Analytische Chemie

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Herbstsemester 2013

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid, Dr. Martin Pabst martin.pabst@org.chem.ethz.ch

HCI D323

martin.pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/

Zusammenfassung der letzten Einheit:

HPLC

high performance liquid chromatography

Reversed Phase = RP (Umkehrphasen) Normal Phase = NP

(Normalphasen auch HILIC)

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Zusammenfassung der letzten Einheit:

NP- und RP-HPLC trennen die Moleküle nach ihrer Polarität Polarität (…entsteht durch die Ausbildung elektrischer Dipole.

Große Unterschiede in der Elektronegativität der Atome führt zu „ungleich verteilten“ Bindungselektronen)

O, N und Halogene werden negativ polarisiert C und H positiv polarisiert

Verbindungen der beiden Gruppen miteinander generiert mehr oder weniger polare Moleküle

Daraus leitet man die „Elutrope Reihe“ ab

Für die Trennung gilt dann: „Gleiches löst Gleiches“

Analytenmoleküle mit ähnlicher Polarität wie die stationäre Phase adsorbieren stark und werden nur von einer mobilen Phase mit hoher Elutionskraft

eluiert.

Die Elutionskraft einer mobilen Phase ist hoch, wenn seine Polarität ähnlich der der stationären Phase wird.

Fortsetzung: LC - Trennprinzipien

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Trennmethode Trennprinzip

Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC Verteilung (und Adsorption) (Dünnschichtchromatographie)

Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss

Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent) Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch

Bildung und Trennung von Diastereomeren

Skript S79ff

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Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

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Stationäre Phasen:

Meist Normalphasen(z.B. Kieselgel) oder Umkehrphasen(z.B. C₁₈) immobilisiert auf Trägermaterialien (z.B. Aluminiumfolie, Kunststofffolie oder Glasplatte)

Mobile Phasen (Laufmittel):

Lösungsmittel wie in der NP-HPLC und RP-HPLC

Räumliche Trennung der Analyten auf der DC-Platte Analyten eluieren hier nicht von der stationären Phase!

Vorteile: einfach, kostengünstig, schnell (mehrere Proben gleichzeitig)

Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

Durchführung

Auftragen der Proben (meist mit dünnen Kapillaren)

Entwicklung

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Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

7

R

_F

= s

_x

s

_f

Detektion:

•Visuell

nur bei VIS-Absorbern (Farbstoffe)

•Fluoreszenzdetektion

Anregung mittels UV-Lampe(254 oder 366 nm)

Fluoreszierende Analyten Autofluoreszenz UV-Absorber Schwächung der Fluoreszenz

eines Indikators in der Platte

•Chemische Anfärbemethoden

z.B. H₂SO₄+ Erhitzen Schwarze, verkohlte Analytflecken

z.B. KMnO₄+ Erhitzen Flecken bei

oxidierbarenAnalyten

Auswertung:

Verzögerungsfaktor oder R_F-Wert:

vgl. Retentionszeit LC bzw. GC !

Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

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Beispiel:

IOWA DIVISION OF CRIMINAL INVESTIGATION

CRIMINALISTICS LABORATORY / DRUG IDENTIFICATION SECTION

Test verdächtiger Pflanzenproben auf Tetrahydrocannabinol (THC)

Standard

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LC: Trennprinzipien

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Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC Verteilung (und Adsorption) (Dünnschichtchromatographie)

Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung

Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss

Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent) Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch

Bildung und Trennung von Diastereomeren

Ionenchromatographie (IC)

Ionenaustauschchromatographie

(ion exchange chromatography = IEC)

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Ionenchromatographie (IC)

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UV: 190 bis 400 nm VIS:400 (violett) bis

800 nm (rot)

+ +

+ + + +

+ +

+

+ + +

+ + - -

- - -

- -

-

- -

- - - -

- - Typische Anwendung: Trennung kleiner anorganischer Ionen

Stationäre Phase: Ionenaustauscher

(organisches Polymer mit geladenen Ankergruppen)

Kationentrennung: Kationenaustauscher Anionentrennung: Anionenaustauscher

Mobile Phase: Wässrige Salzlösung oder verd. Säure Detektor: oft Leitfähigkeitsdetektor

(aber auch alle anderen LC-Detektoren im Prinzip möglich)

Ionenchromatographie (IC)

12

800 nm (rot)

Funktionelle Gruppen Eigenschaften

Kationenaustauscher

(negativ geladen) –COOH, –OPO₃H₂ schwachsauer

–SO₃H starksauer

Anionenaustauscher

(positiv geladen) Primäre Amine –NH₂bzw. –NH₃⁺OH^– schwachbasisch Quarternäre Ammoniumsalze –NR₃⁺OH^– starkbasisch

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Ionenchromatographie (IC)

13

Harz–SO

3-

Eluent

⁺

+ Analyt

⁺

H a r z – S O

3-

Analyt

⁺

+ Eluent

⁺

Harz–NR

3+

Eluent

^-

+ Analyt

^-

H a r z – N R

3+

Analyt

^-

+ Eluent

^-

Mobile Phase:

Kationentrennung: verdünnte Säuren (Eluent⁺= H⁺)

Anionentrennung: z.B. NaHCO₃-Lösung (Eluent^–= HCO₃^–)

Prinzip: Gleichgewicht zwischen Analyt und Eluent. Menge und Stärke von Eluent entscheidet dann über Zeitpunkt der Elution!

