Analytische Chemie LC / HPLC

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Analytische Chemie

für Biologie Pharmazie Bewegungs- wissenschaften und Sport

Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren

LC / HPLC

LC / HPLC

High-Pressure-Liquid-Chromatography High-Performance-Liquid-Chromatography

High-Price-Liquid-Chromatography

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie

HPLC vs GC Apparatur Trennprinzip Mobile Phase

Säule und Stationäre Phase

Unterarten HPLC Detektoren

Dünnschichtchromatographie Wahl einer Methode

!

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Warum HPLC ?

•! GC: nur Trennung von Substanzen, die sich bis ca. 300°C unzersetzt verdampfen lassen

•! Sehr polare und thermisch labile Substanzen

•! Ionische Verbindungen, Biopolymere und Polymere

•! Selektivität hängt ... ab

!!

von der stationären Phase

!!

von der mobilen Phase (Polarität, Gradientselution)

•! Stofftransport in flüssiger Phase ist deutlich langsamer (kleinere Diffusionskoeffizienten), Hochdruck ist nötig

•! Analytische, Präparative und Produktive

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Apparatur

Schematisch HPLC

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300 – 400 bar!

LM 10 ml/min!

(5) Vorsäule/Trennsäule!

(1b) LM Aufteilungsventil!

He/Ar

(1a) LM Behälter!

(6) Detektor!

(4) Injektorventil!

(3) Filter!

(2) Pumpe!

Eluentvorrat (Entgaser, Aufteilungsvalve)!

Pumpe (reproduzierbar und konstant Druck)!

Injektor (bestimmte Menge zur Säule)!

Filter/Vorsäule (fein Partikel)! Säule !

Detektor!

Vor- und Nach- Derivatisierungsteile!

6-Wege-Ventile

Probenschleife!

zur Säule! zur Säule!

Probe ein!

Probe aus!

Eluens! Eluens!

Probe ein!

Probe aus!

Laden ! Injizieren!

HPLC Säule

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Physikalische Eigenschaften:!

•! Partikelgrösse, Form und Grössenverteilung

•! Porosität, Porengrösse, Oberfläche und Volumen

•! Stärke (mechanisch) gegen Druck und Lösungsmettel (Bruch und Deformation)

Stahlrohre porösen Partikeln (3-10 !m) HPLC Säule

L: 10-50 cm ID: 1-10 mm

SiO₂: ideale SP (NP) Al₂O₃, ZrO₂

Polymere: Copolymere von Styrol und Divinylbenzol

Trennprinzip

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Normalphasenchromatographie – Adsorption/Verteilung Umkehrphasenchromatographie – Verteilung/Adsorption

Grössenausschlusschromatographie – Molekülgrösse

Ionenaustauschenchromatographie – Ionische Wechselwirkung Affinitätschromatographie – Ligand-Bindungsaffinität

Komplexierungschromatographie – Metal-Ligand-Komplexierung Chiralchromatographie – Diastereomere-Bildung

Stationäre Phase Mobile Phase Elutionsreihenfolge

der Analyten Bezeichnung

polar apolar (z.B. Hexan) apolar vor polar Normalphasen (NP) apolar Polar (z.B. Wasser) polar vor apolar Umkehrphasen

(RP: reversed-phase)

!

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Klassische Theorie

!

K =

[ ]

[ ]

!

v = L t

!

u = L t

!

k = K V

V

!

k = t

" t

t

= t

t

!

" = K

K

!

" = k

k

!

" = (t

)

(t

)

!

N =N_eff " k+1 k

#

$ % &

' (

2

= t_R^'

)

#

$ % &

' (

2

" k+1 k

#

$ % &

' (

! 2

N= L H = t_R²

"² =16 t_R w

#

$ % &

' (

2

!

t

= t

" t

Trennfaktor / Selektivätsfaktor Retentionsfaktor / Kapazitätsfaktor Retentionszeit / Geschwindigkeit Verteilungskoeffizient

Auflösung

!

H= L 16

w t_R

"

# $ %

&

'

2

Bodenzahl und Bodenhöhe

!

R = t

" t

w

+ w

2

= 2(t

" t

)

w

+ w

!

R = " # 1

"

$

% & ' ( ) * k

1 + k

* N 4

normierte Signalhöhe h

t_M

t_A t_B

w_A w_B Zeit

B A

Van Deemter Gleichung

Minimaler H-Wert!

Theoretische Bodenhöhe H!

!

H = 2 " # d

+ 2k

# D

u + u # f (d

, d

)

D

+ q # k # d

(1+ k)

D

$

% & '

( )

optimale u! Minimum H!

A! B! C!

