Flüssigchromatographie (liquid chromatography = LC)

Flüssigchromatographie

(liquid chromatography = LC)

flüssige mobile Phase feste stationäre Phase

Skript ab S57ff

Flüssigchromatographie (LC)

Die heute am häufigsten eingesetzte instrumentelle LC-Technik ist die

HPLC

high performance liquid chromatography

ursprünglich: high pressure liquid chromatography

•  Hochdruckpumpen zum Fördern der mobilen Phase (300–400 bar)

LC: Einsatzbereich

Mittels Gaschromatographie (GC) lassen sich nur Analyten untersuchen, welche sich unzerstört verdampfen lassen

(also v.a. kleine, unpolare, flüchtige Moleküle)

Die Flüssigchromatographie (LC) hat ein viel breiteres Anwendungsfeld, da man mit ihr auch thermolabile und grosse Moleküle trennen kann:

z.B.

kleine ungeladene Moleküle

anorganische und organische Ionen Organometallkomplexe

Polymere

grosse (Bio-)Moleküle (z.B. Proteine)

Die Analyten müssen nur ausreichend in der mobilen Phase löslich sein.

Es existieren verschiedene Trennprinzipien, welche Moleküle nach verschiedenen

LC: Trennprinzipien

Trennmethode Trennprinzip

Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC Verteilung (und Adsorption) Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss

Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung

Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent) Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch

Bildung und Trennung von

Diastereomeren

LC: Trennprinzipien

Trennmethode Trennung nach...

Normalphasen-HPLC Polarität

Umkehrphasen-HPLC Polarität

Grössenausschlusschromatographie Molekülgrösse

Ionenchromatographie Ladung und Grösse von Ionen

Polarität…….. Ladungsverschiebung à getrennte Ladungsschwerpunkte à Dipolmoment

Normalphasen- und Umkehrphasen-LC

Normalphasen- und Umkehrphasen-LC

Normalphasen- (NP) und Umkehrphasen(RP)-HPLC machen den Grossteil aller flüssigchromatographischen Trennungen aus. Die RP-HPLC deckt etwa 70%

aller Anwendungen ab.

Methode stationäre Phase mobile Phase Elutionsreihenfolge

NP-HPLC polar apolar apolare vor polaren Analyten

RP-HPLC apolar polar polare vor apolaren Analyten

Normalphasenchromatographie

Stationäre Phase: polar (z.B. Kieselgel, Al₂O₃) Mobile Phase: apolar (z.B. Hexan, Pentan)

Polare Moleküle adsorbieren stark an die polare stationäre Phase und werden retendiert. Apolare Moleküle halten sich vor allem in der apolaren mobilen Phase auf und werden schnell eluiert.

Geeignet für Moleküle, die in apolaren Lösungsmitteln löslich sind.

Umkehrphasenchromatographie

ODS =

Octadecylsilan (C₁₈ bzw. RP18)

Hydrophobisierung der Kieselgeloberfläche durch Reaktion mit Alkylchlorsilanen

Umkehrphasenchromatographie

Typische Umkehrphasen

Umkehrphasenchromatographie

Stationäre Phase: apolar (z.B. RP18-Kieselgel) Mobile Phase: polar (z.B. Wasser, Methanol,

Acetonitril)

Die Verteilung der Moleküle zwischen chemisch gebundener stationärer und mobiler Phase liegt für apolare Moleküle auf der Seite der stationären Phase, weshalb apolare Moleküle stärker retendiert werden als polare.

Geeignet für Moleküle, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind (inkl. Wasser und wässrige Pufferlösungen).

Elutionsreihenfolge und elutrope Reihe

Elutionsreihenfolge

Normalphasenchromatographie: apolare Moleküle eluieren vor polaren Molekülen

n

... ...

