Tierärztliche Hochschule Hannover
Stabilität von Vitamin E (α-Tocotrienol, α- Tocopherol, γ-Tocotrienol und γ-Tocopherol) in
Rohwürsten und Pökellake: Einfluss von Zusatzstoffen und Lagerung
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Eva-Maria Gerling
Steinfurt
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Waldemar Ternes Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik
Abteilung Chemische Analytik
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Waldemar Ternes
2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Bernhard Nowak
Tag der mündlichen Prüfung: 13.05.2015
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Fritz-Ahrberg-Stiftung (Hannover) gefördert
Meiner Familie
Teile dieser Arbeit wurden in der internationalen Fachzeitschrift
„Meat Science“ veröffentlicht.
Gerling, E.-M., Ternes, W. (2014)
Stability of α-tocotrienol and α-tocopherol in salami-type sausages and curing brine depending on nitrite and pH.
Meat Science, 98(4), 657-664 DOI: 10.1016/j.meatsci.2014.06.013 Abstract:
We studied the stability of the valuable vitamer nutrients α-tocotrienol and α- tocopherol and options for their protection in salami-type sausages (blended with α- tocotrienol-rich barley oil) and curing brine. Four different sausage formulations were produced containing nitrite curing salt; nitrite curing salt and ascorbic acid (300 mg/kg); nitrite curing salt and carnosic acid (45 mg/kg); or sodium chloride. Initial vitamer contents (100 mg/kg) did not decrease significantly during ripening and decreased only slightly during storage. Ascorbic acid and carnosic acid were found to be effective in preserving the vitamers in fresh sausages. Freeze-drying of sausages resulted in a significant loss of vitamers (97 %), particularly after 14-day storage at room temperature, even in the presence of shielding gases. The vitamer content in the curing brine decreased with decreasing pH in the presence of nitrite. A nitrite concentration of 136 mg/L at pH 4 resulted in significant loss (90 %) of the vitamers.
Sufficient stability of the vitamers in salami-type sausage and curing brine can be achieved by processing, formulation, and storage conditions.
Teile dieser Arbeit wurden bereits als Poster präsentiert:
Gerling, E.-M., Ternes, W.
Stabilität von α-Tocotrienol (Vitamin E) in Rohwürsten und Pökellake
In: Abstracts der 53. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene in Garmisch-Partenkirchen (2012)
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 1
2 Literaturübersicht... 6
2.1 Vitamin E... 6
2.1.1 Definition und Struktur... 6
2.1.2 Eigenschaften von Vitamin E... 7
2.1.3 Vorkommen von Vitamin E... 9
2.1.4 Einsatz von Vitamin E in Fleischprodukten... 11
2.2 Gersten-Biertreber... 13
2.3 Rohwurst... 14
2.3.1 Definition... 14
2.3.2 Physio-chemische Vorgänge in der Rohwurst... 15
2.3.2.1 Einfluss von Nitrit (NO2- )... 16
2.4 Pökellake... 18
2.4.1 Definition... 18
2.4.2 Physio-chemische Vorgänge in der Pökellake... 19
2.4.2.1 Einfluss von Nitrit... 20
2.5 Gefriertrocknung... 20
2.6 Schutzmöglichkeiten für α-Tocotrienol... 20
2.6.1 Matrix / Milieu... 21
2.6.2 Antioxidantien zum Schutz von Vitamin E... 22
2.6.2.1 Ascorbinsäure... 22
2.6.2.2 Carnosolsäure... 24
3 Material und Methode... 25
3.1 Chemikalien... 25
3.2 Geräte... 25
3.3 Probenherstellung... 25
3.3.1 Gewinnung des Biertreber-Extraktes... 25
3.3.2 Herstellung der Biertreber-Extrakt-Emulsion... 26
3.3.3 Herstellung der Wurstproben... 27
3.3.3.1 Rohwurstherstellung... 27
3.3.3.2 Reifung... 28
3.3.3.3 Probenentnahme... 28
3.3.3.4 Gefriertrocknung... 29
3.3.4 Herstellung der Pökellaken... 29
3.3.4.1 Probenentnahme... 30
3.3.5 Trockenmassebestimmung... 30
3.6 Bestimmung der Tocochromanole mittels HPLC... 31
3.6.1 Probenaufbereitung und Tocochromanol-Extraktion... 31
3.6.1.1 Vorbereitung der verwendeten Chemikalien... 31
3.6.1.2 Durchführung bei den Fleischproben... 31
3.6.1.3 Durchführung bei den Lakeproben... 33
3.6.2 HPLC-System... 34
3.6.3 Kalibrierung, Wiederfindungsrate und Bestimmungsgrenze... 36
3.6.3.1 Kalibrierung... 36
3.6.3.2 Wiederfindungsrate... 37
3.6.3.3 Bestimmungsgrenze... 38
3.6.4 Probenmessung und Berechnung... 38
3.7 Bestimmung möglicher Oxidationsprodukte mittels HPLC... 39
3.7.1 Probenaufbereitung... 39
3.7.2 HPLC-System... 39
3.7.3 SPE... 40
3.7.4 Wiederfindung... 40
3.8 Identifizierung der Fettsäuren/ Fettsäurenethylester mittels Gaschromatographie - Massenspektrometrie... 41
3.8.1 Probenaufbereitung... 41
3.8.2 Gaschromatograph-System (dem MS vorgeschaltet)... 42
3.8.3 Flüssigchromatographie-Massenspektrometer-System (LC-MS)... 43
3.8.4 Gaschromatographische Untersuchung der Fettsäurezusammensetzung in den Rohwürsten... 44
3.9 Bestimmung der Ascorbinsäuegehalte mittels HPLC... 44
3.9.1 Probenaufbereitung und Ascorbinsäure-Extraktion... 44
3.9.2 HPLC-System... 45
3.9.3 Kalibrierung... 45
3.9.4 Probenmessung und Berechnung... 46
3.10 Bestimmung der Carnosolsäuregehalte mittels HPLC... 46
3.10.1 Probenaufbereitung und Carnosolsäure-Extraktion... 46
3.10.2 HPLC-System... 47
3.10.3 Kalibrierung... 48
3.10.4 Probenmessung und Berechnung... 48
3.11 Enzymatische Bestimmung von Nitrit und Nitrat mittels UV-Spektrometrie... 49
3.11.1 Probenaufbereitung und enzymatische Umsetzung... 49
3.11.2 UV-Spektrometer... 51
3.11.3 Kalibrierung... 51
3.11.4 Probenmessung und Berechnung... 52
3.12 Statistische Auswertung... 53
4 Ergebnisse und Diskussion... 54
4.1 Gehalte von α-Tocotrienol, α-Tocopherol γ-Tocotrienol und γ-Tocopherol im Laufe der Reifung und Lagerung... 54
4.2 Gehalte von α-Tocotrienol und α-Tocopherol in den gefriergetrockneten Rohwürsten... 59
4.3 Stabilität der Tocochromanole in verschiedenen Pökellake-Rezepturen... 67
4.3.1 Pökellake mit Ascorbinsäurezusatz... 67
4.3.2 Tocochromanolgehalte bei verschiedenen pH-Werten der Pökellake... 69
4.3.3 Tocochromanolgehalte bei Lagerung und Fleischeinlage... 71
4.4 Tocotrienol-Oxidationsprodukte in der Rohwurst... 73
4.4.1 Identifizierung des „Aldehyd-verdächtigen-Peaks“ als Fettsäureethylester... 76
4.5 Abbauverhalten der Ascorbinsäure in den Rohwürsten... 81
4.6 Abbauverhalten der Carnosolsäure in den Rohwürsten... 82
4.7 Nitrit- und Nitrat-Gehalte der Rohwürste... 84
5 Zusammenfassung... 88
6 Summary... 91
7 Literaturverzeichnis... 94
8 Anhang... 105
8.1 Chemikalien- und Geräteliste... 105
8.2 Abbildungsverzeichnis... 110
8.3 Tabellenverzeichnis... 113
8.4 Abkürzungsverzeichnis... 114
8.5 Glossar... 116
8.6 Sieb- und Extraktionsausbeute des Biertrebers... 117
8.7 Reinheit (in %) der Standardlösungen... 118
8.8 Standardaddition am Beispiel von α-Tocopherol bei der Rohwurst... 118
8.9 Chromatogramm zur Bestimmung des Signal/Rausch-Verhältnisses (S/N) zu Ermittlung der Bestimmungsgrenze von α-Tocopherol... 119
8.10 Rohwurstreifungsprogramm der Reifungskammer... 120
8.11 Trockenmassebestimmung der Rohwürste während der Reifung und Lagerung... 121
8.12 Temperaturgradientenprogramm der Gefriertrocknung... 122
8.13 Beispielchromatogramm einer Carnosolsäuremessung... 122
8.14 Tabellen mit den Messwerten der Tocochromanolmessungen (Rohwurst und Pökellake)... 123
8.15 Massenspektren aus der Bibliothek des MS... 127
8.16 Danksagung... 131
1 1 Einleitung
Wie der Name schon andeutet, ist Vitamin E eine wichtige organische Verbindung für die Vitalfunktionen bei Mensch und Tier, die über die Nahrung aufgenommen werden muss, da nur Pflanzen in der Lage sind Vitamin E zu synthetisieren (Kamal-Eldin &
Appelqvist, 1996). Vitamin E kann in zwei Klassen, mit insgesamt acht Tocochromanolen eingeteilt werden: die Tocopherole (α-, β-, γ-, und δ-Tocopherol) und die Tocotrienole (α-, β-, γ-, und δ-Tocotrienol). α-Tocotrienol und das besser bekannte α-Tocopherol unterscheiden sich durch drei Doppelbindungen an der Seitenkette der Tocotrienole, was auch für die anderen Vitamin E-Formen gilt. Die bisher meistgenutzte Tocotrienol-Quelle ist das Palmöl, wobei auch Gerstenöl und insbesondere das Öl aus dem günstigen Nebenprodukt Biertreber, besonders reich an α-Tocotrineol sind (Bohnsack et al., 2011).
