Analytische Chemie

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Thomas Schmid

HCI D323

schmid@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/

Flüssigchromatographie (LC)

Flüssigchromatographie (LC)

Die heute am häufigsten eingesetzte instrumentelle LC-Technik ist die

HPLC

high performance liquid chromatography

ursprünglich: high pressure liquid chromatography

•  Hochdruckpumpen zum Fördern der mobilen Phase (300–400 bar)

LC: Einsatzbereich

Mittels Gaschromatographie (GC) lassen sich nur Analyten untersuchen, welche sich unzerstört verdampfen lassen

(also v.a. kleine, unpolare, flüchtige Moleküle)

Die Flüssigchromatographie (LC) hat ein viel breiteres Anwendungsfeld, da man mit ihr auch thermolabile und grosse Moleküle trennen kann:

z.B.

kleine ungeladene Moleküle

anorganische und organische Ionen Organometallkomplexe

Polymere

grosse (Bio-)Moleküle (z.B. Proteine)

Die Analyten müssen nur ausreichend in der mobilen Phase löslich sein.

Es existieren verschiedene Trennprinzipien, welche Moleküle nach verschiedenen Eigenschaften trennen (z.B. Polarität, Ionenladung, Grösse)

LC: Trennprinzipien

Trennmethode Trennprinzip

Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC Verteilung (und Adsorption) Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss

Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung

Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent) Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch

Bildung und Trennung von

Diastereomeren

LC: Trennprinzipien

Trennmethode Trennung nach...

Normalphasen-HPLC Polarität

Umkehrphasen-HPLC Polarität

Grössenausschlusschromatographie Molekülgrösse

Ionenchromatographie Ladung und Grösse von Ionen

Normalphasen- und Umkehrphasen-LC

Normalphasen- und Umkehrphasen-LC

Normalphasen- (NP) und Umkehrphasen(RP)-HPLC machen den Grossteil aller flüssigchromatographischen Trennungen aus. Die RP-HPLC deckt etwa 70%

aller Anwendungen ab.

Methode stationäre Phase mobile Phase Elutionsreihenfolge

NP-HPLC polar apolar apolare vor polaren Analyten

RP-HPLC apolar polar polare vor apolaren Analyten

NP- und RP-HPLC trennen die Moleküle nach ihrer Polarität.

Normalphasenchromatographie

Stationäre Phase: polar (z.B. Kieselgel, Al₂O₃) Mobile Phase: apolar (z.B. Hexan, Pentan)

Polare Moleküle adsorbieren stark an die polare stationäre Phase und werden retendiert. Apolare Moleküle halten sich vor allem in der apolaren mobilen Phase auf und werden schnell eluiert.

Geeignet für Moleküle, die in apolaren Lösungsmitteln löslich sind.

Umkehrphasenchromatographie

ODS =

Octadecylsilan (C₁₈ bzw. RP18)

Hydrophobisierung der Kieselgeloberfläche durch Reaktion mit Alkylchlorsilanen

Umkehrphasenchromatographie

Typische Umkehrphasen

Umkehrphasenchromatographie

Stationäre Phase: apolar (z.B. RP18-Kieselgel) Mobile Phase: polar (z.B. Wasser, Methanol,

Acetonitril)

Die Verteilung der Moleküle zwischen chemisch gebundener stationärer und mobiler Phase liegt für apolare Moleküle auf der Seite der stationären Phase, weshalb apolare Moleküle stärker retendiert werden als polare.

Geeignet für Moleküle, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind (inkl. Wasser und wässrige Pufferlösungen).

Elutionsreihenfolge und elutrope Reihe

Elutionsreihenfolge

Normalphasenchromatographie: apolare Moleküle eluieren vor polaren Molekülen

n

... ...

R

O

O O

NH₂

H

O O

OH

OH O

NH₂ O

< < <

< < < ~ <

< <

gesättigte Kohlenwasserstoffe

ungesättigte Kohlenwasserstoffe

aromatische Kohlenwasserstoffe

Ether Ester Amine Aldehyde und Ketone

Alkohole Carbonsäuren Amide

NP-Elutionsreihen- folge nach

aufsteigender Retentionszeit geordnet.