R

O

O O

NH₂

H

O O

OH

OH O

NH₂ O

< < <

< < < ~ <

< <

gesättigte Kohlenwasserstoffe

ungesättigte Kohlenwasserstoffe

aromatische Kohlenwasserstoffe

Ether Ester Amine Aldehyde und Ketone

Alkohole Carbonsäuren Amide

NP-Elutionsreihen- folge nach

aufsteigender Retentionszeit geordnet.

Elutionskraft

Die Elutionskraft bezeichnet die Fähigkeit eines Lösungsmittels, Analytenmoleküle von der stationären in die mobile Phase zu überführen.

Erhöhung der Elutionskraft führt zu kleineren Retentionszeiten.

Erhöhung der Elutionskraft führt zu kleineren Verteilungskonstanten.

Die Elutionskraft eines Lösungsmittels ist dann hoch, wenn seine Polarität ähnlich der der stationären Phase ist.

Analytenmoleküle mit ähnlicher Polarität wie die stationäre Phase adsorbieren stark und brauchen eine mobile Phase mit hoher Elutionskraft, um eluiert zu werden.

Die elutrope Reihe ordnet Lösungsmittel nach aufsteigender Elutionskraft in der Normalphasenchromatographie.

Herbstsemester 2015 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Badertscher | martin.badertscher@org.chem.ethz.ch

Elutrope Reihe

15

Die elutrope Reihe ordnet Lösungsmittel nach aufsteigender Elutionskraft in der Normalphasenchromatographie.

<

Cl Cl

Cl Cl

Cl

O Cl Cl

Cl

Cl Cl HO

N

H₃C CN

OH

O O

S H₃C H₃C

O

O

OH H₃C OH

H N

O

H O

H

H O

H +

n-Heptan n-Hexan n-Pentan

Cyclohexan Isooctan Tetrachlorkohlenstoff Toluen

Benzen Chlorbenzen Diethylether Chloroform

Dichlormethan 1-Butanol Pyridin Acetonitril

2-Propanol Ethylacetat Dimethylsulfoxid Aceton

< <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

...

Fortsetzung è

Elutrope Reihe

<

Cl Cl

Cl Cl

Cl

O Cl Cl

Cl

Cl Cl HO

N

H₃C CN

OH

O O

S H₃C H₃C

O

O

OH H₃C OH

H N

O

H O

H

H O

H + Ionen

n-Heptan n-Hexan n-Pentan

Cyclohexan Isooctan Tetrachlorkohlenstoff Toluen

Benzen Chlorbenzen Diethylether Chloroform

Dichlormethan 1-Butanol Pyridin Acetonitril

2-Propanol Ethylacetat Dimethylsulfoxid Aceton

Ethanol Methanol Dimethylformamid Wasser wässrige Puffer- lösungen

< <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

...

Gradientenelution: Fliessmittelgradienten

Eluent 1

geringe Elutionskraft

Eluent 2

hohe Elutionskraft

Gradient: Eluent 1 è Eluent 2 geringe è hohe Elutionskraft

Aufbau einer HPLC-Anlage

Aufbau einer HPLC-Anlage

Oft modularer Aufbau mit Modulen zum/

zur...

•  Entgasen der Lösungsmittel

•  Mischen von Lösungsmittelgradienten

•  Pumpen der mobilen Phase

•  Probeninjektion

•  Trennung der Substanzen (Säule)

•  Detektion der getrennten Substanzen

Aufbau einer HPLC-Anlage

Eluentenvorrat

Entgaser Gradientenmischer Pumpe

Injektionsventil mit Probenschleife

HPLC-Injektionsventil

Aufbau einer HPLC-Anlage

Eluentenvorrat

Entgaser Gradientenmischer Pumpe

Injektionsventil mit Probenschleife

Vorsäule

Trennsäule

Detektor

Abfallgefäss Computer

Fortsetzung: LC - Trennprinzipien

Trennmethode Trennprinzip

Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC Verteilung (und Adsorption) (Dünnschichtchromatographie)

Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss

Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent) Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch

Bildung und Trennung von Diastereomeren

Skript S79ff

Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

Stationäre Phasen:

Meist Normalphasen (z.B. Kieselgel) oder Umkehrphasen (z.B. C₁₈) immobilisiert auf Trägermaterialien (z.B. Aluminiumfolie, Kunststofffolie oder Glasplatte)

Mobile Phasen (Laufmittel):

Lösungsmittel wie in der NP-HPLC und RP-HPLC

Räumliche Trennung der Analyten auf der DC-Platte Analyten eluieren hier nicht von der stationären Phase

Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

Durchführung

Auftragen der Proben

(meist mit dünnen Kapillaren)

Entwicklung

Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

R

= s

s

Detektion:

•  Visuell

nur bei VIS-Absorbern (Farbstoffe)

•  Fluoreszenzdetektion

Anregung mittels UV-Lampe (254 oder 366 nm)

Fluoreszierende Analyten è Autofluoreszenz UV-Absorber è Schwächung der Fluoreszenz

eines Indikators in der Platte

•  Chemische Anfärbemethoden

z.B. H₂SO₄ + Erhitzen è Schwarze, verkohlte Analytflecken

z.B. KMnO₄ + Erhitzen è Flecken bei

oxidierbaren Analyten

Auswertung:

Verzögerungsfaktor oder R_F-Wert:

vgl. Retentionszeit LC bzw. GC !

Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

Beispiel:

Test verdächtiger Pflanzenproben auf Tetrahydrocannabinol (THC)

Standard

LC: Trennprinzipien

Trennmethode Trennprinzip

Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC Verteilung (und Adsorption) (Dünnschichtchromatographie)

Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung

Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss

Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent) Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch

Bildung und Trennung von

Diastereomeren

Ionenchromatographie (IC)

Ionenaustauschchromatographie

(ion exchange chromatography = IEC)

Ionenchromatographie (IC)

UV: 190 bis 400 nm VIS: 400 (violett) bis

800 nm (rot)

+ +

+ + +

+ +

+

+ + +

+

+ + + + +

+ - -

- - -

- -

-

- - - - - -

- - Typische Anwendung: Trennung kleiner anorganischer Ionen

Stationäre Phase: Ionenaustauscher

(organisches Polymer mit geladenen Ankergruppen)

Kationentrennung: Kationenaustauscher Anionentrennung: Anionenaustauscher

Mobile Phase: Wässrige Salzlösung oder verd. Säure Detektor: oft Leitfähigkeitsdetektor

(aber auch alle anderen LC-Detektoren im Prinzip möglich)

Ionenchromatographie (IC)

UV: 190 bis 400 nm VIS: 400 (violett) bis

800 nm (rot)

Funktionelle Gruppen Eigenschaften

Kationenaustauscher

(negativ geladen) –COOH, –OPO₃H₂ schwach sauer

–SO₃H stark sauer

Anionenaustauscher

(positiv geladen) Primäre Amine –NH₂ bzw. –NH₃⁺ OH^– schwach basisch Quarternäre Ammoniumsalze –NR₃⁺ OH^– stark basisch

Ionenchromatographie (IC)

Harz–SO

Eluent

+ Analyt

H a r z – S O

Analyt

+ Eluent

Harz–NR3+ Eluent^- + Analyt^- H a r z – N R3+ Analyt^- + Eluent^- Mobile Phase:

Kationentrennung: verdünnte Säuren (Eluent⁺ = H⁺)

Anionentrennung: z.B. NaHCO₃-Lösung (Eluent ^– = HCO₃^–)

Prinzip: Gleichgewicht zwischen Analyt und Eluent. Menge und Stärke von Eluent entscheidet dann über Zeitpunkt der Elution!

