DETEKTOREN Analytische Chemie

(1)

Herbstsemester 2013

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Pabst , martin.pabst@org.chem.ethz.ch

HCI D323

martin.pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/

DETEKTOREN

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Herbstsemester 2013 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid. Dr. Martin Pabst | martin.pabst@org.chem.ethz.ch 3

Flüssigchromatographie (LC) Detektoren

Trennsäule

Detektor

1. UV/VIS-Detektor (ultraviolet/visible)

Signal: Extinktion von Eluent + Analyt

Grundlinie: Extinktion des Eluenten(oft automatisch abgezogen)

Prinzip: Messung der optischen Transmission (wie bei einem UV/VIS-Spektrometer) UV: 190 bis 400 nm

VIS: 400 (violett) bis 800 nm (rot)

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Herbstsemester 2013 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid. Dr. Martin Pabst | martin.pabst@org.chem.ethz.ch

UV/VIS-Detektor

5

d

I

₀

Probe

I

Lichtintensitä

Abstand

Lichtintensität

= lg I

₀

I = ε λ ( ) ^{c d}

Lambert-Beersches Gesetz E

E .... Extinktion

ε

.... Extinktionskoeffizient c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

• Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion

• Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung (‘extra column effects’)

UV/VIS-Detektor

d

I

₀

Probe

I

Lichtintensitä

Abstand

Lichtintensität

• Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion

• Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung (‘extra column effects’)

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Varianten des UV/VIS-Detektor

7

• Festwellenlängengeräte

(z.B. Hg-Dampflampe mit λ = 254 nm)

• Geräte mit variabler Wellenlängeneinstellung

• Dioden array detektoren (DAD)

UV/VIS-Detektor

mit variabler Wellenlängeneinstellung

Lichtquellen: Deuteriumlampe (λ = 190-370 nm) und/oder Wolfram-Halogenlampe (λ = 370-800 nm)

Wellenlänge wählbar mittels eines Monochromators (z.B. Prisma + Spalt)

(5)

UV/VIS-Detektor

9

Diodenarraydetektor (DAD)

Polychromatische Anregung (Deuteriumlampe und/oder Wolfram-Halogenlampe) Zu jedem Zeitpunkt wird das ganze Spektrum von einem Diodenarray erfasst.

UV/VIS-Detektor

Der UV/VIS-Detektor erfasst nur Analyten, die ausreichend UV-Strahlung bzw.

sichtbares Licht (VIS) absorbieren.

Bei kleinen Wellenlängen um 200 nm absorbieren viele Substanzen, meist aber auch der Eluent. Das Absorbptionsmaximum des Analyten soll längerwellig als die Eluentabsorption sein.

UV/VIS-aktiv:

• (polyzyklische) Aromaten, konjugierte Doppelbindungssysteme

• Doppel- und Mehrfachbindungen

• Carbonylgruppen C=O

• –Br, –I

R R R

...

(6)

2. Brechungsindexdetektor

(refractive index detector = RID)

11

Signal: Brechungsindex-Änderung im Vergleich zum Eluenten Prinzip: Durchflussrefraktometer

Messung der Änderung von Brechungswinkeln

- Vielseitig, da praktisch jeder Analyt den Brechungsindex ändert, aber unspezifisch - Empfindlichkeitbei vielen Analyten um 2–3 Grössenordnungenschlechterals bei UV/VIS- Detektion. Nicht kompatibel mit Gradientenelution.

- Verwendung: Zuckerbestimmung in Wein

Verdampfungs-Lichtstreudetektor

(evaporative light scattering detector = ELSD)

Signal: Intensität des an festen

Analytpartikeln gestreuten Lichts

Prinzip: Eluent + Analyt werden fein vernebelt.

Lösungsmittel verdampft

Das an den festen Analytpartikeln gestreute Laserlicht wird von einem Photodetektor erfasst

Universeller Detektor

Siedepunkt Eluent < Siedepunkt Analyten Kompatibel mit Gradientenelution Inkompatibel mit salzhaltigen Eluenten

(7)

Fluoreszenz-Detektor

13

I

_f

∝ I

₀

⋅ Φ ⋅ ε λ (

_Anregung

) ^⋅ ^c ^⋅ ^d

I

_f

.... Fluoreszenzintensität

Φ

... Quantenausbeute

ε

.... Extinktionskoeffizient c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

Im Gegensatz zu UV/VIS:

Signal(Photodiode) = 0 bei c = 0 Signal ∝I₀

λEmission ≥ λ

Anregung

(Rotverschiebung)

Fluoreszenz-Detektor

Signal: Fluoreszenzintensität

Prinzip: Anregung mit einer definierten

Wellenlänge (Lichtfilter 1) Detektion meist im 90

°

- Winkel der rot verschobenen (Lichtfilter 2)

Fluoreszenzstrahlung

Sehr empfindlich

(Faktor 100–1000 besser als UV/VIS)

Nicht universell – abhängig von der chemischen Natur der Analyten

Nur fluoreszierende Analyten (z.B. polyzyklische Aromaten), alternativ: Derivatisierung

