Analytik (Biologie / Pharmazeutische Wissenschaften) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Analytik

(Biologie / Pharmazeutische Wissenschaften)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Badertscher

Laboratory of Organic Chemistry HCI D 341 martin.badertscher@org.chem.ethz.ch

http://www.analytik.ethz.ch/

2

Übersicht:

Ø  Chromatographie

o Grundlagen

o Flüssigkeitschromatographie

o Gaschromatographie

Ø  Elektrophorese

Ø  Probenvorbereitung

Fragen jederzeit während oder nach der Vorlesung, auch per E-Mail

Skript S1ff

Herbstsemester 2015 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Badertscher | martin.badertscher@org.chem.ethz.ch

Chromatographie

( eine der wichtigsten Methoden der modernen Analytik)

A)  Was ist Chromatographie?

B) Wozu?

Auftrennung von Substanzen (Analyten) durch deren Verteilung zwischen:

Mobiler und stationärer Phase

Trennung einzelner Substanzen aus komplexen Gemischen:

à Identifizierung/Quantifizierung

à Fraktionierung/Aufreinigung von Substanzen

Einfachstes Experiment: Papierchromatographie

„Anschauliches“ Beispiel einer Chromatographie (= Trennung von Analyten)

(1952 Nobelpreis für deren Entwicklung und Beschreibung)

Experiment: Papierchromatographie

Probe: Filzschreiber

(schwarz, wasserlöslich) Analyten: verschiedene

Farbstoffmoleküle Stationäre Phase: Papiertaschentuch,

Löschpapier

Mobile Phase: Ethanol (auch Aceton, Isopropanol...)

A)  Transport der mobilen Phase nach oben aufgrund von Kapillarkräften

B)  Unterschiedliche Verteilung der Substanzen zwischen fester und mobiler Phase (Adsorption) C) Wiederholtes Verteilen über gesamten

Laufbereich und folglich Trennung der Farbstoffe

Wie funktioniert die Papierchromatographie?

A B,C

t=0 t=5min

Stat. Phase

Mobile Phase

Extrakt von Pflanzenfarbstoffen

Der russische Botaniker Michail S.

Tswett führte 1903 erste Experi- mente zur Chromatographie von Pflanzenfarbstoffen durch.

Tswetts Experiment:

Probe: Extrakt von Pflanzenfarbstoffen in Lösungsmittel gelöst

Stationäre Phase: z.B. CaCO ₃ -Pulver Mobile Phase: ein Lösungsmittel

(Kohlenwasserstoff-Gemisch) Ergebnis: Verschiedene Farbstoffe

verlassen zeitlich getrennt

unten die Säule.

Extrakt von Pflanzenfarbstoffen

Trennung von Pflanzenfarbstoffen mittels Säulenchromatographie

http://www.chemie.uni-regensburg.de/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-CC-d.htm"

Gedankenexperiment

Transport von Geröll in einem Fluss

Transportgeschwindigkeit: Sand > Kies > Steine Fluss = “mobile Phase”

Untergrund = “stationäre Phase”

Stationäre Phase

Mobile Phase

Grundprinzip

Flüssig-Flüssig-Extraktion: Trennung aufgrund der Verteilung von Analyten zwischen zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten!

Scheidetrichter. Extraktion wird in der Analytischen oder Organischen Chemie häufig bei der Probenvorbereitung eingesetzt.

A B C D

Grundprinzip

Beispiel: In einer wässrigen Probe befinden sich ein organischer Analyt (gut löslich in org. Lösungsmitteln) und Salze bzw. Ionen. Durch Extraktion soll der org.

Analyt von den Salzen abgetrennt werden, welche die Analyse stören würden.

(1) Ursprünglich befinden sich ein organischer Analyt und Ionen in der Probe

(2) Durch Extraktion soll

der organische Analyt in ein org. Lösungsmittel überführt und so von den Ionen getrennt werden.

Es besteht ein Verteilungsgleichgewicht zwischen den beiden Phasen, welches im

vorliegenden Fall auf der Seite der org. Phase liegt.

Grundprinzip

K _C = c ₁

c ₂ ^{A 1 A 2}

c = m

V = Masse des Analyten

Volumen, in dem er sich befindet Nernstsches Verteilungsgesetz:

gilt für das Gleichgewicht

K _C ... Verteilungskonstante

c ₁ , c ₂ ... Konzentrationen in den Phasen 1 und 2 A ₁ , A ₂ ... Analyt in Phasen 1 und 2

Im Gleichgewichtsfall ist also das Verhältnis der Analytenkonzentrationen in den beiden Phasen bei konstanter Temperatur eine Konstante.

Konzentration:

Einheiten: z.B. mg/l, µg/l, alternativ auch Stoffmengenkonz.: z.B. mol/l C1

C2

Extraktionseffizienz:

Würde der Analyt vollständig in einem Schritt in die organische Phase überführt, ergäbe sich E _org = 1 bzw. 100%.

Da aber ein Verteilungsgleichgewicht besteht, wird eine vollständige Extraktion in einem Schritt kaum erreicht.

Grundprinzip

E

: = m

m

+ m

= Analytmasse in organischer Phase

gesamte Analytmasse = K

V

K

V

+ V

Beispiel 1:

100 ml wässrige Probe werden einmal mit 90 ml organischer Phase extrahiert. Der Verteilungskoeffizient des org. Analyten beträgt 50.