Kationentrennung:

Anionentrennung:

Ionenchromatographie (IC)

Trennung gemäss: Bindungsstärke der Ionen an den Ionenaustauscher (Ladung, Grösse, Hydrathülle, Polarisierbarkeit)

Nicht immer leicht vorhersagbar, aber allgemein gilt:

Stärker geladene und kleine Ionen binden stärker.

Typische Elutionsreihenfolge (nach aufsteigender Retentionszeit geordnet):

Kationentrennung

Li⁺ < H⁺ < Na⁺ < NH₄⁺ < K⁺ < Rb⁺ < Cs⁺ < Mg²⁺ < Zn²⁺ < Ca²⁺ <Ba²⁺

Anionentrennung

Fluorid F^- < Hydroxid OH^- < Acetat CH₃COO^- < Chlorid Cl^- < Nitrit NO₂^- < Bromid Br^-

Ionenchromatographie (IC)

Beispiele

Anionen

Kationen

Ionenchromatographie (IC)

Detektion:

oft Leitfähigkeitsdetektor

universell, da alle Ionen die Leitfähigkeit beeinflussen/ändern

(im Prinzip kann man aber auch alle anderen LC-Detektoren einsetzen) Problem: hohe Grundleitfähigkeit des Eluenten

è Einsatz von Suppressorsäulen

= entfernen von „Störionen“ vor dem Detektor

Trennsäule Suppressorsäule

Kationenanalyse Kationenaustauscher Anionenaustauscher Anionenanalyse Anionenaustauscher Kationenaustauscher

Ionenchromatographie (IC)

Prinzip der Suppressorsäulen

Anionentrennung (Beispiel: NaHCO₃-Eluent, Analyten: NaCl und NaBr, Trennung von Cl^– und Br^–)

Kationentrennung (Beispiel: HCl-Eluent, Analyten: NaBr und KBr, Trennung von Na⁺ und K⁺) Harz–SO3H + Na⁺ + HCO3- Harz–SO3Na + H2CO3

H a r z – S O3H + Na⁺ + Cl^- Harz–SO3Na + H⁺ + Cl^- H a r z – S O3H + Na⁺ + Br^- Harz–SO3Na + H⁺ + Br^-

Harz–NR3OH + H⁺ + Cl^- Harz–NR3Cl + H2O

H a r z – N R3OH + Na⁺ + Br^- Harz–NR3Br + Na⁺ + OH^- H a r z – N R3OH + K⁺ + Br^- Harz–NR3Br + K⁺ + OH^- Eluent:

Analyt 1:

Analyt 2:

Eluent:

Analyt 1:

Analyt 2:

LC: Trennprinzipien

Trennmethode Trennprinzip

Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC Verteilung (und Adsorption) (Dünnschichtchromatographie)

Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss

Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent) Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch

Bildung und Trennung von

Diastereomeren

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

UV: 190 bis 400 nm VIS: 400 (violett) bis

800 nm (rot)

Trennung von Molekülen nach ihrer Grösse

Stationäre Phase: poröse Materialien mit definierter Porengrösse (z.B. poröse Polymer– oder Kieselgelpartikel)

Mobile Phase: Lösungsmittel ähnlicher Polarität wie stationäre Phase (Nur Trennung nach Grösse, kein Einfluss der Polarität)

Unterteilung von SEC (size exclusion chromatography):

Gelpermeationschromatographie (GPC): für unpolare, hydrophobe Analyten

(apolare stationäre Phase und apolares Lösungsmittel)

Gelfiltration: für polare, wasserlösliche Analyten (polare stationäre Phase, polares

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

Kleine Moleküle können in Poren eindringen und werden zurückgehalten.

Elutionsreihenfolge: grosse vor kleinen Molekülen

Zu grosse Moleküle: Ausschlussgrenze

Keine Diffusion in die Poren Keine Retention

Zu kleine Moleküle: Permeationsgrenze

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

Molekülgrösse (logarithmische Achse)

Retentionsvolumen V_R

V’: Volumenstrom (ml/min)

V₀: freies Lösungsmittelvolumen V_i: Porenvolumen

K_C: Verteilungskonstante

Alle Analyten verlassen zwischen V und V + V die Säule.