Umkehrphasenchromatographie: Elutionsreihenfolge dreht sich um

Elutionskraft

Die Elutionskraft bezeichnet die Fähigkeit eines Lösungsmittels, Analytmoleküle von der stationären in die mobile Phase zu überführen.

Erhöhung der Elutionskraft führt zu kleineren Retentionszeiten.

Erhöhung der Elutionskraft führt zu kleineren Verteilungskonstanten.

Die Elutionskraft eines Lösungsmittels ist dann hoch, wenn seine Polarität ähnlich der der stationären Phase ist.

Analytmoleküle mit ähnlicher Polarität wie die stationäre Phase adsorbieren stark und brauchen eine mobile Phase mit hoher Elutionskraft, um eluiert zu werden.

Die elutrope Reihe ordnet Lösungsmittel nach aufsteigender Elutionskraft in der Normalphasenchromatographie.

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Elutrope Reihe

16

Die elutrope Reihe ordnet Lösungsmittel nach aufsteigender Elutionskraft in der Normalphasenchromatographie.

<

Cl Cl

Cl Cl

Cl

O Cl Cl

Cl

Cl Cl HO

N

H₃C CN

OH

O O

S H₃C H₃C

O

O

OH H₃C OH

H N

O

H O

H

H O

H + Ionen

n-Heptan n-Hexan n-Pentan

Cyclohexan Isooctan Tetrachlorkohlenstoff Toluen

Benzen Chlorbenzen Diethylether Chloroform

Dichlormethan

1-Butanol Pyridin Acetonitril

2-Propanol Ethylacetat Dimethylsulfoxid Aceton

Ethanol Methanol Dimethylformamid Wasser wässrige

< <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

...

Fortsetzung 

Elutrope Reihe

<

Cl Cl

Cl Cl

Cl

O Cl Cl

Cl

Cl Cl HO

N

H₃C CN

OH

O O

S H₃C H₃C

O

O

OH H₃C OH

H N

O

H O

H

H O

H + Ionen

n-Heptan n-Hexan n-Pentan

Cyclohexan Isooctan Tetrachlorkohlenstoff Toluen

Benzen Chlorbenzen Diethylether Chloroform

Dichlormethan 1-Butanol Pyridin Acetonitril

2-Propanol Ethylacetat Dimethylsulfoxid Aceton

Ethanol Methanol Dimethylformamid Wasser wässrige Puffer- lösungen

< <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

...

Gradientenelution: Fliessmittelgradienten

Eluent 1

geringe Elutionskraft

Eluent 2

hohe Elutionskraft

Gradient: Eluent 1  Eluent 2 geringe  hohe Elutionskraft

Meistens wird der Gradient so gewählt, dass die Elutionskraft während der Trennung ansteigt.

Aufbau einer HPLC-Anlage

Aufbau einer HPLC-Anlage

Oft modularer Aufbau mit Modulen zum/

zur...

•  Entgasen der Lösungsmittel

•  Mischen von Lösungsmittelgradienten

•  Pumpen der mobilen Phase

•  Probeninjektion

•  Trennung der Substanzen (Säule)

•  Detektion der getrennten Substanzen

Aufbau einer HPLC-Anlage

Eluentenvorrat

Entgaser Gradientenmischer Pumpe

Injektionsventil mit Probenschleife

HPLC-Injektionsventil

Aufbau einer HPLC-Anlage

Eluentenvorrat

Entgaser Gradientenmischer Pumpe

Injektionsventil mit Probenschleife

Vorsäule

Trennsäule

Detektor

Abfallgefäss Computer

Film: HPLC

http://www.youtube.com/watch?v=kz_egMtdnL4 The Royal Society of Chemistry http://www.rsc.org

Flüssigchromatographie (LC)

Detektoren

UV/VIS-Detektor

Signal: Extinktion von Eluent+Analyt

Grundlinie: Extinktion des Eluenten (oft automatisch abgezogen)

Prinzip: Messung der optischen Transmission (wie bei einem UV/VIS-Spektrometer)

UV: 190 bis 400 nm VIS: 400 (violett) bis

800 nm (rot)