K _C = 50, d.h. c _org : c _W = 50:1

Volumen wässrige Phase V _W = 100 ml Volumen org. Phase V _org = 90 ml

Nach einmaliger Extraktion mit 90 ml Lösungsmittel befinden sich also 97.83% der Analytmasse in der organischen Phase.

Grundprinzip

E _org : = m _org

m _org + m _W = K _C V _org

K _C V _org + V _W = 4500

4600 = 97.83%

Was ist effizienter?

Extraktion mit:

1x 90 ml?

…oder 3x 30ml?

à Frage kann man mit Extraktionsgleichgewicht beantworten….

14

Beispiel 2:

Was geschieht, wenn anstelle von einmaliger Extraktion mit 90 ml org.

Lösungsmittel die Probe dreimal mit 30 ml extrahiert wird? Alle anderen Angaben bleiben gleich.

1. Extraktionsschritt:

93.75% der Analytmasse landen in der organischen Phase, 6.25%

verbleiben in der wässrigen Phase.

Im nächsten Schritt werden wieder 93.75% der verbleibenden 6.25%, also 6.25% × 0.9375 = 5.86%, in die organische Phase überführt.

E _org

1. Schritt 93.75%

2. Schritt 99.61%

3. Schritt 99.98% Vergleich: 1 × 90 ml: 97.83%

Grundprinzip

E

: = m

m

+ m

= K

V

K

V

+ V

= 1500

1600 = 93.75%

Je mehr Extraktionsschritte, desto höher die Effizienz.

Oder allgemein:

Je mehr Gleichgewichtseinstellungen, desto besser die Trennung.

wichtig für die Chromatographie

1. Schritt 93.75%

2. Schritt 99.61%

3. Schritt 99.98% Vergleich: 1 × 90 ml: 97.83%

Von der Extraktion zur Chromatographie

aus: http://www.chem.uoa.gr/applets/AppletCraig/Appl_Craig2.html

Extraktionsapparatur nach Craig (1943)

K _c org = c _org /c _w

K _corgA >K _corgB

Von der Extraktion zur Chromatographie

Modell:

Die Chromatographie basiert auf einer

kontinuierlichen Abfolge von Einstellungen des

Verteilungsgleichgewichts von Analyten zwischen zwei

nicht mischbaren Phasen.

Chromatographie

Definition:

Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem

die zu trennenden Substanzen zwischen einer mobilen und einer

stationären Phase verteilt werden. Die beiden Phasen sind nicht mischbar

und die Trennung beruht auf unterschiedlichen Verteilungskonstanten der

verschiedenen Substanzen. Die Technik ist idealerweise so konzipiert, dass

sich das Verteilungsgleichgewicht in einer kontinuierlichen Abfolge

mehrmals während des Trennprozesses einstellen kann.

„Chromatographie-Check“

Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein:

•  Trenntechnik

•  Zwei nicht mischbare Phasen

•  Eine mobile und eine stationäre Phase

•  Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen

•  Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen

Chromatographie - Säulenmodel

Wichtige Begriffe:

(Werden im weiteren Verlauf der Vorlesung erklärt)

•  Analyten

•  Eluent

•  Inertsubstanz

•  Lineargeschwindigkeit

•  Chromatogramm

•  Peak

•  Retentionszeit

•  Peakfläche und Peakhöhe

•  Kalibrierung

1) Einteilung nach der mobilen Phase

FLÜSSIG

è Flüssigchromatographie

= Liquid Chromatography = LC

GASFÖRMIG

è Gaschromatographie

= Gas Chromatography = GC

Für gut lösliche Analyten

Für flüchtige Analyten

2) Einteilung nach der stationären Phase

FEST

Häufigster Fall in der

Flüssigchromatographie

Oft pulverförmiger Feststoff bzw.

Feststoffpartikel in gepackter Säule

è Flüssig-Fest-Chromatographie = Liquid Solid Chromatography = LSC

FLÜSSIG

Häufigster Fall in der

Gaschromatographie

Immobilisierte Flüssigkeit an der Innenwand einer Kapillarsäule.

è Gas-Flüssig-Chromatographie =

Gas Liquid Chromatography = GLC

2) Einteilung nach der stationären Phase

Form der

stationären Phase:

Gepackte Säulen (v.a. LC)

Kapillarsäulen (v.a. auch GC)

1.0 bis 0.020 mm

2) Einteilung nach der stationären Phase

Geometrie der

stationären Phase:

Säulen

oder auch Platten!

-  Papierchromatographie

- Dünnschichtchromatographie

(= DC = Thin Layer Chromatography = TLC)

3) Einteilung nach Anwendung

Analytische Chromatographie

Ergebnis: Chromatogramm

(Detektorsignal vs. Zeit) Ziel: Identifizierung und

Quantifizierung

Analytmengen: sehr geringe Mengen = Spurenanalysen

Präparative Chromatographie

Ergebnis: Lösungen aufgereinigter Substanzen

Ziel: Ausgang für weiterführende Arbeiten

Analytmengen: möglichst grosse Mengen = Gramm bis Kilogramm

Durchmesser 0.5-0.05 cm

Durchmesser

1-30 cm

4) Bezeichnungen für die mobile Phase

LC: Eluent

GC: Trägergas

DC/TLC: Laufmittel

Grundlegende Formeln

zur Chromatographie

Grundlegende Formeln

•  Verteilungskonstante (Verteilungskoeffizient) K _C :

Gleichgewichtsverteilung von Analytenmolekülen in der mobilen (A _M ) und stationären (A _S ) Phase.

