbeitstemperatur Gekoppelt:
•! mit MS zur qualitativen Analysen
•! mit FID zur quantitativen Analysen GC:
am häufigsten verwendete analytische Technik im Labor oder in
der Industrie; 30,000 Geräte pro Jahr (1 Mrd US$ pro Jahr)
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Apparatur
Säule Temperatur Kontrolle
Injektor Detektor
Druck Kontrolle
Software
Trägergas
Methode Kontrolle Auswertung
Interface
Gaschromatographie
•! Mobile Phase
•! Stationäre Phase
–! Feste stationäre Phase –! Flüssig stationäre Phase
•! Säule
–! Gepackte Säule –! Kapillarsäule
•! Injektor
•! Temperatur-Kontroller
•! Detektor
•! Aspekte zur praktischen Anwendungen
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Mobile Phase
•! Kriterien als Mobile Phase
–! Hohe Reinheit (99.999%, O2-frei, trocken)
–! Keine Reaktivität gegenüber Analyten oder stationäre Phase –! Keine Wechselwirkung mit Analyten
–! Eine effektive Detektion erlaubt –! Nicht giftig
–! Nicht zu teuer
•! Helium, Stickstoff, Wasserstoff sind die meist benutzten Trägergase
van-Deemter-Kurve: Ideale u
!
H = 2 " # d
p+ 2k
D# D
Mu + u # f (d
p2,d
c2)
D
M+ q # k # d
2f(1 + k)
2D
S$
% & '
( )
Helium
Höchste Viskosität
!
2t
d" k
(1+ k)
2 feste SP!flüssige SP!
u
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GC Trennsäule
Gepackte Säulen
festes
Trägermaterial Wand
Kapillarsäule
Schutzschicht Wand aus Quarz Trennphase
Gepackte Säule
festes Trägermaterial Wand aus Metall oder Glas
Innerere Durchmesser und Länge Partikelgrösse, Porösität und
Packungsfaktor
Gepackt mit Adsorbentien
•! Anorganische: Kieselgel,
Aluminiumoxid, Molekularsiebe
•! Organische: Polystyrene,
Polyacrylate
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Kapillarsäule
Kapillarsäule
Schutzschicht Wand aus Quarz Trennphase
Quarzwand:
100% SiO2, 100!m Dicke mit grossen Flexibilität Schutzschicht:
mit organischen Polymerfilm (Polyimid) Trennphase:
feste oder flüssige Phase
Kapillarsäulen
SCOT
(support-coated open tubular)
flüssiger Film auf festem Träger!
Wand aus “fused silica” mit Polyimid- beschichtung!
WCOT
(wall-coated open tubular)
Wand aus “fused silica” mit Polyimid-
beschichtung! Flüssigkeitsfilm auf der Wand!
PLOT
(porous-layer open tubular)
festes Träger- material!
Wand aus “fused silica” mit Polyimid- beschichtung!
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Feste Stationären Phase
Adsorbentien
:•! Anorganische: Kieselgel, Aluminiumoxid, Molekularsiebe
•! Organische: Polystyrene, Polyacrylate
Kieselgel
Trennung eines Gasgemisches (Ne, Ar, O2, N2, Kr und Xe) mit einer PLOT-Säule. Stationäre Phase: Molekularsieb, 5 µm dick, mit 5 Å Porengrösse, Säule: 30 m x I.D. 0.53 mm. !
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Flüssige stationäre Phase
Physikalisch adsorbiert auf poröse Kieselgur (diatomite) mit grossen Oberfläche!
Chemikalische Modifizierung von OH-Gruppen durch organische Seitengruppen!
SCOT
(support-coated open tubular)
flüssiger Film auf festem Träger!
Wand aus “fused silica” mit Polyimid- beschichtung!
WCOT
(wall-coated open tubular)
Wand aus “fused silica” mit Polyimid-
beschichtung! Flüssigkeitsfilm auf der Wand!