UV/VIS-Detektor

d

I

Probe

I

Lichtintensität

Abstand

Li ch tin te nsi tä t

A = lg I

I = ! " ( ) ^{c d}

I = I

10

I = I

e

Lambert-Beersches Gesetz E

E .... Extinktion

ε .... Extinktionskoeffizient c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

•  Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion

UV/VIS-Detektor

d

I

Probe

I

Lichtintensität

Abstand

Li ch tin te nsi tä t

•  Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion

•  Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung (‘extra column effects’)

UV/VIS-Detektor

•  Festwellenlängengeräte

(z.B. Hg-Dampflampe mit λ = 254 nm)

•  Geräte mit variabler Wellenlängeneinstellung

•  Diodenarraydetektoren (DAD)

UV/VIS-Detektor

mit variabler Wellenlängeneinstellung

Lichtquellen: Deuteriumlampe (λ = 190-370 nm) und/oder Wolfram-Halogenlampe (λ = 370-800 nm)

Wellenlänge durchstimmbar mittels eines Monochromators (z.B. Prisma + Spalt)

UV/VIS-Detektor

Diodenarraydetektor (DAD)

Polychromatische Anregung (Deuteriumlampe und/oder Wolfram-Halogenlampe)

UV/VIS-Detektor

Der UV/VIS-Detektor erfasst nur Analyten, die ausreichend UV-Strahlung bzw.

sichtbares Licht (VIS) absorbieren.

Bei kleinen Wellenlängen um 200 nm absorbieren viele Substanzen, meist aber auch der Eluent. Das Absorbptionsmaximum des Analyten soll längerwelliger als die Eluentabsorption sein.

UV/VIS-aktiv:

•  (polyzyklische) Aromaten, konjugierte Doppelbindungssysteme

•  Doppel- und Mehrfachbindungen

•  Carbonylgruppen C=O

•  –Br, –I

R R R

... ...

Brechungsindexdetektor

(refractive index detector = RID)

Signal: Brechungsindex-Änderung im Vergleich zum Eluenten

Prinzip: Durchflussrefraktometer Messung der Änderung von Brechungswinkeln

Universeller Detektor, da praktisch jeder Analyt den Brechungsindex ändert.

Empfindlichkeit bei vielen Analyten um 2–3 Grössenordnungen schlechter als bei UV/VIS-Detektion. Nicht kompatibel mit Gradientenelution.

Oft bei UV/VIS-inaktiven Stoffen eingesetzt: Kohlenhydrate, gesättigte Alkane

Verdampfungs-Lichtstreudetektor

(evaporative light scattering detector = ELSD)

Signal: Intensität des an festen

Analytpartikeln gestreuten Lichts

Prinzip: Eluent + Analyt werden fein

vernebelt. Lösungsmittel verdampft Das an den festen Analytpartikeln gestreute Laserlicht wird von

einem Photodetektor erfasst

Universeller Detektor

Siedepunkt Eluent < Siedepunkt Analyten Kompatibel mit Gradientenelution

Inkompatibel mit salzhaltigen Eluenten

Fluoreszenz-Detektor

I

! I

" # " $ % (

) ^{" c " d}

I

.... Fluoreszenzintensität Φ ... Quantenausbeute ε .... Extinktionskoeffizient c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

Im Gegensatz zu UV/VIS:

Signal(Photodiode) = 0 bei c = 0

λ

≥ λ

(Rotverschiebung)

Fluoreszenz-Detektor

Signal: Fluoreszenzintensität

Prinzip: Anregung mit einer definierten Wellenlänge (Lichtfilter 1)

Detektion meist im 90°-Winkel der rot verschobenen (Lichtfilter 2) Fluoreszenzstrahlung

Sehr empfindlich

(Faktor 100–1000 besser als UV/VIS)

Nicht universell

Nur fluoreszierende Analyten (z.B. polyzyklische Aromaten), alternativ: Derivatisierung

Kompatibel mit Gradientenelution

MS Detektoren: HPLC-ESI-MS

(ESI = electrospray ionization)

Pseudo- molekülion [M+H]⁺

[M+nH]ⁿ⁺

•  Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt

•  Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions- zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)