Ausschlussgrenze Permeationsgrenze

V_R = t_R ⋅ ′ V

V

= V

+ K

⋅ V

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

Beispiele:

t_R ∝ 1

log Molekulargewicht

( )

Trennung einer homologen Reihe von Fettsäuren CH₃(CH₂)_nCOOH

Trennung des Proteins Ovalbumin

in seine

mono-, di- und tetramere Form

Wann, welche Technik ?

à  Worin lösen sich die Analyten?

à Polar/apolar/ionisch?

à Molekulargewicht?

DETEKTOREN

Flüssigchromatographie (LC) Detektoren

Trennsäule

Detektor

1. UV/VIS-Detektor (ultraviolet/visible)

Signal: Extinktion von Eluent + Analyt

Grundlinie: Extinktion des Eluenten (oft automatisch abgezogen)

UV: 190 bis 400 nm

VIS: 400 (violett) bis 800 nm (rot)

UV/VIS-Detektor

d

I

Probe

I

Lichtintensität

Abstand

Li ch tin te nsi tä t

A = lg I

I = ε λ ( ) ^{c d}

I = I

10

I = I

e

Lambert-Beersches Gesetz E

E .... Extinktion

ε .... Extinktionskoeffizient c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

•  Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion

UV/VIS-Detektor

d

I

Probe

I

Lichtintensität

Abstand

Li ch tin te nsi tä t

•  Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion

Varianten des UV/VIS-Detektor

•  Festwellenlängengeräte

(z.B. Hg-Dampflampe mit λ = 254 nm)

•  Geräte mit variabler Wellenlängeneinstellung

•  Dioden array detektoren (DAD)

UV/VIS-Detektor

mit variabler Wellenlängeneinstellung

Lichtquellen: Deuteriumlampe (λ = 190-370 nm) und/oder Wolfram-Halogenlampe (λ = 370-800 nm)

UV/VIS-Detektor

Diodenarraydetektor (DAD)

Polychromatische Anregung (Deuteriumlampe und/oder Wolfram-Halogenlampe)

UV/VIS-Detektor

Der UV/VIS-Detektor erfasst nur Analyten, die ausreichend UV-Strahlung bzw.

sichtbares Licht (VIS) absorbieren.

Bei kleinen Wellenlängen um 200 nm absorbieren viele Substanzen, meist aber auch der Eluent. Das Absorbptionsmaximum des Analyten soll längerwellig als die Eluentabsorption sein.

UV/VIS-aktiv:

•  (polyzyklische) Aromaten, konjugierte Doppelbindungssysteme

•  Doppel- und Mehrfachbindungen

•  Carbonylgruppen C=O

•  –Br, –I

R R R

... ...

2. Brechungsindexdetektor

(refractive index detector = RID)

Signal: Brechungsindex-Änderung im Vergleich zum Eluenten Prinzip: Durchflussrefraktometer

Messung der Änderung von Brechungswinkeln

- Vielseitig, da praktisch jeder Analyt den Brechungsindex ändert, aber unspezifisch

- Empfindlichkeit bei vielen Analyten um 2–3 Grössenordnungen schlechter als bei UV/VIS- Detektion. Nicht kompatibel mit Gradientenelution.

Verdampfungs-Lichtstreudetektor

(evaporative light scattering detector = ELSD)

Signal: Intensität des an festen

Analytpartikeln gestreuten Lichts

Prinzip: Eluent + Analyt werden fein vernebelt.