WCOT-Kapillarsäule
(Wall-Coated Open Tubular)!
Wand aus fused silica mit Polyimid- Beschichtung
Flüssigkeitsfilm SiO
2Si O OH
O Si
Si
O OH
O Si O OH
OH
Si
Si O O
O Si
OH
OH OH
Siedpunkt und Polarität
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 15
! Polysiloxan (apolare bis mittel-polare Phase)
In apolaren stationären Phasen findet eine Trennung hauptsächlich aufgrund des Siedepunktes statt (tief siedende Substanzen eluieren früh).
! Polyethylenglykole (Carbowax, polare Phase)
Zusätzlich zum Siedepunkt spielen hier auch Wechselwirkungen zwischen polaren Gruppen eine gewisse Rolle.
Si CH3 CH3
O n
Si CH3 CH3
O n
Si Ph Ph
O m
Si CH3 CH3
O n
Si Ph
O m CN Polysiloxan
unpolar polar
mit Phenylgruppe mit Cyanogruppe
Si O
n O
O
COOH O O
OOC
n
Ethylenglycol Ethylenglycol, Phenyl, und Ester-Gruppen
Polarer Flüssigkeitsfilm
Polarität und Stabilität
Polarität
–60 bis 360°C
–60 bis 360°C
20 bis 280°C
10 bis 250°C
Methyl
Phenyl
Cyano
Si CH3 CH3
O n
Si CH3 CH3
O n
Si Ph Ph
O m
Si CH3 CH3
O n
Si Ph
O m CN
Si O
n
O
O
COOH O O
OOC
n
Ethylenglycol
Säulenbluten
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 17
Nach langem Einsatz!
und unter zu hoher!
Säulentemperatur!
GC Apparatur
Injektor! Detektor!
Säule Druck Kontrolle
Software
Trägergas
Methode Kontrolle Auswertung Interface
Temperatur Kontrolle!
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 19
Injektor
zur Kapillarsäule!
Einwandfreies Einspritzen:!
•! Injektor ist dicht!
•! Injektor ist richtig beheizt!
•! Liner ist sauber und genau eingebaut!
•! Passender Liner gewählt!
•! Säule ist richtig installiert!
1 2
3
1)! Die Analyten in Lösung mit Spritze in Röhrchen (Liner) bringen;!
2)! Durch beheiztes “Röhrchen” wird die Lösung verdampft;!
3)! Der Dampf wird mithilfe des Trägergases zur Säule transportiert.!
Injektorart: Splitless/ Split
Splitless/Split: !
Die Probe wird zunächst splitlos injiziert, und nach einer im Voraus einprogrammierten Zeit, wenn der erwünschte Teil der Probe auf die Säule gelangt ist, wird der Split über ein Schaltventil elektronisch geöffnet und der Injektor leer gespült. !
Split Liner Splitless Liner
!
Splitverhältnis = Splitfluss Säulenfluss
!
= 40
2 = 20
Temperatur-Kontrolle
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 21
!! Injektorbereich
!! Ofen – Trennsäule
"! Isotherme Bedingung
"! T–Gradienten-Programm
!! Detektorschnittstelle
Detektoren
Ideale Eigenschaften:
•! Empfindlich
•! Linear Ansprech (Siganl/Konzentration)
•! Grosser dynamischer Bereich
•! Probe nicht zerstört
•! Sehr selektiv // völlig unselektiv
•! Stabil
•! Reproduzierbar
•! Kurze Ansprechzeit
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 23
Übersicht Detektoren
Flammenionisationsdetektor (FID)
•! 1 von 100,000 C-Atomen erzeugt ein Ion.