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3.Massendetektoren

http://www.dgms-online.de/dgms1/Wissen/Das-ist-MS/massenspektrometer.php?navid=43

Um Analyten mit Massenspektrometern zu detektieren, muss man die Analytenmoleküle vorher ionisieren! = IONENQUELLE

ESI = Electrospray ionization EI = Electron impact ionization CI = Chemical Ionisation

MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (Selten an LC gekoppelt)

ESI produziert

„Pseudo- Molekülionen“

[M+H]⁺

• Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt

• Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions- zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)

• Massenselektive Detektion

(sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)

• Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich

•ESI: v.a. für Moleküle mit protonierbaren oder deprotonierbaren funktionellen Gruppen

LC-ESI-MS

(ESI = electrospray ionization)

Ausgang der Trennsäule

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LC-APCI-MS

(APCI = atmospheric pressure chemical ionization)

17

• Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt

• Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions- zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)

• Massenselektive Detektion

(sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)

• Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich

•APCI: auch für kleine Moleküle ohne polare funktionelle Gruppen gut geeignet Ausgang der

Trennsäule

Vergleich: LC-Detektoren

(HPLC oder LC) Detektor Empfindlichkeit Linearbereich Analyten

UV/VIS + +++ UV- und VIS-Absorber

RID – – + universeller Detektor

ELSD o ++ universeller Detektor

Fluoreszenz +++ +++ Fluorophore

Elektrochemisch ++ / +++ ++ reduzier- und oxidierbare Analyten

MS + / +++ + / ++ universeller Detektor

+ massenselektive Detektion + Massenspektren zur

Strukturaufklärung

(10)

Derivatisierung

19

Derivatisierung: Wenn Analyten nicht oder mit ungenügender Empfindlichkeit durch einen bestimmten Detektor erfasst werden können.

Umsetzung z.B. mit Fluorophoren oder starken UV-Absorbern

N H3C CH3

S

O O

Cl

H₂N R

+ - HCl

N H3C CH3

S

O O

HN R

Fluoreszenz z.B. primäre Amine

5-(N,N- Dimethylamino)-

naphthalin- 1-sulfonylchlorid

= Dansylchlorid

Blau-blaugrün fluoreszierende

Sulfonamide

NO₂ NO2

NH NH2

R₁ R₂ O +

- H2O

NO₂ NO₂

NH N

R₂ R₁

UV/VIS

z.B. Aldehyde und Ketone

2,4-Dinitrophenyl- hydrazin

= DNPH

DNP-Hydrazone

_max≈ 360 nm

Beispiele:

HPLC-Trennungen

(11)

Anwendungsbeispiele HPLC

21

Trennung von Pestiziden

Säule: C18 (RP) Eluenten: Wasser –

Acetonitril 55%:45%

Flussrate: 1 mL/min Detektor UV  = 225 nm

1. Benfuresate 2. Dymron 3. Iprodione 4. Pyrazoxyfen 5. Tebufenozide

6. Iprodione Metabolite 7. Pencycuron

t (min) O

CH₃ H₃C O

S O

O H₃C

NH O N Cl

Anwendungsbeispiele HPLC

t

Trennung von polyzyklischen aromatischen

Kohlenwasserstoffen (PAHs)

Säule: C18 (RP) Eluenten: (A) Wasser

(B) Acetonitril Gradient:

0–10 min 48% A, 52% B 16 min 20% A, 80% B 21 min 0% A, 100% B 28 min 0% A, 100% B 30 min 48% A, 52% B 30 min stop

Flussrate: 1 ml/min Detektor UV  = 260 nm (Minuten)

(12)

Anwendungsbeispiele HPLC

23

HPLC-Trennung von

Serotonin-Wiederaufnahmehemmern (Antidepressiva)

Stationäre Phase: Cyanopropyl-Kieselgel Mobile Phase: Wasser (Phosphatpuffer,

pH 7) – Acetonitril 40%:60%

Flussrate: 1 ml/min

Detektor: UV,  = 230 nm

Uracil

Verunreinigung Fluvoxamin

Sertralin

Fluoxetin

NH NH O

O

CF3

N O

H2N O

HN H3C

H

H Cl

Cl

CF3

H O N

Schlechte Retention der teilweise protonierten Amine auf RP-18-Phase, gute Trennung auf Cyanopropyl-Phase

Vergleich: LC-Detektoren

(HPLC oder LC)

Detektor Empfindlichkeit Analyten

UV/VIS + UV- und VIS-Absorber

Fluoreszenz +++ Fluorophore

MS + / +++ universeller Detektor

massenselektive Detektion

MSn (Fragmentierung) zur Strukturaufklärung

Fluorescein

FITC fluorescin- Iso thiocyanate

Emission bei höherer Wellenlänge!

Derivatisierung: Markieren von Analyten mit UV- oder fluoreszenzaktiven Molekülen:

(13)

UV Detektor … Detektoren sind selektiv

25

HPLC-Analyse von Olivenölproben. UV-Detektion bei zwei Wellenlängen.