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Eddy Diffusion

A Term: die eddy Diffusion

(diese tritt nur bei gepackten Säulen auf)

! H = A + B

u + C " u

Wegen Umwanderung der Molekül durch die Partikel des Packungs-materials legen die Analyten unterschiedliche Weglängen zurück.

Ausmass Homogenität

Dichte

!

A = 2 " # " d

! Packungsfaktor

1 2

1 2

! "

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Longitudinale Diffusion

B Term: die longitudinale Diffusion

!

H = A + B

u + C " u

!

B

u = 2k

D

u

D_M: Diffusionskoeffizienten in der mobilen Phase, k_D: Labyrinthfaktor, constant

In GC: B Term => einen entscheidenden Beitrag zu Peakverbreiterung leistet, insbesondere bei niedrigen

u

In der LC kann der B-Term wegen der sehr

kleinen D

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Massentransport-Effekte

C Term: die Masstransfer zwischen den zwei Phasen

!

C_M "u= f(d_p²,d_c²)u D_M

In der mobilen Phase In HPLC, klein D_M =>

grosse C_M

!

C " u = C

" u + C

" u

Gleichgewichtseinstellung zwischen S/M Phasen benötigt Zeit => da die mobile Phase aber in Bewegung ist, kann sich der Gleichgewichtszustand nicht vollständig einstellen => Zunahme der Höhe eines theoretischen Boden (HETP)

!

H = A + B

u + C " u

!

C

" u = qk " d

" u

(1 + k)

" D

!

C

" u = 2t

" k " u (1 + k)

Gleichgewichts einstellung

In flüssigstationären Phase Filmdicke d_f und D_S

In feststationären Phase

sehr klein Desorptions-

geschwindigkeit t_d "0 HETP

u

Mobile Phase

Reinheit, Inert, Preis

Korrosionsbeständigkeit, Toxizität

UV–Durchlässigkeit, Brechungsindex Mischbarkeit

Haltbarkeit

!!

Elutionsstärke

!!

Selektivität Polarität, Viskosität!

Reihenfolge der Lösungsmittel nach zunehmender Polarität

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n-Heptan, n-Hexan, Cyclohexan, Isooctan Tetrachlorkohlenstoff

Toluen, Chlorbenzen, Benzen

Diethylether, Chloroform, Dichlormethan 1-Butanol, Pyridin, Acetonitril, 2-Propanol Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Aceton Ethanol, Methanol, Dimethylformamid Wasser, wässrige Pufferlösungen

Polarität von Molekülen

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Eluent–Gradient

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Gradiententrennung: Eluent wird während des Laufs verändert.

Isokratische Trennung: Eluent bleibt während des Laufs unverändert.

Stationäre Phase

Original SiO

, Al

O

: Polare OH-Gruppe

Si OH

Si R₂

Cl R

R₁

Modifikation:

Si R₁

R₂ R Si

O

Si

OH HN[Si(CH₃)₃]₂

Entcapping:

Si(CH₃)₃ Si

O

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Normalphase (NP)

O Si R₁

R₂

CN

O Si R₁

R₂

NH₂

O Si R₁

R₂

O OH

OH

Cyano (C₃–CN)

Modifizierte polare NP:

Amino (C₃–NH₂)

Diol (C₃–OCH₂CH(OH)CH₂(OH)

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Modifizierte NP-Säule

Nonpolare Mobile Phase

z.B., Kohlenwasserstoff

Hydrophile Eigenschaft

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Umkehrphase (RP)

O Si R₁

R₂ R

R = C₁ – C₁₈

Straight-chain hydrocarbons (C₁₈, C₁₂, C₈ C₆, C₄, C₃, C₂, C₁)!

Cyclohexyl, Phenyl, Alkylphenyl!

O Si R₁

R₂ O Si

R₁

R₂

O Si R₁

R₂

Unpolare Modifikation durch Kohlenwasserstoffketten

Umkehrphase (Reversed Phase, RP)

Si CH₃

CH₃ (CH₂)₁₇

R = CH₃

Hydrophobe Eigenschaft

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Spezialphase: IC-Harze

Kationentrennung Anionentrennung

Sulfonsäuren: –SO₃^– H⁺ Quartäre Amine: –N(CH₃)₃⁺ OH^– Carbonsäuren: -CO₂^– H⁺ Primäre Amine: –NH₃⁺ OH^–

!

Alkylketten + Endgruppe Austauschharze:

Si OH

Si R₂

Cl R

R₁

Modifikation:

Si R₁

R₂ R Si

O

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Detektoren für HPLC

•! Brechungsindex-Detektor (RID)

•! UV/Vis-Absorption-Detektor (UVD)

•! Lichtstreudetektor (ELSD)

•! Fluoreszenzdetektor

•! Elektrische Leitfähigkeitsdetektor (für Ionen)

•! Massenspektrometrie (MS)

•! IR, NMR (stop-flow technique)

"!