•! Signal ist proportional zur Anzahl reaktionsfähiger C-Atome
+ –
C H
CH
4CH
4O
CHO
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 25
Massenspektrometer
Hochvakuumsystem
Ionenquellen Massenanalyzer Detektor EI
CI FAB
FD ESI MALDI
Time of flight (TOF) Linear Quadrapole Quadrapole Iontrap Magnet Sector FT-Ion Cyclotron Resonance
Ion Detector
M
+/MH
+m/z Raum/Zeit
Massenspektrometer (MS)
The general operation of a mass spectrometer is:
#!
create gas-phase ions and transfer them to MS
#!
separate the ions in space or time based on their mass-to-charge ratio
#!
measure the quantity of ions of each mass-to-charge ratio
Electron impact (EI)!
An EI source uses an electron beam, usually generated from a tungsten filament, to ionize gas-phase atoms or molecules. An electron from the beam knocks an electron off of analyte atoms or molecules to create ions
Chemical ionization (CI)!
Fast atom bombardment (FAB)!
Electrospray ionization (ESI)!
Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)!
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 27 Strukturinformationen
aus Massenspektrum
Elektroneneinfangdetektor
(electron capture detector, ECD)
e–! Anode!
Auslass!
Radioaktive !– !
Stromsignal!
Analytmoleküle aus Säule!
Kathode!
Wasser und Sauerstoff!
63Ni
Emissionsquelle
Sehr empfindlich (als FID, aber klein dynamisch Bereich)
Spezifisch für Anaylten-moleküle mit hoher Elektronenaffinität: N, O, Cl.
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 29
Wärmeleitfähigkeits-Detektor (TCD)
Leicht gekoppelt mit gepackten Säulen oder wide-bore Kapillarsäule Referenzzelle
Messzelle
Trägergas mit Probe
Trägergas
Atomemissions-Detektor (AED)
•! Element-selektive Detektion
•! Spezifisch für Halogenverbindungen und metallorganische Verbindungen
Array-Detektor!
Gitter
Spiegel RF Spule
Säule
Ar
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 31
Flammenphotometrischer Detektor (FPD)
•! Anregung von Molekülemissionen, z.B. HPO und S
2•! Selektiv und empfindlich für S, P, und Sn
Wichtige Aspekte zur GC–Analyse
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 33
GC Ungeeignet?
!!
Thermoempfindlich:
#!
LC // HPLC
!!
Zu polar und zu hohe Siedpunkt (wenig flüchtig)
#!
HPLC oder derivatisieren
!!
Chemische reaktiv zur stationären Phase
#!
Oder Zersetzungsprodukte: reaktiv zur stationären Phase
!!
Thermostabil bei GC, aber problematisch bei Detektion (Fragmentation)
!!
Zu viel Analyten in der Probe
Derivatisierung
F
F F
F F
O NH2
R2 R1 F
F F
F F
O N R2
R1
+ O
N
Si(CH3)3
F3C O (H3C)3Si
R OH R O
Si(CH3)3
+ + Rest
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 35
Erster Schritt
Eigenschaften der Analyten:
#!
Polarität, Siedpunkt, und Stabilität Säulentypen:
#!
Gepackte Säule oder Kapillarsäule (analytisch oder präparativ) Säulenparameter:
#!
Innere Durchmesser, Säulenlänge, Partekelgrösse und Porösität
#!
Polarität der Film und Filmdicke Trägergase
#!
Flussgeschwindigkeit Temperatur-Programm
#!
Isothermes T-Programm
#!
Gradienten-T-Programm
Wahl einer Säule
Säulentypen
Innere Durchmesser, Länge und Kapazität Stationäre Phase: polarität und Filmdicke
Kurze Retentionszeit
Hohe Auflösung
Gaussförmig Peaksform
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 37
Gepackte / Kapillar-säule
Bodenzahl
Kapazität
GSC/GLC 20%
Gasanalyse
GLC
Polysiloxan
Polyethyleneglykol
Gepackte Säule vs Kapillarsäule
(1) n-Pentan; (2) n-Hexan; (3) Benzol; (4) n-Heptan; (5) Toluol; ! (6) n-Octan; (7) Ethylbenzol; (8) m-Xylol; (9) p-Xylol; (10) n-Nonan.!