Nernstsches Verteilungsgesetz

Bei gegebener stationärer und mobiler Phase ist K _C für einen Analyten bei konstanter Temperatur eine Konstante.

A _M A _S

K _C = c _S

c _M = Analytkonzentration in der stationären Phase

Analytkonzentration in der mobilen Phase

Grundlegende Formeln

•  Phasenverhältnis β:

β = V _M

V _S = Volumen der mobilen Phase Volumen der stationären Phase

Wie viel mobile Phase im Verhältnis zu stationärer Phase liegt vor?

Das Chromatogramm

Retentionszeit: Zeitpunkt des Austretens (Elution) aus der Trennsäule

Q u an ti ta ti ve In fo rm ati o n : Pe ak fl äc h en b zw . Pe ak h ö h en

Qualitative Analyse: Vergleich der Retentionszeiten mit Reinsubstanzen Quantitative Analyse: Detektorsignal ∝ Konzentration oder Stoffmenge

Gleiche Substanzen = Gleiche Retentionszeiten

Das Chromatogramm

•  Durchflusszeit (Totzeit) t _M :

Retentionszeit einer Inertsubstanz, die der Probe zugegeben werden kann.

Eine Inertsubstanz fliesst gleich schnell wie die mobile Phase durch bzw.

über die stationäre Phase. Sie erfährt also keine Retention.

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Das Chromatogramm

33

•  Lineargeschwindigkeit u: Wie schnell fliesst der Eluent durch die Säule?

u = L

t _M = Säulenlänge Durchflusszeit

wichtig für die Trennleistung (späteres Kapitel)

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Das Chromatogramm

34

•  Retentionszeit tR z.B.: tR1: 5min

•  Reduzierte Retentionszeit t’ _R : Wie stark wird der Analyt tatsächlich zurückgehalten?

•  t ′ _R = t _R − t _M = Retentionszeit - Durchflusszeit z.B.: t’R1: 3.5min

5min

1.5min

Das Chromatogramm

•  Retentionsfaktor (Kapazitätsfaktor) k:

k ist ein Mass dafür, um wieviel länger sich ein Analyt in der stationären im Vergleich zur mobilen Phase aufhält.

k = t

− t

t

= t

′

t

= K

V

V

= K

β

wichtig für die Trennleistung (späteres Kapitel)

Das Chromatogramm

•  Trennfaktor (“Selektivität”) a :

a beschreibt die relative Retention zweier benachbarter Peaks.

Nach Definition gilt a > 1; bei a = 1 koeluieren zwei Substanzen.

α = t

− t

t

− t

= t

′

′

t

= k

k

= K

K

Wie gut sind Substanz 1 und 2 getrennt?

1

2

Gauss-Funktion:

Im Idealfall lässt sich ein Peak in der Chromatographie mit einer Gauss-Funktion beschreiben.

y ₀ ... Peakhöhe

s ... Standardabweichung (Mass für die Peakbreite)

y = y ₀ e ⁻

x

2 σ

Die ideale Peakform

Funktioniert meine Chromatographie einwandfrei?

Probleme im Ablauf der Chromatographie erkennt man meist an der Peakform.

Die ideale Peakform

Funktioniert meine Chromatographie einwandfrei?

Peakbreite zwischen den Wendepunkten w _i :

Breite bei e ^-1/2 = 0.607 bzw.

60.7% der Peakhöhe.

w _i = 2 σ

Die ideale Peakform

Basisbreite w _b :

Breite zwischen den Schnitt- punkten der Wendetangenten mit der x-Achse (Zeitachse).

w _b = 4 σ

Die ideale Peakform

Peakbreite in halber Höhe (full width at half maximum = FWHM) w1/2:

Breite bei 50% der Peakhöhe.

w _{1/ 2} = 2 σ 2 ln2 ≈ 2.354 σ

Formelsammlung:

•  Trennfaktor α:

α = t

− t

t

− t

= t

′

′

t

= k

k

= K

K

•  Verteilungskonstante K _c : ^K _C = c _S c _M

•  Retentionszeit t _R , Durchflusszeit t _M , reduzierte

Retentionszeit t’ _R :

•  Phasenverhältnis β: ^{β = V M} V _S

′

t _R = t _R − t _M ^• geschwindigkeit u: ^Linear- u = L t _M

•  Retentionsfaktor k:

k = t

− t

t

= t ′

t

= K

V

V

= K

β

′

t

= t

β K

; t

= f K ( )

Retention eines Peaks Relative Retention zweier

benachbarter Peaks

Zusammenfassung: Peakbreite

Peakbreite zwischen den Wendepunkten w _i :

Breite bei e ^-1/2 = 0.607 bzw. 60.7%

der Peakhöhe.

w _i = 2σ

Basisbreite w _b :

Breite zwischen den Schnittpunkten der Wendetangenten mit der

x-Achse (Zeitachse).

w _b = 4 σ

Peakbreite in halber Höhe w _1/2 :

Breite bei 50% der Peakhöhe.

w _{1/ 2} = 2 σ 2 ln2 ≈ 2.354 σ

s... Standardabweichung der Gauss-Funktion

1) Symmetrische Peakverbreiterung – Einfluss auf Peakbreite Verbreiterung des Elutionsprofiles eines Analyten

2) Effizienz der Chromatographie Theoretische Böden

van-Deemter-Kurve

Skript ab S 25ff

mehrere hundert Peaks!