Vitamin E hat einen hervorragenden antioxidativen Effekt und wird unter anderem deshalb auch bei der Stabilisierung von Fetten eingesetzt (Al-Saqer et al., 2004;
Seppanen et al., 2010). Verschiedene Studien zeigten, dass die meist ignorierten Tocotrienole antiproliferative, antiinflammatorische, antikanzerogene und Cholesterol-Biosynthese hemmende Wirkungen haben, die so nicht von den Tocopherolen erreicht werden können (Aggarwal et al., 2010). So haben zum Beispeil Tocotrienole schon einen Cholesterinspiegel senkenden Effekt bei mikromolaren Konzentrationen (Qureshi et al., 2002). Zusätzlich gibt es einige Tierstudien, die berichten, dass besonders das α-Tocotrienol eine neuroprotektive Wirkung auf nanomolarer Ebene hat (Aggarwal et al., 2010). Dieser positive lebensmitteltechnologische und gesundheitsfördernde Effekt könnte speziell durch eine Anreicherung der Lebensmittel mit Tocotrienolen genutzt werden.
Rohwürste gehören zu den beliebtesten Fleischprodukten in Europa. 2011 wurden allein in Deutschland 450.150 t Rohwurst produziert. Der durchschnittliche Fettgehalt von Rohwürsten liegt bei 35 % mit 80 mg/100 g Cholesterin (Souci et al., 2008).
Zwischen der Herstellung und dem Verzehr der Würste, kann Lipidoxidation zum Abbau der ernährungsphysiologisch erwünschten ungesättigten Fettsäuren führen.
Die Tocotrienolzugabe zu Rohwürsten ermöglicht es den Schutz gegen Oxidationen zu verbessern und ein marktgerechtes Produkt mit zusätzlichem Nährwert
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herzuvorbringen. Was in diesem Zusammenhang aber noch nicht untersucht wurde ist die Stabilität der Tocotrienole in der Rohwurst.
Vorhergehende Forschungen basierten auf der Behandlung von zerkleinertem Fleisch mit Vitamin E (α-Tocopherol), welches die Pigment- und Lipidoxidation reduzierte (Djenane et al., 2002; Mitsumoto et al., 1991). Andere Forscher verglichen die Effektivität von Vitamin E (α-Tocopherol) indem sie es der Versuchstiernahrung zufügten (Mitsumoto et al., 1993), wobei sie herausfanden, dass endogenes Vitamin E die Pigment- und Lipidstabilität besser unterstützt als die exogene Zugabe. Andere Studien untersuchten den Effekt von α-Tocopherol auf Fleischprodukte (Hoz et al., 2004). Sie zeigten, dass die Lipidoxidation von trocken gereiften Würsten (Salami), die durch die Fütterung der Schlachttiere mit α-Tocopherol angereichert wurden, geringer war als bei Würsten ohne diese Anreicherung. Zusätzliche Studien untersuchten die Stabilität von α-Tocopherol (ebenfalls durch angereicherte Tiernahrung zugeführt) in Salami mit unterschiedlichen Ergebnissen: während Harms et al. (2003) berichteten, dass es innerhalb von acht Wochen Lagerung zu keiner Veränderung in der Vitamin E-Konzentration der Würste kam, zeigten Sammet et al.
(2006), dass der α-Tocopherolgehalt während der Reifung und Lagerung abnahm.
Bisher untersuchten nur Rosli et al. (2006) die Stabilität von Tocotrienolen aus Palmöl in Fleischprodukten. Sie zeigten, dass das dem Fleisch zugesetzte α- Tocopherol und α-Tocotrienol innerhalb von sechs Monaten Lagerung um die Hälfte reduziert wurde und dass die Produktion, das Kochen, und die Lagerung im gefrorenen Zustand einen Einfluss auf die Vitamin E-Stabilität in Fleischprodukten hatte. Aufgrund niedriger Höchsttemperaturen von 22 °C zu Beginn der Reifung und anaeroben Bedingungen während des Reifungsprozesses scheint die Rohwurst prädestiniert zu sein, die tocotrienolreichen Extrakte aus Biertreber sinnvoll zur lebensmitteltechnologischen und ernährungsphysiologischen Aufwertung einzusetzen. Auch Al-Saqer et al. (2004) haben darauf Wert gelegt, dass sie zur Herstellung ihres „functional food“ (Kastenbrot und „sugar-snap“ Kekse) natürliches Vitamin E aus Palmöl verwendeten, denn insbesondere das natürliche α-Tocopherol ist dem synthetisch Hergestelltem als antioxidativer Zerstörer von radikalischen
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Kettenreaktionen überlegen. Zudem besteht der Vorteil, den öligen und α-tocotrienolreichen Biertreber-Extrakt bei der Herstellung der Rohwurst einsetzen zu können, ohne dass es zu Problemen (wie z.B. mangelnde Umrötung) bei der Reifung kommt. Zusätzlich kann man sich den Umweg der Anreicherung per Fütterung der Schlachttiere und die damit verbundenen Verstoffwechslungsverluste ersparen.
Allerdings ist auch noch der Gebrauch von Pökelsalz obligatorisch bei der Salami- Herstellung. Durch das Pökelsalz kommt Nitrit in das Produkt, welches prooxidative Eigenschaften haben kann, aber auch selbst, oder durch seine Sekundärprodukte imstande ist, antioxidativ zu wirken. In Anwesenheit von Myoglobin kann Nitrosylmyoglobin (NO-Myoglobin) gebildet werden, welches in der Lage ist die Lipidoxidation zu inhibieren (Kanner et al., 1991). Die simultane Präsenz von Nitrit und Tocotrienolen in der Fleischmatrix führt zu komplexen Reaktionsbedingungen.
Unter diesen Umständen ist das Verhalten der Tocotrienole schwer vorherzusagen.
Hieraus resultierend sind umfassende Untersuchungen des Tocotrienol-Abbau- Prozesses nötig, um eine Grundlage für eine gezielte Technologie zu schaffen, die in der Lage ist, α-Tocotrienol und die ernährungsphysiologisch positiven Eigenschaften für den Verbraucher zu bewahren.
Es lässt sich vermuten, dass die Zugabe von anderen Antioxidantien, wie Ascorbinsäure und Carnosolsäure (ein Rosmarininhaltsstoff), dabei helfen könnte, den oxidativen Abbau von α-Tocotrienol zu verhindern. Ascorbinsäure wird oft als Pökelhilfsstoff eingesetzt und ist bekannt für ihre antioxidative Funktion in Lebensmitteln (Chauhan et al., 1998; Liao & Seib, 1988). Niki et al. (1982) berichteten, dass Vitamin C in der Lage ist, ein Vitamin E-Radikal durch Übertragung eines Wasserstoffatoms wieder zu Vitamin E zu regenerieren. Sie vermuteten, dass dieser Vorgang auch eine Rolle bei der Aufrechterhaltung von Vitamin E-Spiegeln im Körpergewebe spielt.
Über die antioxidativen Eigenschaften von Rosmarin-Extrakten wurde schon oft berichtet. Ebenso über die außerordentlich gute antioxidative Wirkung von Carnosolsäure (Richheimer et al., 1996; Schwarz & Ternes, 1992a).
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Stabilität und das Abbauverhalten des wertgebenden Inhaltstoffes α-Tocotrienol in der komplexen Rohwurstmatrix zu
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untersuchen. Auch ein eventuell schützender Effekt von Ascorbin- und Carnosolsäure sowie andere konservierende Methoden (Trocknen, Luftentzug und Gefrieren) sollten dazu untersucht werden.
Eine andere weit verbreitete Art um Fleisch zu Pökeln, ist der Gebrauch von Pökellake, welche Natriumchlorid und/oder Nitrit enthält. Um zum Beispiel gepökelten Schinken herzustellen wird Pökellake verwendet. Einerseits kann das Fleisch darin eingelegt werden oder aber die Pökellake wird direkt ins Fleischstück bis zu einer Menge von 20 % des Fleischgewichtes injiziert (Grais & Kabisch, 2011).
Das macht Pökellake zu einem potentiellen α-Tocotrienol-Träger, um es in Fleischprodukte einzubringen. Gewürzte, säuerliche Pökellake wird verwendet, um dem Fleisch einen bestimmten Geschmack zu geben und/oder es zarter zu machen.
