Analytische Chemie

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Herbstsemester 2013

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid, Dr. Martin Pabst | martin.pabst@org.chem.ethz.ch

HCI D323

Martin.pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/

Zusammenfassung der letzten Stunde:

1) Einteilung von Chromatographie-Techniken

Mobiler Phase (LC u. GC) – Stationärer Phase – Verwendung

2) Grundlegende Formeln Chromatographie

3) Peakform (Elutionsprofil der Analyten von der Säule)

Gauss Peak

(Mittelwert und Standardab., FWHM)

• Verteilungskonstante K_c

:

K_C = c_S c_M

• Trennfaktor a: α = t_R2−t_M t_R1−t_M = ′ t _{R 2}

′ t _R1 = k₂

k₁ = K_{C 2} K_C1

• Retentionsfaktor k: _k₌^t^R⁻^t^M

t_M = t ′ _R

t_M =K_C V_S V_M =K_C

β

Relative Ret. zweier benachbarter Peaks Retention eines Peaks Verteilung zwischen zwei Phasen

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1) Symmetrische Peakverbreiterung – Einfluss auf Peakbreite Verbreiterung des Elutionsprofiles eines Analyten

2) Effizienz der Chromatographie Theoretische Böden

van Deemter Kurve

Skript ab S 25ff

mehrere hundert Peaks !!

Abweichungen von der idealen Peakform (Gauss Peak)

Zeit t asymmetrisch

symmetrisch

„übersättigen mobile Phase“ „überladen stat. Phase“

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Symmetrische Peakverbreiterung

tailing factor a/b = 1

Einflüsse auf die Peakbreite

Im Fall der idealen Peakform entspricht die Retentionszeit der mittleren Aufenthaltszeit der Moleküle eines Analyten in der Säule.

Warum eluieren nicht alle Analyten

zur exakt gleichen Zeit?

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Wie entsteht der Gauss Peak?

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Damit sich das Gleichgewicht einstellen kann, muss ein Molekül mehrmals z.B. ...

• innerhalb der mobilen Phase diffundieren,

• die Phasengrenze erreichen,

• die Phasengrenze überqueren,

• in der stationären Phase diffundieren (GC),

• die Phasengrenze erreichen,

• die Phasengrenze durchqueren, usw.

Die Geschwindigkeiten der einzelnen Prozesse sind für jedes Molekül zufällig

verschieden!

Wie entsteht der Gauss Peak?

Manche Moleküle sind also “zufällig schneller”, manche “zufällig langsamer” als die Moleküle, welche exakt bei der für den Analyten typischen Retentionszeit die Säule verlassen.

Positive und negative Abweichungen von der Retentionszeit mitteln sich im Idealfall heraus.

Die Aufenthaltszeiten der einzelnen Moleküle sind symmetrisch um die Retentionszeit

verteilt.

……folglich ergibt sich ein Gauss Peak!

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Aufgliederung der Einflüsse auf die Peakbreite:

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Peakverbreiternde Prozesse sind:

1) Eddy-Diffusion

2) Longitudinaldiffusion 3) Massentransport-Effekte

(Stofftransport-Effekte)

Eddy-Diffusion

Peakverbreiterung aufgrund von Weglängenunterschieden einzelner Moleküle in gepackten Säulen

http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/basics/saulen_chr/deemter/anschaul/eddydiff000di0300_neu.swf

aus: chemgapedia -- Grundlagen der Chromatographie

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Longitudinaldiffusion

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Peakverbreiterung durch Diffusion der Analytenmokeküle in der mobilen Phase Nur der longitudinale Anteil (entlang oder entgegen der Strömungsrichtung) ist von

Bedeutung

http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/basics/saulen_chr/deemter/anschaul/diffusion000di0300_neu.swf

Massentransport-Effekte

Peakverbreiterung aufgrund von Geschwindigkeitsunterschieden im Stofftransport von individuellen Molekülen

(z.B. Diffusion der Analyten in der mobilen Phase, Übergang zwischen mobiler und stationärer Phase)

http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/basics/saulen_chr/deemter/anschaul/stoffaus000di0300_neu.swf

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Modell der theoretischen Böden

= Effizienz einer Trennung

Modell der theoretischen Böden

Je mehr theoretische Böden, desto mehr Gleichgewichtseinstellungen!

Ein theoretischer Boden ist jene

„theoretische räumliche Einheit“

einer Trennsäule in der sich

zumindest einmal das Nernst-

Gleichgewicht einstellen kann!

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Theoretische Böden

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Je mehr theoretische Böden (N) oder je kleiner die Bodenhöhe (H), desto höher die Effizienz der Trennung!

• Anzahl der theoretischen Böden N:

Die Bodenzahl N hängt von der Retentionszeit eines Peaks und dessen Breite ab. Je breiter ein Peak, desto ineffizienter die Trennung.

