Analytische Chemie

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Herbstsemester 2013

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | schmid@org.chem.ethz.ch

HCI D323

Martin.pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/

Wiederholung der letzten Einheit: Auflösung

R _S = α − 1 α



  

  k ₂ 1 + k ₂



  

  N 4



  

 

α ^: Trennfaktor k: Retentionsfaktor

N: Anzahl theoretischer Böden

Wie Selektiv?

Wie unterschiedlich sind die Gleichgewichts-

einstellungen beider Analyten? (Kc1/Kc2)

Wie lange ist der Analyt in der Säule?

Wie viel mehr Zeit braucht der Analyt durch die Säule als

die mobile Phase? (tr/tm)

Wie viele Gleichgewichts- einstellungen?

Wie breit sind meine Peaks?

Höhe der theoretischen Böden

und Länge der Säule

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 





 





 



 



 +



 



 −

= 1 4

1

2 2 N

k R _S k

α α

k

k 1 + k

αααα N

N 4

Erhöhung von k:

bessere Auflösung, aber höhere Retentionszeiten

längere Analysenzeiten breitere Peaks

Erhöhung von N:

geringere Peakbreite (Standardabweichung σσσσ ⁾

Bei Optimieung durch L/u:

Veränderung t

_R

Erhöhung von α:

Grösserer Abstand der Peaks im Chromatogramm

Veränderung von t

_R

von zumindest einem Peak

Auflösung

M R t t k = ' /

H L N = /

längere Säule L geringeres [u]

höheres [u]

Wechsel Stationäre/Mobile

Phase

α = t

_R2

− t

_M

t

_R1

− t

_M

= ′ t

_{R 2}

′ t

_R1

= k

₂

k

₁

= K

_{C 2}

K

_C1

Peakbreite

verändert sich nicht

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Beschreibung der Effizienz der Chromatographie

= Van Deemter Gleichung

H wie breit werden die Peaks?

U proportional zur Retentionszeit

H = A + B

u + C u

A: Eddy-Diffusion B: Longitudinaldiffusion C: Massentransport-Effekte u: Lineare Flussgeschwindigkeit

Lineare Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase

H

+ -

- -

+

H L N = /

+ Optimum

- Schlechter Bereich

Quantitative Analyse mittels Chromatographie Statistik und Kalibrierung

„Allein die Dosis macht das Gift“

Meist ist das „WIEVIEL?“ genauso wichtig wie das „WAS?“!

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Quantitative Analyse

7

WAS? WIEVIEL?

Ein kleiner Ausflug in die Statistik

(5)

Statistische und systematische Fehler

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Genauigkeit = Präzision + Richtigkeit

Statistische und systematische Fehler

Schüsse 1–3

Schuss 4 nach Korrektur der Zieloptik

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Mittelwert und Standardabweichung

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H ä u fi g ke it e in e s M e ssw e rt e s

x

Mittelwert :

Standardabweichung σσσσ

relative Standardabweichung σσσσ rel,x :

x

x = 1 n x

_i

i=1

∑

n

Messwerte x _i

σ

x

= 1

n − 1 ( x

_i

− x )

²

i=1

∑

n

σ rel, x = σ _x x

Angabe eines Analysenergebnisses

H ä u fi g ke it e in e s M e ssw e rt e s

x

Messwerte x _i In einem Analysenbericht muss ein Messergebnis

immer mit einer Fehlerangabe versehen werden.

Messergebnis mit absolutem Fehler:

± σ _x z.B. 12.3 µg/L ± 0.8 µg/L

Messergebnis mit relativem Fehler:

± σ rel,x z.B. 12.3 µg/L ± 7%

x

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Kalibrierung

Das Detektorsignal ist im Idealfall proportional zur Analytenmenge grössere Analytenmenge mehr Peakfläche

Um das Detektorsignal in Mengenangaben umrechnen zu können (mg, mol, oder mg/ml….)

muss man eine Kalibrierung vornehmen

Kalibrierung

y-Achse: Detektorsignal z.B. in Volt oder Ampere (Peakfläche oder –höhe)

A _Analyt

x-Achse: Probenkonzentration z.B. in mg/l, µg/l, mol/l, ...

c _Analyt

A

_Analyt

= a + b c

_Analyt

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Empfindlichkeit und Nachweisgrenze

Was gilt noch als Peak?