DAD = Diode Array Detektor

UV und RI Detektor

Untersuchung einer Bierprobe Kombination von 2 Detektoren

(1) Brechungsindexdetektor (RI):

universell: erfasst alle Analyten

(2) UV/VIS-Detektor (280 nm):

für einige Analyten empfindlicher als RI

Peak 9: 5-Hydroxymethylfurfural Peak 8: Ethanol

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Massendetektoren

http://www.dgms-online.de/dgms1/Wissen/Das-ist-MS/massenspektrometer.php?navid=43

Um Analyten mit Massenspektrometern analysieren zu können, muss man diese vorher ionisieren = IONENQUELLE

ESI = Electrospray ionization EI = Electron impakt ionization CI = Chemical Ionization

MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (selten mit Trenntechnik gekoppelt)

Massendetektoren „2 Spuren“

Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen

(CHO)

Säule: Porous Graphitized Carbon (PGC)

Eluenten: Wasser / Acetonitril Flussrate: 5 uL/min

Detektor ESI-MS 1. ATP (506) 2. ADP (426) 3. AMP (346) All (M-H)-

"Chromatogram"

TIC = total ion current

Massenspur

1 2 3

1 2

3

(15)

Massendetektoren

„Analyten getrennt betrachtbar“

29

Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen

(CHO)

Säule: PGC Eluenten: Wasser /

Acetonitril Flussrate: 5 µl/min

Detektor ESI-MS 1. ATP (506) 2. ADP (426) 3. AMP (346) All (M-H)-

Chromatogram

TIC = total ion current 1

2 3

1

2

3

SIM = single ion monitoring m/z = 506

m/z = 426

m/z = 346

Anwendungsbeispiele HPLC

HPLC-MS-Trennung von Triglyceriden A) Gesamtionenstrom

(total ion current = TIC) B) Single ion monitoring = SIM Masse 1

Masse 2

Masse 3

Masse 4 TIC

(16)

Anwendungsbeispiele HPLC

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Analyse der Probe ohne vorhergehende Trenntechnik oft auch bei MS nicht möglich.

Chromatographie trotz Massenselektiven Detektor meist notwendig/sinnvoll!

Zu viele Analyten mit den gleichen oder ähnlichen Massen (isobare Analyten)

Schlechte Ionisierung durch Hintergrundsubstanzen der Probe (Salze, kleine polare Analyten....)

Hunderte Analyten in einem kleinem Massenbereich

Identifizierung nicht mehr möglich!

Anwendungsbeispiele HPLC

m/z = 342.2 m/z = 400.1 m/z = 404.0 m/z = 384.1 m/z = 331.0 m/z = 332.1 m/z = 706.4 m/z = 657.4

HPLC-ESI-MS-Trennung von Mykotoxinen (Giftstoffe aus Schimmelpilzen)

Säule: C18 (RP)

Eluent: Wasser (+ NH₄OAc) + Acetonitril

Aflatoxin B₁

DETEKTOREN Analytische Chemie

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

DETEKTOREN

Flüssigchromatographie (LC) Detektoren

1. UV/VIS-Detektor (ultraviolet/visible)

UV/VIS-Detektor

d

I

I

= lg I

I = ε λ ( ) c d

Lambert-Beersches Gesetz E

E .... Extinktion

.... Extinktionskoeffizient c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

UV/VIS-Detektor

d

I

I

Varianten des UV/VIS-Detektor

• Festwellenlängengeräte

• Geräte mit variabler Wellenlängeneinstellung

• Dioden array detektoren (DAD)

UV/VIS-Detektor

UV/VIS-Detektor

UV/VIS-Detektor

2. Brechungsindexdetektor

(refractive index detector = RID)

Verdampfungs-Lichtstreudetektor

(evaporative light scattering detector = ELSD)

Fluoreszenz-Detektor

I

∝ I

⋅ Φ ⋅ ε λ (

) ⋅ c ⋅ d

I

.... Fluoreszenzintensität

... Quantenausbeute

.... Extinktionskoeffizient c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

(Rotverschiebung)

Fluoreszenz-Detektor

Wellenlänge (Lichtfilter 1) Detektion meist im 90

- Winkel der rot verschobenen (Lichtfilter 2)

Fluoreszenzstrahlung

3.Massendetektoren

LC-ESI-MS

(ESI = electrospray ionization)

LC-APCI-MS

(APCI = atmospheric pressure chemical ionization)

Vergleich: LC-Detektoren

Derivatisierung

Beispiele:

HPLC-Trennungen

Anwendungsbeispiele HPLC

Anwendungsbeispiele HPLC

Anwendungsbeispiele HPLC

Vergleich: LC-Detektoren

UV Detektor … Detektoren sind selektiv

UV und RI Detektor

Massendetektoren

Massendetektoren „2 Spuren“

Massendetektoren

Anwendungsbeispiele HPLC

Anwendungsbeispiele HPLC

Anwendungsbeispiele HPLC

I = ε λ ( ) ^{c d}

) ^⋅ ^c ^⋅ ^d