Es ist allerdings auch bekannt, dass Nitrit im saurem Milieu primär oxidativ wirkt und Stickstoffmonoxid entstehen kann (Skibsted, 2011). Allerdings gibt es noch keine Angaben über den direkten Einfluss von Nitrit und pH-Werten auf Tocotrienole und Tocopherole in Pökellake. Die vorgelegte Untersuchung sollte helfen, den Abbau der antioxidativen Substanzen in gepökelten Fleischprodukten aufzuklären und eine Basis für den Einsatz von Tocotrienolen in Pökellake zu schaffen. Dazu wurde die Stabilität der Tocochromanole in der Pökellake mit unterschiedlichen Nitritkonzentrationen und verschiedenen pH-Werten untersucht.
Eine weitere Methode, um Fleisch haltbarer zu machen, ist das Trocknen.
Heutzutage wird Fleisch, das bei „Instant-Produkten“ verwendet werden soll, durch die Gefriertrocknung aromaschonend getrocknet. In der Literatur sind nur wenige Informationen über Antioxidantien in gefriergetrockneten Produkten zu finden.
Wilkinson et al. (2001) zeigten, dass das TBARS-Level in gefriergetrocknetem Fleisch, das mit Tocopherolen angereichert war, niedriger war als in der Kontrollgruppe. Allerdings gibt es keine Berichte über die Stabilität von Tocotrienolen in gefriergetrockneten Fleisch oder Fleischprodukten.
Diese Arbeit konzentriert sich auf die Stabilität von α-Tocotrienol in Rohwürsten und Pökellake unter verschiedenen realitätsnahen Verarbeitungs- und Lagerungsbedingungen, wobei die anderen Tocochromanole (α-Tocopherol, γ- Tocotrienol und γ-Tocopherol) zum Vergleich mitgemessen wurden.
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Ziel dieser umfassenden Studie war es, mit den Ergebnissen einen Beitrag zur Entwicklung gezielter Technologien zu leisten, um Tocotrienole oder den öligen Biertreber-Extrakt, der außerordentlich reich an α-Tocotrienol ist, bei Rohwürsten und Pökellake verwenden zu können. Dies sollte es möglich machen, den lebensmitteltechnologischen und ernährungsphysiologisch positivien Effekt dieser Inhaltsstoffe zu nutzen.
6 2 Literaturübersicht
2.1 Vitamin E
2.1.1 Definition und Struktur
Die ersten, die gezielt Vitamin E aus Pflanzen isolierten, war 1936 die Forschergruppe um Evans aus Berkeley, Kalifornien (Evans, 1936) welche einige Jahre zuvor zum ersten mal die Abhängigkeit der Reproduktionsfähigkeit bei Ratten von Vitamin E beschrieben. In diesem Versuchsaufbau wurde es allerdings noch als
„Substanz X“ bezeichnet (Evans & Bishop, 1922). Benannt wurde das Vitamin nicht durch Evans sondern 1924 durch Sure, der sich für Vitamin „E“ entschied da A, B, C und D schon bekannt waren (Sure, 1924).
Vitamin E wird heute als ein Oberbegriff für insgesamt acht sogenannte Tocochromanole (aus dem griechischen: tokos „Geburt“) verwendet. In der Grundstruktur bestehen sie aus einem Chromanolring und einer Phytyl-Seitenkette.
Der Unterschied der beiden Vitamin E „Familien“ Tocopherole und Tocotrienole liegt in der Phytyl-Seitenkette, welche bei den Tocopherolen gesättigt ist und nur bei den Tocotrienolen drei Doppelbindungen aufweist (Abb. 1). Die Tocopherole sowie die Tocotrienole können noch in 4 Vitamere: alpha (α), beta (β), gamma (γ) und delta (δ) eingeteilt werden. Die Benennung der Vitamere richtet sich dabei nach der Anzahl und Stellung der Methylgruppe am Chromanolring (s. Abb. 1) (Beispiel:
α-Tocopherol; Trivialname: 5,7,8-Trimethyltocol).
Das Tocopherol-Molekül hat drei chirale Zentren in der Phytyl-Seitenkette (2,4‘, und 8‘) was insgesamt acht Stereoisomere Formen möglich macht. Alle natürlich vorkommenden Tocopherole (α-, β-, γ-, und δ-) haben die selbe molekulare Modifikation/Konfiguration [RRR, 2R, 4’R, 8’R] in ihrer Phytyl-Gruppe. Synthetisch hergestelltes α-Tocopherol ist ein Gemisch aus annähernd acht gleichen Teilen an Stereoisomeren (Kamal-Eldin & Appelqvist, 1996).
Die Tocotrienole haben nur ein chirales Zentrum an der Position 2, so dass insgesamt 2D- und 2L-Stereoisomere vorkommen können. Alle natürlich vorkommenden Tocotrienole haben nur eine Konfiguration [REE, 2R,3’E, 7’E]
(Drotleff, 1999; Kamal-Eldin & Appelqvist, 1996). Durch neuere Entdeckungen
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wurden noch zwei weitere Gruppen den Tocochromanolen zugeordnet. Die
„Marinen-Tocopherole“ wurden bei Kaltwasser-Fischen, Krill und Phytoplankton nachgewiesen und zeichnen sich durch eine Doppelbindung am Ende der Phytyl- Seitenkette aus (Dunlap et al., 2002) (s. Abb. 1). Die Tocomonoenole wurde u.a. aus Palmöl und Kiwis isoliert und besitzen eine Doppelbindung in Position C11‘ der Phytyl-Seitenkette (Fiorentino, et al., 2009; Ng et al., 2004; Strohschein et al., 1999).
O R1
R3
R2
HO
CH3
H H3C H
H3C CH3
CH3 1 2 4 3 65
4a
78 8a
1' 3' 5' 7' 9' 11'
O R1
R3 R2 HO
CH3 CH3
CH3
CH3 CH3
O R1
R3 R2 HO
CH2 H H3C H
H3C CH3
CH3
O R1
R3 R2 HO
CH3 H H3C H
H3C CH3
CH3
Abb. 1: Strukturformeln der Tocochromanole
2.1.2 Eigenschaften von Vitamin E
Anfang des letzten Jahrhunderts erkannte man, dass es für die Erhaltung der Gesundheit von Mensch und Tier wichtige Faktoren in der Nahrung gibt und nannte diese sinngemäß Vitamin (lat. vita, „Leben“) (Aggarwal et al., 2010). Wie bereits erwähnt, beschrieben Evans und Bishop (1922) als erste die Notwendigkeit von
Vitamer R1 R2 R3
α- -CH3 -CH3 -CH3
β- -CH3 -H -CH3
γ- -H -CH3 -CH3
δ- -H -H -CH3
Chromanolring Phytyl-Seitenkette
Tocopherole
„Marine-Tocopherole“
Tocotrienole
Tocomonoenole
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Vitamin E im Futter von Ratten, um deren Reproduktionsfähigkeit zu erhalten. Die Tocopherole und Tocotrienole haben jedoch noch weitere physiologisch wirksame Eigenschaften.
Am häufigsten aufgeführt wird die Funktion als Antioxidationsmittel. Aufgrund ihrer Struktur mit substituiertem Phenolring an ortho- und/oder para-Stellung sind die Tocopherole und Tocotrienole in der Lage als Wasserstoff-Donator zu fungieren und haben damit ausgezeichnete antioxidative Eigenschaften. Die dabei gebildeten Radikale sind zudem sehr stabil. Dabei ist, unter den Tocopherolen, das α-Tocopherol strukturell der geeignetste Donator, danach β-, γ-, δ-Tocopherol, gleiches gilt für die Tocotrienole(Burton et al., 1985; Kamal-Eldin & Appelqvist, 1996;
Pokorny, 1987). Besonders effektiv sind sie in Lipiden, da sie durch ihre lange Phytyl-Seitenkette fettlöslich sind. Bei der Lipidautoxidation kommt es zu einer Radikalkettenreaktion. Dabei ist ein Molekül Tocopherol grundsätzlich in der Lage zwei Lipidradikale abzufangen. Zudem kommt es durch die Rekombination eines Tocopherylradikals mit einem weiteren Lipidradikal zum Abbruch der Radikalkettenreaktion (Burton & Ingold, 1981; Kamal-Eldin & Appelqvist, 1996). Im Vergleich α-Tocopherol zu α-Tocotrienol hat letzteres eine höheres antioxidatives Potential, welches laut Serbinova et al. (1991) vermutlich an einem Kombinationseffekt von drei Eigenschaften liegt: (i) α-Tocotrienol wird eine höhere Recyclingeffizienz von seinem Chromanoxyl-Radikal zugeschrieben, (ii) α- Tocotrienol liegt signifikant weniger in Clustern vor und ist gleichmäßiger in Membrandoppelschichten verteilt, (iii) α-Tocotrineol hat einen starken Verteilungseffekt auf Membranlipide, was eine Interaktion der Chromanole mit Lipid- Radikalen effizienter macht.
