Herbstsemester 2013
Analytische Chemie
(für Biol. / Pharm. Wiss.)
Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)
Dr. Martin Pabst
ETH Zurich | Dr. Martin Pabst | martin.pabst@org.chem.ethz.ch
HCI D323
martin.pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/
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Probenvorbereitung
(Probenaufarbeitung)
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Proben
Fest
Flüssig
Gasförmig
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Probenvorbereitung
• Analyten in Lösung bringen
• Abtrennen fester Störsubstanzen
• Abtrennen gelöster Störsubstanzen
• Anreichern der Analyten
• Aufkonzentrieren oder Verdünnen der Probe
• Überführen der Analyten in ein
geeignetes Lösungsmittel
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Analyten in Lösung bringen
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Feste Probe
Lösungsmittel mit extrahierten Analyten Soxhlet-Extraktion
http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/
de/ch/3/anc/dioxine/dioxinanalytik.vlu/Page/vs c/de/ch/3/anc/dioxine/5_probenvorb/animation /soxhlet_m87te0300.vscml.html
Abtrennen fester Störsubstanzen
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Filtration
Links:
Faltenfilter Mitte:
Filter auf Nutsche
Rechts:
Spritzen- filter
Zentrifugation
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Abtrennen gelöster Störsubstanzen
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Flüssig-Flüssig-Extraktion (liquid liquid extraction = LLE)
• Extraktion z.B. lipophiler Analyten aus einer Wasserprobe mittels eines org. Lösungsmittels
• Nernst-Verteilungsgesetz • Je mehr Extraktionsschritte, umso effizienter die Extraktion
• Geeigneten pH einstellen • Aussalzeffekt
• Für grössere Probenmengen (einige 10 ml bis einige 100 ml) geeignet
Abtrennen gelöster Störsubstanzen
Festphasenextraktion (solid phase extraction = SPE)
• Adsorber: typische stationäre Phasen der HPLC (Kieselgel, RP-Kieselgel, Ionentauscher)
• Einweg-Kartuschen als Säulen
• Proben werden mittels Unterdruck durch die Kartuschen gesaugt
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Abtrennen gelöster Störsubstanzen
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Festphasenextraktion (solid phase extraction = SPE)
K o n d it io n ie re n A d so rp ti o n W a sch e n E lu ti o n m it L ö su n g s – m it te l m it h o h e r E lu ti o n skr a ft
Abtrennen gelöster Störsubstanzen
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Affinitätschromatographie (Aufkonzentrierung)
• Ablauf wie bei Festphasenextraktion (SPE)
• Adsorber: immobilisierte Moleküle, welche sehr spezifische (biochemische) Wechselwirkungen
mit Analyten eingehen können
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Abtrennen gelöster Störsubstanzen
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Festphasen-Mikroextraktion (solid phase micro extraction = SPME) Adsorption Desorption
im Injektor
• Probenvorbereitungsmethode für die GC
• SPME-Faser: Glasfaser, häufig beschichtet mit stat. Phase der GC, z.B. Polydimethylsiloxan
• Adsorption in der Probenlösung oder Headspace-SPME
• Thermo-Desorption im GC-Injektor
Einstellen einer geeigneten Analytkonzentration in einem geeigneten Lösungsmittel
Rotationsverdampfer
• Aufkonzentrieren von Lösungen
• Abdestillieren des Lösungsmittels
• Kolben rotiert zum Vermeiden von
Siedeverzügen (Verlust von Analytmolekülen)
• Geeignet für grössere Probenmengen (einige 10 ml bis einige 100 ml)
• Gegen Ende der Destillation (kleines
Volumen): Analytverluste möglich
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Einstellen einer geeigneten Analytkonzentration in einem geeigneten Lösungsmittel
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„speed-vac“ concentrator
• Aufkonzentrieren von Lösungen
• Abdestillieren des Lösungsmittels (Lösungsmitteltausch)
• Rotor rotiert in Unterdruckkammer
•Geeignet für kleinere Probenmengen (einige ml bis wenige µl)
• Gegen Ende der Destillation (kleines Volumen):
Analytverluste möglich aber gering!