Empfindlichkeit und Nachweisgrenze

Empfindlichkeit:

b = Steigung der Kalibriergeraden = Empfindlichkeit = Responsefaktor

Nachweisgrenze NG (limit of detection = LOD):

Minimale Konzentration deren Signal sich gerade noch also solches erkennen lässt bzw. welches sich signifikant vom Grundrauschen unterscheidet.

σ

A0

= Standardabweichung des Blindwerts

3σσσσ-Kriterium: Die NG ist die Konzentration, bei der eine Signalintensität erhalten wird, die 3 σ

A0

über dem Grundrauschen liegt.

Bestimmungsgrenze BG (limit of quantification = LOQ):

Minimale Konzentration, die sicher bestimmt (quantifiziert) werden kann.

Die BG lässt sich nach dem 6 σσσσ -Kriterium ermitteln. Das Signal bei der BG liegt also 6 σ

A0

über dem Grundrauschen.

Ab der BG überlappen die Gauss-Verteilungen von Signal und Rauschen nicht mehr.

A

_Analyt

= a + b c

_Analyt

NG = ( A

₀

+ 3 σ

A₀

) ⁻ ^a

b

BG = ( A

₀

+ 6 σ

_A₀

) ⁻ ^a

b

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Linearität des Detektors

b = Steigung der Kalibriergeraden = Empfindlichkeit

„unterer“ Bereich: LOD / LOQ , das Signal lässt sich vom Grundrauschen des Detektors nicht mehr unterscheiden

„oberer“ Bereich: Durch Überladung des Detektors kommt es zu keiner Signalzunahme mehr!

A

_Analyt

= a + b c

_Analyt

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Kalibrierung

• Kalibrierung ohne internen Standard

• Kalibrierung mit internem Standard

• Kalibrierung mittels Standardaddition

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Kalibrierung ohne internem Standard (extern)

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A

_Analyt

= a + b c

_Analyt

c

_Analyt

= A

_Analyt

− a

b

Bevorzugt eingesetzt, wenn:

• viele Proben mit ähnlicher Matrix gemessen werden sollen,

• systematische Fehler wie Verflüchtigung, Filtrationsverluste, Eintrag, Volumenfehler etc. vernachlässigbar klein sind.

Limitierungen:

• Matrixeffekte und systematische Fehler

Kalibrierung mit internem Standard

Bei der Kalibrierung werden Standardlösungen bekannter Analytkonzentration hergestellt, denen eine bekannte Konzentration an internem Standard zugesetzt wird.

Allen Proben wird dieselbe Menge eines internen Standards hinzugefügt Wird eingesetzt, wenn systematische Fehler z.B. während der Probenaufarbeitung nicht zu vernachlässigen sind (z.B. Aufkonzentrieren der Probe durch Verdunstung des Lösungsmittels, Verluste an Analytenmolekülen bei der Filtration, ...).

interner

Standard

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Kalibrierung mit internem Standard

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Ein interner Standard soll:

• dem Analyten ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften haben

• nicht in der Probe vorkommen

• neben dem Analyten in der Probe bestimmbar sein

Beispiel:

Analyt Interner Standard

Coffein Theophyllin

Ideal:

Stabilisotopen-markierte (z.B. D, ¹³ C) Analytenmoleküle als interner Standard und MS-Detektion.

Kalibrierung mit internem Standard

A

_Analyt

A

interner Standard

= a + b c

_Analyt

c

internerStandard

c

_Analyt

= c

interner Standard

A

_Analyt

A

interner Standard

− a





 





  b

Bei der eigentlichen Analyse wird der Probe vor der Aufarbeitung eine bekannte Konzentration an internem Standard zugesetzt und bei der Messung das Verhältnis der Peakflächen bestimmt.

Vorteil: Der interne Standard durchläuft die gleiche Probenaufarbeitung wie der Analyt Systematische Fehler können ausgeglichen werden.

Limitierung: Der interne Standard hat nicht die exakt gleichen Eigenschaften wie der Analyt.

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Kalibrierung mittels Standardaddition

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