In Lösung ist die Eigenschaft als „freier Radikalfänger“ von α-Tocotrienol und α- Tocopherol allerdings gleich (Kamal-Eldin & Appelqvist, 1996). Wie bei vielen Antioxidationsmitteln bestand auch die Hypothese, dass Tocopherole ebenfalls prooxidativ wirken könnten, wenn sie in sehr hohen Konzentrationen vorliegen. In verschiedenen Untersuchungen wurde auch ein prooxidativer Effekt bei hohen Konzentrationen in Pflanzenölen bestätigt (Cillard et al., 1980a; Cillard, 1980b;
Koskas et al., 1984; Peers & Coxon, 1983; Peers et al.,1981). Kamal-Eldin und
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Appelqvist (1996) schlussfolgerten aufgrund ihrer Untersuchungen, dass nicht die Tocopherole selbst prooxidativ wirken, sondern nur co-prooxidativ, wenn sie in hohen Konzentrationen mit anderen Prooxidantien wie Metall-Ionen, Lipid-Peroxiden oder anderen Oxidationsmitteln vorliegen. Zusätzlich postulierten sie, dass ein Temperatureffekt auf die anti/prooxidative Wirkung der Tocopherole stark verknüpft ist mit den chemischen und physikalischen Eigenschaften des jeweiligen Systems.
Vitamin E hat weitere, besonders im medizinischen Bereich relevante Eigenschaften, die zum Teil in Verbindung mit der antioxidativen Wirkung stehen. Aggarwal et al.
(2010) fassten mehrere Studien zusammen, die über einen antikanzerogenen, kardioprotektiven, cholesterinsynthese hemmenden, neuroprotektiven, Diabetes mellitus und Knochenmetabolismus beeinflussenden Effekt bei Mensch und Tier berichteten. Dabei stellte sich heraus, dass insbesondere die Tocotrienole diese positiven Wirkungen hervorbringen. So waren in einer Studie die oral verabreichten Tocotrienole in der Lage tumorinduzierte Angiogenese zu hemmen, was bei den Tocopherolen nicht der Fall war. Dabei reduzierten die Tocotrienole die Ausbildung von VEGF (vascular endothelial growth factor)-Rezeptoren in HUVEC (human umbilical vein endothelial cells)-Zellen (Zellkultur aus menschlichem Nabelschnurvenenendothel) und blockierten die VEGF Signaltransduktion (Miyazawa et al., 2004). Khanna et al. (2005) zeigten, dass α-Tocotrienol neuroprotektiv wirkt, γ- Tocopherol hingegen nicht. Es kann sogar zu einem direkten Gegenspiel von Tocopherolen und Tocotrienolen kommen, wie bei der HMG-CoA (3-hydroxy-3- methyl-glutaryl Coenzym A) Reduktase-Aktivität. Dieses Enzym, welches geschwindigkeitsbestimmend in der Cholesterinbiosynthese ist, wird durch α- Tocotrienol gehemmt, was wiederum den Cholesterinspiegel senkt, wohingegen α- Tocopherol die Enzym-Aktivität induziert (Parker 1993; Qureshi et al., 1996).
Betrachtet man nur die Tocotrienole, dann ist das α-Tocotrienol, das Tocotrienol mit dem größten antioxidativen, prooxidativen und neuroprotektiven Potential (Aggarwal et al., 2010).
2.1.3 Vorkommen von Vitamin E
Vitamin E kann nur von Pflanzen synthetisiert werden, und die Tocopherole kommen auch in fast allen Pflanzenblättern und Samen vor. Die Tocotrienole hingegen
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kommen nur in wenigen Pflanzen vor. Die derzeitig am meisten genutzte Tocotrienolquelle ist das Palmöl. Aber auch bei anderen Pflanzensamen wurden ebenfalls hohe Tocotrienolgehalte beschrieben (s. Tab. 1)
Pflanzenart Gesamt-Tocotrienol-Gehalt
Mittelwerte (mg/kg TM)
a)Palmöl 1000
b) Reiskleieöl 830
c) Traubenkernöl 333
d) Roggen 31
e) Hafer 62
e) Gerste 61
Tab. 1: Tocotrienol-Gehalte verschiedener Pflanzenarten (a: Schroeder et al. (2006); b: Sookwong et al.
(2010); c: Hassanein et al. (2009); d: Nyström et al. (2008); e: Panfili et al. (2003))
In tierischen Produkten lässt sich Vitamin E auch nachweisen, was daran liegt, dass es vom Tier über die Nahrung aufgenommen wird und aufgrund seiner Lipophilie gespeichert werden kann. Untersuchungen zeigten Vitamin E-Akkumulationen in Fettgewebe, Haut, Leber, Lunge, Herz, Skelettmuskel und Gonaden (Khanna et al., 2005; Uchida et al., 2012). Bei Versuchen an Ratten wurde festgestellt, dass oral aufgenommenes Tocotrienol besonders schnell und mit größerer Effektivität in der Haut aufgenommen wurde als Tocopherol (Khanna et al., 2005). Uchida et al. (2012) hatten bei den Untersuchungen der verschiedenen Organe die höchsten α- Tocotrienol-Werte im Fettgewebe. Das meist vertretene Vitamer im Fleisch ist das α- Tocopherol. Zudem besteht eine Tocopherol-Fett-Relation, denn je höher der Fettgehalt im Fleisch ist, desto höher sind die Tocopherolwerte (Piironen et al., 1985).
11 α-Tocopherol-
Gehalt Mittelwert
(µg/g)
α-Tocotrienol- Gehalt Mittelwert
(µg/g)
Tocopherol- Gesamtgehalt
Mittelwert (µg/g) Muskelfleisch (Schwein1), Rind2)) nach unterschiedlicher Vitamin E (α-Tocopherol) Fütterung
Dotierung im Futter:
a) 2)
250 mg/d 500 mg/d 2000 mg/d
1,39 2,27 4,95
b) 1)
102 mg/d 1092 mg/d
2,39 3,85
c) 1)
60 mg/d 1230 mg/d
2 5
d)2)
80 mg/d 1500 mg/d
1,33 6,10
Fettgewebe (Schwein) nach unterschiedlicher Vitamin E (α-Tocopherol) Fütterung Dotierung im Futter:
b) 102 mg/d 1092 mg/d
13,19 22,73
c) 60 mg/d 1230 mg/d
6 15
Messwerte ohne Fütterungsangaben Schweinefleisch
- reines Muskelfleisch e) 4
f) 0,8
e) 1 e) 5,64
f) 1
- subcutanes Fettgewebe e)7 e) 2 e) 9
- Schweineschmalz e)16 e) 17
Rindfleisch
- reines Muskelfleisch e) 4,7
f) 4,1
e) 0,10 e) 4,96
f) 4,3 Rohwurst
- Salami e) 7,40
f) 1,1
e) 1,20 e) 8,60
f) 6,8
Tab. 2: α-Tocotrienol, α-Tocopherol und Gesamt-Tocopherolgehalte in ausgewählten tierischen Fleisch- produkten ( a: Liu et al. (1996); b: Sammet et al. (2006); c: Harms et al. (2003); Mitsumoto et al. (1991); e:
Souci et al. (2008); f: McLaughlin et al. (1979)
2.1.4 Einsatz von Vitamin E in Fleischprodukten
Aufgrund der positiven Eigenschaften wird Vitamin E auch bei verschiedenen Fleischprodukten angewendet (dabei vor allem α-Tocopherol). Hauptsächlich soll dabei vom antioxidativen Effekt profitiert werden. Dazu wurden in mehreren Studien verschiedene Parameter untersucht: Lipidstabilität (Hoz et al., 2004; Lanari, 2004;
Sammet et al., 2006; Wong, 1995; Zhang et al., 2010), sowie Cholesterin-Oxidation (Grau, 2001) und Farbstabilität (Chan, 1996; Liu et al.,1996; Mitsumoto et al., 1993;
Mitsumoto et al., 1991; Nassu et al., 2012). In den aufgezählten Studien hatte der
12
Einsatz von Vitamin E, welches überwiegend durch eine supplementierte Futterration ins Tier und damit ins Fleisch gekommen ist, positive Effekte auf die Produktstabilität.
Dabei wurde mit Vitamin E-Konzentrationen von 0,62 mg/kg bis 100 mg/kg im Fleisch gearbeitet.
Eine mögliche Erklärung für die Wirkung der Tocopherole in Fleisch-Lipiden liegt darin, dass sich das Tocopherol-Molekül und das Peroxy-Radikal (von den Lipiden) annähern und sich ihre Elektronenwolken überlappen. Dadurch wird ein Übergangszustand erreicht, der die Eigenschaften eines Charge-Transfer- Komplexes (LOO----TOH+) besitzt. Wenn sich das Tocopherol-Molekül und das Peroxy-Radikal in einem nennenswerten Umfang annähern, findet ein Protonen- Tunneling statt, bei dem das Chromanol-Molekül, unter Bildung eines Chromanoxyl- Radikals, ein Wasserstoffatom an ein Lipid Peroxy-Radikal verliert (LOO●+TOH LOOH + TO●). Dabei kann jedes Tocopherol-Molekül zwei Peroxy-Radikale neutralisieren (Kamal-Eldin & Appelqvist, 1996; Nagaoka et al., 1992). Es wird aber auch über Vitamin E als Nitritscavenger und N-Nitrosamine-Inhibitor berichtet.