• Bodenhöhe H:

H ist besser geeignet als N um Säulen verschiedener Länge L miteinander zu vergleichen

N= t_R σ



 



2

=16⋅ t_R w_b



 



2

= 5.54⋅ t_R w_{1/ 2}



 



2

H = L N

Die van-Deemter-Gleichung

H = A + B

u + C u

Beiträge von

A: Eddy-Diffusion

B: Longitudinaldiffusion C: Massentransport-Effekte

Die van-Deemter-Gleichung beschreibt die Effizienz einer Trennung bzw. die Bodenhöhe H als Funktion der Lineargeschwindigkeit u.

Je grösser A, B und C, desto ineffizienter die Trennung.

Die Trenneffizienz hat bei der Lineargeschwindigkeit u ein Optimum, bei der H minimal wird.

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Die van-Deemter-Gleichung

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H = A + B

u + C u

Beiträge von

A: Eddy-Diffusion

B: Longitudinaldiffusion C: Massentransport-Effekte

A-Term: Eddy-Diffusion

Verringerung der Effizienz aufgrund unterschiedlicher Weglängen der Analyten in einer gepackten Säule.

Unabhängig von der Lineargeschwindigkeit u. Als Funktion von u ergibt der A-Term eine zur x-Achse parallele Gerade.

LC: arbeitet mit gepackten Säulen, der A-Term ist hier also von Bedeutung.

GC: ist nur bei gepackten Säulen von Bedeutung, kann bei den meistens eingesetzten

Kapillarsäulen vernachlässigt werden.

A-Term

Konstanter Einfluss, abhängig von Material und Beschaffenheit der stat. Phase

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Je grösser der Diffusionskoeffizient des Analyten in der mobilen Phase (D_M), desto grösser B:

LC: Kleine Diffusionskoeffizienten (D_M < 10^-5cm²s^-1) in Flüssig- keiten, deshalb geringer Einfluss von B.

GC: Grosse Diffusionskoeffizienten (DM≈10-1 cm2 s-1) in Gasen, deshalb starker Beitrag von B an der Peakverbreiterung.

B-Term: Longitudinaldiffusion

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Verringerung der Effizienz aufgrund der Diffusion der Analyten in der mobilen Phase (nur der longitudinale Anteil hat einen Einfluss).

B ∝ D

_M

B-Term = B x u Hyperbel

Indirekte Proportionalität, da bei langer Aufenthaltszeit der Moleküle in der Säule die Peakverbreiterung durch Diffusion grösser wird.

C-Term: Massentransport-Effekte

Verringerung der Effizienz aufgrund von Unterschieden in der Stofftransport- geschwindigkeit

C-Term = Cu Gerade

Direkte Proportionalität, da bei geringerer Geschwindigkeit u mehr Zeit für den Ablauf der Stofftransportprozesse bzw. zur Gleichgewichtseinstellung zur Verfügung steht.

C u = C

_S

u + C

_M

u

CS, CM: Beiträge von stationärer und mobiler Phase LC: C_Sspielt bei gepackten Säulen keine Rolle

GC: bei Kapillarsäulen sind C_S und C_M von Bedeutung

C u ≈ C

_M

u

C_M ∝ 1 D_M

C_S ∝ d_S

D_S = Schichtdicke stat. Phase

Diffusionskoeffizient in stat. Phase C_M ∝ 1 D_M

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Van-Deemter-Gleichung

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Typische Verläufe für LC und GC

LC GC

A = const. A = 0

B ∝ D

_M ^(DM < 10^-5 cm²s^-1)

B ∝ D

_M ^(DM≈ 10^-1cm²s^-1)

C u ≈ C

_M

u

C_M ∝ 1 D_M

C_S∝ d_S

D_S C_M ∝ 1 D_M schmales

Optimum

breites Optimum

Gase mit grossem D_M bevorzugt (H₂, He)

Anzahl theoret. Böden N, Bodenhöhe H

Tab. 1: Typische Bodenzahlen N und Bodenhöhen H gängiger Säulen in der Gas- chromatographie (GC) und Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) sowie typische Säulenparameter.

Säulen t y p N (pro Säu l e ) H (mm )

GC

Kapillarsäulen (25 m)

0.1 mm Innendurchmesser 0.5 mm Innendurchmesser gepackte Säulen (1-3 m)

30’000-100’000 20’000-50’000 500-2’000

0.2-0.6 0.5-1.3 1 - 6

HPLC

gepackte Säulen (25 cm) 10 µm-Partikel 3 µm-Part ik el

2’500-5’000 8’000-18’0 0 0

0.05-0.1 0.02-0. 0 5

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Anzahl theoret. Böden N, Bodenhöhe H

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Tab. 2: Optimale und in der Praxis eingesetzte Lineargeschwindigkeiten und Fluss- raten in der Gaschromatographie (GC) und Hochleistungs-Flüssig- chromatographie (HPLC)

Technik / Säule Lineargeschwindigkeit [cm s^-1]

Flussrate (Volumenstrom) [mL min^-1]

Optimum In der Praxis Optimum In der Praxis GC

Kapillarsäule

(0.25 mm Innendurchmesser)

gepackte Säule

(4 mm Innendurchmesser)

30-40

2-4

60-80

4-8

1-2

40-50

1-4

40-80

HPLC

gepackte Säule

(4.6 mm Innendurchmesser) 0.05-0.1 0.1-0.2 0.2-0.5 1-2