ml oder µl Reaktionsgefäß
Einstellen einer geeigneten Analytkonzentration in einem geeigneten Lösungsmittel
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Einengen der Analytlösung im N 2 -Strom
• Entfernen letzter Lösungsmittelreste
• Geeignet für kleine Probenmengen
• Analyten sammeln sich im spitz zulaufenden Ende des Kolbens
• Analyten können im Anschluss in einem
geeigneten Lösungsmittel in geeigneter
Konzentration aufgenommen werden
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Zusammenfassung Elektrophorese
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Elektrophorese
• Gel-Elektrophorese
• Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese
• Natriumdodecylsulfat-PAGE
• Kapillarelektrophorese
• Kapillarzonenelektrophorese
• Mizellare Elektrokinetische Chromatographie
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Übersicht
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• Gel-Elektrophorese
• Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
• Trennung geladener Makromoleküle (z.B. DNA-Fragmente)
• Trennung aufgrund von Ladung und Grösse (Faltungszustand)
• Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)
• Trennung von Proteinen (als SDS-Protein-Komplex)
• Trennung nur aufgrund des Molekulargewichts
• Kapillarelektrophorese (CE)
• Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
• Trennung geladener, kleiner Moleküle (z.B. Aminosäuren, Ionen)
• Trennung von Kationen und Anionen (wegen EOF)
• Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
• Trennung ungeladener, kleiner Moleküle
• Trennung aufgrund der Polarität (Elutionsreihenfolge analog RP-HPLC)
Agarose-Gelelektrophorese
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
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• Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung im elektrischen Feld
• Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung
• Kleine Moleküle wandern schneller als grosse
• Detektion: chemische Anfärbemethoden (z.B. Fluoreszenz)
• Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse
z.B.: Auftrennung von DNA-Fragmenten („Genetischer Fingerabdruck“)
–
+
Standard Probe
Probe: DNA-Fragment mit 522 Basenpaaren (bp)
Proben Aufbringung
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SDS-PAGE
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SDS = sodium dodecyl sulfate Natriumdodecylsulfat Natriumlaurylsulfat C 12 H 25 NaO 4 S
Tensid, Detergent =
Herabsetzen der Grenzflächenspannung zwischen zwei Phasen
z.b.: Öl und Wasser fein vermengbar
SDS bildet Mizellen SDS denaturiert Proteine SDS bildet negativ geladene
Komplexe mit Proteinen
SDS-PAGE
• Trennung von negativ geladenen Komplexen von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen
• Faltung beeinflusst nicht die Trennung
• Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom Molekulargewicht ab, Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle
• Trennung von Proteinen nur aufgrund des
Molekulargewichts
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Kapillarelektrophorese
(capillary electrophoresis = CE)
Migration eines Ions im elektrischen Feld E
z.b.: Kapillarzonenelektrophorese Analyten müssen „geladen“ sein (basische oder acide Analyten) Elektrophorese ist keine
Chromatographie!
Adenosin Triphosphat Neuraminsäure
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Detektion:
In der Regel UV Detektoren Kopplung an Massen-
Spektrometrie ist schwierig Trennung:
Spannung (+/-) Kapillarlänge Puffer
75cm Kapillare
Voltage: -15/-20/-25/-30 Ammonia bicarbonate EOF block, pumping
Trennung von Metaboliten
CE: Beispiel
Elektropherogramm
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Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
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Dem Puffer wird ein Tensid (z.B. SDS) zugegeben, welches Mizellen bildet.
siehe SDS-PAGE!
Abhängig von ihrer Polarität halten sich die Analyten v.a.
in der Pufferlösung (polar) oder in den Mizellen (unpolar) auf.
• Trennung ungeladener Analyten (keine Ionen)
• Chromatographie
• Mobile Phase: Pufferlösung (polar)
• Pseudo-stationäre Phase: Mizellen (unpolar)
Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
• Trennung von
ungeladenen Analyten
• Pufferlösung (mobile Phase) bewegt sich wegen EOF in Richtung Kathode
• Mizellen (pseudo-stationäre Phase) bewegen sich langsamer
• Elutionsreihenfolge wie in RP-HPLC: polare Moleküle eluieren vor unpolaren
• Detektor wegen EOF kathodenseitig angebracht Polarität der Analyten
hoch gering
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Done!
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