Aufgrund seiner antioxidativen Eigenschaften reagiert α-Tocopherol schneller mit dem Nitrit als das sekundäre Amin mit Nitrit. Dabei wird α-Tocopherol durch das nitrosierende Agens zu α-Tocopherylchinon oxidiert (Lathia & Blum, 1991). Durch den vollständig substituierten Benzolring bei α-Tocopherol ist eine C-Nitrosierung nicht möglich. Dabei ist nur die unveresterte Form, des Tocopherols wirksam, wie sie auch im pflanzlichen Vitamin E vorkommt. Im Vergleich mit Ascorbinsäure reagiert α- Tocopherol bei einem pH-Wert unter 4 schneller mit dem Nitrit Anion. Um einen möglichst effektiven Schutz vor der Bildung von Nitrosaminen zu erreichen sollte die α-Tocopherol-Konzentration möglichst hoch sein, oder mindestens gleich mit der von Natriumnitrit (Kamm et al., 1977).
2.2 Gersten-Biertreber
Wie bereits erwähnt, gehören Gerstenkörner mit zu den Pflanzensamen die einen hohen Tocotrienolgehalt aufweisen (s. Tab 1).
Biertreber ist ein Nebenprodukt des
Bierbrauprozesses, d
Hauptbestandteile die Teile der Gerste sind, die nach der Trennung von dem für die Gärung wichtigen Bestandteile (Mehlkörper als Zuckerlieferant) übrig bleiben: Gerstenkornschale, Fett und Eiweiß. Einige Studien zeigten, dass Gerstenöl eine potentiel
Lebensmittelherstellung genutzt werden kann 2008; Moreau et al., 2007)
Aleuronschicht, im Vergleich zur Spelze oder zum Mehlkörper die höchsten Tocotrienol-Konzentrationen aufweist.
zerkleinerte Gerstenkörner und fanden in Siebfraktionen mit einer Partikelgröße
Im Biertreber ist der Anteil der tocotrienolreichen Aleuronschicht dafür ist, dass während des Brauprozesses der
stärkehaltige Mehlkörper
aufgeschlossen wird und nur die äußeren Schichten, wozu auch die Aleuronschicht zählt, zurück bleiben. In unserem Arbeitskreis ist es gelungen, die Tocotrienol-
Biertreber noch weiter zu steigern (um das 2 fache) (Bohnsack et al., 2011)
der Biertreber mechanisch gesiebt und Siebfraktionen mit einer Partikel
13 Wie bereits erwähnt, gehören die
körner mit zu den Pflanzensamen die einen hohen Tocotrienolgehalt Der Gersten- Biertreber ist ein Nebenprodukt des
, dessen
Hauptbestandteile die Teile der Gerste , die nach der Trennung von dem für die Gärung wichtigen Bestandteile (Mehlkörper als Zuckerlieferant) übrig bleiben: Gerstenkornschale, Fett und Eiweiß. Einige Studien zeigten, dass
l eine potentielle Tocotrienolquelle darstellt, die genutzt werden kann (Lampi et al., 2004;
, 2007). Dabei stellte sich zudem heraus, dass die eiweißreiche im Vergleich zur Spelze oder zum Mehlkörper des Gerstenkornes
Konzentrationen aufweist. Moreau et al. ( zerkleinerte Gerstenkörner und fanden in dem mit Hexan extrahierten
mit einer Partikelgröße unter 700 µm die höchsten Tocotrienolgehalte.
Anteil der tocotrienolreichen Aleuronschicht erhöht. Ursächlich dass während des Brauprozesses der
stärkehaltige Mehlkörper des Gerstenkornes aufgeschlossen wird und nur die äußeren , wozu auch die Aleuronschicht zählt, In unserem Arbeitskreis ist es -Ausbeute aus dem Biertreber noch weiter zu steigern (um das 2-3 et al., 2011). Dabei wurde der Biertreber mechanisch gesiebt und die mit einer Partikel-Größe von
Abb. 3: Schema eines Gerstenkornes Längsschnitt. (modifiziert nach Zentgraf, 1993)
Abb. 2: Gersten-Biertreber in ve
Verarbeitungsstufen (reale Mengenverhältnisse) 1 = Biertreber (Ausgangsprodukt)
2 = Siebfraktion < 500 µm 3 = Biertreber-Extrakt
1
darstellt, die bei der 2004; Liu & Moreau, heraus, dass die eiweißreiche des Gerstenkornes, et al. (2007) siebten mit Hexan extrahierten Gerstenöl aus unter 700 µm die höchsten Tocotrienolgehalte.
erhöht. Ursächlich
: Schema eines Gerstenkornes im (modifiziert nach Zentgraf, Biertreber in verschiedenen
(reale Mengenverhältnisse) 1 = Biertreber (Ausgangsprodukt)
2
3
14
> 800, 800 - 500 µm und unter 500 µm gesammelt, wobei sich die Siebfraktion < 500 µm bei der Tocotrienol-Extraktion als ertragreichste herausstellte: Trockentreber: 64 mg/kg; Siebfraktion < 500 µm: 81,7 mg/kg. Der Biertreber-Extrakt stellt damit eine reichhaltige und natürliche Tocotrienolquelle dar, die im Gegensatz zu Palmöl ohne lange Importwege zu Verfügung steht.
2.3 Rohwurst 2.3.1 Definition
Laut den Leitsätzen des Deutschen Lebensmittelbuches: „Leitsätze für Fleisch und Fleischerzeugnisse vom 27./28. 11. 1974 (Beilage zum BAnz. Nr. 134 vom 25. 7.
1975, GMBl Nr. 23 S. 489 vom 25.7. 1975), zuletzt geändert am 08. 01. 2010 (BAnz.Nr. 16 vom 29. 01. 2010, GMBl Nr. 5/6 S. 120ff vom 04. 02. 2010)“ sind Wurstwaren, und damit auch die Rohwurst, wie folgt definiert:
„Wurstwaren“ (Würste und wurstartige Erzeugnisse) sind bestimmte, unter Verwendung von geschmackgebenden und/oder technologisch begründeten Zutaten zubereitete schnittfeste oder streichfähige Gemenge aus zerkleinertem Fleisch, Fettgewebe sowie sortenbezogen teilweise auch Innereien sowie bei besonderen Erzeugnissen sonstige Tierkörperteile.
Wurstwaren gelangen geräuchert oder ungeräuchert in Hüllen oder Behältnissen oder auch ohne Hüllen in den Verkehr.
„Rohwürste“ sind in der Regel umgerötete, ungekühlt (über + 10 °C) lagerfähige, in der Regel roh zum Verzehr gelangende Wurstwaren, die streichfähig oder nach einer mit Austrocknung verbundenen Reifung schnittfest geworden sind. Zucker werden in einer Menge von nicht mehr als 2 % zugesetzt.
„Schnittfeste Rohwürste“ weisen besondere Merkmale auf:
gereift; unangeschnitten ohne Kühlung lagerfähig; an die Oberfläche der Fleischteilchen ausgetretenes Muskeleiweiß hat im Verlauf der Reifung Fleisch- und Fettgewebeteilchen miteinander verbunden; bei grober Körnung Fettgewebe zu erkennen; bei luftgetrockneten und schwach geräucherten Erzeugnissen auf dem Darm zuweilen weißliche Beläge von Mikroorganismen.
15
„Salami I a, Salami fein, Katen-I a, Katenrauch I a, Mettwurst I a“ gehören zu den schnittfesten Rohwürsten und bestehen in vielen Fällen aus dem gleichen Ausgangsmaterial: sehnen- und fettgewebsarmes Rindfleisch, grob entfettetes Schweinefleisch und Speck.
2.3.2 Physio-chemische Vorgänge in der Rohwurst
Die Rohwurst ist ein sehr komplexes Lebensmittel, das sich im Laufe der Herstellung und der notwenigen Reifungszeit stetig verändert und an dessen Abschluss ein sehr stabiles Endprodukt steht. Dabei kommt es zu verschiedenen physikalischen sowie chemischen Vorgängen. Bei der Herstellung ist auf die Temperatur des Bräts (- 4 bis 0°C) und besonders auf die Temperatur des Specks zu achten. Dieser sollte nur gefroren verarbeitet werden, um eine homogene Masse anstatt eines schmierigen Schnittbildes zu erhalten. Durch das Kuttern werden die Muskelzellen zerschnitten und Sarkoplasma und Myofibrillen gehen in eine wässrige Lösung über. Durch den Zusatz von Salz quellen die Myofibrillen und Proteine werden hydratisiert. Vor allem die sarkoplasmatischen Proteine umhüllen die Fettkinkel und zerkleinerten Muskelstücke, sodass es zur Ausbildung eines dreidimensionalen Proteinnetzwerkes kommt, welches im Solzustand gelöst ist. Durch eingesetzte Starterkulturen kommt es zu einer mikrobiell induzierten Säuerung, die unterhalb von pH 5,4 zu Vernetzungen zwischen den Partikeln und letztendlich zu einer durchgehenden Gallerte führt, welche die Schnittfestigkeit des Endprodukts ausmacht. Durch verminderte Wasserbindefähigkeit am isoelektrischen Punkt der Muskelproteine tritt immer mehr Wasser an die Oberfläche und verdunstet (Ternes, 2008). Um die gewünschte Stabilität und gesundheitliche Unbedenklichkeit von Rohwürsten zu erreichen ist auf folgende Parameter, von Leistner (1986) zum sogenannten
„Hürdenkonzept“ zusammengefasst, zu achten: Richtige Temperatur, Senkung des aW-Wertes, pH-Wert-Absenkung, Verminderung des Sauerstoffangebots, Redoxpotential (Eh-Wert) und konservierend wirkende Stoffe (Salz, Nitrit, Rauch).
