Elektrophorese Analytische Chemie

(1)

Herbstsemester 2013

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid, Dr. Martin Pabst | martin.pabst@org.chem.ethz.ch

HCI D323

Martin.pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/

Elektrophorese

(2)

Herbstsemester 2013 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Pabst martin.pabst@org.chem.ethz.ch

Elektrophorese

3

Allgemein:

Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld Analytische Chemie:

Trennung von Ionen im elektrischen Feld

(Elektrophoretische Trenntechniken zählen im Allgemeinen nicht zur Chromatographie)

„Chromatographie-Check“

4

Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein:

• Trenntechnik

• Zwei nicht mischbare Phasen

• Eine mobile und eine stationäre Phase

• Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen

• Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen

(3)

Übersicht Elektrophorese:

5

• Gel-Elektrophorese

• Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

• Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)

• Kapillarelektrophorese (CE)

• Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

• Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

Gel-Elektrophorese

(4)

Gel-Elektrophorese

7

Gel-Elektrophorese: http://www.youtube.com/watch?v=qMxQ-65qYDk

„Genetischer Fingerabdruck“: http://www.youtube.com/watch?v=W5HeXufSFE4

Agarose-Gelelektrophorese

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

8

• Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung im elektrischen Feld

• Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung

• Kleine Moleküle wandern schneller als grosse

• Detektion: chemische Anfärbemethoden (z.B. Fluoreszenz)

• Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse

• z.B. Auftrennung von DNA-Fragmenten (z.B. „Genetischer Fingerabdruck) –

+

Standard Probe

Probe: DNA-Fragment mit 522 Basenpaaren (bp)

Probenauftragung

(5)

Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE)

Z.B.: DNA fingerprinting

9

• Trennung nach Ladung und Grösse

• Grösse:

hydrodynamischer Durchmesser

• Proteine werden also nach Ladung, Molekulargewicht und Faltung getrennt

• Bei Proteinen wird häufig die SDS-PAGE angewandt

SDS-PAGE ^{SDS =} sodium dodecyl sulfate Natriumdodecylsulfat Natriumlaurylsulfat C ₁₂ H ₂₅ NaO ₄ S

Tensid, Detergent =

Herabsetzen der Grenzflächenspannung zwischen zwei Phasen

z.b.: Öl und Wasser fein vermengbar

SDS bildet Mizellen

SDS denaturiert Proteine

(6)

SDS-PAGE

11

• Trennung von negativ geladenen Komplexen von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen

• Faltung beeinflusst nicht die Trennung

• Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom Molekulargewicht ab, Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle

• Trennung von Proteinen nur aufgrund des

Molekulargewichts

SDS-PAGE

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Elektrophorese Analytische Chemie

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

HCI D323

Martin.pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/

Elektrophorese

Elektrophorese

Allgemein:

Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld Analytische Chemie:

Trennung von Ionen im elektrischen Feld

(Elektrophoretische Trenntechniken zählen im Allgemeinen nicht zur Chromatographie)

„Chromatographie-Check“

Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein:

• Trenntechnik

• Zwei nicht mischbare Phasen

• Eine mobile und eine stationäre Phase

• Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen

• Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen

Übersicht Elektrophorese:

• Gel-Elektrophorese

• Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

• Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)

• Kapillarelektrophorese (CE)

• Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

• Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

Gel-Elektrophorese

Gel-Elektrophorese

Gel-Elektrophorese: http://www.youtube.com/watch?v=qMxQ-65qYDk

„Genetischer Fingerabdruck“: http://www.youtube.com/watch?v=W5HeXufSFE4

Agarose-Gelelektrophorese

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

• Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung im elektrischen Feld

• Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung

• Kleine Moleküle wandern schneller als grosse

• Detektion: chemische Anfärbemethoden (z.B. Fluoreszenz)

• Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse

• z.B. Auftrennung von DNA-Fragmenten (z.B. „Genetischer Fingerabdruck) –

+

Standard Probe

Probe: DNA-Fragment mit 522 Basenpaaren (bp)

Probenauftragung

Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE)

Z.B.: DNA fingerprinting

• Trennung nach Ladung und Grösse

• Grösse:

hydrodynamischer Durchmesser

• Proteine werden also nach Ladung, Molekulargewicht und Faltung getrennt

• Bei Proteinen wird häufig die SDS-PAGE angewandt

SDS-PAGE SDS = sodium dodecyl sulfate Natriumdodecylsulfat Natriumlaurylsulfat C 12 H 25 NaO 4 S

Tensid, Detergent =

Herabsetzen der Grenzflächenspannung zwischen zwei Phasen

z.b.: Öl und Wasser fein vermengbar

SDS bildet Mizellen

SDS denaturiert Proteine

SDS-PAGE

• Trennung von negativ geladenen Komplexen von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen

• Faltung beeinflusst nicht die Trennung

• Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom Molekulargewicht ab, Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle

• Trennung von Proteinen nur aufgrund des

Molekulargewichts

SDS-PAGE

• Trennung von negativ geladenen Komplexen von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen

• Faltung beeinflusst nicht die Trennung

• Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom Molekulargewicht ab, Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle

• Trennung von Proteinen nur aufgrund des

Molekulargewichts

SDS-PAGE-Trennung verschiedener Proteine (1-8) gemäss ihres Molekulargewichts.

Links: Gemisch von Proteinen bekannter Grösse

als Molekulargewichtsstandard (14–97 kDa)

SDS-PAGE ^{SDS =} sodium dodecyl sulfate Natriumdodecylsulfat Natriumlaurylsulfat C ₁₂ H ₂₅ NaO ₄ S