Abweichungen von der idealen Peakform (Gauss-Peak)

Zeit t asymmetrisch

symmetrisch

Übersättigen (mobile Phase) Überladen (stat. Phase)

Symmetrische Peakverbreiterung

tailing factor a/b = 1

Einflüsse auf die Peakbreite

Im Fall der idealen Peakform entspricht die

Retentionszeit der mittleren Aufenthaltszeit der Moleküle eines Analyten in der Säule.

Warum eluieren nicht alle Analyten

zur exakt gleichen Zeit?

Wie entsteht der Gauss-Peak?

Damit sich das Gleichgewicht einstellen kann, muss ein Molekül mehrmals z.B. ...

•  innerhalb der mobilen Phase diffundieren,

•  die Phasengrenze erreichen,

•  die Phasengrenze überqueren,

•  in der stationären Phase diffundieren (GC),

•  die Phasengrenze erreichen,

•  die Phasengrenze durchqueren, usw.

Die Geschwindigkeiten der einzelnen Prozesse sind für jedes Molekül zufällig

verschieden.

Wie entsteht der Gauss-Peak?

Manche Moleküle sind also “zufällig schneller”, manche “zufällig langsamer” als die Moleküle, welche exakt bei der für den Analyten typischen Retentionszeit die Säule verlassen.

Positive und negative Abweichungen von der Retentionszeit mitteln sich im Idealfall heraus.

Die Aufenthaltszeiten der einzelnen Moleküle sind symmetrisch um die Retentionszeit

verteilt.

Folglich ergibt sich ein Gauss-Peak.

Aufgliederung der Einflüsse auf die Peakbreite:

Peakverbreiternde Prozesse sind:

1) Eddy-Diffusion

2) Longitudinaldiffusion

3) Massentransport-Effekte

(Stofftransport-Effekte)

Eddy-Diffusion

Peakverbreiterung aufgrund von Weglängen-Unterschieden einzelner Moleküle in gepackten Säulen

http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/basics/saulen_chr/deemter/anschaul/eddydiff000di0300_neu.swf

aus: chemgapedia -- Grundlagen der Chromatographie

Longitudinaldiffusion

Peakverbreiterung durch Diffusion der Analytenmokeküle in der mobilen Phase

Nur der longitudinale Anteil (entlang oder entgegen der Strömungsrichtung) ist von Bedeutung

http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/basics/saulen_chr/deemter/anschaul/diffusion000di0300_neu.swf

aus: chemgapedia -- Grundlagen der Chromatographie

Massentransport-Effekte

Peakverbreiterung aufgrund von Geschwindigkeitsunterschieden im Stofftransport von individuellen Molekülen

(z.B. Diffusion der Analyten in der mobilen Phase, Übergang zwischen mobiler und stationärer Phase)

http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/basics/saulen_chr/deemter/anschaul/stoffaus000di0300_neu.swf

aus: chemgapedia -- Grundlagen der Chromatographie

Modell der theoretischen Böden

= Effizienz einer Trennung

Modell der theoretischen Böden

Je mehr theoretische Böden, desto mehr Gleichgewichtseinstellungen.

Ein theoretischer Boden ist jene

theoretische räumliche Einheit

einer Trennsäule, in der sich

zumindest einmal das Nernst-

Gleichgewicht einstellen kann.

Theoretische Böden

Je mehr theoretische Böden (N) oder je kleiner die Bodenhöhe (H), desto höher die Effizienz der Trennung.

•  Anzahl der theoretischen Böden N:

Die Bodenzahl N hängt von der Retentionszeit eines Peaks und dessen Breite ab. Je breiter ein Peak, desto ineffizienter die Trennung.

•  Bodenhöhe H:

H ist besser geeignet als N um Säulen verschiedener Länge L miteinander zu vergleichen

N = t

σ

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

2

= 16 ⋅ t

w

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

2

= 5.54 ⋅ t

w

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

2

H = L

N

Die van-Deemter-Gleichung

H = A + B

u + C u

Beiträge von

A: Eddy-Diffusion

B: Longitudinaldiffusion C: Massentransport-Effekte

Die van-Deemter-Gleichung beschreibt die Effizienz einer Trennung bzw. die Bodenhöhe H als Funktion der Lineargeschwindigkeit u.

Je grösser A, B und C, desto ineffizienter die Trennung.

Die Trenneffizienz hat bei der Lineargeschwindigkeit u ein Optimum, bei der

H minimal wird.

Die van-Deemter-Gleichung

H = A + B

u + C u

Beiträge von

A: Eddy-Diffusion

B: Longitudinaldiffusion

C: Massentransport-Effekte

A-Term: Eddy-Diffusion

Verringerung der Effizienz aufgrund unterschiedlicher Weglängen der Analyten in einer gepackten Säule.