Kationentrennung:

Anionentrennung:

Trägermaterial

Ionenchromatographie (IC)

Trennung gemäss: Bindungsstärke der Ionen an den Ionenaustauscher (Ladung, Grösse, Hydrathülle, Polarisierbarkeit)

Nicht immer leicht vorhersagbar, aber allgemein gilt:

Stärker geladene und kleine Ionen binden stärker!

Typische Elutionsreihenfolge (nach aufsteigender Retentionszeit geordnet):

Kationentrennung

Li⁺< H⁺< Na⁺< NH₄⁺ < K⁺ < Rb⁺ < Cs⁺< Mg²⁺< Zn²⁺< Ca²⁺<Ba²⁺

Anionentrennung

(8)

Ionenchromatographie (IC)

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Beispiele

Anionen

Kationen

Ionenchromatographie (IC)

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Detektion:

oft Leitfähigkeitsdetektor

universell, da alle Ionen die Leitfähigkeit beeinflussen/ändern

(im Prinzip kann man aber auch alle anderen LC-Detektoren einsetzen) Problem: hohe Grundleitfähigkeit des Eluenten

Einsatz von Suppressorsäulen

= entfernen von „Störionen“ vor dem Detektor

Trennsäule Suppressorsäule

Kationenanalyse Kationenaustauscher Anionenaustauscher Anionenanalyse Anionenaustauscher Kationenaustauscher

(9)

Ionenchromatographie (IC)

17

Prinzip der Suppressorsäulen

Anionentrennung(Beispiel: NaHCO₃-Eluent, Analyten: NaCl und NaBr, Trennung von Cl^–und Br^–)

Kationentrennung(Beispiel: HCl-Eluent, Analyten: NaBr und KBr, Trennung von Na⁺und K⁺)

Erniedrigung der Grundleitfähigkeit und Erhöhung der Leitfähigkeit bei Anwesenheit von Analyten

Harz–SO3H + Na⁺ + HCO3- H a r z – S O3Na + H2CO3

H a r z – S O3H + Na⁺ + Cl^- Harz–SO3Na + H⁺ + Cl^- H a r z – S O3H + Na⁺ + Br^- Harz–SO3Na + H⁺ + Br^-

Harz–NR3OH + H⁺ + Cl^- H a r z – N R3Cl + H2O H a r z – N R3OH + Na⁺ + Br^- Harz–NR3Br + Na⁺ + OH^- H a r z – N R3OH + K⁺ + Br^- Harz–NR3Br + K⁺ + OH^- Eluent:

Analyt 1:

Analyt 2:

Eluent:

Analyt 1:

Analyt 2:

LC: Trennprinzipien

Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC Verteilung (und Adsorption) (Dünnschichtchromatographie)

Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung

Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss

Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent)

Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch

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Grössenausschlusschromatographie (SEC)

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800 nm (rot)

Trennung von Molekülen nach ihrer Grösse

Stationäre Phase: poröse Materialien mit definierter Porengrösse (z.B. poröse Polymer– oder Kieselgelpartikel)

Mobile Phase: Lösungsmittel ähnlicher Polarität wie stationäre Phase (Nur Trennung nach Grösse, kein Einfluss der Polarität)

Unterteilung von SEC (size exclusion chromatography):

Gelpermeationschromatographie (GPC): für unpolare, hydrophobe Analyten (apolare stationäre Phase und apolares Lösungsmittel)

Gelfiltration: für polare, wasserlösliche Analyten (polare stationäre Phase, polares Lösungsmittel)

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

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Kleine Moleküle können in Poren eindringen und werden zurückgehalten.

Elutionsreihenfolge: grosse vor kleinen Molekülen

Zu grosse Moleküle:Ausschlussgrenze

Keine Diffusion in die Poren Keine Retention

Zu kleine Moleküle: Permeationsgrenze

Alle Moleküle können vollständig in die Poren eindringen Keine Retentionsunterschiede

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Grössenausschlusschromatographie (SEC)

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Molekülgrösse (logarithmische Achse)

Retentionsvolumen (ml) V₀ V₀+ V_i

Retentionsvolumen V_R

V’: Volumenstrom (ml/min)

V₀: freies Lösungsmittelvolumen V_i: Porenvolumen

K_C: Verteilungskonstante

Alle Analyten verlassen zwischen V₀und V₀+ V_idie Säule.

Ausschlussgrenze Permeationsgrenze

V

_R

= t

_R

⋅ ′ V

V

_R

= V

₀

+ K

_C

⋅ V

_i

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

Beispiele:

t_R ∝ 1

log Molekulargewicht

( )

Trennung einer homologen Reihe von Fettsäuren CH₃(CH₂)_nCOOH

Trennung des Proteins Ovalbumin

in seine

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Wann, welche Technik ?

(aus: Zusammenfassung S24)

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Worin lösen sich die Analyten?

Polar/apolar/ionisch?

Molekulargewicht?