Analytische Chemie

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 1

Analytische Chemie

für Biologie Pharmazie Bewegungs- wissenschaften und Sport

Elektrophoretische Trennverfahren

Das erste Versuch

1. In freier Lösung oder trägerfreie Pufferlösung

• U-förmigen Glasrohr

• Elektroden (Kathode / Anode)

• Einfache Probenaufgabe Schwerwiegendster Nachteil:

Joule’schen–Wärme verzerrt bereits getrennte Banden.

2.

Verwendung von

stabilierenden Medien, Um

Joule’schen–Wärme

einzuschränken oder ganz auszuschalten

• Gelen auf Glasplatten

• puffergetränkte Papierstreifen

Arne Tiselius

The Nobel Prize in Chemistry 1948

"for his research on electro- phoresis and adsorption analysis, especially for his discoveries concerning the complex nature of the serum proteins"

Ladung

Mobilität

Richtung Geschwindigkeit

+ ^Grösse

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Erste U – Rohr Elektrophorese

the first results obtained by the new apparatus: serum gives a number of relatively distinct components, namely: albumin, ! , " , and # globulin.

It was subsequently found that further subdivision of some of these components could be made.

10.08.1902 – 29.10.1971

Arne Tiselius

1926: U-Tube EP 1937: redesign see right picture First paper in Transactions of the Faraday Society

Typen der Elektrophorese

1. Platten-Gelelektrophorese

2. Papierelektrophorese

3. Kapillar–EP

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 5

Theoretische Grundlage

Transport von Ionen in einer Lösung unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes, wobei die wirkende elektrische

Kraft F_e

definiert ist:

z_i Ladungszahl der Komponente i e₀ Elementarladung [C]

E elektrische Feldstärke [V/cm]

!

F

_e

= z

_i

" e

₀

" E

!

F

_R

= k " # " v

_j

k Konstante [cm] (6 r für sphärische Partikel (Stokesches Gesetz))

$ Viskosität der Lösung [Pa s]

v_i Wanderungsgeschwindigkeit der Komonente i [cm/s]

Reibungskraft:

Theoretische Grundlage

daraus folgt für die Geschwindigkeit einer Komponente i in einem konstanten elektrischen Feld (F

_e

= F

_R

):

daraus ergibt sich unter definierten experimentellen Bedingungen eine Stoffkonstante der Komponente i, die elektrophoretische Mobilität !_EP

!

v

_i

= z

_i

" e

₀

6# " $ " r " E ^r

hydrodynamischer Radius des hydratisierten Ions (ungleich Ionenadius)

!

µ

_EP

= v

_i

E = z

_i

" e

₀

6# " $ " r = q 6# " $ " r

• nur Trennung geladener Analyten, Trennung beruht auf Unterschieden der Molekülgröße (r) und Ladung z_i

• elektrophoretische Verfahren stellen daher zunächst einmal keine

chromatographischen Methoden dar (keine Verteilung zwischen einer mobilen und stationären Phase)

• aber: sehr ähnliche Instrumentierung (Kapillarchromatographie) als auch Mischformen (s.u. micellare elektrokinetische Chromatographie)

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 7

Elektroosmotischer Fluss – EOF

!

eine Vielzahl von Materialien (Glas, Quarz, Teflon) bilden aufgrund von Oberflächenladungen (Quarz bzw. Glas => Dissoziation der Si-OH Gruppen) bei Kontakt mit einer Elektrolytlösung eine elektrochemische Doppelschicht aus

!

Innenseite der Kapillare: negativ geladen positiv geladene Flüssigkeitssäule

!

Elektroosmose tritt auf wenn ein elektrisches Feld an das flüssige Elektrolytsystem angelegt wird

!

positiv geladene Flüssigkeitssäule bewegt sich im elektrischen Feld in Richtung Kathode => EOF =>Transport der Flüssigkeit ähnlich einer mechanischen Pumpe

Zetapotenzial !

EOF: Grösse und Fliessprofil

in Gegensatz zu einem hydrodynamischen Fliessprofil (parabelförmig) ist das Profil des EOF annähernd stempelförmig

flaches Fliessprofil beim EOF hat vernachlässigbare Bandenverbreierung zur Folge ( => EOF trägt nicht zur Peakverbreiterung bei => N

_th

)

parabelförmig

stempelförmig

!

µ

_EO

= " # $

4 % # &

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 9

Trennung erfolgt

!

N = µ " V

2 " D

!

µ = µ

_EP

+ µ

_EOF

Einflussfaktoren des EOF

bei hohen pH-Werten ist der EOF deutlich grösser als bei niedrigen, da der Dissoziations-grad der Silanol-gruppen zunimmt (bei pH > 9 => ! = 1)

pH-Abhängigkeit des EOF (fused-silica-Kapillare) 1. pH Werte

2. Typen der Pufferlösung 3. Spannung

4. Andere Kapillarmaterialien(Teflon oder Derivatisierung)

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 11

Apparatur

• L: 10-100 cm

• ID 10-100 !m Probenaufgabe (1-10 nl) durch

• Hydrostatische Injektion (Siphoneffekt)

• Druck/Vakuum Injektion (Druckdifferenz)

• Elektrokinetische Injektion (!_EOF, !_EP)

• UV – 10^–6 mol/L

• Fluoreszenz – Attomol

• Kopplung an MS

On-column (durchsichtlich)

Fused silica mit Polyimidbeschichtung

bis 30 kV

Probenaufgabe

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 13

Arten Kapillar-EP

! Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

! Gelelektrophorese (GE) oder Kapillargelelektrophorese (CGE)

! Isoelektrische Fokussierung (IEF)

! Isotachophorese (ITP)

! Mizellare elektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC)

! Kapillarelektrochromatographie

Trennleistung: Kapillarinnenwand; Bufferlösung und pH-Werte (Additive); Spannung; Methode

Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

" Diffusion

" T-Profile

" Feldinhomogenitäten

" Adsorptionseffekte

" Sekundäre Gleichgewichte

" Injektion

!

