Dr. Martin Pabst

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Herbstsemester 2013

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid / Dr. Martin Pabst, martin.pabst@org.chem.ethz.ch

Laboratory of Organic Chemistry HCI D323 martin.pabst@org.chem.ethz.ch

http://www.analytik.ethz.ch/

Herbstsemester 2013 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid / Dr. Martin Pabst, martin.pabst@org.chem.ethz.ch

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Übersicht:

Chromatographie o Grundlagen

o Flüssigkeitschromatographie o Gaschromatographie

Elektrophorese Probenvorbereitung

(Übungsstunde(n) im Dezember)

Fragen jederzeit während oder nach der Vorlesung, bzw. auch per E-Mail!

Skript S1ff

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Chromatographie

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eine der wichtigsten Methoden der modernen Analytik)

A) Was ist Chromatographie?

B) Wozu?

Auftrennung von Substanzen (Analyten) durch deren Verteilung zwischen:

Mobiler und stationärer Phase

Trennung einzelner Substanzen aus komplexen Gemischen:

Identifizierung/Quantifizierung

Fraktionierung/Aufreinigung von Substanzen

Einfachstes Experiment: Papierchromatographie

„Anschauliches“ Beispiel einer Chromatographie (= Trennung von Analyten) (1952 Nobelpreis für deren Entwicklung und Beschreibung)

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Experiment: Papierchromatographie

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Probe: Filzschreiber

(schwarz, wasserlöslich)

Analyten: verschiedene

Farbstoffmoleküle Stationäre Phase: Papiertaschentuch,

Löschpapier

Mobile Phase: Ethanol (auch Aceton, Isopropanol...)

A) Transport der mobilen Phase nach oben aufgrund von Kapillarkräften

B) Unterschiedliche Verteilung der Substanzen zwischen fester und mobiler Phase (Adsorption) C) Wiederholtes Verteilen über gesamten

Laufbereich und folglich Trennung der Farbstoffe

Wie funktioniert die Papierchromatographie?

A B,C

t=0 t=5min Stat. Phase

Mobile Phase

Extrakt von Pflanzenfarbstoffen

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Der russische Botaniker Michail S.

Tswett führte 1903 erste Experi- mente zur Chromatographie von Pflanzenfarbstoffen durch.

Tswetts Experiment:

Probe: Extrakt von Pflanzenfarbstoffen in Lösungsmittel gelöst

Stationäre Phase: z.B. CaCO₃-Pulver Mobile Phase: ein Lösungsmittel

(Kohlenwasserstoff-Gemisch) Ergebnis: Verschiedene Farbstoffe

verlassen zeitlich getrennt unten die Säule.

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Extrakt von Pflanzenfarbstoffen

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Trennung von Pflanzenfarbstoffen mittels Säulenchromatographie

http://www.chemie.uni-regensburg.de/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-CC-d.htm

Gedankenexperiment

Transport von Geröll in einem Fluss

Transportgeschwindigkeit: Sand > Kies > Steine Fluss = “mobile Phase”

Untergrund = “stationäre Phase”

Stationäre Phase Mobile Phase

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Grundprinzip

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Flüssig-Flüssig-Extraktion: Trennung aufgrund der Verteilung von Analyten zwischen zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten!

Scheidetrichter. Extraktion wird in der Analytischen oder Organischen Chemie häufig bei der Probenvorbereitung eingesetzt.

A B C D

Grundprinzip

Beispiel: In einer wässrigen Probe befinden sich ein organischer Analyt (gut löslich in org. Lösungsmitteln) und Salze bzw. Ionen. Durch Extraktion soll der org.

Analyt von den Salzen abgetrennt werden, welche die Analyse stören würden.

(1) Ursprünglich befinden sich ein organischer Analyt und Ionen in der Probe

(2) Durch Extraktion soll der organische Analyt in ein org. Lösungsmittel überführt und so von den Ionen getrennt werden.

Es besteht ein Verteilungsgleichgewichtzwischen den beiden Phasen, welches im vorliegenden Fall auf der Seite der org. Phase liegt.

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Grundprinzip

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K

_C

= c

₁

c

₂

A

₁

A

₂

c = m

V = Masse des Analyten

Volumen, in dem er sich befindet

Nernstsches Verteilungsgesetz:

gilt für das Gleichgewicht

K_C... Verteilungskonstante

c₁, c₂... Konzentrationen in den Phasen 1 und 2 A₁, A₂... Analyt in Phasen 1 und 2

Im Gleichgewichtsfall ist also das Verhältnis der Analytenkonzentrationen in den beiden Phasen bei konstanter Temperatur eine Konstante.

