Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

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Herbstsemester 2013

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid / Dr. Martin Pabst, martin.pabst@org.chem.ethz.ch

Laboratory of Organic Chemistry HCI D323 martin.pabst@org.chem.ethz.ch

http://www.analytik.ethz.ch/

Kurze Zusammenfassung der letzten Einheit:

2. Chromatographie Check

a) Trenntechnik

b) Zwei nicht mischbare Phasen c) Eine mob. und eine stat. Phase

d) Trennung beruht durch Verteilung zwischen den Phasen e) Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen 1. Was ist Chromatographie?

Eine kontinuierlichen Abfolge von Einstellungen des Verteilungsgleichgewichts von Analyten zwischen zwei nicht mischbaren Phasen.

Dadurch passiert eine unterschiedlich schnelle Wanderung der Analyten und folglich deren Auftrennung.

C1

3. Nernstsches Verteilungsgesetz (anschaulich: in Flüssig-Flüssig-Extraktion) C2

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3

1) Einteilung von Chromatographie-Techniken 2) Grundlegende Formeln - Chromatogram 3) Peakform

Stationäre Phase

Mobile Phase

Was passiert nun mit den getrennten Analyten?

= Anwendung

Start: Skriptum S18ff

ad1)

1) Einteilung nach der mobilen Phase

4

FLÜSSIG

Flüssigchromatographie

= Liquid Chromatography = LC

GASFÖRMIG

Gaschromatographie

= Gas Chromatography = GC

Für gut lösliche Analyten

Für flüchtige Analyten

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2) Einteilung nach der stationären Phase

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FEST

Häufigster Fall in der

Flüssigchromatographie Oft pulverförmiger Feststoff bzw.

Feststoffpartikel in gepackter Säule Flüssig-Fest-Chromatographie = Liquid Solid Chromatography = LSC

FLÜSSIG

Häufigster Fall in der Gaschromatographie

Immobilisierte Flüssigkeit an der Innenwand einer Kapillarsäule.

Gas-Flüssig-Chromatographie = Gas Liquid Chromatography = GLC

2) Einteilung nach der stationären Phase

Form der

stationären Phase:

Gepackte Säulen (v.a. LC)

Kapillarsäulen (v.a. auch GC)

1.0 bis 0.020 mm

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2) Einteilung nach der stationären Phase

7

Geometrie der stationären Phase:

Säulen

oder auch Platten!

- Papierchromatographie

- Dünnschichtchromatographie

(= DC = Thin Layer Chromatography = TLC)

3) Einteilung nach Anwendung

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Analytische Chromatographie

Ergebnis: Chromatogramm

(Detektorsignal vs. Zeit) Ziel: Identifizierung und

Quantifizierung Analytmengen: sehr geringe Mengen

= Spurenanalysen

Präparative Chromatographie

Ergebnis: Lösungen aufgereinigter Substanzen

Ziel: Ausgang für weiterführende Arbeiten

Analytmengen: möglichst grosse Mengen

= Gramm bis Kilogramm

Durchmesser 0.5-0.05 cm

Durchmesser

1-30 cm

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4) Bezeichnungen für die mobile Phase

9

LC: Eluent

GC: Trägergas

DC/TLC: Laufmittel

Grundlegende Formeln

zur Chromatographie

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Grundlegende Formeln

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• Verteilungskonstante (Verteilungskoeffizient) K _C :

Gleichgewichtsverteilung von Analytenmolekülen in der mobilen (A _M ) und stationären (A _S ) Phase.

Nernstsches Verteilungsgesetz

Bei gegebener stationärer und mobiler Phase ist K _C für einen Analyten bei konstanter Temperatur eine Konstante.

A _M A _S

K _C = c _S

c _M = Analytkonzentration in der stationären Phase Analytkonzentration in der mobilen Phase

Grundlegende Formeln

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• Phasenverhältnis β:

β = V _M

V _S = Volumen der mobilen Phase Volumen der stationären Phase

Wie viel mobile Phase im Verhältnis zu stationärer Phase liegt vor?