(a)! (b)! (c)!
0 1 2 3 0 1 2 3 0 8 16 24
(a) 2 m, 2 mm ID, gepackte Säule, 8% SE-30 auf 80/100-mesh Chromosorb W- HP; He 20 ml/min, 90°C; (b) 25 m, 0.53 mm ID, 5-!m Film Methylsilicon „fused- silica“ Säule, 20 ml/min, 90°C; (c) gleich wie (b), ausser He mit 1.4 ml/min, 110°C.
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 39
GSC!– Al 2 O 3 vs SiO 2
Verunreinigungen in Propen Feste SP: Al2O3
50-m, 0.53 mm, 40°C (3min) 10°C/min, 120°C (5min) FID als Detektor
He 37.5 cm/s, Splitinjektion Schlecht bei SiO2
Säulenlänge
50-m 25-m
12-m 5-m 2.5-m
(a) n-nonane (b) 2-octanone (c) n-decane (d) 1-octanol (e) 2,6- dimethylphenol (f) n-undecane (g) 2,4-dimethylanaline (h) Naphthalene (i) n-dodecane.
! "
(0.25-mm ID 0.25-µm dimethylpolysilicone)
!
R= "#1
"
$
% & ' ( ) * kB
1+kB * N 4
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Innerer Säulendurchmesser
Bodenhöhe vs u / Säulendurchmesser ID
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 43
Auflösung R vs Säulendurchmesser
ID 0.1 mm R = 4.00
ID 0.25 mm R = 1.63
!
R = " #1
"
$
% & ' ( ) * k
B1 + k
B* N
! 4
k = K V
sV
MAuflösung R vs Filmdicke d f
Je dicker der Film, desto besser die Auflösung, tR länger
df = 0.25 !m R = 3.14
df = 0.50 !m R = 3.60
df = 1.0 !m R = 4.95
!
k = K V
sV
M!
R = " # 1
"
$
% & ' ( ) * k
B1 + k
B* N
4
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 45
P0larität der Säulen
1 – p-Xylol 2 – m-Xylol 3 – Decan 4 – Undecan apolarer Poly(dimethylsiloxan)film
polarer Polyethylenglycolfilm
Si CH3 CH3
O n
Si O
n
Polarität: Säulen vs Analyten
Polysiloxane 100% dimethyl-
alkaloids, amines, drugs, FAME, hydrocarbons, petroleum products, phenols, ethanol, essential oils solvents, PCBs, simulated distillation, waxes, general purposes
5% diphenyl- 95% dimethyl-
alcohols, alkaloids, aromatic hydrocarbons, drugs, FAMEs, flavors, fuels, halogenates, herbicides, pesticides, petroleum products, solvents, waxes, general purposes
50% dimethyl- 50% diphenyl-
alcohols, drugs, herbicides, pesticides, phenols, steroids, antidepressants, suga r s
14% cyanopropylphenyl- 86% dimethyl-
alcohols, pesticides, herbicides, aroclors, PAHs, phenols, steroids, alcohol acetates, drugs, fragrances, pesticides
50% cyanopropylmethyl- 50% diphenyl-
carbohydrates, FAME,
trifluoropropyl- drugs, environmental samples, ketones, nitroaromatics
Polyethylene glycol alcohols, aromatics, aldehydes, essential oils, glycols, pharmaceuticals, flavors, fragrances,
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 47
Lineargeschwindigkeit Trägergas (1)
11 cm/s 30 cm/s
A = n-nonane, B = n-decane, C = 1-octanol, D = n-undecane, E = 2, 6-dimethylphenol, F = 2, 4-dimethylaniline, G = n-dodecane, H = naphthalene
Column: 25-m " 0.53-mm-i.d. 3-µm film thickness 5% phenylmethylsilicone, He carrier at 125°C, inlet at 200#C; flame ionization detector at 200°C
" !