Konzentration:

Einheiten: z.B. mg/l, µg/l, alternativ auch Stoffmengenkonz.: z.B. mol/l C1

C2

Extraktionseffizienz:

Würde der Analyt vollständig in einem Schritt in die organische Phase überführt, ergäbe sich E_org= 1 bzw. 100%.

Da aber ein Verteilungsgleichgewicht besteht, wird eine vollständige Extraktion in einem Schritt kaum erreicht.

Grundprinzip

E_org := m_org

m_org +m_W = Analytmasse in organischer Phase

gesamte Analytmasse = K_CV_org K_CV_org+V_W

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Beispiel 1:

100 ml wässrige Probe werden einmal mit 90 ml organischer Phase extrahiert. Der Verteilungskoeffizient des org. Analyten beträgt 50.

K_C= 50, d.h. c_org: c_W= 50:1

Volumen wässrige Phase V_W= 100 ml Volumen org. Phase V_org= 90 ml

Nach einmaliger Extraktion mit 90 ml Lösungsmittel befinden sich also 97.83% der Analytmasse in der organischen Phase.

Grundprinzip

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E

_org

: = m

_org

m

_org

+ m

_W

= K

_C

V

_org

K

_C

V

_org

+ V

_W

= 4500

4600 = 97.83%

Was ist effizienter?

Extraktion mit:

1x 90 ml?

…oder 3x 30ml?

Frage kann man mit Extraktionsgleichgewicht beantworten….

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Beispiel 2:

Was geschieht, wenn anstelle von einmaliger Extraktion mit 90 ml org.

Lösungsmittel die Probe dreimal mit 30 ml extrahiert wird? Alle anderen Angaben bleiben gleich.

1. Extraktionsschritt:

93.75% der Analytmasse landen in der organischen Phase, 6.25%

verbleiben in der wässrigen Phase.

Im nächsten Schritt werden wieder 93.75% der verbleibenden 6.25%, also 6.25% ×0.9375 = 5.86%, in die organische Phase überführt.

E_org 1. Schritt 93.75%

2. Schritt 99.61%

3. Schritt 99.98% Vergleich: 1 ××××90 ml: 97.83%

Grundprinzip

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E_org:= m_org

m_org+m_W = K_CV_org

K_CV_org+V_W =1500

1600= 93.75%

Je mehr Extraktionsschritte, desto höher die Effizienz.

Oder allgemein:

Je mehr Gleichgewichtseinstellungen, desto besser die Trennung.

(= wichtig für die Chromatographie)

1. Schritt 93.75%

2. Schritt 99.61%

3. Schritt 99.98% Vergleich: 1 × 90 ml: 97.83%

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Von der Extraktion zur Chromatographie

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aus: http://www.chem.uoa.gr/applets/AppletCraig/Appl_Craig2.html

Extraktionsapparatur

nach Craig (1943)

K_corg = c_org/c_w

K_corgA>K_corgB

Von der Extraktion zur Chromatographie

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Die Chromatographie basiert auf einer

kontinuierlichen Abfolge von Einstellungen des Verteilungsgleichgewichts von Analyten zwischen zwei

nicht mischbaren Phasen.

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Chromatographie

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Definition:

Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem die zu trennenden Substanzen zwischen einer mobilen und einer stationären Phase verteilt werden. Die beiden Phasen sind nicht mischbar und die Trennung beruht auf unterschiedlichen Verteilungskonstanten der verschiedenen Substanzen. Die Technik ist so konzipiert, dass sich das Verteilungsgleichgewicht in einer kontinuierlichen Abfolge mehrmals während des Trennprozesses einstellen kann.

„Chromatographie-Check“

Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein:

• Trenntechnik

•Zwei nicht mischbare Phasen

•Eine mobile und eine stationäre Phase

•Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen

•Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen

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Chromatographie - Säulenmodel

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Wichtige Begriffe:

(Werden im weiteren Verlauf der Vorlesung erklärt)

• Analyten

• Eluent

• Inertsubstanz

• Lineargeschwindigkeit

• Chromatogramm

• Peak

• Retentionszeit

• Peakfläche und Peakhöhe

• Kalibrierung