•  Massenselektive Detektion möglich

(sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)

•  Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich

MS Detektoren: HPLC-APCI-MS

(APCI = atmospheric pressure chemical ionization)

Pseudo- molekülion [M+H]⁺

[M+nH]ⁿ⁺

•  Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt

•  Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions- zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)

•  Massenselektive Detektion möglich

(sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)

•  Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich

•  APCI: auch für Moleküle ohne polare funktionelle Gruppen geeignet

Vergleich: HPLC-Detektoren

Detektor Empfindlichkeit Linearbereich Analyten

UV/VIS + +++ UV- und VIS-Absorber

RID – – + universeller Detektor

ELSD o ++ universeller Detektor

Fluoreszenz +++ +++ Fluorophore

Elektrochemisch ++ / +++ ++ reduzier- und oxidierbare Analyten

MS + / +++ + / ++ universeller Detektor

+ massenselektive Detektion + Massenspektren zur

Derivatisierung

Derivatisierung:  Wenn Analyten nicht oder mit ungenügender Empfindlichkeit mit einem bestimmten Detektor erfasst werden können.

 Umsetzung z.B. mit Fluorophoren oder starken UV-Absorbern

H3C N CH3

S

O O

Cl

H₂N R

+ - HCl

H3C N CH3

S

O O

HN R

Fluoreszenz

z.B. primäre Amine

5-(N,N- Dimethylamino)-

naphthalin- 1-sulfonylchlorid

= Dansylchlorid

Blau-blaugrün fluoreszierende

Sulfonamide

NO₂ NO₂

NH NH₂

R₁ R₂ O +

- H₂O

NO₂ NO₂

NH N

R₂ R₁

UV/VIS

z.B. Aldehyde und Ketone

2,4-Dinitrophenyl- hydrazin

= DNPH

DNP-Hydrazone λ_max ≈ 360 nm

Beispiele:

HPLC-Trennungen

(Normal- und Umkehrphase)

Anwendungsbeispiele HPLC

HPLC-Analyse von Olivenölproben. UV-Detektion bei zwei Wellenlängen.

Das UV-Detektorsignal bei 280 nm zeigt konjugierte Doppelbindungen an.

Anwendungsbeispiele HPLC

Untersuchung einer Bierprobe Kombination von 2 Detektoren

(1) Brechungsindexdetektor (RI):

universell: erfasst alle Analyten

(2) UV/VIS-Detektor (280 nm):

für einige Analyten empfindlicher als RI

Peak 9: 5-Hydroxymethylfurfural

Anwendungsbeispiele HPLC

t

Trennung von polyzyklischen aromatischen

Kohlenwasserstoffen (PAHs)

Säule: C18 (RP)

Eluenten: (A) Wasser (B) Acetonitril Gradient:

0–10 min 48% A, 52% B 16 min 20% A, 80% B 21 min 0% A, 100% B 28 min 0% A, 100% B 30 min 48% A, 52% B 30 min stop

Flussrate: 1 mL/min

Detektor UV λ = 260 nm (Minuten)

Anwendungsbeispiele HPLC

Säule: C18 (RP) Eluenten: Wasser –

Acetonitril 55%:45%

Flussrate: 1 mL/min

Detektor UV λ = 225 nm

1. Benfuresate 2. Dymron

3. Iprodione 4. Pyrazoxyfen 5. Tebufenozide

6. Iprodione Metabolite

O

CH₃ H₃C

O S O

O H₃C

NH O N Cl

Anwendungsbeispiele HPLC

HPLC-Trennung von

Serotonin-Wiederaufnahmehemmern (Antidepressiva)

Stationäre Phase: Cyanopropyl-Kieselgel Mobile Phase: Wasser (Phosphatpuffer,

pH 7) – Acetonitril 40%:60%

Flussrate: 1 mL/min

Detektor: UV, λ = 230 nm

Uracil

Verunreinigung

Fluvoxamin

Sertralin

Fluoxetin

NH NH O

O

CF₃

N O

H₂N O

HN H₃C

H

H Cl

Cl

CF₃ H O

N

Schlechte Retention der teilweise protonierten Amine auf RP-18-Phase, gute Trennung auf Cyanopropyl-Phase