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Das Chromatogram

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Retentionszeit: Zeitpunkt des Austretens (Elution) aus der Trennsäule

Qualitative Analyse: Vergleich der Retentionszeiten mit Reinsubstanzen Quantitative Analyse: Detektorsignal Konzentration oder Stoffmenge

Gleiche Substanzen = Gleiche Retentionszeiten

Das Chromatogram

• Durchflusszeit (Totzeit) t _M :

Retentionszeit einer Inertsubstanz, die der Probe zugegeben werden kann.

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Das Chromatogram

15

• Lineargeschwindigkeit u: Wie schnell fliesst der Eluent durch die Säule?

u = L

t _M = Säulenlänge Durchflusszeit

wichtig für die Trennleistung (späteres Kapitel)

Das Chromatogram

16

• Retentionszeit tR ……(z.B.:. tR1: 5min)

• Reduzierte Retentionszeit t’ _R : Wie stark wird der Analyt tatsächlich zurückgehalten?

• t ′ _R = t _R − t _M = Retentionszeit - Durchflusszeit ……(z.B.: t’R1: 3.5min)

5min

1.5min

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Das Chromatogram

17

• Retentionsfaktor (Kapazitätsfaktor) k:

k ist ein Mass dafür, um wieviel länger sich ein Analyt in der stationären im Vergleich zur mobilen Phase aufhält.

k = t

_R

− t

_M

t

_M

= t ′

_R

t

_M

= K

_C

V

_S

V

_M

= K

_C

β

wichtig für die Trennleistung (späteres Kapitel)

Das Chromatogram

• Trennfaktor (“Selektivität”) αααα ^: α = t

_R2

− t

_M

− = ′ t

_{R 2}

′ = k

₂

= K

_{C 2}

Wie gut sind Substanz 1 und 2 getrennt?

1

2

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Gauss-Funktion:

Im Idealfall lässt sich ein Peak in der Chromatographie mit einer Gauss-Funktion beschreiben.

y ₀ ...Peakhöhe

σ ... Standardabweichung (Mass für die Peakbreite)

y = y ₀ e ⁻

x

²

2σ

²

Die ideale Peakform

Funktioniert meine Chromatographie einwandfrei?

Probleme im Ablauf der Chromatographie erkennt man meist an der Peakform!

Die ideale Peakform

Funktioniert meine Chromatographie einwandfrei?

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Peakbreite zwischen den Wendepunkten w _i :

Breite bei e ^-1/2 = 0.607 bzw.

60.7% der Peakhöhe.

w _i = 2 σ

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Die ideale Peakform

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Basisbreite w _b :

Breite zwischen den Schnitt- punkten der Wendetangenten mit der x-Achse (Zeitachse).

w _b = 4 σ

Die ideale Peakform

Peakbreite in halber Höhe (full width at half maximum = FWHM) w1/2:

Breite bei 50% der Peakhöhe.

w _{1/ 2} = 2 σ 2 ln2 ≈ 2.354 σ

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Formelsammlung:

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• Trennfaktor α:

α = t

_R2

− t

_M

t

_R1

− t

_M

= ′ t

_{R 2}

′ t

_R1

= k

₂

k

₁

= K

_{C 2}

K

_C1

• Verteilungskonstante K _c : K

_C

= c

_S

c

_M

• Retentionszeit t _R , Durchflusszeit t _M , reduzierte

Retentionszeit t’ _R :

• Phasenverhältnis β:

′

t _R = t _R − t _M ^{• Linear-} geschwindigkeit u:

• Retentionsfaktor k:

k = t

_R

− t

_M

t

_M

= t ′

_R

t

_M

= K

_C

V

_S

V

_M

= K

_C

β

′ t

_R

= t

_M

β ^K

^C

^; ^t

^R

⁼ ^{f K} ( )

^C

Retention eines Peaks Relative Retention zweier

benachbarter Peaks

Zusammenfassung: Peakbreite

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