µ

_app

= µ

_eof

± µ

_ep

Kationen: additive Neutral: nur !_eof Anionen: subtractive Elutionsreihe

1. Kationen 2. Neutral 3. Anionen Dispersion:

Elektroosmotischer Fluss (EOF)

!

µ

_eof

> µ

_ep

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 15

Schema von CZE

Kapillar-Gelelektrophorese

1. Grösse

2. Ladung

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 17

Isotachophorese (ITP)

Kation mit einer höheren Mobilität als alle Probenkationen (H+, H3O+) Kation mit niedrigerer Mobilität als

alle Probenkationen

Kathodenseite Anodenseite

1. Ionenband zu ordnen; 2. Alle Ionenband bewegen mit gleichen !

Isotachophorese (ITP)

Ionen bewegen mit variierten ! und werden geordnet.

Dann die geordnete Ionen (Ionenband) bewegen mit gleichen ! durch Detektor nach Kathode

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 19

Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Zwitterionische oder amphotere Proben wie Proteine and Peptide, die sich in ihrem isoelektrischen Punkt (pI–Wert) unterscheiden.

1. Flachbett- oder Kapillar-IEF 2. pH-Gradient

3. Unterschiedlich pI Werte

Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Aufgrund des H⁺ und OH^–-flusses entsprechend ihrer pI-Werte ordnen sich die Ampholyte an, und es bildet sich ein stabiler pH-Gradient über die gesamte Trennstrecke aus nach Anlegen einer Spannung.

Die aufgegebenen amphoteren Probenbestandteile wandern im el. Feld entsprechend ihrer Ladung bis zu dem Punkt, an dem der sich einstellende pH-Werte ihrem isoelektrischen Punkt entspricht, dann bleiben still wegen ihrer null Nettoladung. Die getrennten Zonen können entweder elektrokinetisch durch EOF oder durch Anlegen einer Druckdifferenz am Detektor vorbeigeführt werden.

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 21

Micellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

Ein Hydrid zweier Trenntechniken (CE und HPLC) Terabe in 1984: CE an

ungeladenen Substanzen unpolaren Verbindungen

CZE:

Kation/Neutral/Anion, aber unmöglich an mehrere

Neutralverbindungen Micelle (Hydrophilen und Hydrophoben) aus SDS

Natriumdodecylsulfat stehen mit

monemeren im Gleichgewicht

Pseudo-stationäre Phase

Die Pufferlösung als mobile Phase

MEKC

• Micelle-Bildung: kinetische Gleichgewicht (Hydrophoben Innen / Hydrophilen Aussen)

• Neutral Verbindungen: Gleichgewicht in Micelle und in Pufferlösung

• Negativladung !ep entgegensetzt Puffenlösung !eof => Micelle bewegt sich fast nicht oder gar leicht umzukehren, wie stationäre Phase

• Micelle als reine stationäre Phase, unpolar Innenraum wie flüssigfilm bei HPLC

• Pufferlösung als mobile Phase

• Neutral CyD (Hydrophobenraum) und Kronenether (Polarzentrum) als Zusatz

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 23

Ein Beispiel

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 25

Kapillarelektrochromatographie (CEC)

Pretorius’ Idee in 1974 wurde 10 Jahre später umgesetzt.

1. Stationäre Phase: RP-Kieselgele wie HPLC 2. M-Phase: Methanol – Puffer // Acetonitril – Puffer

3. Mobilität durch Vorantreiben der EOF anstatt durch Pump

Vorteil durch EOF:

1. Flache Strömungsprofil mit 2. Selektivitäten von HPLC 3. Kiegel 3 !m ohne Problem 4. Polare und unpolare sowie 5. geladene und ungeladene

Verbindungen gleichzeitig nebeneinander analysieren werden

Vorteile und Charakteristika

"

sehr gute Abstrahlung der überschüssigen Hitze und damit

keine Bandenverbreiterung durch Konvektion

"

flaches Strömungsprofil bei Ausnutzung des EOF

"

keine feste stationäre Phase

"

hohe Trennleistung (wegen geringer Bandenverbreiterung)

"

extrem wenig Lösungsmittelverbrauch (Kosten, Abfall)

"

nur kleine Probenmengen nötig

"

hohe Bodenzahl, kleine reduzierte Bodenhöhe

"

schonende Technik (wichtig für Biopolymere)

"

in der Regel schnelles Verfahren (10 - 20 Minuten pro Analyse)

"

Automatisierbar

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Sept. 25, 2007 AC – BPBS HS07 27

Analytische Chemie