Anwendungsbeispiele HPLC

HPLC-MS-Trennung von Triglyceriden A) Gesamtionenstrom

(total ion current = TIC)

B) Single ion monitoring = SIM Masse 1

Masse 2

Masse 3

Masse 4

Anwendungsbeispiele HPLC

m/z = 342.2 m/z = 400.1 m/z = 404.0 m/z = 384.1 m/z = 331.0 m/z = 332.1 m/z = 706.4 m/z = 657.4

HPLC-ESI-MS-Trennung von Mykotoxinen (Giftstoffe aus Schimmelpilzen)

Säule: C18 (RP)

Eluent: Wasser (+ NH₄OAc) + Acetonitril

Aflatoxin B₁

Ionenchromatographie (IC)

Ionenaustauschchromatographie

(ion exchange chromatography = IEC)

Ionenchromatographie (IC)

UV: 190 bis 400 nm VIS: 400 (violett) bis

800 nm (rot)

+ +

+ + +

+ +

+

+ + +

+

+ + + + +

+ - -

- - -

- -

-

- - - - - -

- - Typische Anwendung: Trennung kleiner anorganischer Ionen

Stationäre Phase: Ionenaustauscher

(organisches Polymer mit geladenen Ankergruppen)

Kationentrennung: Kationenaustauscher Anionentrennung: Anionenaustauscher

Mobile Phase: Wässrige Salzlösung oder verd. Säure Detektor: meistens Leitfähigkeitsdetektor

(aber auch alle anderen LC-Detektoren im Prinzip möglich)

Ionenchromatographie (IC)

UV: 190 bis 400 nm VIS: 400 (violett) bis

800 nm (rot)

Funktionelle Gruppen Eigenschaften

Kationenaustauscher –COOH, –OPO₃H₂ schwach sauer

–SO₃H stark sauer

Anionenaustauscher Primäre Amine –NH₂ bzw. –NH₃⁺ OH^– schwach basisch Quarternäre Ammoniumsalze –NR₃⁺ OH^– stark basisch

Ionenchromatographie (IC)

Harz–SO

Eluent

+ Analyt

H a r z – S O

Analyt

+ Eluent

Harz–NR

Eluent

+ Analyt

H a r z – N R

Analyt

+ Eluent

Mobile Phase:

Kationentrennung: verdünnte Säuren (Eluent ⁺ = H⁺)

Anionentrennung: z.B. NaHCO₃-Lösung (Eluent ^– = HCO₃^–)

Prinzip:

Kationentrennung:

Anionentrennung:

Ionenchromatographie (IC)

Trennung gemäss: Bindungsstärke der Ionen an den Ionenaustauscher (Ladung, Grösse, Hydrathülle, Polarisierbarkeit)

Typische Elutionsreihenfolge (nach aufsteigender Retentionszeit geordnet):

Kationentrennung

Li⁺ < H⁺ < Na⁺ < NH₄⁺ < K⁺ < Rb⁺ < Cs⁺ < Mg²⁺ < Zn²⁺ < Ca²⁺ <Ba²⁺

Anionentrennung

Fluorid F^- < Hydroxid OH^- < Acetat CH₃COO^- < Chlorid Cl^- < Nitrit NO₂^- < Bromid Br^-

< Nitrat NO ^- < Iodid I^- < Oxalat (COO) ^2- < Sulfat SO ^2- < Citrat C H O ^3-

Ionenchromatographie (IC)

Beispiele

Anionen

Kationen

Ionenchromatographie (IC)

Detektion:

Meistens Leitfähigkeitsdetektor

universell, da alle Ionen die Leitfähigkeit beeinflussen/ändern

(im Prinzip kann man aber auch alle anderen LC-Detektoren einsetzen) Problem: hohe Grundleitfähigkeit des Eluenten

 Einsatz von Suppressorsäulen vor dem Detektor

Trennsäule Suppressorsäule

Kationenanalyse Kationenaustauscher Anionenaustauscher Anionenanalyse Anionenaustauscher Kationenaustauscher

Ionenchromatographie (IC)