Lösungsmittel verdampft

Das an den festen Analytpartikeln gestreute Laserlicht wird von einem Photodetektor erfasst

Universeller Detektor

Siedepunkt Eluent < Siedepunkt Analyten Kompatibel mit Gradientenelution

Inkompatibel mit salzhaltigen Eluenten

Fluoreszenz-Detektor

I

∝ I

⋅ Φ ⋅ ε λ (

) ^{⋅ c ⋅ d}

I

.... Fluoreszenzintensität Φ ... Quantenausbeute ε .... Extinktionskoeffizient c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

Im Gegensatz zu UV/VIS:

Signal(Photodiode) = 0 bei c = 0

λ

≥ λ

(Rotverschiebung)

Fluoreszenz-Detektor

Signal: Fluoreszenzintensität

Prinzip: Anregung mit einer definierten Wellenlänge (Lichtfilter 1)

Detektion meist im 90°- Winkel der rot verschobenen

(Lichtfilter 2)

Fluoreszenzstrahlung

Sehr empfindlich

(Faktor 100–1000 besser als UV/VIS)

Nicht universell – abhängig von der chemischen Natur der Analyten

3.Massendetektoren

Um Analyten mit Massenspektrometern zu detektieren, muss man die Analytenmoleküle vorher ionisieren! = IONENQUELLE

ESI = Electrospray ionization EI = Electron impact ionization CI = Chemical Ionisation

ESI produziert

„Pseudo- Molekülionen“

[M+H]⁺

•  Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt

•  Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions- zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)

•  Massenselektive Detektion

(sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)

•  Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich

LC-ESI-MS

(ESI = electrospray ionization)

Ausgang der Trennsäule

LC-APCI-MS

(APCI = atmospheric pressure chemical ionization)

•  Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt

•  Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions- zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)

•  Massenselektive Detektion

(sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)

•  Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich Ausgang der

Trennsäule

Vergleich: LC-Detektoren

UV/VIS + +++ UV- und VIS-Absorber

RID – – + universeller Detektor

ELSD o ++ universeller Detektor

Fluoreszenz +++ +++ Fluorophore

Elektrochemisch ++ / +++ ++ reduzier- und oxidierbare Analyten

MS + / +++ + / ++ universeller Detektor

+ massenselektive Detektion + Massenspektren zur

Derivatisierung

Derivatisierung: Ÿ Wenn Analyten nicht oder mit ungenügender Empfindlichkeit durch einen bestimmten Detektor erfasst werden können.

Ÿ Umsetzung z.B. mit Fluorophoren oder starken UV-Absorbern

N H₃C CH₃

S

O O

Cl

H₂N R

+ - HCl

H₃C N CH₃

S

O O

HN R

Fluoreszenz

z.B. primäre Amine

5-(N,N- Dimethylamino)-

naphthalin- 1-sulfonylchlorid

Blau-blaugrün fluoreszierende

Sulfonamide

NO₂ NO₂

NH NH₂

R₁ R₂ O +

- H2O

NO2

NO₂

NH N

R₂ R1

UV/VIS

z.B. Aldehyde und Ketone

2,4-Dinitrophenyl-

hydrazin DNP-Hydrazone

Beispiele:

HPLC-Trennungen

Anwendungsbeispiele HPLC

Trennung von Pestiziden Säule: C18 (RP)

Eluenten: Wasser – Acetonitril 55%:45%

Flussrate: 1 mL/min Detektor UV λ = 225 nm

1. Benfuresate 2. Dymron 3. Iprodione 4. Pyrazoxyfen 5. Tebufenozide

6. Iprodione Metabolite

O

CH₃ H₃C

O S O

O H₃C

NH O N Cl

Anwendungsbeispiele HPLC

t

Trennung von polyzyklischen aromatischen

Kohlenwasserstoffen (PAHs)

Säule: C18 (RP)

Eluenten: (A) Wasser (B) Acetonitril Gradient:

0–10 min 48% A, 52% B 16 min 20% A, 80% B 21 min 0% A, 100% B 28 min 0% A, 100% B 30 min 48% A, 52% B 30 min stop

Flussrate: 1 ml/min (Minuten)