Um möglichst wenig Sauerstoff in den Rohwürsten zu haben, ist es wichtig, bei der Abfüllung der Rohwurstmasse in die Därme darauf zu achten und Lufteinschluss (Blasen, ungenügender Druck bei der Abfüllung) in den Würsten zu vermeiden.
16 2.3.2.1 Einfluss von Nitrit (NO2-
)
Das Stickstoffatom (N) ist eines der chemischen Elemente mit der breitesten Spanne im Bezug auf seinen Oxidationsstatus. Beispielsweise kann die äußere Schale, bestehend aus fünf Elektronen (s2p3), drei zusätzliche Elektronen aufnehmen, was dem Stickstoff dann einen Oxidationsstatus von N3- gibt, so wie es unter anderem bei Ammoniak vorkommt (NH3), oder es kann fünf Elektronen abgeben und liegt dann als N5+ vor, wie bei Nitrat (NO3-
). Bei Nitrit liegt es als N3+ vor. Diese Vielfältigkeit ist der Grund für die Komplexität der Stickstoff-Reaktivität (Honikel, 2008).
Um Fleisch haltbarer zu machen wurde es schon seit Jahrhunderten gesalzen oder in mit Salz gefüllten Gefäßen gelagert. Der Zusammenhang zwischen Nitrit und der roten Farbe des gepökelten Fleisches wurde aber erst Ende des 19ten Jahrhunderts erkannt (Lehmann 1899; Kisskalt 1899). Heutzutage wird gezielt Nitrit, in Form von Nitritpökelsalz (NaNO2) bei der Rohwurstherstellung für die „Umrötung“ des Produktes eingesetzt. Dabei wird die hohe Affinität des NO-Liganden zum Eisen der Hämgruppe des Myoglobins der Fleischstücke ausgenutzt. Beim roten Myoglobin liegt das zentrale Eisenatom als Fe2+ vor (Ternes, 2008). Das Nitrit oxidiert das Myoglobin zu Metmyoglobin (Mb + NO2-
→ MMb+ + NO). Bei Metmyoglobin, welches den oxidierten Zustand darstellt, liegt das zentrale Eisenatom als Fe3+ vor. NO wiederrum hat die Fähigkeit, als Donator oxidiertes Myoglobin wieder zu reduzieren.
Es bildet mit Mb und MMb+ sehr stabile Komplexe (Nitrosomyoglobin und Nitrosometmyoglobin), welche für die leuchtend rote Farbe, das „Pökelrot“, verantwortlich sind (MbNO und MMb+ ●NO). Durch Reduktionsmittel wie Ascorbat, kann die Umrötung durch Reduktion von Nitrit zu NO und Mbb+ zu Mb beschleunigt werden. Das entstehende Nitrosylmyoglobin (MbNO) ist in Abwesenheit von Sauerstoff sehr stabil und die Farbe des gepökelten Fleisches bleibt auch beim erhitzen stabil (Belitz et al., 2001). Das Nitrit ist zusätzlich an der Bildung des Pökelaromas beteiligt. Die dazugehörigen chemischen Reaktionen sind komplex und noch nicht ausreichend aufgeklärt. Es wird aber vermutet, dass es sich dabei um Verbindungen handelt, die bei der Bindung von Stickstoff oder Nitrit an Proteine oder Fette sowie durch die Abspaltung von Stickstoff entstehen (Jira, 2004).
17
Ein weiterer Reaktionsverlauf, der durch die Zugabe von Nitrit ablaufen kann, ist der der salpetrigen Säure (HNO2). Nachdem sie aus Nitrit in einer sauren Fleisch-Matrix gebildet wird, kann sie Anhydride (N2O3) bilden, welche im Gleichgewicht mit ihren Oxiden NO und NO2 vorliegt. NO reagiert mit Myoglobin oder einer Aminosäure, während NO2 in Verbindung mit Wasser wieder ein Molekül salpetrige Säure und ein Molekül Salpetersäure (HNO3) bildet. Dabei wird Nitrit/ salpetrige Säure zu Nitrat/
Salpetersäure oxidiert und zu NO reduziert (Honikel, 2008).
Der Zusatz von Nitritpökelsalz hat zudem noch einen weiteren positiven Effekt auf die gewünschte Qualität und Produktsicherheit. Ein keimhemmender Effekt (insbesondere auf Clostridium botulinum) wird einerseits durch die Senkung des aW-Wertes (Maß für frei verfügbares Wasser) erzielt und andererseits entsteht aus dem Nitrit in geringem Maße die instabile undissoziierte salpetrige Säure, die bakteriostatisch wirken kann, da sie fähig ist Bakterienzellwände zu durchdringen und im Bakterieninneren Enzyme zu hemmen vermag (Ternes, 2008).
Im Endprodukt kommen nur noch 5 - 20 % der zugesetzten Nitritmenge in freier Form vor, da sie mit anderen Inhaltsstoffen reagiert (Abb. 4). Dabei kann das Nitrit sowie das gebildete Nitrosylkation (NO+) unter schwach sauren Bedingungen mit sekundären und tertiären Aminen zu Nitrosaminen reagieren, die eine kanzerogene Wirkung haben (Ternes, 2008). Aus diesem Grund ist heute auch der Einsatz von Nitrit in Lebensmitteln gesetzlich geregelt. Bei der Herstellung ist eine verwendete Höchstmenge an Natriumnitrit von 150 mg/kg einzuhalten und der Endgehalt im
Abb. 4: Mögliche Reaktionswege von Nitrit und Nitrat sowie Folgeprodukte mit entsprechenden Rezepturzusätzen (Asc = Ascorbat, DehA = Dehydroascorbinsäure, GdL = Glucono-delta-lacton) (Ternes, 2008)
18
fertigen Produkt ist, mit wenigen Ausnahmen, bei 50 mg/kg festgesetzt (ZZulV Teil C Andere Konservierungsstoffe, Liste 1 Nitrite und Nitrate; Stand: 21.05.2012).
In Fleischprodukten hat Nitrit aber auch eine antioxidative Wirkung. Das beim Umröten entstehende MbNO schützt das Fleisch, durch abfangen von Fettsäureperoxylradikale (ROO●) unter Bildung von Myoglobin und Nitrit (Belitz et al., 2001). Wie bereits erwähnt kann bei den Reaktionen von Nitrit im Fleisch NO entstehen, welches in Anwesenheit von Sauerstoff leicht zu NO2 oxidiert werden kann. Dabei findet eine Sauerstoff-Sequestierung/Bindung statt und definiert die antioxidative Aktivität des Nitrits, denn durch Reduzierung des Sauerstoffes wird das ranzig werden des Produkts verzögert (Honikel, 2008). Weiter äußert sich der antioxidative Effekt auch in der sauerstoffverbrauchenden Oxidation zu Nitrat und in der Komplexbildung zwischen Häm-gebundenen Eisen, freien Eisen-Ionen und Nitrit, wodurch freies Eisen (Fe2+) nicht mehr für die Indizierung von Lipid-Oxidationen zur Verfügung steht (Andrée et al., 2010). Freybler et al. (1993) vermuten zudem, dass Nitrit in der Lage ist mehrfach ungesättigte Fettsäuren dadurch zu stabilisieren indem sie Nitro-Nitroso-Derivate bilden, was die Stabilität von gepökeltem Fleisch bei der Lagerung erhöht.
2.4 Pökellake 2.4.1 Definition
Im Lebensmittel-Lexikon von Ternes et al. (2005) wird Pökellake wie folgt beschrieben:
Flüssigkeit, in der sich das Pökelgut (Fleisch) befindet. Sie enthält sowohl die beim Pökeln zugesetzten Salze wie Kochsalz, Nitrat und Nitrit, ferner Inhaltsstoffe des Fleisches z.T. auch den Pökelhilfsstoff Natriumascorbat und Gewürzextrakte. Sollen an Stelle dessen Naturgewürze verwendet werden, müssen diese mit einem Teil der Lake zusammen aufgekocht, nach dem Abkühlen abfiltriert und anteilig der Gesamtlake zugegeben werden.
Beim Lakepökeln wird das eingelagerte Fleisch mit einer etwa 10 - 23 %igen Pökelsalzlake übergossen.