Prinzip der Suppressorsäulen

Anionentrennung (Beispiel: NaHCO₃-Eluent, Analyten: NaCl und NaBr, Trennung von Cl^– und Br^–)

Kationentrennung (Beispiel: HCl-Eluent, Analyten: NaBr und KBr, Trennung von Na⁺ und K⁺)

Erniedrigung der Grundleitfähigkeit und Erhöhung der Leitfähigkeit bei Anwesenheit von Analyten

Harz–SO3H + Na⁺ + HCO3- Harz–SO3Na + H2CO3

H a r z – S O3H + Na⁺ + Cl^- Harz–SO3Na + H⁺ + Cl^- H a r z – S O3H + Na⁺ + Br^- Harz–SO3Na + H⁺ + Br^-

Harz–NR3OH + H⁺ + Cl^- Harz–NR3Cl + H2O

H a r z – N R3OH + Na⁺ + Br^- Harz–NR3Br + Na⁺ + OH^- H a r z – N R3OH + K⁺ + Br^- Harz–NR3Br + K⁺ + OH^- Eluent:

Analyt 1:

Analyt 2:

Eluent:

Analyt 1:

Analyt 2:

Dünnschichtchromatographie (DC)

(thin layer chromatography = TLC)

Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

Stationäre Phasen:

Meist Normalphasen (z.B. Kieselgel) oder Umkehrphasen (z.B. C₁₈) immobilisiert auf Trägermaterialien (z.B. Aluminiumfolie, Kunststofffolie oder Glasplatte)

Mobile Phasen (Laufmittel):

Lösungsmittel wie in der NP-HPLC und RP-HPLC

Räumliche Trennung der Analyten auf der DC-Platte

Vorteile: einfach, kostengünstig, schnell (mehrere Proben gleichzeitig)

Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

http://www.youtube.com/watch?v=rbp_Qc4jMAc Durchführung

Auftragen der Proben

(meist mit dünnen Kapillaren)

Entwicklung

Herbstsemester 2011 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | schmid@org.chem.ethz.ch

Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

60

R

= s

s

Detektion:

•  Visuell

nur bei VIS-Absorbern (Farbstoffe)

•  Fluoreszenzdetektion

Anregung mittels UV-Lampe (254 oder 366 nm)

Fluoreszierende Analyten  Autofluoreszenz UV-Absorber  Schwächung der Fluoreszenz

eines Indikators in der Platte

•  Chemische Anfärbemethoden

z.B. H₂SO₄ + Erhitzen  Schwarze, verkohlte Analytflecken

z.B. KMnO₄ + Erhitzen  Flecken bei

oxidierbaren Analyten

Auswertung:

Verzögerungsfaktor oder R_F-Wert:

Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

Beispiel:

Test verdächtiger Pflanzenproben auf Tetrahydrocannabinol (THC) Standard

Grössenausschlusschromatographie

(size exclusion chromatography = SEC)

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

UV: 190 bis 400 nm VIS: 400 (violett) bis

800 nm (rot)

Trennung von Molekülen nach ihrer Grösse

Stationäre Phase: poröse Materialien mit definierter Porengrösse (z.B. poröse Polymer– oder Kieselgelpartikel)

Mobile Phase: Lösungsmittel ähnlicher Polarität wie stationäre Phase (Nur Trennung nach Grösse, kein Einfluss der Polarität)

Unterteilung:

Gelpermeationschromatographie (GPC): für unpolare, hydrophobe Analyten

(apolare stationäre Phase und apolares Lösungsmittel)

Gelfiltration: für polare, wasserlösliche Analyten (polare stationäre Phase, polares

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

Kleine Moleküle können in Poren eindringen und werden retendiert.