Lineargeschwindigkeit Trägergas (2)
53 cm/s 105 cm/s
Column: 25-m " 0.53-mm-i.d. 3-µm film thickness 5% phenylmethylsilicone, He carrier at 125°C, inlet at 200#C; flame ionization detector at 200°C
! "
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 49
Isothermes T-Programm
90°C 100°C
110°C 120°C
A = n-nonane; B = n-decane; C = 1-octanol;
D = n-undecane; E = 2, 6-DMP; F = 2, 4- DMA; G = naphthalene; H = n-dodecane
! "
!
"
T-Grandienten-Programm
Temperatur-Gradienten-Programm!
isotherme Bedingungen!
70°C
70°C 5 min
10°C/min 15 min
220°C (10min)
Analysenzeit: 30 min
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 51
Programmierte T-Gradienten (1)
1.5°C/min 4.0°C/min
"
"
Programmierte T-Gradienten (2)
8.0°C/min 16°C/min
! "
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 53
Zusammenfassung
k N
Säulenparameter
und Bedingung Kapazität Geschwindigkeit
R
! ! !
L ! ! " !
" ! "
ID ! ! " "
! ! "
d
f! ! " ! "
" ! !
T ! ! !
" !
! ! opt
u ! ! ! opt
Probenmenge & Injektionstechnik
1% Gewicht in Lösung; 1!l einzuspritzen
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 55
Problem ???
#!
GC/Detektor Kontrollieren
#!
Kein / Schlechtes Signal
#!
Alte Peaks
#!
Schlecht Peakform
#!
Säulenblüten
Fehlerbehebung – Kein / Schlecht Signal
#!
GC/Detektor Kontrollieren
#!
Kein Signal
#!
Alte Peaks
#!
Schlecht Peakform
#!
Säulenblüten
Septum
Interface-T
Nur Basislinie sichtbar:
1.! Filament verbrannt
2.! Säulenblockieren
3.! Anschlussleak22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 57
Kontamination
#!
GC/Detektor Kontrollieren
#!
Kein Signal
#!
Alte Peaks
#!
Schlecht Peakform
#!
Säulenblüten
1.! Zu viel Probemenge eingespritzen 2.! Substanzen mit zu hohem Siedepunkt 3.! Zu polare Substanzen
Kontaminierung am Septum, Liner und Säulenanfang
"!
Septum wechseln
"!
Liner reinigen
"!
Säulen abschneiden
Probenüberlastung
#!
GC/Detektor Kontrollieren
#!
Kein Signal
#!
Alte Peaks
#!
Schlecht Peakform
#!
Säulenblüten
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 59
Säulenermüdung
Nach Spülung mit 30 ml n-Pentan
#!
GC/Detektor Kontrollieren
#!
Kein Signal
#!
Alte Peaks
#!
Schlecht Peakform
#!
Säulenblüten
Säulenblüten
#!
GC/Detektor Kontrollieren
#!
Kein Signal
#!
Alte Peaks
#!
Schlecht Peakform
#!
Säulenblüten
Nach langem Einsatz!
und unter zu hoher!
Säulentemperatur!
22–10– 2008 Zhang, Xiangyang 61
Jetzt können Sie sie Erledigen!!!
1. Isobutan 2. n-Butan 3. Isopentan 4. n-Pentan
13. 2,2,4-Trimethylpentan 14. n-Heptan
15. 2,5-Dimethylhexan 16. 2,4-Dimethylhexan
17. 2,3,4-Trimethylpentan 18. Toluene
19. 2,3-Dimethylhexan 20. Ethylbenzen 21. m-Xylen 22. p-Xylen 23. o-Xylen
5. 2,3-Dimethylbutan 6. 2-Methylpentan 7. 3-Methylpentan 8. n-Hexan
9. 2,4-Dimethylpentan 10. Benzen
11. 2-Methylhexan 12. 3-Methylhexan