Unabhängig von der Lineargeschwindigkeit u. Als Funktion von u ergibt der A-Term eine zur x-Achse parallele Gerade.

LC: arbeitet mit gepackten Säulen, der A-Term ist hier also von Bedeutung.

GC: ist nur bei gepackten Säulen von Bedeutung, kann bei den meistens eingesetzten

Kapillarsäulen vernachlässigt werden.

A-Term

Konstanter Einfluss, abhängig von Material und Beschaffenheit der stat. Phase

Je grösser der Diffusionskoeffizient des Analyten in der mobilen Phase (D _M ), desto grösser B:

LC: Kleine Diffusionskoeffizienten (D _M < 10 ^‑5 cm ² s ^-1 ) in Flüssig- keiten, deshalb geringer Einfluss von B.

GC: Grosse Diffusionskoeffizienten

(DM ≈ 10 ‑ 1 cm2 s-1) in Gasen, deshalb starker Beitrag von B an der Peakverbreiterung.

B-Term: Longitudinaldiffusion

Verringerung der Effizienz aufgrund der Diffusion der Analyten in der mobilen Phase (nur der longitudinale Anteil hat einen Einfluss).

B ∝ D _M

B-Term = B x u è Hyperbel

Indirekte Proportionalität, da bei langer Aufenthaltszeit der Moleküle in der Säule die

Peakverbreiterung durch Diffusion grösser wird.

C-Term: Massentransport-Effekte

Verringerung der Effizienz aufgrund von Unterschieden in der Stofftransport- geschwindigkeit

C-Term = Cu è Gerade

Direkte Proportionalität, da bei geringerer Geschwindigkeit u mehr Zeit für den Ablauf der Stofftransportprozesse bzw. zur Gleichgewichtseinstellung zur Verfügung steht.

C u = C _S u + C _M u

CS, CM: Beiträge von stationärer und mobiler Phase LC: C _S spielt bei gepackten Säulen keine Rolle

GC: bei Kapillarsäulen sind C _S und C _M von Bedeutung C u ≈ C _M u C _M ∝ 1

D _M

C

∝ d

D

= Schichtdicke stat. Phase

Diffusionskoeffizient in stat. Phase C

∝ 1

D

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Van-Deemter-Gleichung

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Typische Verläufe für LC und GC

LC GC

A = const. A = 0

B ∝ D _M ^(D M < 10 ^{‑ 5} cm ² s ^-1 ) B ∝ D _M ^(D M ≈ 10 ^‑1 cm ² s ^-1 ) C u ≈ C _M u C _M ∝ 1

D _M ^C

^∝

d

D

C

∝ 1 D

schmales

Optimum

breites Optimum

Gase mit

grossem D _M

bevorzugt

(H ₂ , He)

Anzahl theoret. Böden N, Bodenhöhe H

Tab. 1: Typische Bodenzahlen N und Bodenhöhen H gängiger Säulen in der Gas- chromatographie (GC) und Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) sowie typische Säulenparameter.

Säulen t y p N (pro Säu l e ) H (mm )

GC

Kapillarsäulen (25 m)

0.1 mm Innendurchmesser 0.5 mm Innendurchmesser gepackte Säulen (1-3 m)

30’000-100’000 20’000-50’000 500-2’000

0.2-0.6 0.5-1.3 1 - 6 HPLC

gepackte Säulen (25 cm) 10 µm-Partikel

3 µm-Partikel

2’500-5’000 8’000-18’0 0 0

0.05-0.1

0.02-0. 0 5

Anzahl theoret. Böden N, Bodenhöhe H

Tab. 2: Optimale und in der Praxis eingesetzte Lineargeschwindigkeiten und Fluss- raten in der Gaschromatographie (GC) und Hochleistungs-Flüssigchromato- graphie (HPLC)

Technik / Säule Lineargeschwindigkeit [cm s

]

Flussrate (Volumenstrom) [mL min

]

Optimum In der Praxis Optimum In der Praxis GC

Kapillarsäule

(0.25 mm Innendurchmesser) gepackte Säule

(4 mm Innendurchmesser)

30-40 2-4

60-80 4-8

1-2 40-50

1-4

40-80 HPLC

gepackte Säule

(4.6 mm Innendurchmesser) 0.05-0.1 0.1-0.2 0.2-0.5 1-2

1. Abweichungen von der idealen Peakform (Abweichung vom Nernst-Gesetz)

2. Überlagerung von Peaks

3. Auflösung (=Trennung) zweier Peaks

Leichte Abweichungen von der

Nernst-Verteilung

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Abweichungen von der idealen Peakform

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Zeit t

Abweichungen von der idealen Peakform

Zeit t

In te nsi tä t I

T: Asymmetrie-Faktor oder Tailing-Faktor

(oft werden Asymmetrien bis T<1.2 bzw. T>0.8 toleriert)

Abweichungen von der idealen Peakform

Asymmetrische Peaks sind meist auf Überladungseffekte zurückzuführen.

Überladung der mobilen Phase:

Der Analyt kondensiert auf der stationären Phase und wird erst nach und nach von der mobilen Phase abtransportiert. Es kommt also in der Form zu einer

asymmetrischen Verteilung, dass ein grosser Anteil der Moleküle später als im Idealfall die Säule verlässt.