Elutionsreihenfolge: grosse vor kleinen Molekülen

Zu grosse Moleküle: Ausschlussgrenze

Keine Wechselwirkung mit den Poren Keine Retention

Zu kleine Moleküle: Permeationsgrenze

Alle Moleküle können vollständig in die Poren eindringen Keine Retentionsunterschiede

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

Molekülgrösse (logarithmische Achse)

Retentionsvolumen V_R

V’: Volumenstrom (mL/min)

V₀: freies Lösungsmittelvolumen V_i: Porenvolumen

K_C: Verteilungskonstante

Alle Analyten verlassen

zwischen V und V + V die

Ausschlussgrenze Permeationsgrenze

V_R = t_R ! " V

V

= V

+ K

! V

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

Beispiele:

t

! 1

log Molekulargewicht ( )

Trennung einer homologen Reihe von Fettsäuren CH₃(CH₂)_nCOOH

Trennung des Proteins Ovalbumin

in seine

mono-, di- und tetramere Form

Zusammenfassung LC

LC: Analyten

GC: Analyten müssen unzerstört verdampfbar sein.

LC: Auch geeignet für grosse und thermolabile Moleküle

•  kleine ungeladene (polare und unpolare) Moleküle

•  anorganische und organische Ionen

•  Polymere

•  Grosse (Bio-)Moleküle

Einschränkung: Analyt muss ausreichend in mobiler Phase löslich sein.

LC: Techniken

Trennmethode Trennung nach...

Normalphasen-HPLC Polarität

Umkehrphasen-HPLC Polarität

Grössenausschlusschromatographie Molekülgrösse

Ionenchromatographie Ladung und Grösse von Ionen

Affinitätschromatographie spezifische biochemische Bindungsaffinität

(z.B. Antikörper–Antigen)

Chirale Chromatographie Chiralität (R- und S-Form)

LC: Detektoren

Detektor Empfindlichkeit Linearbereich Analyten

UV/VIS + +++ UV- und VIS-Absorber

RID – – + universeller Detektor

ELSD o ++ universeller Detektor

Fluoreszenz +++ +++ Fluorophore

Elektrochemisch ++ / +++ ++ reduzier- und oxidierbare Analyten

MS + / +++ + / ++ universeller Detektor

+ massenselektive Detektion + Massenspektren zur

Strukturaufklärung

Ausführlichere Tabelle in: Cammann, Instrumentelle Analytische Chemie

LC: Detektoren

Zusätzlich: Leitfähigkeitsdetektor (mit Suppressor) in der Ionenchromatographie

Weitere Kriterien:

•  Kompatibel mit der Gradientenelution?

•  Preis, einfache oder komplizierte Bedienung, Aufwand für Justage, Wartung etc.

Derivatisierung:

Ermöglicht den Einsatz von Detektoren, die für die vorliegenden Analyten an sich nicht geeignet oder zu unempfindlich sind.

LC: Trenneffizienz

A: Eddy-Diffusion B: Longitudinal-Diffusion C: Massentransport-Effekte

H = A + B

u + C u

HPLC:

Verbesserung der Effizienz durch Einsatz kleiner

Partikel (µm-Bereich).

Dadurch hohe Drücke erforderlich (300-400 bar)

 vanDeemter.xls

LC: Auflösung

R_S > 1.5

Grundlinien- getrennte

Peaks

R

= ! " 1

!

#

$ % &

' ( k

1 + k

#

$ % &

' ( N 4

#

$ % &

' (

! = f k,K (

)

k = f ( ) ,K

)

N = f L, ( H )

HPLC:

Verbesserung der Auflösung durch Verwendung kleiner Partikel (µm-Bereich)

 Verbesserung der Trenneffizienz (H) und Erniedrigung des Phasenverhältnisses β = V /V

 Gauss.xls

LC: Optimierung der Trennung

Ziel der Optimierung ist, eine effektive Peakauflösung (R_S > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit zu erreichen.

Mobile Phase: anderes Lösungsmittel(-gemisch), Gradientenelution Stationäre Phase: Wechsel der Säule (z.B. Änderung der Polarität)

Lineargeschwindigkeit, Temperatur, Säulenlänge (selten, da Analysenzeit L)

Gradiententrennung:

Änderung des Eluenten während der Trennung (z.B. Acetonitril- Wasser-Gemisch in verschiedenen Konzentrationen)

Oft Erhöhung der Elutionskraft im Lauf der Trennung

 Kürzere Analysenzeiten, schmalere Peaks bei hoher Retention

t

Isokratische Trennung:

Lösungsmittelzusammensetzung konstant während der Trennung

!