Nachweisgrenze

"!

Linearer Messbereich

"! Kompatibilität mit der mobilen Phase

"!

Selektivität

"!

Flexibilität, Robustheit, Preis

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UV/vis-Detektor

Variiert # oder PDA (Photodiodenarray) um ein ganzes UV- Spektrum aufzu- nehmen

Br, I, S Carbonyl Konjugierte Aromatische

Fluoreszenzdetekor

Nachweisgrenze +++

Linearbereich +++

Nur einsetzbar für:

•! Nativ

fluoreszierenden Substanzen

•! Nach derivati- sierung nicht- fluoreszierender Analyten mit einem Fluoreszenz-

marker

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Massenspektrometrische Detektor

Interface – LC und MS!

Senkrecht!

Offline!

räumlich

zeitlich

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Brechungsindex-Detektor

refractive index detectors, RID

Universell, aber geringe Empfindlichkeit wegen kleiner RID-Unterschied von LM und Analytenmolekülen

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Verdampfungs-Lichtstreudetektor ELSD

EBULIZE ELUENT AND SELECT SMALL

DROPLETS TO MINIMIZE BACKGROUND NOISE

EVAPORATE AT LOW TEMPERATURE

DETECT LIGHT SCATTERING

Universell einsetzbarer Detektor, wenn"

•! Analytmolekül keine UV-Absorbtion "

•! Mit einem Brechungsindex-Detektor nicht detektierbar"

•! Eine Gradientenelution anstatt

isokratischen Laufmittel Partikelgrösse und -anzahl"

Partikelgrösse und -anzahl!

Charakteristika der Detektoren

Detektor Nachweisgrenze Linearer Bereich

Spezielle Eigenschaften des Analytmoleküls oder Bulk-Eigenschaften von Analytmolekül und Lösungsmittel: Nachweisgrenze, Linearer Messbereich, Kompatibität mit MP, Selektivität, Flexibilität und Robustheit, Preis.!

UV/Vis 10

g 10

Fluoreszenz 10

g 10

Leitfähigkeit 10

g.mL

10

MS 10

– 10

g 10

AAS 10

– 10

g 10

ICP-MS 10

– 10

g 10

HPLC Trennprinzipien und Unterarten

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Normalphasenchromatographie – Adsorption/Verteilung Umkehrphasenchromatographie – Verteilung/Adsorption

Grössenausschlusschromatographie – Molekülgrösse

Ionenaustauschenchromatographie – Ionische Wechselwirkung Affinitätschromatographie – Ligand-Bindungsaffinität

Komplexierungschromatographie – Metal-Ligand-Komplexierung Chiralchromatographie – Diastereomere-Bildung

Stationäre Phase Mobile Phase Elutionsreihenfolge der Analyten

Bezeichnung

polar apolar (z.B. Hexan) apolar vor polar Normalphasen (NP) apolar Polar (z.B. Wasser) polar vor apolar Umkehrphasen

(RP: reversed-phase)

!

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Adsorptionschromatographie

Elutrope Reihe:

Hexan < Cyclohexan < Toluol <Dichlormethan

< Tetrahydrofuran < Acetonitril < Ethanol <

Methanol < Wasser

Probenmoleküle Reihenfolge:

Fluorierte, gesättigte Kohlenwasserstoffe <

gesättigte Kohlenwasserstoffe

< Aromaten < halogenierte Verbindungen

< Äther < Nitrile < Nitroverbindung < Ester

< Ketone < Aldehyde < primäre Amine

< Amide < Phenole < Carbonsäuren

Präparative Trennung im Labor

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Verteilungschromatographie

Flüssige stationäre Phase

Nur chemisch-verbundene flüssige Filme

Wechselwirkungsmechanismus

schwach

stark schwach

stark

Hydrophob Hydrophil Dipol-Dipol

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Trennung bei NP/RP Säulen

Unpolare Analyten erst eluiert Polare Analyten erst eluiert

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Ionenchromatographie (IC)

"! Ionenaustauschchromatographie (Ion Exchange Chromatography)

"! Ionenpaarchromatographie (Ion Pair Chromatography)

"! Ionenausschlusschromatographie (Ion Exclusion Chromatography)

Schnelligkeit, Empfindigkeit, Selektiivität, und Simultanität

Organische Polymere als Trägermaterial, hohen pH-Stabilität; frei vom ionische Verunreinigungen aus Edelstahl und korrosive

Elutionsmittel zu vermeiden

Detektor – Leitfähigkeitsdetektor häufig, aber alle andere Detektoren auch einsetzen können