19
Das Prinzip der Schnellpökelverfahren wie Spritzpökeln und Vakuumpökeln beruht auf dem Einspritzen von Pökellake in das arterielle Gefäßsystem oder direkt in das Muskelfleisch bzw. auf dem bei Anlegen von Vakuum beschleunigten Eindringen des Pökelsalzes in das Fleischgewebe. Die sich beim Pökeln vollziehenden enzymatisch- chemischen Vorgänge können durch Zugabe von verschiedenen Zuckerarten, Genusssäuren, Ascorbinsäure (E 300), Ascorbaten (E 301, E 302), Isoascorbinsäure, Glucono-δ-lacton (E 575), Citraten (E 331 - E 333), Diphosphaten (E 450a), Triphosphaten (E 450b) und Polyphosphaten (E 450c) unterstützt und beschleunigt werden.
2.4.2 Physio-chemische Vorgänge in der Pökellake
Das Einlegen des Fleisches in eine Pökellake dient dazu die Haltbarkeit zu verlängern, das Produkt umzuröten und um das gewünschte Aroma und die Konsistenz der Produkte zu erreichen. Das Pökeln in Pökellake kann man in zwei Phasen einteilen (Ortner, 2006):
Pökelphase 1: Das Fleisch ist vom gelösten Salz umgeben, wobei die Salzkonzentration außen höher ist als im Produktinneren. Es erfolgt ein Austausch von Salz in das Innere, wobei im Gegenzug Fleischsaft (Wasser, gelöstes Eiweiß, Fleischinhaltsstoffe) nach außen diffundiert. Bei einer Temperatur von 4 - 6 °C beträgt die Dauer der ersten Phase abhängig von Größe und Gewicht des Fleischstückes, ein bis drei Wochen. In dieser Zeit beginnt die Umrötung, die Aromabildung und die Konsistenzveränderung.
Pökelphase 2: Beim sogenannten „Durchbrennen“ wird das Produkt aus der Lake genommen und es findet eine gleichmäßige Verteilung von Salz und Pökelstoffen im Inneren des Produktes statt und die unterschiedliche Salzkonzentration zwischen Kern und Rand gleicht sich aus. Während des Durchbrennens verstärkt sich das Aroma, stabilisiert sich die Pökelfarbe und das Fleisch wird vor allem durch Reifungs- und Fermentationsvorgänge mürbe und zart. Diese Phase findet bei 6 - 8 °C statt und beansprucht fast ebensoviel Zeit wie die erste Phase.
20
Abb. 5: Schematische Darstellung der Gefriertrocknung (Baltes, 2007)
2.4.2.1 Einfluss von Nitrit
Auch bei dem in Pökellake eingelegtem Fleisch ist das Nitrit bei der Umrötung, der Aromabildung und dem konservierenden Effekt, wie bereits bei der Rohwurst (Kap. 2.3.2.1) beschrieben, beteiligt.
2.5 Gefriertrocknung
Die Technologie des Trocknens gehört zu den ältesten Methoden der Haltbarmachung von Lebensmitteln. Das dabei entzogene Wasser fehlt Verderbnis- verursachenden Mikroorganismen, die mindestens eine
Gleichgewichtsfeuchtigkeit von 70 - 80 % benötigen, um existieren zu können (Baltes, 2007). Eine heute oft verwendete Methode, um Lebensmittel zu trocknen, ist die Gefriertrocknung. Diese Methode nutzt die Eigenschaft des Wassers im Vakuum zu sublimieren. Das zu gefriertrocknende Produkt wird zuvor eingefroren, um dann in einem Vakuum die Sublimationswärme durch Heizmittel in den Platten zugeführt zu bekommen. Die Produkttemperaturen liegen während der Sublimationsphase gewöhnlich zwischen - 30 °C und - 10 °C und können graduell bis zum Ende der Trocknung auf bis zu 50 °C ansteigen. Diese Methode ist optimal, um das Aroma des Lebensmittels zu schützen, allerdings scheint die Fettoxidation trotzdem abzulaufen (Baltes, 2007). Eine Kombination aus Gefriertrocknung und Antioxidantien, wie zum Beispiel Ascorbinsäure, Carnosolsäure oder die lipophilen Tocochromanole, könnte daher eine optimierte Möglichkeit darstellen, um Lebensmittel durch Trocknung haltbar zu machen und vor einer Fettoxidation zu schützen.
2.6 Schutzmöglichkeiten für α-Tocotrienol
Bei Vitamin E und insbesondere bei den Tocotrienolen handelt es sich um besonders wertvolle Vitamere, deren Erhaltung in Lebensmitteln erstrebenswert ist, um sie dem menschlichen Organismus zur Verfügung zu stellen. Wie bereits beschrieben, kann es aber gerade in der Lebensmittelmatrix zu vielen komplexen Reaktionsabläufen kommen, die möglicherweise einen Abbau der Tocotrienole zur Folge hätten.
21
Tocopherole und Tocotrienole können durch oxidative Vorgänge zerstört werden, was durch den Einfluss von Licht, Basen, Hitze und Kationen wie Fe3+ und Cu2+ noch beschleunigt werden kann (Bauernfeind, 1980). Tocopherole und Tocotrienole gehen besonders schnell in der Anwesenheit von peroxidierten oder peroxidierenden Lipiden verloren (Diplock, 1985). d'Ischia und Novellino (1996) beschrieben, dass Stickoxid in der Lage ist α-Tocopherol zu oxidieren, wobei es zu der Bildung von Tocopherylchinon und Chinon-Epoxiden kam. Bohnsack et al. (2011) und Büsing et al. (2012) fanden in ihren Untersuchungen die Oxidationsprodukte von α-Tocotrienol (u.a. α-Tocotrienolchinon-Epoxide) in pflanzlichen Ölen und tierischen Fetten, die unter Hitzeeinwirkung oxidiert wurden. Bei der Brotherstellung kommt es hauptsächlich durch den im Knetvorgang des Teiges eingebrachten Sauerstoff zum Abbau der Tocotrienole (Leenhardt et al., 2006). Es gilt also, das wertgebende Vitamin E (dabei besonders die Tocotrienole) in den Lebensmitteln durch Antioxidantien und geeigneter Lebensmitteltechnologie vor dem oxidativen Abbau zu schützen.
2.6.1 Matrix / Milieu
Tocotrienolreiches Getreide, wie die Gerste, sind oft in Form von Mehl in allgemeinen Haushalten vorhanden. Der oxidative Abbau der Tocotrienole in Getreidemehl beträgt allerdings schon nach 12 Monaten 60 - 80 % (Piironen et al., 1988). Ein Lebensmittel, welches sich durch seine lange Haltbarkeit auszeichnet, ist die Rohwurst. Sie liefert schon aufgrund ihrer Beschaffenheit einen großen Vorteil:
Durch die angewendete Technologie, die weitere Verfestigung und Abtrocknung bildet sich ein anaerobes Milieu im Inneren der Rohwurst. Sauerstoff induzierte Oxidationen des α-Tocotrienols limitieren sich dadurch quasi von selbst. Allerdings hat Rödel (1992) in seinen Untersuchungen festgestellt, dass die Abnahme des Sauerstoffpartialdrucks in Rohwurstbrät durch Nitrit verzögert wird. Technologie wie zum Beispiel ein Vakuumkutter, würde das Einbringen von Sauerstoff in die Rohwurst noch weiter minimieren.
22
2.6.2 Antioxidantien zum Schutz von Vitamin E
Antioxidantien werden im Allgemeinen bei der Lebensmittelproduktion eingesetzt, um einer Oxidation durch Luftsauerstoff vorzubeugen. Aber auch bei anderen autooxidativen Prozessen haben sie eine verzögernde Wirkung. So können Antioxidantien auch andere Antioxidantien, wie z. B. das Vitamin E, wieder reduzieren.
Dabei sollten sie nach (Ternes, 2008) bestimmte Anforderungen erfüllen: Sie dürfen nicht toxisch sein; Sie müssen bereits in geringer Konzentration (100 - 500 mg/kg) wirksam sein; Sie dürfen den Geruch und Geschmack des Lebensmittels nicht beeinflussen; Sie sollten zugunsten einer homogenen Verteilung in der Fettphase fettlöslich sein; Sie sollten bei der Lebensmittelverarbeitung stabil bleiben und das beim Lipid-Radikal-Abfangen resultierende Antioxidans-Radikal muss mesomerie- stabilisiert sein.