Überladung der stationären Phase:

Die Bindungsstellen auf der stationären Phase sind mit Analyten belegt.

Analytenmoleküle aus der mobilen Phase können nicht mehr binden und werden

schlechter retendiert. Ein wesentlicher Anteil der Analytenmoleküle verlässt die

Säule also früher als bei idealer Retention.

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Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

69

Nernst-Gesetz:

ist bei konstanter Temperatur eine Konstante.

Daraus folgt: c _S = K _C × c _M

Bei Abweichungen vom Nernst-Gesetz ist c _S = f(c _M ) keine lineare Funktion mehr bzw. K _C ist keine Konstante.

Retentionsfaktor:

Daraus folgt:

K _C = c _S c _M

k = t

− t

t

= t

′

t

= K

V

V

= K

β

′

t _R = t _M

β ^{K C bzw. t ′ R ∝ K C}

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Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

70

Tailing:

Bei hoher Konzentration:

K _C sinkt

Überladung der stationären Phase

Peak-Maximum verschiebt sich zu kleinerer t

Bei hoher Konzentration:

t _R sinkt

wegen

′

t _R = t _M

β ^{K C bzw. t ′ R ∝ K C}

Fronting:

Bei hoher Konzentration:

K _C steigt

Überladung der mobilen Phase

Peak-Maximum verschiebt sich zu höherer t

Bei hoher Konzentration:

t _R steigt

wegen

M C S

c

K = c = const. ?

Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

Beispiel: Fronting mit Verschiebung des Peakmaximums zu höherer t _R Peakformen Integrale

Peakformen und insbesondere Integrale zeigen:

Ein wesentlicher Anteil der Moleküle verlässt beim Frontig später die Säule als im Fall

des Gauss-Peaks è Überladung der mobilen Phase

Starke Abweichungen vom Nernst-Gesetz und Nicht-Gleichgewichtsbedingungen

•  In der Praxis sind stärkere Abweichungen vom Nernst-Gesetz möglich

•  In der Chromatographie wird praktisch nie der Endpunkt der Gleichgewichtseinstellung erreicht

Gründe, z.B.

- Langsame Gleichgewichtseinstellung z.B. wegen langsamer Stofftransportprozesse - Bedingungen ändern sich dauernd (Transport der mobilen Phase, defekte o. inhomogene stationäre Phase)

Wie sich Peakformen unter diesen Bedingungen ändern, lässt sich kaum vorhersagen. Asymmetrische Peaks sind aber auch hier eine Folge von Überladungseffekten.

Fragen: Was geschieht auf der Ebene der Moleküle?

Verlässt ein wesentlicher Anteil der Moleküle früher oder später die

Säule?

Abhilfe bei Fronting/Tailing

•  Asymmetrische Peaks sind meist eine Folge von Überladungseffekten.

•  Einschränkung sowohl von qualitativer als auch von quantitativer Analyse

Abhilfe:

Verringerung des Probenvolumens bzw. der Probenkonzentration (weniger Analytenmoleküle auf der Säule)

Erst wenn das keinen Effekt hat:

Änderung der betroffenen Phase (z.B. Wechsel des Eluenten, Wechsel der stationären Phase, andere Gradienten)

Wechsel von mobiler und insbesondere stationärer Phase sind aber mit

Zeitaufwand und Kosten verbunden.

Überlagerung von Peaks und

Koelution

Koelution

Zwei Analyten haben annähernd die gleiche Retentionszeit.

Ein für beide Substanzen sensitiver Detektor erfasst nicht die Einzelpeaks (gestrichelte Linien), sondern die

Summe aus beiden (durchgezogene Linie).

Abhilfe:

•  Optimieren der Trennbedingungen (Lineargeschwindigkeit, mobile Phase, stationäre

Phase, Temperatur, Gradienten)

•   Verwendung verschiedener Detektoren mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten für die beiden Substanzen (oder: verschiedene Wellenlängen bei spektroskop. Detektor)

•  MS-Detektion (jede Masse erzeugt ein eigenes Detektorsignal)

Fronting?

II) Auflösung und

Optimierung einer Trennung

Definition der Auflösung einer Trennung

R _S = t _{R 2} − t _R1 w _b1 + w _{b 2}

2

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

= 2 ( t _{R 2} − t _R1 )

w _b1 + w _{b 2} = Differenz der Retentionszeiten

Mittelwert der Basisbreiten

Auflösung R _S zweier benachbarter Peaks:

Auflösung

R _S < 0.75

Überlagerung bzw. Koelution

R _S > 0.75

Zwei Peaks erkennbar

R _S > 1.5

Grundlinien- getrennte

Peaks

Auflösung

R

= 2 ( t

− t

)

w

+ w

≈ t

− t

w

= t

− t

4 σ

Aus der Näherung kann man folgende Gleichung

herleiten:

R _S = α− 1 α

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟ k ₂ 1 + k ₂

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟ N 4

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

a Trennfaktor

k Retentionsfaktor

N Anzahl theoretischer Böden

a , k und N sind die “Schrauben”, an denen man zur Optimierung einer

Trennung drehen kann.