Suppressor: Reduktion der Grundleitfähigkeit auf minimalen Wert und Erhöhung des Signal/Untergrund Verhältnisse

Mobile Phase: Wasser oder Puffer (mit pH)

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Ionenaustauschchromatographie (IC)

Stationäre Phase mit funktionellen Gruppen

•! SO₃^–H⁺ (Sulfonsäure): stark saurer Kationenaustauscher, pH 2 – 14

•! COO^–H⁺ (Carbonsäure): schwach saurer Kationenaustauscher, pH 8 – 14

•! NR₃⁺OH^– (quaternäres Amin): stark basischer Anionenaustauscher, pH 0 – 10

•! NR₂ (tertiäres Amin): schwach basischer Anionenaustauscher, nur bei niedrigem, pH 0 – 6.

Ionenaustauschschromatographie

Beispiel stark saurer Kation- enaustauscher:

Harz-SO₃H + M⁺(aq) " Harz- SO₃M + H⁺(aq)

Der Selektivitätskoeffizient S für den Austausch zweier verschiedener Metallionen ist gegeben durch den Quotienten der entsprechend- en Gleichgewichtskonstanten K:

S(M₁/M₂) = K(M₁)/K(M₂) More highly charged

molecules are more tightly bound to the resin, and so travel slowly and are eluted later.

Moderately charged molecules equilibrating between the resin and the moving buffer more readily.

Less charged molecules bind less strongly to the resin, equilibrate with the moving buffer more readily, and so travel rapidly and are eluted faster.

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Elutionsreihenfolge

Elutionsreihenfolge für Kationen:

Ba²⁺ < Ca²⁺ < Zn²⁺ < Mg²⁺ < Cs⁺ < Rb⁺ < K⁺ < NH₄⁺ < Na⁺ < H⁺ < Li⁺

Elutionsreihenfolge für Anionen:

Citrat (COO

)

< Sulfat < Oxalat (COO

)

< Iodid < Nitrat (NO

) <

Phosphat < Bromid < Nitrit (NO

) < Chlorid <Acetat < Hydroxid

MP: Wasser, Puffer (gewisser pH-Werte einstellen) Leitfähigkeitsdetektor mit Supressionsäulen

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Leitfähigkeitsdetektor

•! Universell für Ionenchromatographie

•! Grundleitfähigkeit des Eluenten wird durch Suppressortechnik erniederigt, um die Nachweisgrenzen zu senken.

!

" = "

# $ % C

Harz-NR₃OH + H⁺ + Cl^– ––> Harz-Cl + H₂O Harz-SO₃H + Na⁺ + HCO₃^– ––> Harz-Na + H₂CO₃

Für Kationenanalytik, Suppressorsäule mit OH^– beladen : Für Aionenanalytik, Suppressorsäule mit Protonen beladen:

Harz-SO₃H + Na⁺ + Cl^– ––> Harz-Na + H⁺+ Cl^– Harz-SO₃H + Na⁺ + Br^– ––> Harz-Na + H⁺+ Br^–

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Suppressor

Suppressor (Kation-Typ)

Harz-SO₃H + Na⁺ + HCO₃^– ––> Harz-Na + H₂CO₃ Harz-SO₃H + Na⁺ + Cl^– ––> Harz-Na + H⁺ + Cl^– Harz-SO₃H + Na⁺ + Br^– ––> Harz-Na + H⁺ + Br^– Grundleitigkeit zu erniedrigen

Analyt-signal zu verstärken

# (H⁺) = 350

# (Na⁺) = 50 Beispiel von Cl^– and Br^–

NaHCO₃^– als Eluent

Gelpermeationschromatographie (GPC)

Grössenausschluss-Chromatographie/Size Exclusion Chromatography

Mechanismus: Grösse / Molekularer Radius

SP:

5 – 100,000 nm Ausschluss-Limit Eindringen-Limit Geeignet für

10% Unterschied in MW

Kein Wechselwirkung

Biopolymer, Polymer

Organische Moleküle

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Größenausschlusschromatographie

!

t

" 1 log

MW

CH

(CH

)

COOH

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Dünnschichtchromatographie (HPTLC)

DC-laufmitteltest

Wahl der DC Platte

Probeauftragen Laufmitteltest

Entwicklung Detektion

Normal Silica / Alumina TLC, HPTLC plates C 18-50 (50% silanization) and C–18-100 (100% silanization) with fluorescent indicator

Entwicklung der DC

Laufmittel

Wahl des Laufmittels

(Rein oder Gemisch)

Entwicklung

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Selektivität und Trennleistung

!

R

= S

S

Auswertung