2.6.2.1 Ascorbinsäure
Ascorbinsäure, auch Vitamin C genannt, gehört zu den bekanntesten und am häufigsten eingesetzten Antioxidationsmitteln bei Lebensmitteln. Aufgrund ihrer positiven Eigenschaften bei nur geringer Toxizität (ab 4 - 10 g/d können bei gesunden Menschen Durchfälle auftreten (Cathcart, 1981)). Die Ascorbinsäure besitzt zwei Asymmetriezentren an
den C-Atomen 4 und 5 und damit vier mögliche, nicht deckungsgleiche Konfigurationen. Diese kann man in zwei Paare von Enantiomeren, mit einer 2- hexenono-1,4-lacton Struktur, zusammenfassen : L- und D-Ascorbinsäure und D- und L-Isoascorbinsäure (Liao & Seib, 1988). Die am meisten eingesetzte L- Ascorbinsäure besitzt 100 % Vitamin C-Aktivität, wohingegen die drei anderen Stereoisomere nur eine 0 - 5 % ige Aktivität aufweisen (Hay, 1967). Die wichtigste chemische Eigenschaft von L-Ascorbinsäure ist ihre einfache Oxidation durch einen ein- oder zwei-Elektronen Transfer. Für die Reaktion mit Vitamin E ist die „ein- Elektron-Reduktion durch L-Ascorbinsäure-Reaktion“ die entscheidende. Wenn im
Abb. 6: Strukturformel der L-Ascorbinsäure
geschwindigkeitsbestimmenden Schritt ein Elektron übertragen wird, bildet sich als erstes Produkt das Ascorbinsäure-Radikal, welches oxi
reduzierend wirken und mit anderen Radikalen reagieren kann
ihre Reaktivität mit freien Radikalen verhalten sich
Ascorbinsäure und Ascorbylpalmitat (Fettsäureester der Ascorbinsäure) wie ein typisches Antioxidationsmittel:
verzögern das Einsetzen von Kettenreaktionen,
Qualität von pflanzlichen Ölen, tierischen Fetten, Fisch, Margarine, Milch und Carotenoiden zur Folge hat
Vitamin C wird auch eingesetzt Nitrosamine zu verringern
Ascorbinsäure unter Bildung von Dehydroascorbinsäure und Stickoxid bzw. Stickstoff anstelle der sekundären Amine
Es wird auch ein synergistischer/
Winifred, 1982; Doba et al.,
Pourazrang et al., 2002). Dabei reagiert das Tocopherol als erstes mit den freien Radikalen (Lambelet et al.
Dieses wird dann von Ascorbylpalmitat und Tocopherol somit regeneriert
läuft so lange ab, bis das komplette Ascorbat aufgebraucht ist 1985).
Abb. 8: Regeneration von α-Tocopherol (modifiziert nach Niki et al.
Hierbei übernimmt GSH (Glutathion) das Radikal und wird zum Dimer (Disulf übergibt das Radikal an das Vitamin C. NADPH+H
23
Abb. 7: Strukturformel der Dehydroascorbinsäure
geschwindigkeitsbestimmenden Schritt ein Elektron übertragen wird, bildet sich als erstes Produkt das L-
Radikal, welches oxidativ sowie und mit anderen L-Ascorbinsäure- Radikalen reagieren kann (Liao & Seib, 1988). Durch ihre Reaktivität mit freien Radikalen verhalten sich L-
Ascorbinsäure und Ascorbylpalmitat (Fettsäureester der Ascorbinsäure) wie ein typisches Antioxidationsmittel: Sie beugen Peroxidbildung in Lipiden vor und en von Kettenreaktionen, die eine Verschlechterung der Qualität von pflanzlichen Ölen, tierischen Fetten, Fisch, Margarine, Milch
und Carotenoiden zur Folge hat (Cort Winifred, 1982).
wird auch eingesetzt, um die Bildung der gesundheitsschädlichen (Liao & Seib, 1988). Dabei reagiert das Nitrit mit der Ascorbinsäure unter Bildung von Dehydroascorbinsäure und Stickoxid bzw. Stickstoff anstelle der sekundären Amine (Mirvish, 1981).
wird auch ein synergistischer/regenerativer Effekt mit Vitamin E beschrieben et al., 1985; Golumbic & Mattill, 1941; Niki et al., 1982;
Dabei reagiert das Tocopherol als erstes mit den freien et al., 1985) unter der Bildung eines Tocopherol
es wird dann von Ascorbylpalmitat und L-Ascorbinsäure reduziert und das Tocopherol somit regeneriert (Wayner et al., 1986). Diese Tocopherol
läuft so lange ab, bis das komplette Ascorbat aufgebraucht ist
Tocopherol (modifiziert nach Niki et al., 1982)
GSH (Glutathion) das Radikal und wird zum Dimer (Disulfitgruppe) oxidiert und übergibt das Radikal an das Vitamin C. NADPH+H+ fungiert als Lieferant von Elektronen
Strukturformel der Dehydroascorbinsäure
Ascorbinsäure und Ascorbylpalmitat (Fettsäureester der Ascorbinsäure) wie ein Peroxidbildung in Lipiden vor und erschlechterung der Qualität von pflanzlichen Ölen, tierischen Fetten, Fisch, Margarine, Milch, Vitamin A
um die Bildung der gesundheitsschädlichen . Dabei reagiert das Nitrit mit der Ascorbinsäure unter Bildung von Dehydroascorbinsäure und Stickoxid bzw. Stickstoff
regenerativer Effekt mit Vitamin E beschrieben (Cort 1985; Golumbic & Mattill, 1941; Niki et al., 1982;
Dabei reagiert das Tocopherol als erstes mit den freien unter der Bildung eines Tocopherol-Radikals.
Ascorbinsäure reduziert und das Diese Tocopherol-Regeneration läuft so lange ab, bis das komplette Ascorbat aufgebraucht ist (Lambelet et al.,
tgruppe) oxidiert und Lieferant von Elektronen und Wasserstoff.
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Abb. 9: Strukturformel der Carnosolsäure
2.6.2.2 Carnosolsäure
Carnosolsäure ist ein natürlich vorkommendes phenolisches Diterpen in Rosmarinblättern (Rosmarinus officinalis) mit einer starken antioxidativen Wirkung, die zur Stabilisierung von Fetten eingesetzt werden kann (Richheimer et al., 1996; Schwarz & Ternes, 1992a;
Ternes, 2008). Dadurch, dass die Carnosolsäure in leicht sauren Lebensmitteln mit entsprechendem Salzgehalt
(Ternes, 2008) und in Öl stabiler ist als in wässriger Umgebung (Richheimer et al., 1996), ist sie optimal für den Einsatz in Rohwürsten geeignet. Durch Oxidation und Lactonisierung wird aus Carnosolsäure Carnosol gebildet, das ebenfalls noch antioxidativ wirksam ist(Ternes, 2008). Die Wirkung phenolischer Antioxidantien wird mit ihrer Fähigkeit erklärt, radikalische Bruchstücke abzufangen und zu binden, wobei sich die Möglichkeit zur Resonanzstabilisierung positiv auswirken dürfte. Die Antioxidantien werden durch autoxidative Vorgänge verbraucht (Baltes, 2007). Auch bei der Carnosolsäure wurde im Zusammenhang mit Vitamin E (α-Tocopherol) ein synergistischer Effekt beschrieben: Wada und Fang (1992) zeigten einen synergistischen Effekt von α-Tocopherol und Rosmarin-Extrakt in Sardinenöl und gefrorenem Fisch und Nieto et al. (2011) in Liposomen als biologisches Membran- Modell. Bei beiden Studien wurde der synergistische Effekt damit begründet, dass α- Tocopherol als Radikalfänger „Scavenger“ fungiert und Radikale bindet und diese stabilisiert, unter der Bildung von Tocopheroxyl-Radikalen. Der Rosmarin-Extrakt, der als funktionelle Hauptkomponente Carnosolsäure enthält (u.a. neben Carnosol und 12-Methoxycarnosolsäure) (Richheimer et al., 1996), regeneriert α-Tocopherol durch übertragen eines Wasserstoffatoms (α-TO● + CS → α-TOH + CS●) oder schützt es dadurch, dass die antioxidativ wirksamen Bestandteile des Rosmarin-Extraktes an anderen oxidative Substanzen wie z. B. Metallionen binden.
25 3 Material und Methode
3.1 Chemikalien
Die vollständige Beschreibung der verwendeten Chemikalien ist tabellarisch im Anhang aufgeführt (Kap. 8.1).
3.2 Geräte
Die vollständige Beschreibung der verwendeten Laborgeräte ist tabellarisch im Anhang aufgeführt (Kap. 8.1).
3.3 Probenherstellung
3.3.1 Gewinnung des Biertreber-Extraktes
Der getrocknete Biertreber (Trockentreber), zur Verfügung gestellt von der Firma Leiber GmbH (Bramsche, Deutschland), wurde im ersten Schritt mit einer Getreidemühle (Bosch) auf der Mahlwerkstufe 2 gemahlen. Diese nur geringfügige Zerkleinerung diente einer besseren Siebausbeute.
Der gemahlene Trockentreber wurde dann in der Vibrations-Siebmaschine (Fritsch) mechanisch, unter Zuhilfenahme von Glaskugeln (Murmeln), gesiebt und in 3 unterschiedlich große Fraktionen getrennt.
Die oberste Siebschale enthielt die Trockentreberanteile mit einer Partikelgröße von
≥ 800 µm, die mittlere Siebschale Anteile mit < 800 - 500 µm und die unterste die Trockentreberfraktion mit < 500 µm (Beispiele für quantitative Siebausbeuten s. Tabelle Kap. 8.6). Die Extraktion erfolgte mit drei Soxhlet-Apparaturen. Jeweils 300 - 400 g der < 500 µm Fraktion wurden in eine Soxhlet-Extraktionshülse eingewogen und in einen
Biertreber mahlen
Biertreber sieben
300 - 400 g der < 500 µm Fraktion in Extraktionshülse
einwiegen
8 Stunden mit Ethanol (96 %) in Soxhlet-Apparatur extrahieren
Ethanol-Extrakt im Rotationsverdampfer eindampfen
Biertreber-Extrakt (Öl)
Abb. 10: Fließschema der Gewinnung des Biertreber-Extraktes