Herbstsemester 2015 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Badertscher | martin.badertscher@org.chem.ethz.ch

Auflösung

80

R _S = α− 1 α

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟ k ₂ 1 + k ₂

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟ N 4

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

a : Trennfaktor

k: Retentionsfaktor

N: Anzahl theoretischer Böden

k ∝ t _R

N ∝ 1 σ ²

α = t _R ′ ₂

′

t _R1

Auflösung _R

S = α − 1

⎛ α

⎝⎜ ⎞

⎠⎟

k 1 + k

⎛ ⎝⎜ ⎞

⎠⎟

N 4

⎛

⎝⎜

⎞

⎠⎟

k

k 1 + k

a N

α − 1 α

N 4

k ∝ K _C

k kann verändert werden, indem man K

ändert:

•   Temperatur

•  mobile Phase ändern

•  stationäre Phase ändern

N erhöhen:

längere Säule (aber:

Kosten, Analysezeit) Lineargeschwindigkeit optimieren (van-Deemter) N oft erst dann optimiert, wenn Optimieren von k und a nicht zum Ziel führt a von vielen Parametern abhängig:

•  Temperatur

•  mobile Phase

•  stationäre Phase

a in diesem Zusammenhang auch

“Selektivität” genannt

α = K _{C 2} K _C1

Oft aber können α, k und N nicht unabhängig voneinander geändert werden

Auflösung _{R S =} ^{α − 1}

⎛ α

⎝⎜ ⎞

⎠⎟

k 1 + k

⎛ ⎝⎜ ⎞

⎠⎟

N 4

⎛

⎝⎜

⎞

⎠⎟

k

k 1 + k

a N

α − 1 α

N 4

Erhöhung von k:

bessere Auflösung, aber höhere Retentionszeiten è  längere Analysenzeiten è  breitere Peaks

Erhöhung auf k > 10 bringt kaum Verbesserung

Erhöhung von N:

geringere Peakbreite (Standardabweichung s ₎ Wurzelfunktion,

d.h. viermal höheres N bewirkt nur Verdopplung der Auflösung

Erhöhung von a :

grösserer Abstand der Peaks im Chromatogramm

a knapp über 1: kleine Änderungen von a bewirken eine starke

Änderung der Auflösung

t _R ∝ k

Gradientenelution

Oft findet man mehrere ungenügend getrennte Peaks in einem Chromatogramm.

Optimieren eines Parameters kann gegenläufige Effekte auf verschiedene Peaks haben.

Abhilfe: Gradientenelution: stufenweise oder graduelle Änderung von Trennparametern

LC:

Lösungsmittel- gradient

Isokratische Trennung:

Lösungsmittelzusammensetzung konstant während der Trennung

Gradiententrennung:

Änderung des Eluenten

(z.B. Acetonitril-Wasser-Gemisch in verschiedenen Konzentrationen)

t t

Häufig: Erhöhung der Elutionskraft

während der Trennung

Optimierung einer Trennung

Ziel der Optimierung ist es,

eine effektive Peakauflösung (R _S > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit

zu erreichen

M R t t

k = ' /

H L N = /

längere Säule L geringeres [u]

höheres [u]

Wechsel Stationäre/Mobile

Phase

α = t

− t

t

− t

= t

′

′

t

= k

k

= K

K

Peakbreite

verändert sich nicht

Beschreibung der Effizienz der Chromatographie

= Van Deemter Gleichung

H à wie breit werden die Peaks?

U à proportional zur Retentionszeit

H = A + B

u + C u

A: Eddy-Diffusion

B: Longitudinaldiffusion C: Massentransport-Effekte

u: Lineare Flussgeschwindigkeit

Lineare Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase à

H

+ -

- -

+

H L N = /

+ Optimum

- Schlechter Bereich

Quantitative Analyse mittels Chromatographie Statistik und Kalibrierung

„Allein die Dosis macht das Gift“

Meist ist das „WIEVIEL?“ genauso wichtig wie das „WAS?“!

Quantitative Analyse

WAS? WIEVIEL?

Ein kleiner Ausflug in die Statistik

Statistische und systematische Fehler

Genauigkeit =

Präzision + Richtigkeit

Statistische und systematische Fehler

Schüsse 1–3

Schuss 4 nach Korrektur der Zieloptik

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Mittelwert und Standardabweichung

92

H äu fig ke it ei ne s Me ssw ert es

x

Mittelwert :

Standardabweichung s

relative Standardabweichung s _rel,x :

x

x = 1

n x _i

i = 1

∑ n

Messwerte x _i σ

= 1

n − 1 ( x

− x )

i=1

∑

σ _{rel, x} = σ _x

x

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Angabe eines Analysenergebnisses

93

H äu fig ke it ei ne s Me ssw ert es

x

Messwerte x _i In einem Analysenbericht muss ein Messergebnis

immer mit einer Fehlerangabe versehen werden.

Messergebnis mit absolutem Fehler:

± s x z.B. 12.3 µg/L ± 0.8 µg/L

Messergebnis mit relativem Fehler:

± x s _rel,x z.B. 12.3 µg/L ± 7%

x

Kalibrierung

Das Detektorsignal ist im Idealfall proportional zur Analytenmenge grössere Analytenmenge à mehr Peakfläche

Um das Detektorsignal in Mengenangaben umrechnen zu können (mg, mol, oder mg/ml….)

muss man eine Kalibrierung vornehmen

Kalibrierung

y-Achse: Detektorsignal z.B. in Volt oder Ampere (Peakfläche oder –höhe)

A _Analyt

x-Achse: Probenkonzentration z.B. in mg/l, µg/l, mol/l, ...

c _Analyt

A _Analyt = a + b c _Analyt

Empfindlichkeit und Nachweisgrenze

Was gilt noch als Peak?