Anwendungsbeispiele HPLC

HPLC-Trennung von

Serotonin-Wiederaufnahmehemmern (Antidepressiva)

Stationäre Phase: Cyanopropyl-Kieselgel Mobile Phase: Wasser (Phosphatpuffer,

pH 7) – Acetonitril 40%:60%

Flussrate: 1 ml/min

Detektor: UV, λ = 230 nm

Uracil

Verunreinigung

Fluvoxamin

Sertralin

Fluoxetin

NH NH O

O

CF₃

N O

H₂N O

HN H₃C

H

H Cl

Cl

CF₃ H O

N

Vergleich: LC-Detektoren

Detektor Empfindlichkeit Analyten

UV/VIS + UV- und VIS-Absorber

Fluoreszenz +++ Fluorophore

MS + / +++ universeller Detektor

massenselektive Detektion

MSn (Fragmentierung) zur Strukturaufklärung

Fluorescein

FITC fluorescin- Iso thiocyanate

Emission bei höherer Wellenlänge!

Derivatisierung: Markieren von Analyten mit UV- oder fluoreszenzaktiven Molekülen:

UV Detektor … Detektoren sind selektiv

HPLC-Analyse von Olivenölproben. UV-Detektion bei zwei Wellenlängen.

UV und RI Detektor

Untersuchung einer Bierprobe Kombination von 2 Detektoren

(1) Brechungsindexdetektor (RI):

universell: erfasst alle Analyten

(2) UV/VIS-Detektor (280 nm):

für einige Analyten empfindlicher als RI

Peak 9: 5-Hydroxymethylfurfural

Massendetektoren

Um Analyten mit Massenspektrometern analysieren zu können, muss man diese vorher ionisieren = IONENQUELLE

ESI = Electrospray ionization EI = Electron impakt ionization CI = Chemical Ionization

Massendetektoren „2 Spuren“

Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen

(CHO)

Säule: Porous Graphitized Carbon (PGC)

Eluenten: Wasser / Acetonitril

Flussrate: 5 uL/min

Detektor ESI-MS 1. ATP (506) 2. ADP (426) 3. AMP (346)

All (M-H)-

"Chromatogram"

TIC = total ion current

Massenspur

1

2 3

1 2

3

Massendetektoren „Analyten getrennt betrachtbar“

Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen

(CHO)

Säule: PGC Eluenten: Wasser / Acetonitril

Flussrate: 5 µl/min

Detektor ESI-MS 1. ATP (506) 2. ADP (426) 3. AMP (346)

All (M-H)-

Chromatogram

TIC = total ion current

1 2 3

1

2

3

SIM = single ion monitoring m/z = 506

m/z = 426

m/z = 346

Anwendungsbeispiele HPLC

HPLC-MS-Trennung von Triglyceriden

A) Gesamtionenstrom

(total ion current = TIC)

B) Single ion monitoring = SIM

Masse 1

Masse 2

Masse 3

Masse 4

TIC

Anwendungsbeispiele HPLC

Analyse der Probe ohne vorhergehende Trenntechnik oft auch bei MS nicht möglich.

Chromatographie trotz Massenselektiven Detektor meist notwendig/sinnvoll

à  Zu viele Analyten mit den gleichen oder ähnlichen Massen (isobare Analyten)

à  Schlechte Ionisierung durch Hintergrundsubstanzen der Probe (Salze, kleine polare Analyten....)

Hunderte Analyten in einem kleinem Massenbereich

Identifizierung nicht mehr möglich

Anwendungsbeispiele HPLC

m/z = 342.2 m/z = 400.1 m/z = 404.0 m/z = 384.1 m/z = 331.0 m/z = 332.1 m/z = 706.4 m/z = 657.4

HPLC-ESI-MS-Trennung von Mykotoxinen (Giftstoffe aus Schimmelpilzen)

Säule: C18 (RP)

Eluent: Wasser (+ NH OAc)

Aflatoxin B₁