Empfindlichkeit und Nachweisgrenze

Empfindlichkeit:

b = Steigung der Kalibriergeraden = Empfindlichkeit = Responsefaktor

Nachweisgrenze NG (limit of detection = LOD):

Minimale Konzentration deren Signal sich gerade noch also solches erkennen lässt bzw. welches sich signifikant vom Grundrauschen unterscheidet.

σ

= Standardabweichung des Blindwerts

3 σ -Kriterium: Die NG ist die Konzentration, bei der eine Signalintensität erhalten wird, die 3 σ

über dem Grundrauschen liegt.

Bestimmungsgrenze BG (limit of quantification = LOQ):

Minimale Konzentration, die sicher bestimmt (quantifiziert) werden kann.

Die BG lässt sich nach dem 6 σ -Kriterium ermitteln. Das Signal bei der BG liegt also 6 σ

über dem Grundrauschen.

Ab der BG überlappen die Gauss-Verteilungen von Signal und Rauschen nicht mehr.

A _Analyt = a + b c _Analyt

NG = ( A

+ 3 σ

) ^{− a}

b

BG = ( A

+ 6 σ

) ^{− a}

b

Linearität des Detektors

b = Steigung der Kalibriergeraden = Empfindlichkeit

„unterer“ Bereich: LOD / LOQ , das Signal lässt sich vom Grundrauschen des Detektors nicht mehr unterscheiden

„oberer“ Bereich: Durch Überladung des Detektors kommt es zu keiner

Signalzunahme mehr

A _Analyt = a + b c _Analyt

http://www.chemgapedia.de

Kalibrierung

•  Kalibrierung ohne internen Standard

•  Kalibrierung mit internem Standard

•  Kalibrierung mittels Standardaddition

Kalibrierung ohne internen Standard (extern)

A _Analyt = a + b c _Analyt c _Analyt = A _Analyt − a

b

Bevorzugt eingesetzt, wenn:

•  viele Proben mit ähnlicher Matrix gemessen werden sollen,

•  systematische Fehler wie Verflüchtigung, Filtrationsverluste, Eintrag, Volumenfehler etc. vernachlässigbar klein sind.

Limitierungen:

•  Matrixeffekte und systematische Fehler

Kalibrierung mit internem Standard

Bei der Kalibrierung werden Standardlösungen bekannter Analytkonzentration hergestellt, denen eine bekannte Konzentration an internem Standard zugesetzt wird.

Allen Proben wird dieselbe Menge eines internen Standards hinzugefügt

Wird eingesetzt, wenn systematische Fehler z.B. während der Probenaufarbeitung nicht zu vernachlässigen sind (z.B. Aufkonzentrieren der Probe durch Verdunstung des Lösungsmittels, Verluste an Analytenmolekülen bei der Filtration, ...).

interner

Standard

Kalibrierung mit internem Standard

Ein interner Standard soll:

•  dem Analyten ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften haben

•  nicht in der Probe vorkommen

•  neben dem Analyten in der Probe bestimmbar sein

Beispiel:

Analyt Interner Standard

Coffein Theophyllin

Ideal:

Stabilisotopen-markierte (z.B. D, ¹³ C) Analytenmoleküle als interner Standard und

MS-Detektion.

Kalibrierung mit internem Standard

A

A

= a + b c

c

c

= c

A

A

− a

⎛

⎝ ⎜

⎜

⎞

⎠ ⎟

⎟ b

Bei der eigentlichen Analyse wird der Probe vor der Aufarbeitung eine bekannte Konzentration an internem Standard zugesetzt und bei der Messung das Verhältnis der Peakflächen bestimmt.

Vorteil: Der interne Standard durchläuft die gleiche Probenaufarbeitung wie der Analyt è Systematische Fehler können ausgeglichen werden.

Limitierung: Der interne Standard hat nicht die exakt gleichen Eigenschaften wie der Analyt.

Kalibrierung mittels Standardaddition

Für die Kalibrierung werden keine Standardlösungen hergestellt, die Kalibrierung erfolgt in der Probe selbst.

1) Messung der Probe

2) Messung der Probe nach Zugabe bekannter Analytenkonzentration (Standard)

c _Analyt

c _Standard = A _Analyt

A _{Analyt + Standard} − A _Analyt

Kalibrierung mittels Standardaddition

105

A _{Analyt+ Standard} = a + b c _Standard

Zusammenfassung Kalibrierung:

•  Kalibrierung ohne internen Standard:

•  einfachstes Kalibrierverfahren

•  Fehler in der Aufarbeitung werden nicht berücksichtigt

•  Matrixeffekte werden nicht kompensiert

•  Kalibrierung mit internem Standard:

•  Kompensation systematischer Fehler

•  Interner Standard hat nicht exakt die gleichen Eigenschaften wie der Analyt

•  Matrixeffekte werden nicht kompensiert

•  Kalibrierung mittels Standardaddition

•  Kalibrierung in der Probe mit dem Analyten als „Standard“

•  Matrixeffekte können kompensiert werden